CN102102094B - 热稳定脂肪酶,其编码基因的表达及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了一种具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的分离的脂肪酶，其编码序列，含有其的载体、细胞、和组合物，其制备方法，以及其用于催化酯合成、手性拆分或将植物油转化为生物柴油的用途。

Description

热稳定脂肪酶,其编码基因的表达及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体的说，涉及一种突变的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的脂肪酶，其编码基因，及含有该编码基因的重组质粒和用于表达目标脂肪酶蛋白的重组菌株；本发明还涉及所表达的热稳定脂肪酶的用途。

背景技术

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶，在动植物组织及多种微生物中普遍存在，其天然底物是生物产生的天然油脂，是最早被研究的酶类之一。自1834年兔胰脂肪酶的活性报道至今，有关脂肪酶的研究已有上百年的历史。20世纪初国外科研人员首次发现了微生物脂肪酶。微生物脂肪酶种类多，比动植物酶的作用pH、作用温度以及对底物的专一性类型更广，便于进行工业化生产和获得高纯度酶制剂，这些因素促进了微生物脂肪酶的研究，也极大地带动了脂肪酶在各领域中的基础和实际应用等方面的研究。目前脂肪酶已经成为重要的工业用酶之一。

脂肪酶的应用虽不如淀粉酶、蛋白酶广泛，但在许多方面已显示出不可估量的开发潜力。据报道，脂肪酶占总用酶频度的25％左右。利用其天然底物长链脂肪酸酷(各种油脂等)，脂肪酶可在异相系统油-水界面或有机相中起作用，并且具有一定的位置专一性。脂肪酶在国内洗涤剂、制革、水产、饲料、生物化工、造纸、油脂化工、医药、环保等行业已表现出十分重要的应用潜力，目前许多工业生产中已大量使用了脂肪酶。另外脂肪酶以其来源广泛、催化功能多样以及催化底物类型广泛(酯、酸、醇、酸酐、酰胺等都可以成为它的底物)等优点也已经使其成为生物技术及有机合成方面应用最广泛的一类酶。

脂肪酶是一类作用于甘油酰基的酶，这类酶的活性包括两个方面，专一性水解甘油酯键，释放更少酯键的甘油酯或甘油以及脂肪酸；在无水或少量水体系中催化水解的逆反应，即酯化反应。脂肪酶温和的操作条件，优良的立体选择性，以及保护环境等特点使它在有机合成，脂肪性质改良中有特殊的吸引力。但它应用的主要障碍有两点，一是成本高，这一点已由固定化技术得到大大改进；二是稳定性与活性，这正是当今生化研究集中解决的问题。脂肪酶应用研究日益增加，采用它进行的新型食品开发也正成为众多科学家的研究的课题。脂肪酶应用的现状及前景可以归结为：(1)广泛用来开发新型生化转移反应，已有上百种采用脂肪酶的生化反应器报道，主要以固定化酶反应器为多大大提高了反应的得率。(2)它使用及建议使用的工业用途将大大超过蛋白酶和糖化酶的应用。因此，脂肪酶的重要之处是它们的潜在用途而不仅是目前的应用水平。

我国脂肪酶的研究仅有40多年历史，20世纪60年代末才有报道。1967年，中国科学院微生物研究所筛选到一株解枝假丝酵母(Caudida lipolytica)AS2.1203，并于1969年制成酶制剂投放市场。20世纪70年代末我国开始碱性脂肪酶的研究，施巧琴于1981年发表了我国第一篇关于碱性脂肪酶生产菌(Penicillium exansum)选育的研究论文，并且于1984年首次在江苏南通投人生产。进人90年代，我国科技工作者紧跟国际研究热点，脂肪酶的研究进人快速发展时期，这些都促进和加快了我国脂肪酶领域的研究工作。

我国脂肪酶的研究在1995～2001年的7年间，基础研究发展较快，其中以性质研究工作最多，醋合成及产酶条件的研究次之，而有关酶结构功能、酶反应动力学、分子生物学等方面的研究相对较少，特别是结构和性质作为不可分割的两个方面，现在却产生了较大的差距。我们知道结构决定性质，只有将性质研究与结构研究结合起来，才能整体上推动脂肪酶的基础研究。产生这种不平衡现象的主要原因是这部分工作属纯基础性的研究，与过去我国的科研水平和宏观导向有一定的关系。另外，脂肪酶的应用研究在此期间呈现一定的增长趋势，其中以油脂化工、洗涤剂、生物化工方面居多，环保研究最少。

我国脂肪酶的基础研究、应用研究有了较深入的开展。我们还应看到就微生物脂肪酶而言，虽在产酶条件、性质、酶促水解、合成、交换及工业应用上研究了几十年，但由于脂肪酶结构和性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性和纯化困难以及应用范围不广泛等问题，使得其研究进展与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多也窄得多。我们仍有许多工作要做，结构研究、动力学研究、分子生物学研究仍是我们应重点加强的基础理论研究，同时还要重视成果的产业转化，加强应用研究，加强环保方面的研究，使我国的脂肪酶研究在国际上能逐渐占有重要位置。

近年来，基因技术简化了下游加工，使微生物脂肪酶的产量增加了许多倍。而且引入变性剂和诱导剂使我们有可能取得具有优势三维结构的脂肪酶，因为使用诱导剂和脂肪酶生产出的产品具有专一性定向性和特殊的应用。随着研究的深入，脂肪酶的工业应用将不断增加。因此，目前对于采用新方法获得新型有工业价值的脂肪酶有潜在的需要。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种新的脂肪酶，以使其满足工业上的需要。

本发明的第一个方面公开了一种分离的脂肪酶，其含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在该方面的一个优选例中，所述脂肪酶的氨基酸序列与SEQ IDNO：2具有至少有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，再优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的相同性。在该方面的另一个优选例中，该脂肪酶还包括其功能性片段。在该方面的一个最优选例中，该脂肪酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

在本发明的另一个方面，提供了一种编码上述脂肪酶的核酸分子。在一个优选例中，它具有如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。在该方面的一个优选例中，所述核酸分子与SEQ ID NO：2具有至少有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，再优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的相同性。在该方面的一个最优选例中，该核酸分子的核苷酸序列是SEQ ID NO：2。

在本发明的第三个方面，提供了一种载体，其包含上述多核苷酸。

在本发明的第四个方面，提供了一种细胞，其包含上述载体，或其基因组中整合有上述多核苷酸。

在本发明的第五个方面，提供了上述脂肪酶的用途，用于催化酯合成、手性拆分或将植物油转化为生物柴油。

在本发明的第六个方面，提供了一种组合物，该组合物中含有上述脂肪酶和载体。在该方面的一个优选例中，载体选自食品上、工业上、药用上的载体。

在本发明的第七个方面，提供了一种生产上述脂肪酶的方法，包括：培养上述宿主细胞，从培养物中分离出表达产物。

在本发明的第八个方面，提供了一种将植物油转化为生物柴油的方法，包括用上述脂肪酶处理植物油。

在本发明的第九个方面，提供了一种催化酯合成的方法，包括在无水或少量水体系中用上述脂肪酶催化酯化反应。

在本发明的第十个方面，提供了一种手性拆分的方法，包括用上述脂肪酶催化手性拆分。

附图说明

图1：来自枯草芽孢杆菌的编码脂肪酶的核酸序列Lip Cell(SEQ ID NO：1)及其编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图2：枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶在质粒pTrcHis2上的重组子结构图。

图3：大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的最适反应pH，以pH对相对酶活力(％)作图。

图4：大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的最适反应温度，以温度对相对酶活力(％)作图。

图5：大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的pH稳定性，以pH对残余酶活力(％)作图。

图6：大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的热稳定性，以温度对残余酶活力(％)作图。

图7：大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶发酵过程中样品的SDS-PAGE电泳图。

图8：纯化后大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的SDS-PAGE电泳图。

图9：纯化后大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶的PAGE电泳图。

图10：大肠杆菌表达枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性随时间变化的图。

图11：脂肪酶催化酯合成的标准色谱图。

图12：脂肪酶催化手性拆分的标准色谱图。

图13：脂肪酶催化产生生物柴油的标准色谱图。

具体实施方式

通过对枯草杆菌的筛选，发明人发现了一种新型脂肪酶，其热稳定性好，具有高度的应用性能。在此基础上完成本发明。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的脂肪酶”是指该脂肪酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脂肪酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。脂肪酶的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的脂肪酶可以是重组蛋白(多肽)、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的脂肪酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的脂肪酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的脂肪酶还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括脂肪酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然脂肪酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的脂肪酶片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“脂肪酶”指具有脂肪酶活性的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白。该术语还包括具有与脂肪酶相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括脂肪酶的活性片段和活性衍生物。

该脂肪酶的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与脂肪酶的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗脂肪酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含脂肪酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白外，本发明还包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，该片段具有脂肪酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供脂肪酶的类似物。这些类似物与天然脂肪酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的脂肪酶并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

在本发明中，“脂肪酶保守性变异蛋白(多肽)”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser

Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

作为本发明的优选方式，所述的脂肪酶是从枯草芽孢杆菌中克隆的脂肪酶，被称为Lip-Cell，具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。同时，本发明的脂肪酶也包括那些具有功能活性的，和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，再优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的氨基酸序列的变体。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO：1任一所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，.1％SDS，0℃；或(2)杂交时加有变性剂，50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：2所示的成熟蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码脂肪酶的多聚核苷酸。

作为本发明的优选方式，编码所述的脂肪酶的多核苷酸分离自枯草芽孢杆菌，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明中的蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的脂肪酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

作为实施方式之一，本发明人提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，通过基因组文库构建好活性筛选的方法克隆到编码脂肪酶的全长序列。结果获得如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或脂肪酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的脂肪酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码脂肪酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，脂肪酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：大肠杆菌质粒。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含脂肪酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

在一种实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明脂肪酶编码序列经XhoI和SnaBI酶切后与XhoI和SnaBI双酶切的pTrcHis2载体连接，得到大肠重组表达载体pTrcHis2-LipC。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌TOP10和JM109构建表达脂肪酶的重组细胞。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的脂肪酶。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为实施方式之一，通过包含本发明脂肪酶编码序列的大肠杆菌(例如大肠杆菌TOP10)发酵来生产脂肪酶，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

本发明的脂肪酶的用途包括(但不限于)：用于催化酯合成、手性拆分或将植物油转化为生物柴油的用途。本发明的脂肪酶具有优异的用于催化酯合成、手性拆分或将植物油转化为生物柴油的效果，且具有良好的热稳定性以及pH稳定性，应用前景良好。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的脂肪酶以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：缓冲液、水等。其可被制成溶液或粉剂等。所述的“有效量”是指可发挥脂肪酶的功能或活性的且可被接受的量。在使用时，本领域能够根据所述脂肪酶的酶活性方便地确定所述的有效量。

本发明利用基因工程手段制备了能够表达脂肪酶的重组菌株，并获得了优质的脂肪酶。

在本发明的实施方式之一中，获得一种脂肪酶，其最适pH值为11.0，最适温度为60℃，有较好的pH稳定性和热稳定性，能够应用于催化酯合成、手性拆分和生物柴油转化，并且有较高的效率，这些性质使其在医药、化工、造纸、纺织等产业中具有更广泛的应用和更高的应用价值。

本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特别说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括：Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

I.实验材料和试剂：

1.菌株及载体：

大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、DH5α、TOP10和JM109，表达载体pTrcHis2(购自Invitrogen公司)，pUC19购自TakaRa公司。引物合成由捷瑞公司(中国，上海)完成。

2.酶类及其他生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Invitrogen公司。三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯等底物，AOT(二-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠)购自Sigma公司。其它都为市售。

3.使用的培养基：LB、SOB培养基均参照Invitrogen大肠杆菌操作手册。

4.方法：

4.1脂肪酶活力测定

本发明各实施例中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指脂肪酶活力，可用甘油三酯如三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三油酸甘油酯等作为底物进行检查和测定。其中，酶活力定量测定采用酸碱滴定法。

具体的说，按照以下的步骤进行：

1)原理：样品中的脂肪酶对底物甘油三酯进行水解，水解产生的脂肪酸使反应体系的pH降低，用标准氢氧化钠溶液滴定反应产生的脂肪酸。

2)试剂配制：本方法中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。

①Britton-Robinson缓冲液：50mM Britton-Robinson pH 11.0。

②50mM NaOH标准溶液：用邻苯二甲酸氢钾标定，使用时再稀释1倍。

③底物乳化液：称取15.0g聚乙烯醇(PVA)，加450ml蒸馏水，边加热边搅拌，直至完全溶解，停止加热，继续搅拌30分钟，用浓盐酸或氢氧化钠调节pH至11.0后，用蒸馏水定容至500mL。4℃保存，一周有效。

量取上述PVA溶液150ml，加入甘油三酯底物50ml，用高速组织捣碎机搅拌6分钟，4000rpm/分钟，前后各3分钟，中间间隔5分钟，即为底物乳化液，置于4℃保存，3天内有效。

3)样品测定：

用缓冲液(50mM Britton-Robinson pH11.0)将样品做10倍梯度稀释，调整酶活力在20-50U/ml之间，然后按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入缓冲液(Britton-Robinson pH11.0)开始，向每只三角瓶(250ml)中加入试剂的时间间隔要绝对一致，60℃分别保温10分钟。反应步骤如表1所示。

表1

反应顺序	样品，标准液	样品空白
			Britton-Robinson缓冲液(ml)	4	4
底物乳化液(ml)	5	5

60℃预热5分钟	√	√
			依次加入样品(ml)	1	1
无水乙醇(ml)	--	15
			混合	√	√
60℃保温反应10分钟	√	√
			无水乙醇(ml)	15	--
混合	√	√
			总体积(ml)	25	25

注：“√”表示须执行此操作

反应后的试样加15ml蒸馏水进行稀释后，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液滴定水解产生的游离脂肪酸，以pH电极指示滴定终点。然后可根据样品标准和空白之间的ΔV计算出样品的脂肪酶活力。

4)酶活定义：在pH11.0、温度60℃条件下，单位量的脂肪酶每分钟水解甘油三酯底物释放出1μmol脂肪酸所需要的酶量，定义为一个酶活单位，以U表示。

5)酶活计算

脂肪酶的活力U按下面的公式进行计算：

$U=\frac{V-V_0}{t\×1}\×50\×n$

式中：U——样品脂肪酶活力，U/ml；

V——样品标准耗碱毫升数，ml；

V₀——样品空白耗碱毫升数，ml；

t——反应时间，分钟；

1——样品加量，1ml；

50——1ml 0.05N氢氧化钠的微克分子数；

n——稀释倍数。

两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数，同一样品两个平行测定值的相对偏差不大于10％

6)比活力计算：

脂肪酶的比活力按下面的公式计算：

U_c＝U/c

其中：

U_c——样品脂肪酶比活性，U/mg；

U——样品脂肪酶活力，U/ml；

c——样品溶液中的蛋白质含量，mg/ml。

纯化倍数X按照下面的公式计算：

X＝U_C/U_C0

其中：

X——纯化倍数；

U_C——纯化后脂肪酶样品的比活力，U/mg；

U_C0——纯化前脂肪酶样品的比活力，U/mg。

实施例1枯草芽孢杆菌脂肪酶编码基因的克隆和获得

基因组DNA的提取：取37℃培养2天，菌体浓度OD_600nm至0.5～0.8的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.BGSC 1A700，(BacillusGenetic Stock Center(Columbus，Ohio，USA)))菌液50ml，10000rpm离心10分钟，取50mg菌体加500μl无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重新悬浮于500μl 1mg/ml的溶菌酶溶液(上海生工)中，于37℃温浴30分钟，再补加溶菌酶液100μl于40-50℃继续保温30分钟，至菌液透明后，加10％SDS至终浓度2％(m/v)，搅拌约5分钟至菌液粘度显著下降，15000rpm离心10分钟去除碎片。上清依次用等体积酚、酚∶氯仿(1∶1)、氯仿抽提。取氯仿抽提所得上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10分钟。16000rpm离心15分钟。沉淀用70％(v/v)乙醇清洗，低速离心，将沉淀晾干后用30μl无菌水溶解，备用。

取提取的基因组DNA 10μl(约50μg)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(OMEGA公司的E.Z.N.A.凝胶抽提试剂盒)回收1-10kb的DNA片段。取2μl(约5μg)回收得到的DNA片段，用限制酶BamHI酶切，然后与同样酶切的pUC19载体连接，用所得重组质粒转化大肠杆菌DH5α(购自宝生物工程(大连)有限公司)，构建基因文库。挑取白色的阳性克隆(LB培养基加入80μg/ml Amp、0.5％(m/v)X-gal和1.5mM IPTG)，转移到活性筛选平板(LB培养基中含有2％(m/v)的琼脂，10％(v/v)橄榄油乳化液(橄榄油与3％(m/v)聚乙二醇以1∶3比例混合，10000r/分钟搅拌乳化3分钟，间歇5分钟再搅拌3分钟。)，1％(v/v)罗丹明溶液(20mg Rhodamine B，用10ml蒸馏水溶解))上过夜培养，然后于紫外灯下观察并测量荧光圈的大小。含有脂肪酶编码序列的克隆能够产生荧光圈。挑取产生荧光圈的克隆，提取该克隆的质粒，进行测序，得到脂肪酶的编码序列Lip-Cell，该序列包括960bp(图1，SEQ ID NO：1)，其中第955-960位为终止密码子TAG和TAA、第1-954位编码不含信号肽的成熟蛋白(图1)，该成熟蛋白含有318个氨基酸(SEQ ID NO：2)。

实施例2构建大肠杆菌表达载体及在大肠杆菌中表达脂肪酶

根据pTrcHis2质粒的序列设计引物

pTrcHis2前导引物：

5′-GTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACTCGAGCCCTTAAGGGC-3′(SEQ ID NO：3)和pTrcHis2反向引物：5′-GAATTCGCCCTT

AAGGGCTCGAGTTTATTCCTCCTTA-3′(SEQ ID NO：4)，引入酶切位点XhoI(划线部分)，以pTrcHis2质粒为模板，进行PCR扩增，PCR反应参数为：95℃变性2分钟；然后95℃变性20秒，60℃退火10秒，68℃延伸2分10秒，18个循环后68℃保温5分钟。收集产物，进行琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收4400bp附近的DNA片段(OMEGA公司的E.Z.N.A.凝胶抽提试剂盒)，得到带有新酶切位点的pTrcHis2质粒。

根据实施例1所得脂肪酶的编码序列设计引物：

5′-CTCGAGATGCAACTATTCGATCTGCCGCT-3′(SEQ ID NO：5)和5′-TACGTATTATCAGCCTTTAAGATGCTGCTTAAAGAAAG-3′(SEQ ID NO：6)，分别引入酶切位点XhoI和SnaBI(划线部分)，以实施例1所得的含有脂肪酶编码DNA片段的重组pUC19质粒为模板，进行PCR扩增，收集1000bp附近的片段，进行琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒将该片段回收(OMEGA公司的E.Z.N.A.凝胶抽提试剂盒)。将回收所得DNA片段用限制酶XhoI和SnaBI进行双酶切，然后与同样进行双酶切的带有新酶切位点的pTrcHis2质粒连接，得到脂肪酶的重组质粒pTrcHis2-LipC。将所得的重组质粒转入DH5α中进行扩增培养，培养结束后，收集菌体并用质粒提取试剂盒提取质粒(OMEGA公司的E.Z.N.A.质粒小制备试剂盒I试剂盒)，进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收5350bp附近的DNA片段(OMEGA公司的E.Z.N.A.凝胶抽提试剂盒)。

取10μl上面回收所得的DNA片段，加入到100μl制备好的感受态细胞(大肠杆菌TOP10和JM109)中，摇匀置于冰上，冰浴30分钟；置于42℃水浴中热休克90秒；将离心管快速移至冰水混合物中冰浴2分钟；每管加入400μl SOC培养基(2％蛋白胨(m/v)，0.5％酵母粉(m/v)，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl₂，10mM MgSO₄，20mM葡萄糖，pH7.0～7.2)，用移液器轻吸打散后于37℃摇床上复苏1h(80rpm～200rpm)；离心，4000rpm×5分钟，除去400μl上清，剩余部分混匀；涂平板(LB-agar平板，含80μg/ml Amp)，37℃正置1小时后，倒置培养过夜，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取上面重组质粒阳性克隆所在的重组大肠杆菌菌株JM109，接种于50ml LB培养液中(250ml三角瓶，含50μg/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养2-2.5小时，取培养液10000rpm离心10分钟，收集菌体，提取质粒，酶切回收目的DNA片段(质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.质粒小制备试剂盒I和E.Z.N.A.凝胶抽提试剂盒)，进行测序，经比对，所测得的序列与实施例1中的序列一致，这说明目的基因在质粒pTrcHis2正确插入。

挑取上面pTrcHis2-LipC TOP10表达菌株，接种于液体LB(50μg/ml Amp)的试管中培养过夜，次日按1％菌量转接到50ml LB培养液中(50μg/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养2h，待菌溶长至OD600约为0.6时，加入IPTG诱导(终浓度为1mM)，37℃250rpm再振荡培养3-4h。取培养液10000rpm离心10分钟，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10分钟，取沉淀用1/5体积pH11.0的Britton-Robinson缓冲液悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60％功率，间隔5秒破碎10分钟，停止10分钟，再破碎10分钟。12000rpm离心，收集上清液，测定脂肪酶，结果表明枯草杆菌来源的脂肪酶编码基因所编码的脂肪酶可在大肠杆菌中表达，且有较高的酶活性，可达到1200U/ml(用三乙酸甘油酯为底物)。

另外，将上面所收集的细胞破碎上清液进行SDS-PAGE目的蛋白质电泳分析(见图7所示)，并按照实施例中所述方法从上清液中纯化目的蛋白质，分别将所得到的纯的目的蛋白进行N端氨基酸序列测定，所得到的N端氨基酸序列与SEQ IDNO：2中相应的氨基酸序列一致，这表明目标蛋白得到了正确表达。

实施例3重组脂肪酶的制备

取实施例2中所制备的枯草杆菌来源脂肪酶重组质粒阳性克隆的重组大肠杆菌菌株TOP10，接种于1瓶50ml LB培养液中(250ml三角瓶，含80μg/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养至OD600nm＝0.3～0.5(约2-3小时)，然后将种子接种于3L发酵基本培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，1g/L NaCl，6g/L Na₂HPO₄·12H₂O，3g/L KH₂PO₄，6g/L(NH₄)₂SO₄，1g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L CaCl₂，15g/L葡萄糖，0.05g/L Amp，0.1g/L FeSO₄。)中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水(v/v)调节pH，使其维持在7.0-7.2，并且以2.8ml/小时的速度流加微量元素溶液(3.5mM硫酸铜，0.06mM碘化钠，1.8mM硫酸锰，0.08mM钼酸钠，0.04mM硼酸，0.5mM氯化钴，0.02mM氯化锌，0.03mM硫酸亚铁，0.17mM生物素)进行连续流加补料，直至OD₆₀₀＝15(3-4小时)。

进入诱导阶段，加入一定量的浓度为1mol/L的IPTG，使其终浓度为1mmol/L，开始诱导，并以15-20ml/小时的速度流加TY(500g/L葡萄糖，12.5g/L MgSO₄·7H₂O)，以10-15ml/小时的速度流加DY(100g/L酵母粉，10g/L(NH₄)₂SO₄)，使培养基中还原糖和氨基氮的终浓度在0.4-％0.6％和0.05％-0.15％之间。

发酵过程中，从诱导开始，每隔1小时取样一次，将所取的培养液样品10000rpm离心10分钟，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10分钟，取沉淀用10倍体积的pH11.0的Britton-Robinson缓冲液悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60％功率，间隔5s破碎10分钟，停止10分钟，再破碎10分钟。12000rpm离心，收集上清液，并测定脂肪酶活力和进行SDS-PAGE(图7)，至酶活力无明显增加时，停止发酵(7-8hr)。发酵结束后(8hr)，测得重组枯草芽孢杆菌来源脂肪酶的活力可达到3150U/ml(以三乙酸甘油酯为底物)。

实施例4重组脂肪酶的纯化

将实施例3所制备的发酵培养液(8小时后回收所得)10000rpm离心10分钟，收集菌体，用4倍于菌体体积的pH11.0的Britton-Robinson缓冲液重新悬浮菌体，充分混合均匀后，10000rpm离心10分钟，收集沉淀物，再次用4倍体积的pH11.0的Britton-Robinson缓冲液使其充分悬浮，10000rpm离心10分钟，收集沉淀物，继续再用10倍体积的pH11.0的Britton-Robinson缓冲液使其充分悬浮，然后用高压均质机进行细胞破壁，破壁条件为：压力800-1000bar，过程中用0-4℃冰水进行冷却。将细胞破碎后的混悬液10000rpm离心10分钟，收集上清液4℃保存待用。

取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至75％(w/v)，13000rpm离心15分钟，取沉淀，pH11.0的Britton-Robinson缓冲液重新溶解，置于截留分子量为8000Da的透析袋中，以pH11.0的Britton-Robinson缓冲液为透析外液，透析外液与内液的体积比大于50，4℃透析12-16小时，中间每隔4小时更换透析外液一次，透析完后，取透析内液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，再进行冷冻干燥后，置于-20℃的低温冰箱中保存待用。

取50mg上面所得到的冻干粉末于离心管中，加入2ml pH7.0，50mM的PBS缓冲液(含150mM NaCl)，使其充分溶解后，上Sephacryl S-300凝胶柱(Φ1.6×100cm)。先用pH7.0，50mM的PBS缓冲液(含150mM NaCl)充分平衡柱子后，然后上样，再用相同的缓冲液洗脱2个柱体积，流速为0.5ml/分钟，用部分收集器收集，每管3ml。然后对收集管中的溶液测定脂肪酶活力及蛋白电泳分析。

收集常压凝胶过滤分离后的活性峰，浓缩、脱盐、冻干后，再用pH9.0，50mM的Tris-HCl缓冲液溶解，上Mono Q^TM 5/50GL阴离子交换柱，先用pH9.0，50mM的Tri s-HCl缓冲液平衡柱子，然后上样，再用相同缓冲液配制的NaCl按照下面的梯度进行洗脱：0M NaCl 2CV(柱体积)，0-0.6M NaCl 4CV，0.6-1.0M NaCl2CV，1.0M NaCl 1CV。流速为1ml/分钟，用全自动部分收集器按峰收集。然后对收集管中的溶液测定脂肪酶活力及蛋白电泳分析。

收集高效阴离子交换分离后的活性峰，浓缩、脱盐、冻干后，再用pH7.0，50mM PBS缓冲液溶解，上Superdex^TM 200prep grade凝胶柱(柱体积25ml)。先用pH7.0，50mM PBS缓冲液平衡柱子，然后上样，用pH7.0，50mM PBS缓冲液洗脱1.5个柱体积，流速为0.5ml/分钟，用全自动部分收集器按峰收集。然后对收集管中的溶液测定脂肪酶活力及蛋白电泳分析。

将本实施例中所得到的纯品进行PAGE，并分别进行考马斯亮蓝染色和活性染色，考马斯亮蓝染色与常规方法相同，活性染色按照下面的方法进行，具体为：以甘油三乙酯为底物，溴麝香草酚蓝为染色剂检测凝胶电泳分离后脂肪酶区带的酶活性(原理：在脂肪酶作用下，甘油三乙酯的乙基水解形成乙酸，使脂肪酶所在区带的凝胶pH下降而使溴麝香草酚蓝由蓝绿色转变为黄色，从而表明脂肪酶的底物水解活性。)

步骤：

1)非变性PAGE电泳(通常使用4-12％梯度凝胶)。

2)50ml水漂洗电泳后凝胶10分钟，置于摇床上轻轻摇动。

3)重复水漂洗一次。

4)以30ml 10mM KH₂PO₄pH7.0溶液漂洗一次10分钟。

5)加入30ml10mM KH₂PO₄pH 7.0溶液及0.4ml饱和并经0.22μm过滤的溴麝香草酚蓝溶液，室温保温10分钟。(由于溶液呈中性pH，染色液呈蓝绿色)。

6)加入1ml 99.5％纯度的三乙酸甘油酯。

7)黄色区带呈现，表明脂肪酶的活性凝胶区带。

SDS-PAGE结果(图8)表明，枯草芽孢杆菌来源的脂肪酶纯化后的脂肪酶蛋白仅有单一的条带，分子量均约为35kDa。PAGE结果表明(图9)，重组脂肪酶有活性区带，对应于该活性区带的蛋白条带的分子量为280KDa。由此可知，重组枯草芽孢杆菌来源脂肪酶的活性分子以8聚体的形式存在。

纯化完成后，重组枯草芽孢杆菌脂肪酶的比活性从粗酶液的372U/mg提高到了纯酶的534U/mg，纯化倍数为1.4。

实施例5重组脂肪酶的酶学性质分析

将实施例3所制备的脂肪酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH3.0-11.0的Britton-Robinson缓冲液(柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、氢氧化钠、巴比妥)。将重组枯草芽孢杆菌脂肪酶置于不同pH的缓冲液中，60℃下测定不同pH对酶促反应的影响，结果表明重组枯草芽孢杆菌脂肪酶的最适pH为11.0(图3)。

将脂肪酶液在不同pH值的Britton-Robinson缓冲液中于室温下处理60分钟，再测定残余酶活性以研究脂肪酶的pH稳定性。结果表明(图5)，在pH7.0-11.0之间，重组脂肪酶的残余活性均在90％以上，在pH5.0-11.0的范围内，重组脂肪酶的残余活性均在70％以上，这说明本发明所得到的重组脂肪酶都有很好的pH稳定性。

最适反应温度的测定在特定的缓冲体系(pH11.0的Britton-Robinson缓冲体系)及不同温度下(35℃-70℃)进行，按照前述酸碱滴定法进行酶促反应和活力测定。结果(图4)表明，重组脂肪酶的最适反应温度均为60℃。

热稳定性研究为在不同温度(40-70℃)下处理15-60分钟，再进行酶活性测定。结果见图6，表明在40℃-60℃的范围内保温60分钟，重组脂肪酶的残余酶活力均可维持在90％以上，这说明本发明所获得的重组脂肪酶有很好的热稳定性。

在重组脂肪酶溶液中分别加入0.05ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH7.0PBS缓冲液配置)和胃蛋白酶(0.1mg/ml，用pH4.0甘氨酸-HCL缓冲液配置)于37℃处理30-240分钟，稀释后再测定脂肪酶活性。经胰蛋白酶处理240分钟后，重组脂肪酶的残余酶活力仍维持在95％以上，无明显的损失；经胃蛋白酶处理240分钟后，重组脂肪酶的酶残余酶活力维持在45％左右(图10)，由此可以看出，重组脂肪酶有较强的抵抗蛋白酶水解的能力。

底物特异性的研究为特定的缓冲体系(pH11.0的Britton-Robinson缓冲体系)及特定温度下(60℃)进行，按照前述酸碱滴定法进行酶促反应和活力测定，分别以三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯，三油酸甘油酯，椰子油、棕榈油、橄榄油等不同碳链长度的甘油三酯作为底物。结果见表2所示，从表中可知，重组枯草芽孢杆菌脂肪酶对多种甘油三酯底物都有活性，但对三乙酸甘油酯的活性最高，属于短链的酯水解酶类。

表2

底物	酶活力(U/ml)
		三乙酸甘油酯	3150
三丁酸甘油酯	475
		三油酸甘油酯	230
椰子油	30
		棕榈油	25
橄榄油	27

实施例6固定化重组脂肪酶的制备

采用直接包埋法，具体的说：将质量分数3.5％海藻酸钠(或质量分数3.5％海藻酸钠与质量分数3.0％明胶混合物)和酶液(实施例3所制备的脂肪酶，酶用量为3000U/g绝干海藻酸钠)按一定比例混合，在37℃水浴中使海藻酸钠溶化，并使海藻酸钠溶液与酶溶液充分混匀。用5mL注射器(5号针头)吸取载体与酶的混合液，以10cm左右的高度逐滴注入质量分数2％氯化钙(m/v)溶液中，立即形成光滑的凝胶小球。滤出凝胶小球，更换氯化钙溶液，在4℃冰箱中静置硬化2小时。再次滤出凝胶小球，用质量分数0.9％NaCl(m/v生理盐水)洗涤后，用吸水纸吸干表面水分。再将该海藻酸钠固定化酶置于4℃的冰箱中陈化24小时，然后贮存于4℃冰箱中待用。固定化酶的酶活收率为45-50％，固定化酶的酶活力为45-50U/g。可按照下面的公式计算固定化酶的酶活收率。

式中：U₀——酶液活力，U/ml；

V₀——酶液体积，ml；

U₁——周定化酶活力，U/g；

m₁——固定化酶质量，g。

实施例7重组脂肪酶用于催化酯合成反应

在100ml的典量瓶中，将0.10mol/L的乙酸，0.04mol/L的甘油和7.5ml正庚烷组成非水相酯化反应体系，然后加入在缓冲体系(pH11.0的Britton-Robinson缓冲体系)中预冻干的固定化脂肪酶(实施例6所制备)，每份1g，然后将该反应体系置于50℃条件下，在恒温水浴摇床中以150rpm的速度旋转振荡48小时，然后取样进行GC分析。

日本岛津公司GC-2010气相色谱仪，毛细管柱为(Φ0.50mm×25m)，N₂为载气，进样口和检测器温度分别为270℃和300℃，程序升温：80℃保持2分钟，然后以20℃/分钟的速率升到200℃维持1分钟，最后以45℃/分钟的速率升至290℃维持2分钟。以分析纯的三乙酸甘油酯为标准品，做标准色谱图(图11)，并用内标法确定其保留时间，再配置不同浓度的三乙酸甘油酯标准品分别上样，以峰面积为横坐标，三乙酸甘油酯浓度为纵坐标，绘制标准曲线，然后依据标准曲线计算样品中三乙酸甘油酯的生成量。实验结果为：重组枯草芽孢杆菌脂肪酶催化乙酸和甘油的酯合成反应，最终产物三乙酸甘油酯的生成量为19mmol/L，这说明本发明所得到的重组脂肪酶能够在一定程度上催化短链酯类的合成反应。

实施例8重组脂肪酶用于催化手性拆分反应

反应体系的水活度：将将含有酰基供体与(R，S)-2-辛醇(R-2-辛醇和S-2-辛醇的沸点都为175℃)的有机溶剂体系或离子液体体系及脂肪酶分别与含有已知水活度αw的饱和盐溶液置于密闭容器中，于25℃下放置72h。所用的饱和盐溶液分别为 ：LiCl(αw＝0.11)，MgCl₂·6H₂O(αw＝0.33)，Mg(NO₃)₂·6H₂O(αw＝0.53)，NaCl(αw＝0.75)，K₂SO₄(αw＝0.97)。

a.有机溶剂中的催化反应：在25ml的典量瓶中加入5ml已知水活度的甲苯(有机溶剂在使用前均用活化后的4A分子筛进行除水)，再分别加入50mmol/L酰基供体氯乙酸乙酯和25mmol/L(R，S)-2-辛醇。然后加入在缓冲体系(pH11.0的Britton-Robinson缓冲体系)中预冻干的固定化脂肪酶(实施例6所制备)，每份1g。然后将该反应体系置于50℃下，以200r/分钟反应72-96h后取样测定转化率c和对映体过量率。

b.反胶束体系中的酶催化反应：用注射法制备反胶束体系。在25ml的典量瓶中分别加入5mL含有380mmol/L AOT的异辛烷(A液)，然后加入580μL重组脂肪酶酶液(实施例3所制备)和50mM缓冲液(B液，pH11.0的Britton-Robinson缓冲液)，制成Wo(水与表面活性剂的摩尔比)为17的AOT反胶束体系。向每个容器中均加入25mmol/L(R，S)-2-辛醇和50mmol/L酰基供体氯乙酸乙酯，并将该组反应体系置于50℃下，以200r/分钟反应120h后取样测定转化率和对映体过量率。

用气相色谱仪(GC-2010，日本岛津公司)测定残留底物2-辛醇的量。检测器为氢火焰(FID)，采用衍生化气相色谱法测定2-辛醇的对映体过量率。取1mL样品，加入100μl甲苯进行萃取，取萃取液50μl，加入2μL(S)-(+)-α-苯乙基异氰酸酯和50μL干燥甲苯，反应物置45℃下衍生化2小时。毛细管柱为SE30(Φ0.25mm×30m，澳大利亚SGE)，N2为载气，进样口和检测器温度分别为250℃和270℃，程序升温过程为：110℃保持1分钟，然后以10℃/分钟的速率升到210℃并维持2分钟，继续以3℃/分钟的速率升到222℃。以分析纯的(R，S)-2-辛醇、R-2-辛醇和S-2-辛醇为标准品，做标准色谱图，确定各组分的保留时间(图12)。

①(S)-2-辛醇对映体过量率e.e.S或e.e.R按照下面的公式进行计算：

e.e.S＝(A_S-A_R)/(A_S+A_R)×100％或

e.e.R＝(A_R-A_S)/(A_S+A_R)×100％

其中A_S为(S)-2-辛醇衍生物的峰面积，A_R为(R)-2-辛醇衍生物的峰面积。

②转化率c的计算：

c＝(A_S+A_R)/A×100％

其中A为醇和酯总的峰面积。

③对映选择率E与转化率c和e.e.S或e.e.R的关系为：

E＝ln[(1-c)(1-e.e.S)]/ln[(1-c)(1+e.e.S)]或

E＝ln[(1-c)(1-e.e.R)]/ln[(1-c)(1+e.e.R)]

实验结果为：重组脂肪酶在有机相中催化(R，S)-2-辛醇的手性拆分反应的对应体过量率e.e.S为67.7％，转化率c为29％；重组脂肪酶在反胶束中催化(R，S)-2-辛醇的手性拆分反应的对应体过量率e.e.R为11.3％，转化率c为8.2％。这说明本发明所得到的重组脂肪酶能够催化手性拆分反应，并且有较高的效率，特别是在有机反应体系中。

实施例9重组脂肪酶用于催化产生生物柴油

将3.00g棉籽油和0.3g甲醇(油醇摩尔比1∶3)，4.50g正己烷，1.0g固定化脂肪酶(实施例6所制备，在pH11.0的Britton-Robinson缓冲体系中预冻干)，装入50ml典量瓶中混合均匀，50℃密闭振荡(200rpm)反应4h，再加入0.3g甲醇继续反应4h，最后第三次加入甲醇0.3g继续反应4h。反应结束后，将酶从产物中分离出来，再将反应产物12000rpm离心10分钟，静置分层后，分离出下层的粗甘油和上层的蒸馏液，最后蒸发回收有机溶剂，同时得到成品生物柴油。脂肪酶催化植物油转化为生物柴油的反应方程式如下所示：

其中R₁、R₂、R₃为C_7-17烷基或烯烃基。

①生物柴油的转化率按照下面的公式计算：

②油脂脂肪酸含量分析：参照GB/T 17376-1998eqv ISO 5509。

③生物柴油的测定：

脂肪酶催化反应后的产物生物柴油通过气相色谱仪测定。系统为岛津GC-2010气相色谱仪，PEG-20M毛细管柱(长30m，内径0.25mm)，FID检测器，分流进样，程序升温：柱温120℃，以8℃/分钟升至200℃，保温3分钟；再以4℃/分钟升至220℃，保温3分钟；再以5℃/分钟升至240℃，保温1分钟。进样口温度为240℃，检测器温度为270℃。取样品0.1mL，根据样品的浓度用正己烷进行适当稀释，取1μL样品进样。在以上检测条件下，产物中的各组分均能够得到较好的分离。将分析纯的棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亚油酸甲酯用正己烷配成已知浓度的混合液，按照以上的条件上样分析，做标准色谱图(图13所示)，并采用内标法确定该混合物中各组分的保留时间，然后在结合外标法测定样品中这4种脂肪酸甲酯的含量。所得结果为：重组脂肪酶催化棉籽油转化为生物柴油的酯转化率为90％，这说明本发明中所得到的重组脂肪酶能够有效的催化植物油转化为生物柴油。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>福建福大百特科技发展有限公司

<120>热稳定脂肪酶，其编码基因的表达及其用途

<130>096156 1CNCN

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>960

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<400>1

atgcaactat tcgatctgcc gctcgaccaa ttgcaaacat ataagcctga aaaaacagca     60

ccgaaagatt tttctgagtt ttggaaattg tctttggagg aacttgcaaa agtccaagca    120

gaacctgatt tacagccggt tgactatcct gctgacggag taaaagtgta ccgtctcaca    180

tataaaagct tcggaaacgc ccgcattacc ggatggtacg cggtgcctga caaggaaggc    240

ccgcatccgg cgatcgtgaa atatcatggc tacaatgcaa gctatgatgg tgagattcat    300

gaaatggtaa actgggcact ccatggctac gccacattcg gcatgcttgt ccgcggccag    360

cagagcagcg aggatacgag tatttcaccg cacggtcacg ctttgggctg gatgacgaaa    420

ggaattcttg ataaagatac atactattac cgcggtgttt atttggacgc cgtccgcgcg    480

cttgaggtca tcagcagctt cgacgaggtt gacgaaacaa ggatcggtgt gacaggagga    540

agccaaggcg gaggtttaac cattgccgca gcagcgctgt cagacattcc aaaagccgcg    600

gttgccgatt atccttattt aagcaacttc gaacgggcca ttgatgtggc gcttgaacag    660

ccgtaccttg aaatcaattc cttcttcaga agaaatggca gcccggaaac agaagtgcag    720

gcgatgaaga cactttcata tttcgatatt atgaatctcg ctgaccgagt gaaggtgcct    780

gtcctgatgt caatcggcct gattgacaag gtcacgccgc cgtccaccgt gtttgccgcc    840

tacaatcatt tggaaacaaa gaaagagctg aaggtgtacc gctacttcgg acatgagtat    900

atccctgctt ttcaaactga aaaacttgct ttctttaagc agcatcttaa aggctgataa    960

<210>2

<211>318

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>2

Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro

1               5                   10                  15

Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu

            20                  25                  30

Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp

        35                  40                  45

Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe

    50                  55                  60

Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Glu Gly

65                  70                  75                  80

Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp

                85                  90                  95

Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Thr

            100                 105                 110

Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile

        115                 120                 125

Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp

    130                 135                 140

Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala

145                 150                 155                 160

Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly

                165                 170                 175

Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala

            180                 185                 190

Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser

        195                 200                 205

Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu

    210                 215                 220

Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln

225                 230                 235                 240

Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg

                245                 250                 255

Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr

            260                 265                 270

Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Lys Lys

        275                 280                 285

Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe

    290                 295                 300

Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly

305                 310                 315

<210>3

<211>55

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gtatatatta atgtatcgat taaataagga ggaataaact cgagccctta agggc    55

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gaattcgccc ttaagggctc gagtttattc ctcctta    37

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ctcgagatgc aactattcga tctgccgct    29

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

tacgtattat cagcctttaa gatgctgctt aaagaaag    38

Claims (3)

1.一种将植物油转化为生物柴油的方法，其特征在于，包括用氨基酸序列为SEQ ID NO：2的脂肪酶处理植物油。

2.一种催化酯合成的方法，其特征在于，在无水体系中用氨基酸序列为SEQ IDNO：2的脂肪酶催化酯化反应。

3.一种手性拆分的方法，其特征在于，用氨基酸序列为SEQ ID NO：2的脂肪酶催化手性拆分。

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