CN1051058A

CN1051058A - 微生物植酸酶的克隆及表达

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Publication number: CN1051058A
Application number: CN90108977A
Authority: CN
Inventors: 罗伯特·F·M·V·哥修穆; 威廉·V·哈里金思德; 皮特勒斯·A·V·帕里顿; 阿尼玛里·E·伏恩思塔; 鲁道夫·G·M·尤坦; 吉拉多斯·C·M·西尔坦
Original assignee: Utrecht National Academy
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1989-09-27
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 1991-05-01
Anticipated expiration: 2005-09-27
Also published as: CA2042054C; ES2072834T1; FI104380B; IL95803A0; FI108299B; LV10310A; CZ289014B6; DK0420358T3; CA2341081C; RU2113468C1; WO1991005053A1; ES2072834T3; FI912530A0; SK280670B6; DE69033103T2; CA2042054A1; SK466390A3; DD300886A5; PT95447B; HU907465D0

Abstract

对一种编码植酸酶的核苷酸序列进行了分离和克隆。将编码序列插入表达体中，后者又被插入到能转化微生物表达寄主的载体中。转化的微生物寄主可以用于工业规模经济地生产植酸酶。通过本发明生产的植酸酶可以用于多种需要将植酸盐转化成肌醇和无机磷酸盐的方法中。

Description

本发明是关于微生物植酸酶产品

磷是所有生物体生长所需的一种必需元素。在家畜饲养过程中，必须提供含有无机磷的饲料以使单胃动物（如猪、家禽和鱼）获得良好的生长状况。

相反，反刍动物的饲料无需添加无机磷酸盐，因为其瘤胃中存在的微生物能产生将植酸盐催化转化为肌醇和无机磷酸盐。

植酸盐作为一种贮存磷源实际上存在于所有来自植物的食物中（参见：植酸，化学特性及应用，编辑：E.Graf Pilatus出版，美国明尼阿波利斯州，MN，（1986））。植酸盐在所有坚果、谷物、豆科植物、油料种籽、孢子和花粉中占1-3%。它的复合盐是植酸钙镁。植酸被认为是一种抗营养因子，因为它能与钙、锌、镁、铁等无机元素螯合，并且还能与蛋白质反应，从而降低蛋白质的生物效价，减少有重要营养价值的无机元素的生物利用性。

植酸盐中的磷通过单胃动物的胃肠道排泄在粪便中。尽管在结肠中能产生一些植酸盐的水解产物，但由此而释放的无机磷毫无营养价值，因为这些无机磷仅仅被小肠吸收了。因此，尽管在饲料中存在有大量的具有重要营养价值的磷，但却没有被单胃动物所利用。

植酸盐的磷排泄在粪便中还会引起其它后果，在过去数十年中，家畜集中饲养极大地增加了，因此，产生的粪便量也相应的增加，由此而引起了世界各地的环境问题。在某种程度上，这是由于粪便中的磷酸盐在表层水中的积累而使这些水中的养份过剩。

由微生物产生的，能催化转化植酸盐为肌醇和无机磷，普通公知的是植酸酶，能产生植酸酶的微生物包括细菌，如枯草杆菌（Bacillus Subtilis）（V.K.Paver和V.J.Jagannathan，细菌学杂志，（1982），151，1102-1108）和Pseudonomas（D.J.Cosgrove.澳大利亚生物科学杂志，（1970）23，1207-1220）;酵母菌，如啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（N.R.Nayini和P.Markakis，（1984）Lebensmittel Wissenscnaftund Technologie 17，24-26）;以及真菌，如土曲霉（Aspergillus terreus（K.Yamada，Y.Minoda和S.Yamamoto Agric、Biol、Chem、（1986）.32，1275-1282）。其它曲霉菌种也已知能产生植酸酶，这其中，由无花果曲霉Aspergillus ficuum

产生的植酸酶经测定是具有最高比活性的植酸酶之一，并且比由其它微生物（非公开的观察报道）产生的植酸酶有更好的热稳定性。

向单胃动物的饲料中添加微生物植酸酶的设想已有报道（见Wave，J.H.，Bluff.L和Shieh.T.R.的US，3，297，548号专利（1967）;Nelson，T.S.，Shieh.T.R.Wodzinski，R.J.和Ware，J，H.在营养杂志（1971）上的文章，101，1289-1294）。但是迄今，这一设想的应用尚非商业可行，因为，生产微生物酶类的成本太高（见Y.W.Han，动物饲料科技（1989）.24，345-350）。出于经济原因，仍将无机磷加到单胃动物的饲料中。

现已发现微生物植酸酶还有其它工业用途，这些用途的实例如用玉米和小麦之类的谷物工业化加工生产淀粉。包括由湿磨法得到的玉米谷蛋白物料在内的废弃物是作为动物饲料出售的。在浸泡过程中，可以添加植酸酶，对真菌植酸酶，条件（T≈50℃，PH＝5.5）是理想的（参见如Alko有限公司的EP-A-0321004）。从该方法的废弃物得到的动物饲料的优点是含有磷酸盐而不是植酸盐。

还有一种设想是将植酸酶用于大豆加工过程中（参见Finase^TMEnzymes By Alko，Alko有限公司公开发行的产品信息小册子，Rajamaki，Finland），因为大豆中有较高含量的抗营养因子植酸盐，这就使得该蛋白源不适宜用于婴儿食品、鱼、小牛、和其它非反刍动物的饲料。将这宝贵的蛋白源进行酶催化改性，可以提高它的营养和商品价值。

其它研究者对各种较好特性的植酸酶和改进它们的生产过程及其应用很感兴趣。Ullah发表了一种从野生型Aspergillus ficuum）中提纯植酸酶的方法，并且测定了按该提纯方法获得的产品的几个生化参数（Ullah，A，（1988a）Preparative Biochem.18，443-458）。由Ullah获得的有关数据列在下表1中。

Ullah两次披露了A.ficuum植酸酶蛋白质的N-末端氨基酸排列顺序：Ullah，A.（1987年10月4-8日在加利福尼亚Santa Barbara的第Ⅸ届酶与工程会议上（广告或介绍）和（1988b）Prep.Biochem.18.459-471上。由Ullah获得的氨基酸序列资料复制在下面的图1A、序列E中。

从Ullah的披露可以得到几个有趣的观察结果：首先，按Ullah（1988a和1988b）的描述制备的“提纯”物在SDS-PAGE上由二条蛋白质带组成，而我们发现，从A.ficuum提纯的植酸酶含有一污染物和在SDS-PAGE上看到二条蛋白带之一，由Ullah确认的植酸酶来自于该污染物。

这种差异在Ullah公开的氨基酸顺序资料（1987，1988b;将图1A，序列A和B与序列C比较）上也出现了。事实上，经我们测定，Ullah描述的植酸酶内肽氨基酸序列中的一条（见图1B，序列E）实际上属于污染的100KDa蛋白质（图1C），该蛋白质存在于按Ullah描述的方法所得到的制备物中，并被视为SDS-PAGE上的两带之一。Ullah并未意识到污染蛋白的存在，而是把它看成了植酸酶的另一种形式。回过头来看，该污染物的存在，对选择和分离编码植酸酶活性的真实核苷酸序列增加了难度。另外，该污染物的存在降低了试验蛋白质的比活性值。

另外，关于Ullah公开的序列，值得注意的是Ullah披露的第12位上的氨基酸残基是甘氨酸。采用蛋白质和DNA排列技术，我们一贯地发现该残基不是甘氨酸，实际上是半胱氨酸（参见图6和8）。

最后，Ullah揭示说植酸酶是一种85KDa蛋白质，脱糖基后的分子量为61.7KDa（Ullah 1988b），这个数字比早期报导的76KDa蛋白质（Ullah.A.和Gibson.D.（1988）Prep.Biochem.17（1）63-91）低得多，后者是以水解释放的碳水化合物的相对量及SDS-PAGE上的天然蛋白质的表观分子量计的。但是我们发现，糖基化的植酸酶只有一个表观分子量85KDa，而脱糖基的蛋白质根据脱糖基的程度，表观分子量在48-56.5KDa范围内。

Mullaney等人（丝状真菌会议，1987.4，Pacific Grove，加利福尼亚，（广告介绍））也报道了A.ficuum植酸酶的特征，但是，该报道也包括SDS-PAGE上的两条蛋白质带，其一为85KDa，另一为100KDa，它们以“纯的”蛋白质制备物形式存在。这些蛋白质带被作者确认为是植酸酶的两种形式。一种转化微生物寄主的方法已提出，但尚未报道，克隆和分离编码植酸酶的DNA序列也未见揭示说明。

评价植酸酶的经济生产方法，尤其对动物饲料工业来说是有极大的益处的。更经济的生产植酸酶的一种方法是用重组DNA技术以提高各种微生物中酶的表达值，这些微生物是已知能产生高值表达的肽或蛋白质。但是，迄今为止，编码植酸酶活性的DNA序列的分离和克隆尚未见公开报道。

本发明提供了提纯和分离编码植酸酶的DNA序列的方法，编码植酸酶的DNA序列的分离和克隆是通过采用专为本发明而研制的专门的低聚核苷酸探针而实现的。可以由真菌源，特别是曲霉属的丝状真菌获得优选的编码植酸酶的DNA序列。

本发明的另一目的是提供一种包含有表达组份的载体，所说的表达组份还含有至少一条编码植酸酶的且最好是同系DNA序列的至少一条复制物，该复制物经操作联接在一适宜表达寄主内的能高值表达的具有植酸酶活性的肽或蛋白质的适当可调的区域。

由本发明提供的表达组份可以插入一载体，最好是插入能转化微生物寄主细胞并结合进入基因组。

本发明还有一个目的是提供一种转化体最好是被如上段所述载体转化的微生物寄主。本发明提供的转化的寄主是曲霉属、木霉属、毛霉属和青霉属的丝状真菌，Kluyveromyces和酵菌属的酵母或芽孢杆菌属的细菌，特别优选的表达寄主是曲霉属的丝状真菌。转化的寄主能经济地以工业化规模生产高值的重组植酸酶。

另一方面，本发明是关于具有植酸酶活性的糖基化或非糖基化的重组肽和蛋白质的;还涉及到上述非糖基化肽和蛋白质的生产方法，没有杂质的植酸酶活性的肽和蛋白质;以及用这些重组或提纯的蛋白质与单克隆抗体反应。

按Ullah方法提纯的野生型A.ficuum植酸酶与按本发明得到的进一步提纯的野生型A.ficuum植酸酶的生化参数的比较汇于下表1，特别注解给出了比活性数据，其中可以看出本发明获得的提纯蛋白质比活性是Ullah公开的两倍。

本发明还提供了编码展示植酸酶活性的蛋白质的核苷酸序列以及这些蛋白质的氨基酸排列顺序。所提供的序列可用于设计低聚核苷酸探针，该探针再用于为了识别来自其它品种，特别是微生物菌种的植酸酶基因的杂交筛选研究，随后可以进行分离和克隆。

本发明提供的序列还可以用作建立“第二代”植酸酶的原料，“第二代”植酸酶是通过诱变技术（如指定位诱变）而改进的植酸酶，其特性相异于如按本发明方法所产生的野生型植酸酶或重组植酸酶的特性，例如：可以改变温度或最佳PH值，比活性或底物亲和性以便更好地适用于有限的方法。

在本发明范围内，术语植酸酶指的是涉及从各种肌醇六磷酸盐中去掉无机磷的催化反应的一族酶。

可以通过众多的检定来测量植酸酶的活性，其中选择何种检定方法对本发明是无关紧要的。为了达到更详细的说明目的，植酸酶的活性可以按下述方法测定，即在37℃，PH＝5.50，流速为1μmol/min的条件下，测定从1.5mM植酸钠释放无机磷的酶用量。

应该指出在本说明书中术语“植酸酶”包括所有具有植酸酶活性的肽和蛋白质。这点在图1A中有详细说明，图1A对序列A和B（在本发明过程中获得的序列）与序列C（由Ullah公开的，1988b）进行了比较，该图证明按本发明获得的蛋白质缺少成熟A.ficuum植酸酶蛋白质的开始端四个氨基酸（序列A的蛋白质缺开始端七个氨基酸），但是，这些蛋白质保持有植酸酶活性。从相应的核苷酸序列演绎而来的完整的植酸酶蛋白质氨基酸序列示于图8中。

按本发明生产的植酸酶可以应用于需要将植酸盐转化为肌醇和无机磷酸盐的各种方法中。

例如，按本发明方法生产的植酸酶可以降低微生物植酸酶的生产成本，使之十分经济地应用于动物饲料，从而最终使整体价格/性能比例能与无机磷酸盐竞争。另一好处是粪便中的磷含量可以大幅度降低。

在价格上可与无机磷酸盐竞争，这样，植酸酶的应用就将可以增加配合饲料工业的自由度，从而生产出高质量的饲料。例如：当向饲料中添加植酸酶时，就可以不加无机磷酸盐，并可以提高各种含植酸盐的物料量。

除了上面讨论的用于动物饲料和大豆加工外，按本发明获得的植酸酶还可以有各种不同的工业用途，如：

-猪和家禽的液体饲料。普遍施行的是，在饲喂前将饲料浸泡几小时，在此期间，酶可以将植酸盐转化为肌醇和无机磷酸盐;

-从植酸盐工业化加工生产肌醇或肌醇一磷酸盐;

-用含植酸盐的底物进行其它工业化加工如淀粉工业和发酵工业，如酿造工业，金属离子被植酸盐螯合可以使这些无机元素不能产生微生物，植酸盐的酶促水解防止了这些问题的发生。

本发明的种种目的及优点还将体现在下面的详细说明中。

图1.A.确定为提纯植酸酶的N-末端氨基酸序列。标记为A和B的氨基酸序列是由本发明提供的，来源于等电点分别为5.2和5.4的植酸酶派生物，序列C由Ullah（1987，1988b，前述）引证。序列A和B的第12位上的氨基酸残基经本发明测定不是甘氨酸残基。

〔^＊表示未明确识别，

^＊＊表示没有检测到残基〕

B.CNBr_分裂的内植酸酶片段的N-末端氨基酸序列。标记为A和B的氨基酸序列（表观分子量分别大约为2.5KDa和36KDa的肽）是由本发明提供的，序列C至E引证于Ullah（1988b，前述）

C.100KDa蛋白质的N-末端氨基酸序列，该蛋白质是由本发明发现找到的，其存在于粗植酸酶样品中。

图2.A.根据图1A，肽A至E的资料设计的低聚核苷酸探针。

B.根据图1B，肽A和B的资料设计的低聚核苷酸探针。

图3.用于分离编码酸性磷酸酯酶的基因的低聚核苷酸探针。

图4.含A.ficuum植酸酶座位的 λ-噬菌体AF201的限制图。箭头表示植酸酶基因的位置及转录方向。克隆＃表示在PAN₈-1（对PAF28-1）中和PUC19（对所有其它的亚克隆）中的噬菌体AF201的指示限制酶引发的亚克隆。

图5.PAF1-1的物理图，插入在PUC19中的10kb BamHI片段含有编码A.ficuum酸性磷酸酯酶的全部基因。

图6.汇集了含有植酸酶染色体基因座位的质粒PAF2-3、PAF2-6和PAF2-7的核苷酸序列。植酸酶的编码区在核苷酸的第210位至1713位;内含子在染色体基因的核苷酸的第254位至355位上。指示出了限制座位，植酸酶的起始和终止密码子以及内含子的位置等有关特征。

图7.是序列植酸酶染色体座位的详细物理图，箭头指出了植酸酶的编码区的两个外显子的位置。

图8.植酸酶cDNA片段的转译区的核苷酸序列及衍生的植酸酶蛋白质的氨基酸序列;成熟植酸酶蛋白质的开端标记为位置+1。36KDa内蛋白质片段的氨基末端位于241位氨基酸上，而2.5KDa蛋白质片段起始于第390位氨基酸。

图9.植酸酶表达盒PAF2-2S的物理图，箭头指明了基因的转录方向。

图10.A.ficuum NRRL3135转化体中过表达的植酸酶的IEF-PAGE证据。将等体积的A.ficuum培养物的上清液（带1）与转化体PAF2-2SSP7（带2）在指定条件下培养，在Phast系统（Pharmacia）及IEF-PAGE胶凝和PH4.5-6下进行分析。为了进行比较，提纯至同系的A.ficuum植酸酶试样或单独分开（带4），或与培养物上清液混合（带3）。凝胶或者用本文（A）所述的磷酸酯酶染色剂（A）染色，或用一般的蛋白质染色剂（Coomassie亮兰，B）染色。星号表示植酸酶带。

图11.对黑曲霉（A.niger）CBS513.88转化体中过表达的植酸酶的IEF-PAGE证明。按图10的说明，如用IEF-PAGE分析同样体积的黑曲霉亲代菌株的培养物的上清液（带1），或转化细胞PAF2-2S＃8（带2），PFYT3＃205（带3）和＃282（带4）。凝胶用一般的磷酸酯酶活性染色剂（A）染色，或者用一般的蛋白质染色剂（B）染色。星号表示植酸酶带。

图12.PAB6-1的物理图。插入PUC19的14.5kb HindⅢ DNA包括全部来自黑曲霉的糖淀粉酶（AG）座位。

图13.通过聚合酶连反应（PCR），AG启动子/植酸酶基因发生融合反应的图解，本文给出了使用的所有低聚核苷酸引物的序列。

图14.植酸酶表达盒PAF2-2SH的物理图。

图15.中间体PXXFYT1、PXXFYT2和植酸酶表达盒PXXFYT3的物理图，其中XX表示主导序列（L）。在P18FYT＃和P24FYT＃中分别插有18aa和24aaAG主导序列，而在PFYT＃中，用的是植酸酶主导序列。

图16.质粒pFYT3amds物理图。

图17.质粒pFYT31NT的物理图。

图18.植酸酶/AG取代载体pREPFYT3的物理图。

图19.染色体DNA的放射自显影。用PVUⅡ（A）和BamHI（B）消化，用³²P标记的A.ficuum植酸酶cDNA作为下列微生物菌种的探针进行杂交啤酒酵母菌（带2）;枯草杆菌（带3）;K.lactis（带4）;P.crysogenum（带5）;铜绿仓假单胞菌（P.aeruginosa（带6）;S.lividans（带7），黑曲霉1μg（带8），黑曲霉5μg（带9），空白（带10），C.thermocellum（带11）。带1：标志DNA。

可以采用各种不同的方式来克隆编码由微生物产生选择出的蛋白质的基因。一种方法是提纯所需的蛋白质，随后测定其N-末端氨基酸序列，用以上述的N-末端氨基酸序列为基础的DNA低聚核苷酸探针筛选上述微生物的基因组库。该方法的成功应用例是克隆（cephalosporium acremonium）的异青霉素N-合成酶基因（S.M.Samson等人，Nature（1985）318，191-194）以及分离出用于米曲霉编码TAKA淀粉酶的基因（Boel等人，EP-A-0238023，1986）。

已经采用上述方法偿试分离了编码植酸酶的A.ficuum基因，对蛋白质进行了提纯，并测定几个生化参数，将所得数据与Ullah公开的数据（1988a）进行比较，两组数据均列于下表1中。

表1

提纯的野生型A.ficuum植酸酶生化参数

参数本发明 Ullah

比活性^＊100U/mg蛋白质 50U/mg蛋白质

纯度：SDS-PAGE 85KDa 85/100KDa

：IEF-PAGE 3或4条带未做

Km（亲和常数）：250μM 40μM

专一性：

肌醇-1-P 无活性无活性

肌醇-2-P Km＝3.3mM 5%活性

最适PH 2.5和5.5 2.5和5.5

最适温度（℃） 50 58

MW（KDa）^＊＊85 85和100

MW（未糖基化）^＊＊56.5 61.7

等电点^＊＊＊5.0-5.4 4.5

＊。Ullah是在58℃而不是37℃下测定植酸酶活性。植酸酶活性单位的定义是：在37℃，PH＝5.50，速率为1μmol/min时，由1.5mM植酸钠释放无机磷所需的酶量。比较发酵产率和比活性，对Ullah公开的活性按温度差校正，该校正是以37℃测得的植酸酶活性与Ullah表Ⅲ（1988b）所示的58℃测得的植酸酶活性的差为基础进行的。

＊＊.用SDS-PAGE测得表观分子量。

＊＊＊用IEF-PAGE测得的结果。

为了分离出编码植酸酶的基因，首先要根据上述方法设计第一套低聚核苷酸探针（图2A），这些探针的设计是以氨基酸序列资料为依据的。为了对整个方法进行对照，采用同样的步骤来分离编码的酸性磷酸酯酶的基因，该磷酸酯酶采用的是Ullah和Cummins公开发表的蛋白质资料（1987），Prep.Biochem.17，397-422）。对于酸性磷酸酯酶，可以毫无困难地分离出相应的基因，但对植酸酶就出现了困难。尽管进行了许多努力，其中包括采用由N-末端氨基酸序列衍生的探针，也分离不出基因DNA片段或明确显示包括编码植酸酶基因的基因库的克隆。

为了解决该问题，将提纯的植酸酶进行CNBr-一定向分裂，然后再将所得蛋白质片段分离。测定这些片段的N-末端氨基酸序列（图1B），并根据新的资料设计出新的低聚核苷酸探针（图2B）。令人惊奇的是，新的低聚核苷酸探针能标记特定的DNA片段，并适用于基因库的克隆的没有争议的标记。在新克隆或分离出的DNA片段与第一套低聚核苷酸探针或用该探针分离的克隆之间未观察到交叉杂交的现象。

第二套探针也可以用于标记有关植酸酶的编码序列。

新分离出的克隆可用作Northern blot杂交的探针。当从产生菌丝体的植酸酶分离出mRNA时，仅检测出分离的mRNA，当试图从产生菌丝体的非植酸酶获得RNA时，未发现杂交信号。mRNA其大小约为1800b，理论上能产生最大分子量为约60KDa的蛋白质。该值与测得的未糖基化的蛋白质的分子量是相一致的，蛋白质分子量是由DNA序列推断出的。

另外，当通过转化引入真菌细胞时，可以证明植酸酶活性提高了，这真凭实据地表明编码植酸酶的核苷酸序列确实被分离出来了。被确定为纯的植酸酶和由此而得到的CNBr片段的氨基酸序列与由确定为克隆基因的序列推断出的氨基酸序列同时出现，图6和8给出了核苷酸序列和推断出的氨基酸序列，并进一步说明编码植酸酶的克隆序列。

利用分离出来的编码植酸酶的核苷酸序列，通过现代重组DNA技术，如基因放大、调节元素的交换、如启动基因、分泌标志物等手段或将这些手段结合起来就能够十分经济地以工业规模生产植酸酶。

因此，本发明还包括能有效高值的表达具有植酸酶活性的肽或蛋白质的转化表达寄主，如果需要，还应有效地表达出酸性磷酸酯酶。可选用的表达寄主是选自曲霉属、木霉属、毛霉属如青霉素属丝状真菌，选自Kluyveromyces和酵母菌属的酵母以及芽孢杆菌属的细菌。优先选用能有效分泌内源蛋白质的表达寄主。

特别感兴趣的是曲霉属的工业菌株，尤其是黑曲霉、ficuum、泡盛曲霉（awamori）或米曲霉。另外，Trichoderma reesei、Mucor mienei、Kluyveromyces lactis、啤酒酵母菌、枯草杆菌或地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）也可以使用。

表达体包括编码待表达酶产物的核苷酸序列，通常，寄主上有一功能性标志序列，提供分泌产物肽或蛋白质。

按照本发明，可以采用各种标志序列。可以用与待表达的克隆核苷酸序列同系的标志序列。另外，可以用与寄主的靶座位处的标志基因序列同系或基本同系的标志序列以便于同系重组。再则，还可以采用为改善选择表达寄主的分泌作用而设计的标志序列。例如，参阅Eur.J.Biochem.133，17-21（1983，Von.Heyne）和J.Mol.Biol.167，391-409（1983）Perlman和Halverson）。编码标志序列的DNA序列可以通过编码加工标志（分裂识别位置）的序列直接联接到要求编码蛋白质的序列上，或通过一短桥，通常小于十个密码子联接到要求编码蛋白质的序列上。

在本发明范围内所用的优选分泌标志序列是与待表达的克隆核苷酸序列同系的标志序列，18氨基酸糖化酶（AG）标志序列和24氨基酸糖化酶（AG）标志序列，后两个或与待表达核苷酸同系或是异种的。

表达产物或感兴趣的核苷酸序列可以是与表达寄主同系或异种的DNA。

在此，“同系”DNA是指来源于同一菌属的DNA，例如，曲霉用来自曲霉的DNA转化，用这种方法可以改善已有的真菌属的性质，而不会带入以前不存在的新的特性。

“异种”DNA是指来源于一个以上菌属的DNA。即，如果用上段给出的例子，那么，将来源于非曲霉属的DNA表达在曲霉上。

编码植酸酶活性的核苷酸序列以从真菌源获得为宜，最好是由曲霉属获得的编码植酸酶的核苷酸序列，而最优选序列是由A.ficuum或黑曲霉菌种获得的。

在所感兴趣的核苷酸序列的5′至开放解读密码区域包括了转录起始调节区（或启动基因）。可以利用寄主内的功能区域，包括与待表达的编码植酸酶的核苷酸序列同系的启动基因。但是，在大部分情况下，利用的区域与靶座位的区域是同系的。这样就能有效地用感兴趣的表达物取代靶位点的表达物。对编码蛋白质的靶座位的分泌和表达水平达到有效生产的程度，转录起始调节区一般就被认为符合要求了。但是，在一些实例中，可望比靶座位基因高的转录值或者可以期望用一种特定的诱导表达。在这些实例中，可以利用不同于靶座位基因区的转录起始调节区。已知大量转录起始调节区在丝状真菌中是有作用的。这些区域包括编码糖化酶（AG）、真菌淀粉酶、酸性磷酸酯酶、GAPDH、TrpC、AmdS、AlcA、AldA、组蛋白H₂A、PyrA、PyrG、异青霉素N合成酶、PGK、酸性蛋白酶、酰基转移酶等的基因的区域。

靶座位最好是编码高值地表达蛋白质基因，也就是说，那些表达物的基因在发酵过程终止时表达浓度至少是大约0.1g/l。发酵周期的持续特别可以改变要求得到的蛋白质产品。编码糖化酶（AG）的基因即是这类基因的一个例证。其它感兴趣的基因包括真菌α-淀粉酶、酸性磷酸酯酶、蛋白酶、酸性蛋白酶、脂酶、植酸酶和纤维二糖水解酶。特别优选的靶座位是黑曲霉的糖化酶基因、米曲霉的真菌淀粉酶基因、T.reesei的纤维二糖水解酶基因、Mucor miehei的酸性蛋白酶基因、Kluyveromyces lactis的乳糖酶基因或啤酒酵母的转化酶基因。

转录终止调节区域可来自感兴趣的基因、靶座位、或其它任何方便的序列。其中表达体还包括从所感兴趣的基因的下流的序列（沿转录方向），如果转录终止调节区域与靶座位同系，那么，基本上应是小于同系侧面的区域。

通常采用选择标记，它可以是表达体的一部分，或独立于表达体，因此，它可以在不同于所感兴趣的基因部位整合。由于本发明的重组分子最好是转化成能用于工业化生产的寄主菌株，所以，探查转化过程的选择标记最好是显性选择标记，即没有突变株被引入能够利用这些选择标记的寄主菌株。其中的实例有能够使转化体在规定营养源上生长的标记（例如，A.nidulans amds基因能使黑曲霉转化体在乙酰胺作为唯一的氮源上生长）或对抗菌素产生抗性的标记（例如，ble基因能对腐草霉素产生抗性，或hph基因，能对潮霉素B产生抗性）。

选择基因具有自己的转录和翻译起始和终止调节区域，这样就能独立地表达标记。如前所述，已知有大量的转录起始调节区域，并可与标记基因联用，其中，利用抗菌素抗体时，选择的抗菌素浓度将根据抗菌素而改变，但一般大约为30-300μg/ml抗菌素。

可以按照已知技术将各种序列连接起来，如限制作用，接合互补限制座位及连接，通过悬垂填充来平整末端和平整连接、Ba131切除、引物修复，体外诱变等等。可以用多连接子和连接物，在适当的时候，按照已知技术引入或除去以便于表达体组合，在表达体合成的每个阶段，均可以克隆片段，并通过限制酶，排列顺序或杂交等分析。有大量的载体可用于克隆，至于具体的选择，不是本发明的关键。一般是在E.Coli中进行克隆。

侧区可以包括靶座位中的至少部分开放解读密码，特别是标志序列，靶座位基因的调节区5′和3′，或者延长超出调节区。通常，侧区至少是100bp，往往是至少200bp，并且可以是500bp或大于500bp。选择侧区是为了分裂靶基因，阻止其表达。上述目的可以通过下面方法实现：将表达盒（包括被表达的核苷酸序列，并最好包括其它组分，如标记序列，转录起始调节区序列和/或转录终止调节区序列）插入最接近5′区的开放解读密码，用表达体全部或部分取代靶基因，或者在靶座位的转录起始调节区和开放解读密码之间进行表达体干涉。正如已经指出的那样，当终止调节区与靶座位的区域同系时，实际上3′一侧区应该大体上大于表达体内的终止调节区。

本发明还提供了建立“第二代”植酸酶的原料，所说的“第二代”植酸酶即是性质上不同于本文所说的分离出来的酶的植酸酶。第二代植酸酶改变了最适的温度和PH，改变了比活性或对底物的亲和度，或者改变了其它质量，使该酶更适用于规定的方法。E.Coli是进行诱变（如定位诱变）的最佳寄主。由于E.Coli缺少为除去可能存在于植酸酶基因中的内含子的拼接机构，所以植酸酶的cDNA克隆是被表达在E.Coli上的选择序列。该cDNA序列能够通过现有技术已知的方法很容易地诱变，诱变后，可将诱变基因引入要求的表达体中。

所说的表达体可以转化进入作为克隆载体的寄主中，不是线性的，即是环形的，或者如果需要，也可以从克隆载体中除去。克隆载体最好是质粒，通常，在大约1kbp所感兴趣的基因内，质粒被线性化。最好是将生产本发明植酸酶的表达体整合进入选择的表达寄主的基因组。

有各种技术可以实现丝状真菌的转化，这些技术包括原生质体融合或转化，电击以及将微抛射体射入细胞。现已发现原生质体转化成功的，可以优先采用。

首先，在KCl或山梨糖醇等的渗透稳定剂参与下，通过细胞壁的酶促消化，将感兴趣的真菌种的菌丝体转化为原生质体，添加CaCl₂和浓的聚乙二醇溶液来帮助原生质对DNA的吸收，添加的后一种物质能引起原生质聚集，由此，转化DNA被包含在聚集体中，并被原生质所吸收，随后，使原生质在固体介质中再生，所说的固体介质含有渗透稳定剂，如果需要，还含有一种选择剂，该选择剂是用作转化DNA编码抗体的。

在选择转化体后，可以用不同的方法来测定所感兴趣的基因的存在。利用抗体，其中表达产品与寄主异种，可以探测所感兴趣的表达基因的存在。另外，可以用Southern或Nothern blots探测整合基因或其转录产品的存在。

可以通过标准技术，如将多重复制表达体引入转化载体，或用amds基因作选择标记（如：Weinans等人，Current Genetics（1985），9 361-368）来放大核苷酸序列或所感兴趣的表达体。如上所讨论的，待放大后的DNA序列可以包括或与表达寄主同系，或是异种的DNA。

然后，可使细胞在任意的营养介质上生长，可以用低浓度的蛋白酶抑制剂，如苯基甲基磺酰氟、α2-巨球蛋白和抑胃肽（Pepstatin）等，常用浓度范围是大约1μg/ml-1mg/ml。为了避免或减少所要蛋白质的降解，可以将蛋白质失活。

转化体可以在间歇，或者是连续发酵反应缶中生长，其中营养介质是分开的，并且是符合要求的提取产物。

如果需要，可以采用各种不同的方法来提纯产品，如气相色谱法（例如HPLC）、溶剂萃取、电泳等，或者将这些方法组合使用。

本发明还提供了一种顺流加工法，其中，将发酵液（最好是提纯过的）过滤，然后，进行第二次无菌过滤，随后，将过滤的溶液浓缩，将如此获得的浓缩液按如下使用：

a）在连续搅拌条件下，加入丙酮，其量为最终体积的60%（V/V），可使植酸酶和其它蛋白质从浓缩物中沉淀出来，在真空中，35℃下干燥沉淀物，粉碎成干粉末后，可将酶制品做应用试验。回收率大约90%。

b）可以采用常规的喷雾干燥技术将液态浓缩物喷雾干燥，回收率在80%-99%范围内变化。

c）可将浓缩物与载体材料，如小麦麸混合，如此得到的混合物可以在喷雾塔或流化床中干燥。

d）通过添加如山梨糖醇，可使浓缩液渗透性稳定，可以添加苯甲酸之类的防腐剂以防止微生物污染。

上述四种配料可以出售给预混合工厂、配合饲料工业、其它销售商和农场主。

在本发明中，实施例只是进一步说明，并非是对本发明的范围加以限制。本发明的植酸酶基因可用于异种杂交试验，涉及从其它微生物分离编码植酸酶基因、这些对本领域技术人员来说都是显而易见的。

实施例1

A.ficuum NRRL3135的发酵

由北区研究室（美国、伊利诺斯州，Peoria，North University大街1815号，USDA）得到Aspergillus ficuum菌株NRRL3135，按下面的标准技术制备真菌孢子。

将孢子及随后的细胞通过在锥形瓶中进行一系列间歇发酵，并转移到101发酵罐，间歇培养生长后，该发酵罐内物料即作为最终500L间歇发酵的接种物。

所用的培养基包括：91g/L玉米淀粉（BDH化学有限公司）、38g/L葡萄糖·H₂O，0.6g/L MgSO₄·7H₂O、0.6g/L KCl、0.2g/L FeSO₄·7H₂O和12g/L KNO₃。通过用4N NaOH或4N H₂SO₄自动滴定，使PH保持在4.6±0.3。

在28℃，自动控制25%空气的溶解氧浓度条件下，培养细胞。发酵10天后，植酸酶产物达5-10U/ml的最高值。

实施例2

将A.ficuum植酸酶提纯及特性化

A.植酸酶活性测定

将100μl发酵液过滤物（必要时可以稀释）或上清液或100μl demiwater作为参照物加入到含有下列成份的培养混合物：

-0.25M NaAC缓冲液，PH5.5或

-甘氨酸、HCl-缓冲液，PH2.5

-1mM植酸，钠盐

-demiwater达900μl

将所得混合物在37℃下，恒温培养30分钟，加入1ml10%TCA（三氯乙酸）终止反应，终止反应后，加入2ml试剂〔50ml含3.66g FeSO₄·7H₂O的钼酸铵溶液（2.5g（NH₄）₆Mo₇O₂₄·4H₂O和8ml H₂SO₄用demiwater稀释至250ml）〕。

在750nm处利用分光光度法测定兰色强度。测定结果表明，根据磷酸盐校准曲线释放出的磷酸盐量在0-1m mol/l范围内。

磷酸酯酶染色

用一般磷酸酯酶染色法，通过等电点聚焦探测具有磷酸酯酶活性的组份。将凝胶用含α-萘基磷酸盐和Fast Garnet GBC色盐（σ，分别是0.1%和0.2%（W/V））的0.6M NaAC缓冲液（PH5.5），恒温培养，再将出现黑色沉淀的反应物或用甲醇∶乙酸（30∶10%V/V）终止，或者当仍需要有植酸酶活性的蛋白质时，可以用蒸馏水洗涤。

B.A.ficuum植酸酶的提纯

将来源于A.ficuum NRRL3135培养发酵液的植酸酶提纯到同质性程度。首先，通过过滤使发酵液无菌，然后将所得培养过滤物在带有30KD断流过滤器的Filtron超滤装置中浓缩。在提纯过程中，利用10mM NaAC缓冲液（PH4.5）冲洗样品，以调节样品的PH和离子强度。在超滤过程中，最终浓缩约20倍。

然后，将试样加到650型水制备先进的蛋白质提纯系统（Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System）中的阳离子交换器内〔20ml S-琼脂糖速流柱（HR16/10），由Pharmacia获得〕。用含有NaCl（浓度梯度为0-1M）的醋酸钠缓冲液洗脱粘结的蛋白质，植酸酶在大约250mM NaCl中洗脱。将含植酸酶活性的洗脱物收集起来，经超滤浓缩和脱盐。再将所得溶液加入阴离子交换柱（20ml Q-琼脂糖速流柱（HR16/10），Pharmacia），再次用上述的含浓度梯度为0-1M NaCl的NaAC缓冲液洗脱蛋白质，大约在200mM NaCl时，由该柱洗脱出植酸酶。

经过这些提纯步骤，得到比活性大约为40-50U/mg蛋白质的部分纯化过的植酸酶制品，表明纯度为25倍。

对部分提纯植酸酶纯度分析表明存在有分子量约为100KDa（图1B，序列E）的主要杂质。等电点聚焦试验表明有大量的含磷酸酯酶活性的酶存在，包括3-4种植酸酶亚形式（等电点在5.0-5.4范围变化）（图1A，序列A和B）。

为了获得同质植酸酶制品，利用在LKB Multiphor系统中的Ampholine PAG板上（PH4-6.5）等电点聚焦分离部分提纯过的植酸酶组分，进一步使其纯度提高2倍。

用前述一般磷酸酯酶染色法检测含磷酸酯酶（包括植酸酶）的蛋白质，随后，由凝胶中摘除感兴趣的带，通过在10mM NaAC缓冲液（PH5.5）中恒温培养，硅胶切片16小时洗脱活性蛋白质。按实施例2所述的方法，对蛋白质部分进行植酸酶比活性分析，这样，即从其它酸性磷酸酯酶中鉴别出植酸酶成份。植酸酶的最终提纯度大约是60倍（最终制备物的比活性是100U/mg蛋白质）。在最后的提纯步骤中，还可以分离出植酸酶的不同亚形式（图1A，序列A和B）。

制备针对A.ficuum植酸酶的样品的单克隆抗体，以提供有效的提纯方法。将抗体偶联到溴化氰激活的琼脂糖4B（5mg/ml凝胶）上，并将该基质用于免疫亲合柱，基质示出粘合含有大约1mg植酸酶/ml。用PH2.5的缓冲液（100mM甘氨酸-HCl，500mM NaCl）将植酸酶从亲合柱中洗脱出来，而活性不会有任何损失。该方法可一步将同质植酸酶从粗培养液过滤物中分离出来，回收率达80%，纯化约60倍。

C.植酸酶脱糖基

用总体积为30μl，内含0.2M磷酸钠缓冲液（其中含有2.5UN-聚糖酶（Genzyme PH8.6）和10mM 1，10-菲咯啉的溶液培养A.ficuum植酸酶（70μg蛋白质）。

37℃下，培养16小时后，利用电泳法（Phast系统，Pharmacia）检查脱糖程度。发现植酸酶的表观分子量由85KDa下降到大约56.5KDa。利用鉴别天然植酸酶糖蛋白的高碘酸Schiff（PAS）糖染色法，检测不到有残留的碳水化合物连接在蛋白质上。利用灵敏的植物凝集素-吸印法（lectin-blotting）进一步证明碳水化合物已完全脱除。将天然的和脱糖基的植酸酶（两份、1.5μg）在标准SDS-PAGE凝胶上试验，并通过电泳法转移到PVDF膜（Immobilon，Millipore），该膜并于25mM TRIS-甘氨酸缓冲液（PH8.3）、20%（V/V）甲醇中，电压30V，时间16小时。

然后，用含有1%（W/V）牛血清清蛋白的磷酸盐缓冲液以及用伴刀豆球蛋白A-过氧化物酶（σ，10μg/ml磷酸盐缓冲盐液）培养上述膜。之后，用4-氯-1-萘酚（σ）对过氧化物酶染色。

用该灵敏方法也不能检测到有任何残留的碳水化合物连接在脱糖基的植酸酶上。

脱糖基后，植酸酶完全失去了它的活性，这可能是由于酶聚集的缘故。

实施例3

植酸酶氨基酸排列顺序的测定及低聚核苷酸探针的设计

A.N-末端氨基酸序列的确定。

将植酸酶用电泳法由SDS-PAGE或IEF-PAGE传送至PVDF吸印（blotting）膜上（Immobilon，Milli-pore）在含10%（V/V）甲醇的10mM CAPS（3-环己氨基-丙磺酸）缓冲液（PH11.0）中，进行电吸印（Electro-blotting），电压30V，4℃，时间16小时。

用考马斯亮兰染色蛋白质，将所感兴趣的带摘除，在甲醇中脱色，并进行气相排列顺序。利用几个不同的制备物，进行了几次操作。所得结果在图1A中给出（序列A至D）。

还对粗制备物中存在的100KDa蛋白质测定了氨基酸序列，所得数据列于图1C中。该序列明显表明与由黑曲霉分离出来的酸性磷酸酯酶是同系（MacRae等人，基因，（1988）71，339-348）。

B.内氨基酸序列的测定

用溴化氰进行蛋白质断裂

通过超滤（微型浓缩器Centricon 30，Amicon）把纯化至呈同系的植酸酶转移到100mM NaHCO₃中。接着将蛋白质冷冻干燥，并溶于70%三氟乙酸（V/V）中，并在约过量摩尔数为300倍的CNBr存在的条件下培养6小时。通过加水稀释该混合物使反应终结。将得到的片段再次冷冻干燥。然后，将样品溶于含有DTT（二硫苏糖醇）的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品缓冲液中，通过PAGE测定出断裂的程度。分析PAGE在Pharmacia Phast-System unit上，在20%SDS-PAGE凝胶上进行。对该凝胶进行预运行，以产生连续的缓冲液体系来改进小肽的分离（按指南）。用本领域公知的银-着色技术检测肽，因为考马斯（Coomassie）亮兰不能检测到最小的肽。上述步骤的结果是使植酸酶完全降解为肽，其分子量＜2.5KDa、36KDa、57KDa和80KDa。

通过SDS-（N-三（羟甲基）甲基甘氨酸）-PAGE将肽离析用于气相排列顺序，如Scnagger和Jagow（1987）分析生物化学（Anal.Biochem.）166，368-379所述，接着进行如上述的电吸印。

57KDa片段的N-末端与Ullah（1988b，Supra）测定植酸酶的N-末端相同，例外的是不存在头四个氨基酸（图1A，序列D）。2.5KDa和36KDa肽的N-末端序列如图1B所示，为序列A和B。

C.低聚核苷酸探针

基于图1A和1B中给出的氨基酸序列，设计低聚核苷酸探针，并使用应用生物体系ABI380B DNA合成仪进行制备。图2A和2B给出了这些低聚核苷酸。

实施例4

基因组吸印（genomicblots）和基因组库（genomicli-braries）与第一套低聚核苷酸探针的杂交作用

采用标准步骤（例如Yelton等（1984）Proc.Natl.Acad.Sci-U.S.A，1470-1474）、通过在液氮中研磨菌丝体，从A.ficuum中分离出基因组DNA。在噬菌体载体λEMBL3上，按照标准技术（例如，Maniatis等人（1982）“分子克隆，实验室指南”，Cold Spring Harbor实验室，New York），使用A.ficuum NRRL 3135染色体DNA的Sau 3A部分消化液建立基因组库。如此得到的基因组库含有60-70倍的A.ficuum基因组。在不通过杂交作用插入λEMBL3填充片段的条件下，检测该基因组库的噬菌斑是否存在。观察到少于1%的噬菌斑与λEMBL3探针杂交。插入物的大小为13-17kb。

为确定适于筛选基因组库的条件和探针用一些限制性酶消化基因组DNA，将之在琼脂糖凝胶上分离，并使用生产厂家的说明书将其吸印在基因筛正面。该吸印与所有低聚核苷酸探针杂交。采用严紧性的变化条件（6×ssc，40-60℃用于杂交;直到0.2×ssc，65℃用于洗涤）进行杂交。选择探针1068和1024（图2A）来筛选基因组库，尽管不能鉴定出有与两个探针专门杂交的普通的DNA，但是酸性磷酸酯酶探针1025（图3）给出一种特别的而且不连续的杂交标记，因此该探针被选定用于筛选基因组库中的酸性磷酸酯酶基因。

使用全部三个探针，则可以鉴定出基因组库中的杂交噬菌斑。对应于探针1025（酸性磷酸酯酶）的杂交标记即强又具有重现性。使用探针1024和1068（植酸酶）观察到杂交标记的强度有变化。没有观察到两种系列之间有交叉杂交。对所有三个系列的噬菌斑重新筛选，并从8个单一的，确定的杂交噬菌斑中分离出DNA（Maniatis等，Supra）。在每一系列中，可以鉴定出具有同一杂交片段的克隆，表明所述克隆的插入物相互有关且可能在同一基因组DNA区上重叠。再者，使用两种植酸酶系列（探针1024和1068）证明没有交叉杂交，表明尽管从蛋白质的N-末端氨基酸序列得到了用于分离两种克隆系列所使用的两种探针，但是不同基因组的DNA片段已经得到确定。

所有三种克隆系列都与从诱导和非诱导菌丝体（实施例6）中分离出来的含有mRNA的Northern吸印杂交。酸性磷酸酯酶特别克隆以及从这些克隆中分离出的内3.1kb SalⅠ片段只与诱导mRNA样品杂交。由酸性磷酸酯酶特别探针鉴定出的mRNA长度约为1800b，这与蛋白质的已知尺寸相符（68KDa，Ullah和Cummins（1987）Prep.Biochem.17，397-422）。无法确证植酸酶特别克隆与特别mRNA克隆有杂交作用，我们由此可以作出结论，上述方法在编码植酸酶基因的克隆中是不成功的。还可以进一步作出结论，这一失败并非由所用的方法所导致，因为该方法已成功应用于鉴定编码酸性磷酸酯酶基因。含有酸性磷酸酯酶基因的λ克隆于1989年4月24日在the Centraal Bureau Voor Schimmel-cultures.Baarn.The Netherlands保藏，保藏号为CBS214·89。从噬菌体Z1中分离出10kb BamHI片段，并在PUC19中亚克隆，该亚克隆含有全部编码酸性磷酸酯酶基因。该亚克隆PAF1-1（图5）于1989年4月24日保藏，保藏号为CBS231.89。

实施例5

使用第二套低聚核苷酸探针分离编码植酸酶基因

使用由CNBr产生的片段的N-末端氨基酸序列设计出探针（图2B，探针1295、1296和1297），并与上述的基因组DNA杂交。通过基因组吸印与探针的Southern杂交作用对使用这些探针分离编码植酸酶基因的可行性再次进行了研究。这次，尽管探针是由非重叠区衍生出的，但是使用所有三种探针都能鉴定出相应长度的杂交片段。发现新的一套探针与使用第一套探针分离出的克隆（实施例4）之间没有杂交作用。因而，使用所有三种探针在独立的试验中，对基因组库重新筛选。由各个单独探针分离出的克隆的子集（λAF201、219、241和243）也与其它两种探针杂交，表明在这种情况下，使用该三种不同探针从单一基因组区中分离出了克隆。对新分离出的克隆与探针1024和1068的杂交进行了多次试验。在两种情形中，在两种探针与已成功地与用这些探针分离出的克隆杂交的条件下（见实施例4），没有观察到与新分离的克隆有杂交作用。这证明新分离出的克隆与纯化过的植酸酶的N-末端衍生出的探针不是同系。

与所有三种探针（1295-1297）都杂交的λEMBL3-克隆命名为λAF201（图4），并于1989年3月9日保藏，保藏号为CBS155.89。

λAF201的5.1kb Bam HI片段（在PUC19中的亚克隆，称为PAF2-3，见图4）与所有三种低聚核苷酸探针都能杂交。它常是Northern吸印的探针。在这种情况下，鉴定出尺寸为1800碱基的不连续的mRNA。这种mRNA只在诱导菌丝体中发现。当使用低聚核苷酸作探针时，得到了相似的结果。因而使用新的一套探针鉴定出普通DNA片段，该片段专门与诱导mRNA杂交。这种长度为（1800b）的mRNA足以用于约60KDa蛋白质的编码，后者长度大约是非糖基化蛋白质的尺寸。明显的是，分离的片段至少含有部分编码植酸酶基因。

实施例6

“诱导”和“非诱导”mRNA的分离

从文献中得知，由A.ficuum合成植酸酶要经过磷酸基决定的严格的规则（Han和Callagher（1987）工业微生物杂志（J.Indust.Microbiol.1，295-301）。因而，可以认为分离基因要受相似规则的证明，就支持所感兴趣的基因已克隆的证据。

为便于分离已在生产和非生产条件下合成的mRNA，按如下所述，使A.ficuum NRRL3135生长。首先，孢子先在非诱导介质中生长一夜。第二天，采集菌丝体，用无菌水洗涤，并在诱导或非诱导介质中接种。所用的介质含有（每升）：20g玉米淀粉、7.5g葡萄糖、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.2g FeSO₄·7H₂O和7.2g KNO₃。为使植酸酶诱导，向介质中加入高达2g/l玉米浸泡液，而非诱导介质含有2g/LK₂HPO₄。菌丝体至少再生长100小时。按选定的时间间隔采取样品。随后用植酸酶测定产生的植酸酶，如实施例2A所述。通过电泳分离出变性mRNA，并吸印在基因筛正面。将该吸印与P³²标记的PAF2-3或与在实施例4中从PAF1-1（酸性磷酸酯酶）中分离出的3.1kb SalⅠ片段杂交。结果见表2。

仅当细胞是在诱导合成植酸酶和酸性磷酸酯酶的已知条件下生长时，观察到植酸酶特别的5.1kb BamHI片段和酸性磷酸酯酶特别的3.1kb SalⅠ片段与分离的mRNA确实有杂交作用。从这些结果已得出结论，分离的基因是按照预期的植酸酶和酸性磷酸酯酶调整的。

表2

Nortnern吸印的杂交使用植酸酶特别的5.1kb BamHI片段（A）或酸性磷酸酯酶特别3.1kb SalⅠ片段（B）作探针，+表示存在1800b植酸酶mRNA或1800b酸性磷酸酯酶mRNA。对24小时样品测定其相关的植酸酶活性：诱导培养物比非诱导培养物的植酸酶活性高10倍。

接种后诱导非诱导

时间

A 24小时 + -

B 24小时 + -

实施例7

植酸酶基因克隆的证据

为得到成功分离编码植酸酶基因的确切证据，以及为研究提高克隆基因表达的可行性，将植酸酶基因在适宜的载体中亚克隆，并转移至黑曲霉402（A.niger402）（ATCC9092）。所以，从λ克隆AF201中分离出呈10kb NruI片段的植酸酶基因，并在含有ble基因（具有腐草霉素抗性）作选择标记物的载体PAN8-1（Mattern，I.E.和Punt，P.J.（1988）Fungal Genetics Newsletter 35，25）的StuI位中克隆。将产生的表达体（Construct）命名为PAF28-1（图4），并按实施例9中所述的方法将其转移至黑曲霉402中，与所述方法不同的是，原生质体沉积在Aspersillus最低限度培养介质上，该介质有30μg腐草霉素/ml的辅助成分，并用0.75%琼脂固化。将单一转移物纯化、分离并在摇瓶上做制备试验，如实施例1和2所述，作为对照，也试验了只含有载体的转移物以及未经转移的寄主（表3）。只有含有PAF28-1的黑曲霉402表现出生成植酸酶，后者与直接抗A.ficuum植酸酶的特殊单克隆抗体发生反应。与该单克隆抗体反应的植酸酶可以从PH值为2.5的免疫亲和柱上洗脱，并在分子量、糖基化程度、等电点和对A.ficuum植酸酶的比活性方面表现出同一性。这一发现，提供了下述结论的清楚证据，即转移有PAF28-1的黑曲霉402细胞表达了植酸酶，后者实际上与A.ficuum植酸酶相同。在对照细胞的两种类型中，都观察到相似的表达。

表3

菌株	植酸酶／活性u/ml	吸附在免疫亲合柱中的植酸酶活性％
			黑曲霉402黑曲霉402PAF28-1黑曲霉402PAN8-1	0.50.70.5	0100

菌株在诱导条件（实施例6）下生长。在生长96小时后取样。

实施例8

植酸酶基因的特征测定

通过使用多种限制性酶进行消化，分析含有植酸酶基因的λ克隆。图4给出了包括植酸酶基因的基因组区域图。在克隆载体PUC19中，将确定的限制性片段亚克隆，如图4所示。

如上述（实施例5），在PAF2-3中存在的5.1kbBamHI片段至少包括部分植酸酶基因。然而，前面还看到，低聚核苷酸探针1295和1297（图2B）与从PAF2-7（PAF2克隆的位置示于图4）中得到的SalⅠ插入物杂交，而探针1296可能跨越PAF2-6和PAF2-7中片段间的SalⅠ位置。这些实验的结果表明，植酸酶编码序列位于PAF2-3的Bam HI插入物的左侧。

然后，使用二脱氧链终止方法（Sanger等（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467）和Messing等（1981，Nucl.Acids Res.9，309-321）所述的弹枪式实验法，对质粒PAF2-3、PAF2-6和PAF2-7的插入物的核苷酸序列进行了全面测定。此外，在排列顺序的过程中，基于得到的核苷酸序列的资料合成了特殊的低聚核苷酸。

包括染色体植酸酶基因座位的克隆PAF2-3、PAF2-6和PAF2-7的全部核苷酸序列汇编于图6，图7给出了图示代表。

对全序列的蛋白质编码容量的分析揭示了成熟蛋白质的N-末端氨基酸序列是从核苷酸381位开始编码（Ullah公开的N-末端位于369位）。更进一步的说，发现36KDa和2.5KDa内肽片段的N-末端氨基酸序列（见图1B-序列B和A）分别在核苷酸的1101和1548位编码。开放解读密码终止于核苷酸的1713位。

这些发现清楚地证明特征染色体位置是含编码植酸酶DNA序列的同一物。

在编码成熟的植酸酶蛋白质的染色体序列的正上游，在与成熟蛋白质开放解读密码相接的开放解读密码中没有发现ATG起始密码子，但是使用内含子-外显子边界特性，可以假定在核苷酸的254和355位之间有一内含子，在带成熟植酸酶编码解读密码的密码中的核苷酸210位有ATG密码子。由该N-末端扩展衍生的氨基酸序列完全符合VonHeyne（1983，Eur.J.BioCnem.133，17-21）公开的分泌标记序列的规则。

为了验证这些假说，由特殊的植酸酶引物和将全体mRNA/cDNA群作模板通过PCR-放大作用将植酸酶cDNA按下面所述的方法分离出来。

从Aapergillus ficuum中分离多聚A+RNA

从在如实施例6中的诱导条件下生长的A.ficuum NRRL3135中分离出全部RNA。将干燥菌丝体用液氮冷冻并研磨。然后，在3M LiCl、6M尿素中在0℃将该粉末在Ultra-Turrax上进行均化（全速进行一分钟），并在4℃保持一夜，如Auffrey和Rougeon（Eur.J.Biochem.，107，303-314，1980）所述。在以16000g离心力下离心30分钟并用苯酚∶氯仿∶异戊醇（50∶48∶2）连续进行两次萃取后获得了全部细胞的RNA。用乙醇使该RNA沉淀，并溶于1ml的10mM Tris-HCl（PH7.4）、0.5%SDS中。为选择多聚A⁺，将全部RNA样品在60℃加热5分钟，调整到0.5M NaCl，然后施用于低聚（Oligo）（dT）-纤维素柱中。经含有10mM Tris-HCl PH 7.4、0.5%SDS和0.1M NaCl溶液的几次洗涤后，用10mM Tris-HCl PH7.4和0.5%SDS洗脱，收集到多聚A⁺RNA。mRNA/cDNA复合体的制备

为合成第一cDNA链，将5μg的多聚A⁺RNA溶于16.5μl H₂O中，并加入以下成份：2.5μl Rnasin（30U/μl）、10μl含50mM Tris-HCl PH7.6、6mM MgCl₂和40mM KCl的缓冲液;2μl 1M KCl;5μl 0.1MDTT;0.5μl Oligo（dT）12-18（2.5mg/ml）;5μl 8mM dNTP-mix;5μl BSA（1mg/ml）和2.5μl Moloney MLV反转录酶（200U/ml）。将混合物在37℃培养30分钟，通过加入10μl 0.2M EDTA和50μl H₂O使反应终止。用氯仿进行萃取，在离心后，向上清液中连续加入110μl 5M NH₄AC和440μl C₂H₅OH。在干冰/C₂H₅OH溶液中进行mRNA/cDNA复合体的沉淀30分钟。通过离心收集mRNA/cDNA，然后用70%冰冷C₂H₅OH洗涤并溶于20μl H₂O中。

植酸酶cDNA片段的克隆

cDNA编码植酸酶序列的分离是通过两个片段中的聚合酶链反应（PCR）来实现的。基于如图6所示的基因组的植酸酶序列设计了4个合成的低聚核苷酸引物。

Oligo1:5＇-GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.

GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.CTA -3＇

Oligo2:5＇-AGT.GAC.GAA.TTC.GTG.CTG.

GTG.GAG.ATG.GTG.TCG -3＇

Oligo3:5＇-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.

TCC -3＇

Oligo4:5＇-AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.

GTG.ATT.GTT.TAA.AGG.G -3＇

Oligo 1含有植酸酶ATG起始密码子（210位至231位）下游的核苷酸序列，位在5′侧面，由Eco RI部位邻接;Oligo2含有Sal I部位（1129位至1109位）上游紧邻的核苷酸序列，也由附加的Eco RI部位相接;Oligo 3含有绕Bam HI部位（845位至865位）的核苷酸序列和Oligo 4含有位于植酸酶结尾密码子下游（1890位至1867位）的核苷酸序列，由附加的Pst I部位相接。

按Taq-聚合酶供应厂商（Cetus），进行聚合酶链反应。使用含有mRNA/cDNA杂种（如上面所述）的溶液（1.5μl作为模板，并以各为0.3μg的Oligo 1和2作为放大N-末端植酸酶cDNA部分的反应中的引物，以各为0.3μg的Oligo3和4作为放大C-末端植酸酶cDNA部分的反应的引物（见图8）。在变性（在100℃7分钟）和加入2μ Taq-聚合酶后，该反应混合物在PerKin-Elmer/Cetus的DNA-放大器中经受25个放大循环（各为：在55℃2′，在72℃3′，在94℃1′）。在最后的循环中，省出了变性步骤。在消化作用后（对N-末端cDNA部分由EcoRI，对C-末端cDNA部分由BamHI和BstI在适宜的PTZ18R（Promega）位置上将两种cDNA片段克隆。

采用二脱氧链末端技术（Sanger，supra），对得到的两种PCR片段测定核苷酸序列，在染色体植酸酶基因序列后使用设计的合成低聚核苷酸作引物，使用全部放大的DNA以及克隆cDNA片段做模板。在图8中给出了对植酸酶蛋白质进行编码的cDNA区的序列和植酸酶蛋白质衍生氨基酸序列。

cDNA序列验证了上面假设的内含子的取位，并且表明在染色体基因序列中不存在其它内含子。

植酸酶基因对467氨基酸（MW51091）的初级转译产物进行编码;通过断裂标记肽处理初级转译产物就得到了444（MW48851）或448（含有如Ullah公开的头四个N-末端氨基酸，MW49232）氨基酸的成熟植酸酶蛋白质。

实施例9

通过引入附加植酸酶基因组DNA复制品在Aspergilli中对植酸酶的过表达

建立表达载体PAF2-2S

采用标准生物学方法，做出全部表达体，如Maniatis等分子克隆、实验室指南、（Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.）所述。

通过在PUC19的Sma I位置将植酸酶基因组的克隆λAF201的6kb PvuⅡ DNA片段亚克隆制备出表达载体PAF2-2S。衍生的质粒命名为PAF2-2（图4）。作为向Aspergillus转化的选择标记，在PAF2-2的Eco RI/Kpn I位置插入含有同系的Aspergillus nidulans amd S基因的质粒PGW325的Eco RI/KpnI DNA片段（Wernars K.（1986），学位论文，农业大学，The Netherlands）得到的表达载体命名为PAF2-2S，并示于图9。

A.在A.ficuum NRRL3135中植酸酶的过表达

采用的转化方法是在A.ficuum NRRL3135中引入质粒PAF2-2S，如Tilburn，J.等（1983）基因26，205-221以及Kelly，J.和Hynes，M.（1985）EMBOJ.，4，475-479所述，其中有以下修改：

-在添加有10mM精氨酸和10mM脯氨酸的Asperillus最低限度培养介质（Cove，D.（1966）Biochem.Biophys.Acta 113，51-56）中，在30℃，在转速为300rpm的摇瓶上将菌丝体生长16小时;

-只有Novozym 234（Novo Industri）而没有helicase用于生成原生质体;

-在原生质体形成90分钟后，在原生质体悬浮液中加入1体积的STC缓冲液（1.2M山梨糖醇，10mM Tris-HCl PH7.5，50mM CaCl₂），并在浮桶式转头离心机上，在4℃以2500g离心力离心10分钟。洗涤原生质体并在STC缓冲液中以10⁸细胞/ml的浓度重新成为悬浮液;

-在TE缓冲液（10mM Tris-HCl PH7.5，0.1mM EDTA）中，以10μl的体积添加质粒DNA，直至成为100μl的原生质体悬浮液;

-在0℃将DNA-原生质体悬浮液培养25分钟后，滴加200μl的PEG溶液（25%PEG4000（Merck）、10mM Tris-HCl、PH7.5、50mM CaCl₂）。然后，缓慢加入1ml PEG溶液（60%PEG4000在10mM Tris-HCl PH7.5，50mM CaCl₂中），用试管反复混合。在室温条件下培养后，用STC缓冲液稀释该悬浮液，通过翻转进行混合，并在4℃以2000g的离心力离心10分钟。将原生质体在200μl STC缓冲液中轻轻地重新悬浮，并沉积在以10mM乙酰胺为唯一氮源并含有15mM CsCl、1M蔗糖的Aspergillus最低限度培养介质上，用0.75%细菌学琼脂＃1（Oxoid）固化。在33℃条件下生长进行6-10天。

对命名为sp4、sp7和sp8的单一转化物进行分离、纯化并在摇瓶中测试其植酸酶产量，采用在实施例1和2中所述的方法。作为对照，对只含有载体（amds基因在PUC19中）以及未转化的寄主也进行了测试。

菌株在诱导条件下生长（见实施例6），并在生长进行96小时后提取样品。通过测定植酸酶活性（表4）和等电点聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）来进行分析。

从A.ficuum和A.ficuum PAF2-2S sp7的发酵物中提取相同体积的样品，在同一条件下生长，并涂布在IEF-PAGE凝胶（PH4.5-6，phast体系，pharmacia）上。按生产厂家的说明书进行电泳。然后，或用一般蛋白质着色Coomasse亮兰着色（图10B），或用一般磷酸酯酶活性着色法着色，如实施例2所述（图10A）。

纯化至呈均一性（通过如实施例7所述的免疫亲和色谱法）的A.ficuum植酸酶样品，同样或单独或与培养物上清液混合在一起进行涂布。

在多种样品中植酸酶以数种异构体（以星号表示）存在，如本发明已经提到的。在采用两种着色方法（A和B）的纯化的植酸酶中在带3和4中有明显可见的两种主要同功酶。在亲代A.ficuum菌株中植酸酶带免强可见，而在PAF2-2S sp7转化体菌株中有显著的增强。

表4

通过A.ficuum NRRL3135的转化增加植酸酶的产量

菌株植酸酶活性（U/ml）

A.ficuum 0.6

A.ficuum+对照质粒 0.6

A.ficuumPAF 2-2S sp8 7.6

A.ficuumPAF 2-2S sp7 6.7

A.ficuumPAF 2-2S sp4 4.3

B.在黑曲霉CBS513.88.中植酸酶的过表达

通过如对A.ficuum所述的转化方法，将表达载体PAF2-2S也引入到黑曲霉CBS513.88中。将单一转化物分离、纯化并在摇瓶中在诱导生长条件下测试其植酸酶产量，如实施例6所述。

对一些转化物（命名为黑曲霉PAF2-2S＃8、＃20和＃33）和对照菌株的植酸酶表达值按如实施例9A所述进行，并示于表5。

黑曲霉转化物具有与A.ficuum转化物相类似的植酸酶表达值。这一结果还表明A.ficuum植酸酶启动基因在黑曲霉中是有活性的。

通过在phast系统（Pharmacia）PH范围为4.5-6的IEF-PAGE凝胶上进行电泳对转化物PAF2-2S＃8的培养介质进行进一步的分析，如上面所述。将在相同条件下生长的、相同体积的黑曲霉亲代菌株培养物上清液和转化物PAF2-2S＃8，涂布在凝胶上。所述凝胶的操作和此后的着色如上面所述。

亲代黑曲霉生成的植酸酶的量很少，通过凝胶电泳不能检测到。菌株PAF2-2S＃8生成约多90倍的植酸酶，这一差别在图11中明显可见。

检测到植酸酶的几种异构体（由星号表示）。一般蛋白质着色表明，植酸酶蛋白质带的强度有显著的增强，并没有出现其它主要蛋白质带。

表5

通过用PAF2-2S转化黑曲霉CBS513.88生产植酸酶

菌株植酸酶活性（U/ml）

黑曲霉 0.2

黑曲霉+对照质粒 0.2

黑曲霉PAF2-2S＃8 14

黑曲霉PAF2-2S＃33 5

黑曲霉PAF2-2S＃20 4

实施例10

植酸酶在由表达载体转化的黑曲霉中的表达，所述的表达载体含有熔接在启动基因和/或黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶（AG）基因上的标记序列的A.ficuum植酸酶基因。

表达载体的建立

为了得到植酸酶在黑曲霉中的过表达，衍生出附加的表达盒，其中A.ficuum植酸酶基因受与不同标记序列组合在一起的黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶（AG）启动基因的控制。在P18FYT3和P24FYT3中，来自黑曲霉中的各自的AG基因18和24氨基酸（aa）前导序列熔接在编码成熟蛋白质的植酸酶基因片段上。在表达盒PFYT3中，AG启动基因序列熔接在包括植酸酶前导序列的植酸酶编码序列上。

P18FYT3的建立

通过聚合酶链反应方法实现AG-启动基因和18aa AG-前导序列在编码成熟蛋白质的植酸酶序列上的熔接。在PCR反应中使用了两种不同的模板：含有如上所述的全部植酸酶基因的PAF2-2S和含有来自黑曲霉的全部AG-座位的质粒PAB6-1，后者是从黑曲霉质粒库中分离出来的，它含有PUC19中的13-15kb Hind Ⅲ片段。在分离过程中，使用了AG-特殊Oligos：

AG-1:5＇-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACAT

TGTTTGGCCC-3＇

AG-2:5＇-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3＇

两种都是基于黑曲霉公开的核苷酸序列（Boel等（1984）EMBOJ.3，1097-1102;Boel等（1984），Mol.and Cell.Biol，4，2306-2315）。从围绕内含子2的序列中衍生出的低聚核苷酸探针：Oligo AG-1位于内含子的3′，并且具有与AG mRNA相同的极性，Oligo AG-2发现其位于内含子2的上游并选择为与AG mRNA反向平行。质粒PAB6-1在14.5kb Hind Ⅲ片段上含有AG基因（见图12）。

作为PCR-放大作用的引物，设计了具有下述序列的四种合成低聚核苷酸：

Oligo 1:5＇-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3＇

(围绕ATG初始密码子上游约250bp Eco R I

位，有－AG-特殊序列）。

Oligo 18-2:5＇CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACC

CTGTGCAGAC-3＇成熟植酸酶

Oligo 18-3:5＇-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGT

CCCCGCCTCG-3＇18aaAG－前导物

成熟植酸酶

Oligo 4:5＇ -GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3＇（取位

在BamH I位置在861位的植酸酶特殊序列）

如Saiki等，（1988），科学239，487-491所述进行PCR，其中进行小的修改（见实施例8）。

为将AG序列熔接在植酸酶编码序列上，进行了两个独立的PCR：第一反应以PAB6-1为模板，以Oligo 1和18-2为放大含有AG启动基因的3′一部分的300bp DNA片段及18aa AG-前导序列的引物，该序列在3′一侧面与植酸酶基因的核苷酸连接，第二个反应以PAF2-2S为模板，以Oligo 18-3和4为放大600bp DNA片段的引物，所述片段含有植酸酶基因的5′部分，该基因在5′一侧面与AG标记肽的18核苷酸连接。图13给出了这些放大作用的示意图。

通过凝胶电泳和C₂H₅OH沉淀纯化产生的两种DNA片段，并在三个PCR中将其用作模板，以Oligo 1和4产生AG-植酸酶熔接的引物。用Eco RI和Bam HI消化所得到的DNA片段，并将其亚克隆在PTZ18R中。所得到的熔接为排列顺序并命名为P18FYT1。

通过对PAB6-1由Kpn 1并部分地由Eco RI消化得到了AG-启动基因余下的（3.5kb）上游区，并将其接到P18FYT1的1.1kb EcoR1/Bam HI片段上，然后克隆在PTZ18R的Kpn1/Bam HI部位中。如此获得的质粒P18FYT2示于图15。

通过在PAF2-2S的Eco RI-部位（位于amds-基因侧面）中插入合成片段：

5＇AATTCAAGCTTG3＇

3＇ GTTCGAACTTAA5＇

引入了附加的HindⅢ限制性部位。将所得的质粒命名为PAF2-2SH（图14），并用作通过PCR AG-植酸酶熔接DNA片段，以交换植酸酶启动基因序列的起始质粒。

对最后的建立步骤，用Kpn I并部分地用Bam HI消化P18FYT2和PAF2-2SH。将P18FYT2的4.6kbDNA片段和PAF2-2SH的11kb DNA片段分离出来，并通过凝胶电泳纯化，然后连接并转移到E.Coli上。衍生的表达盒命名为P18FYT3（图15）。

P24FYT3的建立

按上述建立P18FYT3的方法，通过PCR放大作用，进行AG-启动基因和24aaAG前物序列熔接到成熟植酸酶编码序列上，只是所用的引物有变化。合成了具有以下序列的两种新引物：

Oligo24-2:5＇-CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGG

AAATCACATT-3＇

Ooigo 24-3:5＇-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGT

CCCCGCCTCG-3＇

进行两个独立PCR：第一个反应用PAB6-1做模板，以Oligo1和24-2作为放大318bp DNA片段的引物，所述的片段含有AG-启动基因的3′-部分和24aaAG前物序列，所述序列在3′侧面由植酸酶基因的18个核苷酸连接，第二个反应以PAF2-2S作模板，以Oligo 24-3和4作为放大DNA片段的引物，该片段含有植酸酶基因的5′一部分，该基因在5′一侧面由24aaAG前物的18个核苷酸连接。图13给出了这些放大作用的示意图。

为通过中间产物质粒P24FYT1和P24FYT2建立最终表达盒P24FYT3，使用了与所述的从P18FYT1和P18FYT2衍生出表达盒P18FYT3相同的克隆途径/方法（图15）。

PFYT3的建立

通过PCR-放大作用实现AG-启动基因与植酸酶基因（包括植酸酶前物）序列的熔接，与上述建立P18FYT3的方法相同，只是所用的前物不同。制备出具有下述序列的两个附加引物：

Oligo fyt -2:5＇-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGG

TGTAATGATG-3＇

Oligo fyt-3:5＇CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGT

CTCTGCTGTT-3＇

AG-启动基因植物酶引物

进行两个独立的PCR：第一个反应以PAB6-1为模板，以Oligos1和fyt-2为放大282bp DNA片段的引物，该片段含有AG启动基因的3′一部分，所述的启动基因在3′一侧面由植酸酶引物的18个核苷酸连接，第二个反应以PAF2-2S为模板，以Oligos fyt-3和4为放大DNA-片段的引物，该片段含有植酸酶基因（包括植酸酶前物）的5′一部分并且在5′一侧面由AG-启动基因的18个核苷酸连接。图13给出了这些放大作用的示意图。

为了通过中间产物质粒PFYT1和PFYT2建立最终表达盒PFYT3，使用了与从P18FYT1和P18FYT2衍生出表达盒P18FYT3相同的克隆途径/方法（图15）。

受黑曲霉中AG启动基因控制的植酸酶基因的表达

通过Hind Ⅲ消化从植酸酶上述的表达盒中除出E.Coli序列之后，按照实施例9所述的方法由10μg DNA片段对黑曲霉菌株CBS513.88（保藏日1988年10月10日）进行转化。从每个表达盒中分离出单一的黑曲霉转化物，将孢子在选择性乙酰胺-琼脂板上划线。从细胞中收集每种转化物的孢子，所述的细胞在0.4%土豆-右旋葡萄糖（Oxoid England）琼脂板上在37℃条件下生长3天。在下述生长条件下在摇瓶上测试植酸酶的产量：

将约1×10⁸个孢子在100ml预培养介质中接种，所述的介质含有每升：1g KH₂PO₄;30g麦芽糖;5g酵母提取物;10g酪蛋白-水解产物;0.5g MgSO₄·7H₂O和3g Tween 80。其PH调整至5.5。

在旋转振动器上在34℃生长一夜后，将1ml生长培养物接种在100ml主培养介质中，所述的培养介质含有（每升）：2gKH₂PO₄;70g麦芽糖糊精（Maldex MDO₃，Amylum）;12.5g酵母一提取物;25g酪蛋白-水解产物;2gK₂SO₄;0.5gMgSO₄·7H₂O;0.03gZnCl₂;0.02gCaCl₂;0.05gMnSO₄·4H₂O和FeSO₄。其PH调节至5.6。

该菌丝体至少生长140小时。按实施例2所述测定植酸酶产量。表6所示为从每种表达盒得到的几种随机转化物的产量结果。

表6

由含A.ficuum植酸酶基因的质粒，在黑曲霉AG-启动基因与不同前物序列组合控制下，对几种黑曲霉CBS513.88菌株进行转化的植酸酶制备。

表达盒转化物植酸酶活性

（U/ml）

P18FYT3＃240 82

P18FYT3 P18FYT3＃242 84

（AG-启动基因/ P18FYT3＃243 62

18aaAG-前物） P18FYT3＃244 43

P18FYT3＃245 80

P18FYT3＃246 82

P18FYT3＃250 110

P24FYT3＃256 8

P24FYT3＃257 30

P24FYT3 P24FYT3＃258 13

（AG-启动基因/ P24FYT3＃259 33

24aaAG-前物） P24FYT3＃260 17

P24FYT3＃261 28

P24FYT3＃262 18

P24FYT3＃265 12

PFYT3＃205 50

PFYT3＃282 280

PFYT3 PFYT3＃299 96

（AG-启动基因/ PFYT3＃302 220

植酸酶前物） PFYT3＃303 175

PFYT3＃304 150

PFYT3＃305 150

PFYT3＃312 140

从该数据清楚地表明，在含植酸酶基因的黑曲霉转化物中，在黑曲霉启动基因的控制下，植酸酶的表达值很高。从数据中还看出，从PFYT3表达载体获得了最高植酸酶产量，所述的载体含有植酸酶前物序列。含有无内含子植酸酶基因的相似表达载体在转化至黑曲霉后，得到了与黑曲霉PFYT3转化物相当的植酸酶表达值。

还有，对转化物PFYT3＃205和＃282的培养物上清液在IEF-PAGE凝胶上，以PH4.5-6进行了电泳。将在相同条件下生长的、相同体积的黑曲霉亲代菌株培养物上清液和两种转化物涂布在凝胶上，操作和以后的着色如实施例9所述。亲代黑曲霉产生的植酸酶的量少，在本实验中不能检测出来。菌株PFYT3＃205和＃282产生的植酸酶多约250和1400倍（与表4和5的植酸酶值相比），这一差别在图11中清楚可见。检测到植酸酶的几种异构形式（以星号表示）。一般蛋白质着色表明，植酸酶蛋白质带的强度有明显增强，同时也没有其它主要蛋白质带出现。

实施例11

植酸酶在以工业规模生长的A.ficuum和黑曲霉中的过表达A.A.ficuum

按实施例1所述生长菌株A.ficuum PAF2-2S＃4和A.ficuum NRRL3135。与野生型菌株相比，该转化物产生的植酸酶约多50倍。

表7

通过含多植酸酶基因的A.ficuum的转化物对植酸酶的过表达。细胞的生长如实施例1所述。

接种后植酸酶活性（U/ml发酵液）

小时 A.ficuum NRRL3135 A.ficuum PAF2-2S＃4

0 0 0

24 0 0

92 2 142

141 5 270

B.黑曲霉

菌株黑曲霉PAF2-2S＃8、黑曲霉菌株CBS513.88的转化物和亲代黑曲霉菌株自身按实施例1所述方法进行生长。与原始黑曲霉亲代菌株相比，转化物生成的植酸酶约多1000倍（表8）。

表8

通过含多植酸酶基因的黑曲霉的转化物对植酸酶的过表达。细胞的生长按实施例1所述的方法。

接种后植酸酶活性（U/ml发酵液）

小时黑曲霉CBS513.88 黑曲霉PAF2.2＃8

0 0 0

24 0 5

92 0.1 65

141 0.1 95

实施例12

为了建立载体PREPFYT3，通过该载体可获得同步植酸酶表达和AG基因置换，将PFYT3用Kpn I消化。得到的线性Kpn I DNA片段，实现两个独立的连接。

通过KpnⅠ-HindⅢ连接物的连接1：

5＇－CGGGGA -3＇

3＇-CATGGCCCCTTCGA-5＇

Kpn I HindIII

通过KpnⅠ-HindⅢ^＊连接物的连接2，其中HindⅢ限制性部位在连接后不再恢复：

5＇-CGGGGG -3＇

3＇-CTAGGCCCCCTCGA-5＇

Kpn I Hind III^*

随后，由HindⅢ对连接1进行部分消化。通过凝胶电泳除去含amd S片段后，将余下的DNA片段通过连接进行重新成环，并转移至E.Coli中。所得到的质粒用PFYT3amd S表示（见图16）。

对连接2也用HindⅢ进行消化，通过凝胶电泳将含amd S基因的4kb DNA HindⅢ/HindⅢ^＊片段分离出来，然后将其连接到由HindⅢ部分消化的PFYT3amd S上，并转移到E.Coli中。在植酸酶基因的3′端含amd S基因的质粒用PFYT3INT表示（见图17）。

为了将含3′-侧面AG序列的PAB6-1的约6kb SalⅠ/HindⅢ DNA片段引入，将PFYT3INT用HindⅢ进行部分消化，先连接到连接物：

5＇-AGCTAGGGGG -3＇

3＇- TCCCCCCAGCT-5＇

Hind III^*Sal I

（其中HindⅢ^＊限制性部位在连接后不再恢复）上，然后与PAB6-1的SalⅠ/HindⅢ片段连接。在转化至E.Coli后，就获得所需要的在正确位置上含有3′AG侧面序列的质粒PREPFYT3（图18）。

通过AG基因置换，植酸酶在黑曲霉中的表达

在用PREPFYT3转化黑曲霉之前，通过HindⅢ消化和凝胶电泳将质粒中的E.Coli序列除去。采用实施例9所述的方法用10μg DNA片段对黑曲霉菌株CBS513.88进行转化。转化物的选择和生产按实施例9所述的方法。只有稀少的选择转化物失去AG活性（约20%）。在AG负和植酸酶正转化物上进行染色体DNA的Soutern分析，以验证AGA基因确实被植酸酶基因取代。

实施例13

植酸酶基因在不同菌种中的保藏

为了确定在微生物种中植酸酶基因是否能完好保藏，用A.ficuum植酸酶cDNAR作探针，对来自10个不同种的染色体DNA进行Soutern分析。

这些染色体DNA分析在来自线状真菌、酵母和细菌的种上进行。例如，从每组中只选出有限的数种：对线状真菌，黄青霉和黑曲霉;对酵母，啤酒酵母和Kluyveromyces lactis;对原核生物格兰氏-阳性种，枯草杆菌、clostridum thermocellum和Streptomyces lividans以及举例来说对格氏阴性细菌绿浓杆菌。

对来自这些种的高分子量染色体DNA由PvuⅡ和BamHI分别进行消化，然后在0.7%琼脂糖凝胶上进行电泳。

在转移到硝化纤维素过滤器中后，在低强度下（6×ssc;50℃）与³²P-标记5′-植酸酶cDNA片段进行一夜的杂交（如实施例8所述）。在室温将吸印在6×ssc中洗涤，并在X-光下曝光18小时。

如图19a和b所示，在几乎每一通道上都可观察到不连续的带，预示在微生物种中植酸酶基因有高度的均一性。

Claims

1、一种经纯化并分离出的DNA序列，其特征在于所述的DNA序列能对具有植酸酶活性的肽和蛋白质编码。

2、如权利要求1所述的经纯化并分离出的DNA序列，其特征还在于所述的序列是从微生物源中衍生出来的。

3、如权利要求1所述的经纯化并分离出的DNA序列，其特征还在于所述的序列是从真菌源中衍生出来的。

4、如权利要求1所述的经纯化并分离出的DNA序列，其特征还在于所述的序列是从曲霉源中衍生出来的。

5、如权利要求1所述的经纯化并分离出的DNA序列，其特征还在于所述的序列是从Aspergillus ficuum或黑曲霉源中衍生出来的。

6、如权利要求1所述的经纯化并分离出的DNA序列，所述的序列对表现出如下特征的植酸酶进行编码：

a）当在曲霉寄主中进行表达时，在SDS-PAGE上具有在85KDa处的单一带;

b）在去糖基化后表观分子量的范围为约48-56.5KDa;

c）具有约100U/mg蛋白质的比活性。

7、一种经纯化并分离出的DNA序列，其特征在于所述的序列至少表现出一种下述特征：

a）与低聚核苷酸探针杂交，所述的探针是从如图6中公开的DNA序列衍生出的;

b）与低聚核苷酸探针杂交，所述的探针是从图8中公开的cDNA序列衍生出的。

8、一种表达体，其特征在于将权利要求1-7所述的任一种DNA序列与调节区实现连接，所述的调节区能直接表达在适宜的表达寄主中具有植酸酶活性的蛋白质或肽。

9、如权利要求8所述的表达体，其特征还在于调节区还含有分泌前物序列，所述的序列用于具有植酸酶活性的经表达的蛋白质或肽的分泌。

10、如权利要求9所述的表达体，其特征在于使用AG启动基因直接表达具有植酸酶活性的蛋白质或肽。

11、如权利要求10所述的表达体，其特征还在于使用同系的植酸酶前物序列，用于具有植酸酶活性的经表达的蛋白质或肽的分泌。

12、如权利要求10所述的表达体，其特征还在于使用18氨基酸AG前物序列用于具有植酸酶活性的经表达的蛋白质或肽的分泌。

13、如权利要求10所述的表达体，其特征还在于24氨基酸AG前物序列用于具有植酸酶活性的经表达的蛋白质或肽的分泌。

14、如权利要求9所述的表达体，其特征在于使用同系植酸酶启动基因来直接表达具有植酸酶活性的蛋白质或肽。

15、如权利要求14所述的表达体，其特征还在于使用同系植酸酶前物序列用于具有植酸酶活性的经表达的蛋白质或肽的分泌。

16、如权利要求14所述的表达体，其特征还在于使用18氨基酸AG前物序列用于具有植酸酶活性经表达的蛋白质或肽的分泌。

17、如权利要求14所述的表达体，其特征还在于使用24氨基酸AG前物序列，用于具有植酸酶活性的经表达的蛋白质或肽的分泌。

18、一种能够转化寄主细胞的载体，其特征在于所述的载体含有如权利要求8-17所述的任一种表达体。

19、如权利要求18所述的载体，其特征还在于所述的载体是质粒。

20、如权利要求18所述的载体，其特征还在于所述的载体是选自下述的组中的质粒，所述的组由PAF28-1、PAF2-2S、PAF2-2、PAF2-3、PAF2-4、PAF2-6、PAF2-7、P18FYT3、P24FYT3和PFYT3所组成。

21、一种转化寄主细胞，其特征在于所述的寄主细胞由权利要求18-20所述的任一种载体进行转化。

22、如权利要求21所述的转化寄主细胞，它从由细菌、酵母菌和真菌组成的组中选择。

23、如权利要求22所述的转化的寄主细胞，它由曲霉、木霉菌属、青霉菌、毛霉、芽孢杆菌属、Kluyveromyces和酵母菌属所组成的组中选择。

24、如权利要求22所述的转化的寄主细胞，它选自下述的组，所述的组由黑曲霉、Aspergillus ficuum、泡盛曲霉、米曲霉、Tricnoderma reessi、Mucor miehei、Kluyveromyces lactis、酿酒酵母、枯草杆菌和地衣型芽胞杆菌组成。

25、一种生产具有植酸酶活性的肽或蛋白质的方法，其特征在于在指向生产所述具有植酸酶活性肽或蛋白质的条件下，培养如权利要求21-24的任一项所述的转化的寄主细胞。

26、一种具有植酸酶活性的肽或蛋白质，其特征在于所述的具有植酸酶活性的肽或蛋白质是通过如权利要求25所述的方法生产的。

27、一种植酸酶，其特征在于该植酸酶表现出如下特征：

a）当在曲霉寄主中表达时，在SDS-PAGE上，在85KDa处具有单一的带;

b）在去糖基化后表观分子量的范围约为48-56.5KDa;

c）比活性约为100U/mg蛋白质。

28、一种用于动物的饲料，其特征在于所述的饲料含有如权利要求26和27任一项所述的具有植酸酶活性的肽或蛋白质。

29、如权利要求26和27任一项所述的具有植酸酶活性的肽或蛋白质，用于将植酸盐转化成肌醇和无机磷酸盐的用途。

30、一种促进动物生长的方法，其特征在于饲喂动物的食物包括添加有如权利要求26和27任一项所述的植酸酶的饲料。

31、一种降低动物粪便中植酸酶盐值的方法，其特征在于饲喂动物的食物包括添加有如权利要求26和27任一项所述的植酸酶的饲料，植酸酶的添加量为能有效的将饲料中所含的植酸盐转化成肌醇和无机磷酸盐。