PT2335501T - Alimento animal contendo fitase e método - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ALIMENTO ANIMAL CONTENDO FITASE E MÉTODO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método de melhoria do valor nutricional de um alimento. Mais particularmente, a invenção refere-se a um método de melhoria do valor nutricional de um alimento compreendendo hexaquisfosfato de mio-inositol fornecendo o alimento a um animal em combinação com uma fitase expressa em levedura.

Em particular, a invenção é dirigida a um método de reduzir a razão de ração para ganho de peso de um animal de espécie aviária fornecendo ao animal um alimento, em que o alimento compreende hexaquisfosfato de mio-inositol.

ANTECEDENTES E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As fitases são fosfo-hidrolases de hexaquisfosfato de mio-inositol que catalisam a remoção, passo a passo, de ortofosfato inorgânico de fitato (hexaquisfosfato de mio-inositol). 0 fitato é a principal forma de armazenamento de fosfato em rações vegetais, incluindo cereais e legumes. Devido a animais monogástricos, tais como porcos, aves e humanos, possuírem pouca fitase nos seus tratos gastrointestinais quase todo o fosfato de fitato ingerido é indigesto. Como consequência, estes animais necessitam de suplementação das suas dietas com fitase ou fosfato inorgânico. Pelo contrário, os ruminantes possuem micro-organismos no rúmen que produzem fitases e estes animais não necessitam de suplementação de fitase das suas dietas. 0 fosfato de fitato não utilizado em animais monogástricos cria problemas adicionais. 0 fosfato de fitato não utilizado é excretado em estrume e polui o ambiente. Além disso, em animais monogástricos, o fitato passa, em grande parte, intacto através do trato gastrointestinal superior onde este quela minerais essenciais (e. g., cálcio e zinco), liga aminoácidos e proteínas e inibe atividades enzimáticas. Em consequência, a suplementação de fitase das dietas de animais monogástricos não diminui apenas os requisitos para suplementação com fosfato inorgânico, mas também reduz a poluição do ambiente provocada por fitato, diminui os efeitos antinutricionais de fitato e aumenta o valor nutricional da ração.

Existem dois tipos de fitases incluindo uma 3-fitase (EC.3.1.3.8) que remove grupos fosfato nas posições 1 e 3 do anel mio-inositol e uma 6-fitase (EC.3.1.3.6) que liberta, em primeiro lugar, o fosfato na posição 6 do anel. As plantas contêm, normalmente, 6-fitases e uma vasta gama de micro-organismos, incluindo bactérias, fungos filamentosos e leveduras, produzem 3-fitases. Duas fitases, phyA e phyB de Aspergillus niger, foram clonadas e sequenciadas. A PhyA foi expressa em Aspergillus niger e a enzima recombinante está comercialmente disponível para utilização em suplementação de dietas animais.

Os genes de fitase foram também isolados de Aspergillus terreus, Myceliophthora thermophila, Aspergillus fumigatus, Emericella nidulans, Talaromyces thermophilus, Escherichia coli (appA) e milho. Além disso, as enzimas fitase foram isoladas e/ou purificadas de Bacillus sp., Enterobacter sp., Klebsiella terrigena e Aspergillus ficum. 0 documento WO 01/36607 divulga uma fosfatase/fitase ácida mutante isolada com propriedades enzimáticas melhoradas, que é útil em composições alimentares animais. O documento WO 99/49740 divulga ração de baixo fitato para animais, suplementada com uma fitase. A fitase exemplificada é Natuphos. O elevado custo de produção de fitase restringiu a utilização de fitase na indústria pecuária, uma vez que suplementos de fitase são, de um modo geral, mais caros do que os suplementos fosforosos inorgânicos ambientalmente desejáveis. O custo de fitase pode ser reduzido intensificando a eficiência de produção e/ou produzindo um enzima com atividade superior.

Os sistemas de expressão de levedura podem ser utilizados para produzir eficazmente enzimas, em parte, uma vez que as leveduras são cultivadas em meios simples e baratos. Além disso, com uma sequência sinal apropriada, a enzima expressa pode ser secretada no meio de cultura para isolamento e purificação conveniente. Alguns sistemas de expressão de levedura são também aceites na indústria alimentar como sendo seguros para a produção de produtos alimentares ao contrário de sistemas de expressão de fungos que podem, em alguns casos, ser inseguros, por exemplo, para fabrico de alimentos humanos.

Numa forma de realização, é proporcionado um método de reduzir a razão de ração para ganho de peso de um animal de espécie aviária fornecendo ao animal um alimento em que o alimento compreende hexaquisfosfato de mio-inositol. 0 método compreende o passo de alimentar ao animal o alimento em combinação com uma fitase expressa em levedura, em que a fitase é selecionada do grupo consistindo em AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante dirigido ao local de AppA derivada de Escherichia coli e, em que a razão de alimentação para ganho de peso do animal é reduzida. 0 método pode compreender o passo de alimentar ao animal o alimento em combinação com uma fitase expressa em levedura, em que a fitase é selecionada do grupo consistindo em AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante dirigido ao local de AppA derivada de Escherichia coli e, em que a massa óssea e teor mineral do animal são aumentados. 0 método pode compreender os passos de pulverizar uma fitase selecionada do grupo consistindo em AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante dirigido ao local de AppA derivada de Escherichia coli, misturando a fitase com um veiculo para a fitase e, de um modo opcional, outros ingredientes para produzir uma composição de aditivo alimentar para suplementar um alimento com a fitase, misturando a composição de aditivo alimentar com o alimento e alimentando o animal com o alimento suplementado com a composição de aditivo alimentar. 0 método pode compreender o passo de alimentar à espécie aviária o alimento em combinação com menos de 1200 unidades de uma fitase expressa em levedura por quilograma do alimento, em que a biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato é aumentada por, pelo menos, 1,5 vezes em comparação com a biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato obtido alimentando a uma espécie não aviária o alimento em combinação com a fitase expressa em levedura.

Em particular, é proporcionado um método de reduzir a razão de ração para ganho de peso de uma espécie aviária alimentando a espécie aviária com um alimento em que o alimento compreende hexaquisfosfato de mio-inositol. 0 método compreende o passo de alimentar à espécie aviária o alimento em combinação com uma fitase expressa em levedura em que a razão de alimentação para ganho de peso do animal é reduzida. 0 método pode compreender o passo de alimentar à espécie aviária o alimento em combinação com uma fitase expressa em levedura em que a massa óssea e teor mineral da espécie aviária são aumentados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra as sequências de aminoácidos e nucleotidicas de AppA2. A Fig. 2 mostra as sequências de aminoácidos e nucleotidicas de Mutante U. A Fig. 3 mostra o aumento de percentagem em fosfato biodisponivel in vivo em galinhas alimentadas com um alimento animal suplementado com Natuphos®, Mutante U, AppA ou AppA2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona 1. 0 método de reduzir a razão de alimentação para ganho de peso de um animal monogástrico fornecendo ao animal um alimento em que o alimento compreende hexaquisfosfato de mio-inositol, o método compreendendo o passo de alimentar o animal com o alimento em combinação com uma fitase de E. coli expressa em levedura, em que a razão de alimentação para ganho de peso do animal é reduzida, em que o animal é uma espécie aviária. 2. 0 método da forma de realização 1, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento. 3. O método das formas de realização 1 a 2, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com desde cerca de 50 a cerca de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento. 4. O método das formas de realização 1 a 2, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 1500 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento. 5. 0 método das formas de realização 1 a 2, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 1200 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento. 6. O método das formas de realização 1 a 5, em que a fitase possui uma atividade ótima a um pH de menos de cerca de 4. 7. O método das formas de realização 1 a 6, em que a fitase expressa em levedura é clivada com uma protease para intensificar a capacidade da fitase de reduzir a razão de alimentação para ganho de peso do animal comparada a fitase expressa em levedura intacta. 8. 0 método das formas de realização 1 a 7, em que a levedura é selecionada do grupo consistindo em espécies Saccharomyces, espécies Pichia, espécies Kluyveromyces, espécies Hansenula e espécies Candida. 9. Utilização de uma composição compreendendo hexaquisfosfato de mio-inositol em combinação com uma fitase de E. coli expressa em levedura, para alimentar uma espécie aviária para reduzir a razão de alimentação para ganho de peso. 10. Utilização da forma de realização 9, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento. 11. Utilização das formas de realização 9 a 10, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com desde cerca de 50 a cerca de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento. 12. Utilização das formas de realização 9 a 11. em que a levedura é selecionada do grupo consistindo em espécies Saccharomyces, espécies Pichia, Kluyveromycesspecies, espécies Hansenula e espécies Candida. A fitase pode ser selecionada do grupo consistindo em AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante dirigido ao local de AppA derivada de Escherichia coli. Para espécies aviárias, a fitase pode ser qualquer fitase, incluindo fitases selecionadas do grupo consistindo em AppA derivada de Escherichia coli, AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante dirigido ao local de AppA derivada de Escherichia coli. Em algumas formas de realização, a biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato, a razão de alimentação para ganho de peso e massa óssea e teor mineral são melhorados por, pelo menos, 2 vezes, por exemplo, numa espécie aviária, tal como aves, comparada à melhoria em valor nutricional obtida fornecendo o alimento em combinação com a mesma percentagem em peso de uma fitase expressa numa célula hospedeira de não levedura. Além disso, a biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato e a massa óssea e teor mineral obtidos alimentando uma espécie aviária com o alimento em combinação com a fitase expressa em levedura é aumentada por, pelo menos, 1,5 vezes comparada à biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato e à massa óssea e teor mineral obtidos alimentando uma espécie não aviária com o alimento em combinação com uma fitase expressa em levedura.

Como aqui utilizado "melhoria de valor nutricional" ou "valor nutricional aumentado" significa uma melhoria no valor nutricional de um alimento como refletido por um aumento na biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato, uma redução numa razão de alimentação para ganho de peso, um aumento em massa óssea e teor mineral, um aumento na biodisponibilidade de inositol a partir de fitato, um aumento na biodisponibilidade a partir de fitato de minerais, tais como magnésio, manganês, cálcio, ferro e zinco num animal alimentado com alimento.

Como aqui utilizado um aumento na "biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato" significa um aumento na disponibilidade de fosfato a partir de fitato como refletido por um aumento em ganho de peso ou peso de cinza óssea.

Como aqui utilizado a expressão "célula hospedeira de não levedura" inclui uma célula fúngica.

Como aqui utilizado, o termo "fitase" significa uma enzima capaz de catalisar a remoção de fosfato inorgânico de hexaquisfosfato de mio-inositol.

Como aqui utilizado, o termo "fitato" significa uma composição compreendendo hexaquisfosfato de mio-inositol.

De acordo com a invenção, a razão de alimentação para ganho de peso é calculada dividindo ganho de peso por ingestão de alimento. Um aumento em massa óssea ou teor mineral é refletido por um aumento no peso seco de ossos de tibia ou fibula ou por um aumento em peso de cinzas.

Uma variedade de genes de fitase pode ser expressa para produzir fitase para utilização de acordo com a invenção. Os exemplos de genes que podem ser utilizados de acordo com a invenção são genes de fitase derivados de bactérias, tais como os genes appA (número de acesso Gene Bank M58708) e appA2 (número de acesso Gene Bank 250016) derivados de Escherichia coli (E. coli) e o ou qualquer mutante dirigido ao local destes genes que mantém ou melhora atividade de fosfo-hidrolase de hexaquisfosfato de mio-inositol.

Os genes de fitase podem ser obtidos de E. coli isolada que apresenta atividade de fitase particularmente elevada. Como descrito abaixo, o gene appA2 foi clonado desse isolato de E. coli e é exemplificativo desse gene de fitase. O gene de fitase expresso é um gene heterólogo. Um gene heterólogo é aqui definido como um gene originário de uma espécie diferente das espécies utilizadas para expressão do gene. Por exemplo, no caso de expressão de um gene heterólogo de fitase, um gene de fitase derivado de E. coli pode ser expresso numa espécie de levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris. Um gene homólogo é aqui descrito como um gene originário da mesma espécie utilizada para expressão do gene. No caso de expressão de um gene homólogo de fitase, um gene de fitase derivado de Saccharomyces cerevisiae pode ser expresso, por exemplo, na mesma espécie de levedura.

Os genes exemplificativos para utilização na produção de fitase para utilização de acordo com a invenção são appA, appA2 e mutantes dirigidos ao local de appA ou appA2. Os genes de fitase substituídos, delecionados e truncados, em que a fitase expressa resultante ou um seu fragmento, mantém substancialmente a mesma atividade de fitase como as fitases especificamente exemplificadas aqui, são considerados equivalentes dos genes de fitase exemplificativos e estão dentro do âmbito da presente invenção . 0 gene appA foi isolado de E. coli (ver Patente US N° 6451572. 0 gene appA2 foi isolado de uma colónia bacteriana que apresenta atividade de fitase particularmente elevada obtida dos teores de cólon de porcos Hampshire-Yorkshire-Duroc híbridos (ver pedido de Patente US N° 09/540149). O AppA2 produto de proteína apresenta um pH ótimo entre cerca de 2,5 e cerca de 3,5. A sequência de aminoácidos de AppA2 é como mostrada nas SEQ ID N°: 2, 3 e 10. A Fig. 1 mostra as sequências de aminoácidos e nucleotídicas de AppA2. A região não traduzida é indicada por letras minúsculas. As sequências sublinhadas são os iniciadores utilizados para amplificar appA2 (Pfl: 1-22 e K2: 1468-1490), appA2 (E2: 243-252 e K2: 1468-1490). Os potenciais locais de N-glicosilação estão em caixas. A sequência de appA2 foi transmitida à biblioteca de dados Genebank com número de acesso 250016. A sequência nucleotídica de AppA2 é como mostrada na SEQ ID N°: 1.

Foram isolados vários mutantes dirigidos ao local de appA (ver Publicação PCT N° WO 01/36607 Al (pedido de Patente US N° 60/166179)). Estes mutantes foram concebidos para intensificar a glicosilação da enzima AppA. Os mutantes incluem A131N/V134N/D207N/S211N, C200N/D207N/S211N (Mutante U) e A131N/V134N/C200N/D207N/S211N (ver Rodriguez et al., Arch, of Biochem. and Biophys. 382: 105-112 (2000)). O Mutante U possui uma atividade específica superior a AppA e, como AppA2, possui um pH ótimo de entre cerca de 2,5 e cerca de 3,5. A mutação C200N no Mutante U é uma região com hiatos e C200 está envolvido com C210 a formar uma única ligação dissulfureto em AppA. A Fig. 2 mostra as sequências de aminoácidos e nucleotídicas de

Mutante U. A sequência de aminoácidos de Mutante U é mostrada na SEQ ID N°: 5 e a sequência nucleotidica de Mutante U é mostrada na SEQ ID N°: 4.

Qualquer sistema de expressão de levedura conhecido para os especialistas na técnica pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Por exemplo, são descritos vários sistemas de expressão de levedura no pedido de Patente US N° 09/104769 (agora Patente US N° 6451572), pedido de Patente US N° 09/540149 e no pedido de Patente US N° 60/166179 (Publicação PCT N° WO 01/36607 Al) . Pode ser utilizado qualquer destes sistemas de expressão de levedura.

Pode ser utilizado um sistema de expressão de levedura para produzir uma quantidade suficiente da fitase a ser secretada a partir das células de levedura de modo que a fitase possa ser convenientemente isolada e purificada a partir do meio de cultura. A secreção no meio de cultura é controlada por um péptido sinal (e. g., o péptido sinal phyA ou péptido sinal de factor α de levedura) capaz de dirigir a fitase expressa fora da célula de levedura. Outros péptidos sinal adequados para facilitar a secreção da fitase a partir de células de levedura são conhecidos dos especialistas na técnica. O péptido sinal é, tipicamente, clivado da fitase após secreção.

Uma vez que é utilizado um sistema de expressão de levedura, pode ser utilizada qualquer espécie de levedura adequada para expressão de um gene de fitase incluindo tais espécies de levedura como espécies Saccharomyces (e. g., Saccharomyces cerevisiae), espécies Kluyveromyces, espécies Torulaspora, espécies Schizosaccharomyces e espécies de levedura metilotróficas, tais como espécies Pichia (e. g., Pichia pastoris), espécies Hansenula, espécies Torulopsis, espécies Candida e espécies Karwinskia. Numa forma de realização, o gene de fitase é expresso na levedura metilotrófica Pichia pastoris. As leveduras metilotróficas são capazes de utilizar metanol como única fonte de carbono para a produção dos recursos de energia necessários para manter a função celular e contêm um gene que codifica álcool oxidase para utilização de metanol.

Pode ser utilizado qualquer sistema hospedeiro-vetor conhecido do especialista (e. g., um sistema em que o vetor replica autonomamente ou integra-se no genoma hospedeiro) e compatível com levedura. Numa forma de realização, o vetor possui locais de clivagem de endonuclease de restrição para a inserção de fragmentos de ADN e marcadores genéticos para seleção de transformantes. 0 gene de fitase pode estar funcionalmente ligado a um promotor capaz de dirigir a expressão da fitase, em levedura e, numa forma de realização, o gene de fitase é excisado em grelha com um elemento intensificador transcricional e possui uma sequência terminadora para terminação de transcrição (e. g., terminador HSP150). 0 promotor pode ser um promotor constitutivo (e. g., o promotor 3-fosfo-glicerato cinase ou o promotor de fator a) ou um indutível (e. g., o promotor ADH2, GAL-1-10, GAL 7, PH05 T7 ou metalotionina). São descritos vários sistemas hospedeiro-vetor no pedido de Patente US N° 09/104769 (agora Patente US N° 6451572), pedido de Patente US N° 09/540149 e no pedido de Patente US N° 60/166179 (Publicação PCT N° WO 01/36607 Al).

As células de levedura são transformadas com um construtor gene-vetor compreendendo um gene de fitase operacionalmente acoplado a um sistema de expressão de levedura utilizando procedimentos conhecidos para os especialistas na técnica. Esses protocolos de transformação incluem eletroporação e transformação de protoplasto.

As células de levedura transformadas podem ser cultivadas por uma variedade de técnicas incluindo fermentação descontinua e continua num meio liquido ou num meio semissólido. Os meios de cultura para células de levedura são conhecidos na técnica e são, tipicamente, suplementados com uma fonte de carbono (e. g., glicose). As células de levedura transformadas podem ser cultivadas aerobicamente, a 30 °C, num ambiente de pH controlado (um pH de cerca de 6) e com a fonte de carbono (e. g. , glicose) mantida continuamente a um nível predeterminado conhecido para suportar o crescimento das células de levedura a uma densidade desejada dentro de um período de tempo específico. A fitase expressa em levedura para utilização de acordo com o método da presente invenção pode ser produzida em forma purificada por técnicas convencionais (por exemplo, pelo menos, cerca de 60% pura ou, pelo menos, cerca de 70-80% pura). Tipicamente, a fitase é secretada no meio de cultura de levedura e é recolhida do meio de cultura. Para purificação a partir do meio de cultura, a fitase pode, por exemplo, ser submetida a precipitação de sulfato de amónio seguida por cromatografia de coluna DEAE-Sefarose. Podem ser utilizadas outras técnicas convencionais conhecidas para os especialistas na técnica, tais como filtração de gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de coluna DEAE-Sefarose, cromatografia de afinidade, extração solvente-solvente, ultrafiltração e HPLC. Em alternativa, podem não ser necessários passos de purificação porque a fitase pode estar presente em concentrações tão elevadas no meio de cultura que a fitase é essencialmente pura no meio de cultura (e. g., 70-80% pura).

Em casos em que a fitase não é secretada no meio de cultura, as células de levedura podem ser lisadas, por exemplo, por sonicação, calor ou tratamento químico e o homogenato centrifugado para remover detritos celulares. 0 sobrenadante pode ser, em seguida, submetido a precipitação de sulfato de amónio e técnicas de fracionamento adicionais como requerido, tais como filtração de gel, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de coluna DEAE-Sefarose, cromatografia de afinidade, extração solvente-solvente, ultrafiltração e HPLC para purificar a fitase. Deve ser entendido que os métodos de purificação descritos acima para purificação de fitases a partir do meio de cultura ou de células de levedura não são limitativos e podem ser utilizadas quaisquer técnicas de purificação conhecidas para os especialistas na técnica para purificar a fitase expressa em levedura se essas técnicas forem necessárias para obter uma fitase substancialmente pura.

Numa forma de realização, a fitase é recolhida do meio de cultura sem passos de purificação adicionais arrefecendo a cultura de levedura (e. g., a cerca de 8 °C) e removendo as células de levedura utilizando tais técnicas como centrifugação, microfiltração e filtração em vácuo rotativa. A fitase no meio sem célula pode ser concentrada por tais técnicas como, por exemplo, ultrafiltração e filtração de fluxo tangencial.

Podem ser preparadas várias formulações da preparação de fitase purificada. As enzimas fitase podem ser estabilizadas através da adição de outras proteínas (e. g., gelatina e leite em pó desnatado), agentes químicos (e. g., glicerol, polietilenoglicol, EDTA, sorbato de potássio, benzoato de sódio e agentes redutores e aldeídos), polissacáridos, monossacáridos, lípidos (óleos vegetais hidrogenados), fitato de sódio e outros compostos contendo fitato e semelhantes. As suspensões de enzima fitase podem também ser secas (e. g., pulverização, secagem em tambor e liofilização) e formuladas como pós, grânulos, comprimidos, blocos minerais, líquidos e géis através de processos conhecidos. Podem ser utilizados agentes gelificantes, tais como gelatina, alginato, colagénio, ágar, pectina e carragenina. A invenção também se estende a uma preparação inoculante alimentar compreendendo levedura não patogénica liofilizada que pode expressar as fitases da presente invenção no trato gastrointestinal do animal quando o animal é alimentado com a preparação.

Numa forma de realização, uma fitase no meio de cultura sem células é concentrada, tal como por ultrafiltração e pulverização do retentato de ultrafiltração. 0 pó pulverizado pode ser misturado diretamente com um alimento ou o pó pulverizado pode ser misturado com um veiculo para utilização como uma composição de aditivo alimentar para suplementação de um alimento com fitase. Numa forma de realização, a fitase no retentato é co-seca com um veiculo e/ou estabilizante. Noutra forma de realização, a fitase é pulverizada com um ingrediente que ajuda a fitase pulverizada seca a aderir a um veiculo ou, em alternativa, a fitase pode associar-se fracamente com o veiculo. A composição de aditivo alimentar (i. e., a composição de fitase/veiculo e, de um modo opcional, outros ingredientes) pode ser utilizada para misturar com o alimento para conseguir ainda mais distribuição da fitase no alimento.

As composições de aditivo alimentar exemplificativas (i. e., composições de fitase/veiculo e, de um modo opcional, outros ingredientes) podem conter 600 unidades de fitase/grama do veículo a 5000 unidades de fitase/grama do veículo. Estas composições de fitase/veículo podem conter ingredientes adicionais. Por exemplo, as composições podem ser formuladas para conter cascas de arroz ou farelos de trigo como veiculo (25-80 porcento em peso), a fitase (0,5 a 20 porcento em peso), carbonato de cálcio (10 a 50 porcento em peso) e óleos (1 a 3 porcento em peso). Em alternativa, a composição de aditivo alimentar pode incluir a fitase e o veículo e nenhuns ingredientes adicionais. A composição de aditivo alimentar pode ser misturada com o alimento para obter uma mistura alimentar final com desde cerca de 50 a cerca de 2000 unidades de fitase/quilograma do alimento.

Deste modo, é ilustrado um alimento compreendendo uma fonte de hexaquisfosfato de mio-inositol, uma fitase expressa em levedura e um veículo. Além disso, é proporcionado um método de melhoria do valor nutricional de um alimento consumido por um animal monogástrico em que o alimento compreende hexaquisfosfato de mio-inositol, em que o método compreende os passos de pulverizar a fitase selecionada do grupo consistindo em AppA derivada de Escherichia coli, AppA2 derivada de Escherichia coli e um mutante dirigido ao local de AppA derivada de Escherichia coli, misturando a fitase com um veículo e, de um modo opcional, outros ingredientes, produzir uma composição de aditivo alimentar para suplementar um alimento com a fitase, misturar a composição de aditivo alimentar com o alimento e alimentar o animal com o alimento suplementado com a composição de aditivo alimentar.

Neste contexto, o veículo pode ser qualquer veículo adequado para fazer uma composição de aditivo alimentar conhecida na técnica incluindo, mas não limitada a cascas de arroz, farelos de trigo, um polissacárido (e. g., amidos específicos), um monossacárido, óleo mineral, gordura vegetal, lípidos hidrogenados, carbonato de cálcio, gelatina, leite em pó desnatado, fitato e outros compostos contendo fitato, uma mistura de base e semelhantes. Uma mistura de base, tipicamente, compreende muitos dos ingredientes, incluindo vitaminas e minerais, de uma mistura alimentar final exceto para a mistura alimentar (e. g. , farinha de milho e farelo de soja) . A fitase para utilização na composição de aditivo alimentar é, de um modo preferido, AppA derivada de E. coli, AppA2 derivada de E. coli ou um mutante dirigido ao local de AppA derivada de E. coli. A composição de aditivo alimentar contendo a fitase pulverizada e um veiculo e, de um modo opcional, outros ingredientes, é misturada com a mistura alimentar final para obter um alimento com um número predeterminado de unidades fitase/quilograma do alimento (e. g., cerca de 50 a cerca de 2000 unidades fitase/quilograma do alimento). Antes de misturar com o veiculo, a fitase pulverizada é ensaiada para atividade de fitase para determinar a quantidade de pó seco a misturar com o veiculo para obter uma composição de aditivo alimentar com um número predeterminado de unidades fitase/grama do veiculo. O veiculo contendo fitase é, em seguida, misturado com a mistura alimentar final para obter uma mistura alimentar final com um número predeterminado de unidades fitase/quilograma do alimento. Como consequência, a concentração de fitase na composição de aditivo alimentar é superior à concentração de fitase na mistura alimentar final.

De acordo com a invenção, o alimento é alimentado em combinação com a fitase expressa em levedura a galinhas, perus (perus jovens (i. e., primeiras semanas pós-eclosão) e animais idosos), patos e faisões, qualquer outra espécie aviária, animais mantidos em cativeiro (e. g., animais de zoo), ou animais domésticos.

Os animais monogástricos agrícolas são, tipicamente, alimentados com composições de alimento animal compreendendo produtos vegetais que contêm fitato (e.g., farinha de milho e farelo de soja contêm fitato (hexaquisfosfato de mio-inositol)) como a principal forma de armazenamento de fosfato e, deste modo, é vantajoso suplementar o alimento com fitase. Como consequência, os alimentos que podem ser suplementados com fitase de acordo com a invenção incluem alimentos para animais agrícolas e alimento para aves e qualquer alimento para espécie aviária.

No caso de um alimento animal alimentado a animais monogástricos, pode ser utilizado qualquer alimento animal misturado conhecido na técnica de acordo com a presente invenção, tais como farinha de colza, farelo de algodão, farelo de soja e farinha de milho, mas são particularmente preferidos farelo de soja e farinha de milho. 0 alimento animal misturado é suplementado com a fitase expressa em levedura, mas outros ingredientes podem, de um modo opcional, ser adicionados à mistura de alimento animal. Ingredientes opcionais da mistura de alimento animal incluem açúcares e hidratos de carbono complexo, tais como monossacáridos, dissacáridos e polissacáridos solúveis em água ou insolúveis em água. Os ingredientes de aminoácidos opcionais que podem ser adicionados à mistura alimentar são arginina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, valina, tirosina etil HC1, alanina, ácido aspártico, glutamato de sódio, glicina, prolina, serina, cisteína etil HC1 e análogos e seus sais. As vitaminas que podem ser, de um modo opcional, adicionadas são tiamina HC1, riboflavina, piridoxina HC1, niacina, niacinamida, inositol, cloreto de colina, pantotenato de cálcio, biotina, ácido fólico, ácido ascórbico e vitaminas A, B, K, D, E, e semelhantes. Podem também ser adicionados minerais, ingredientes de proteína, incluindo proteína obtida de farinha de carne ou farinha de peixe, ovo líquido ou em pó, peixes solúveis, concentrado de proteína de soro de leite, óleos (e. g., óleo de soja), amido de milho, cálcio, fosfato inorgânico, sulfato de cobre, sal e calcário. Quaisquer ingredientes de medicamento conhecidos na técnica podem ser adicionados à mistura de alimento animal, tal como antibióticos.

As composições alimentares podem também conter enzimas que não a fitase expressa em levedura. Exemplos dessas enzimas são proteases, celulases, xilanases e fosfatases ácidas. Por exemplo, a desfosforilação completa de fitato pode não ser conseguida pela fitase isolada e a adição de uma fosfatase ácida pode resultar em libertação de fosfato adicional. Pode ser adicionada uma protease (e. g., pepsina), por exemplo, para clivar a fitase expressa em levedura para intensificar a atividade da fitase. Essa fitase tratada com protease pode apresentar capacidade intensificada para aumentar a biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato, para reduzir a razão de alimentação para ganho de peso, para aumentar massa óssea e teor mineral e para aumentar o peso de ovos ou número de ovos postos para uma espécie aviária comparada à fitase expressa em levedura intacta. Além disso, podem ser utilizadas combinações de fitases, tais como quaisquer combinações que podem atuar sinergisticamente para aumentar a biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato ou podem ser utilizados fragmentos proteolíticos de fitases ou combinações de fragmentos proteolíticos. Neste sentido, o gene de fitase expressa em levedura podia ser utilizado para produzir um produto truncado diretamente para utilização no método da presente invenção.

Podem também ser adicionados antioxidantes ao alimento, tal como uma composição alimentar animal, para prevenir oxidação da proteína fitase utilizada para suplementar o alimento. A oxidação pode ser prevenida pela introdução de antioxidantes de ocorrência natural, tais como beta-caroteno, vitamina E, vitamina C e tocoferol ou de antioxidantes sintéticos, tais como hidroxitolueno butilado, hidroxianisole butilado, butil-hidroquinona terciária, propilgalato ou etoxiquina ao alimento. Podem também ser adicionados compostos que atuam sinergicamente com antioxidantes, tais como ácido ascórbico, ácido cítrico e ácido fosfórico. A quantidade de antioxidantes incorporados neste modo depende dos requisitos, tais como formulação de produto, condições de transporte, métodos de embalamento e tempo de vida desejado.

De acordo com um método da presente invenção, o alimento, tal como um alimento animal, é suplementado com quantidades da fitase expressa em levedura suficientes para aumentar o valor nutricional do alimento. Por exemplo, numa forma de realização, o alimento é suplementado com menos de 2000 unidades (U) da fitase expressa em levedura por quilograma (kg) do alimento.

Esta quantidade de fitase é equivalente a adicionar cerca de 34 mg da fitase a um kg do alimento (cerca de 0,0034% p/p) . Noutra forma de realização, o alimento é suplementado com menos de 1500 U da fitase expressa em levedura por kg do alimento.

Esta quantidade de fitase é equivalente a adicionar cerca de 26 mg da fitase a um kg do alimento (cerca de 0,0026% p/p) . Noutra forma de realização, o alimento é suplementado com menos de 1200 U da fitase expressa em levedura por kg do alimento.

Esta quantidade de fitase é equivalente a adicionar cerca de 17 mg da fitase a um kg do alimento (cerca de 0,0017% p/p) . Noutra forma de realização, o alimento, tal como uma composição alimentar animal, é suplementada com cerca de 50 U/kg a cerca de 1000 U/kg da fitase expressa em levedura (i. e., cerca de 0,7 a cerca de 14,3 mg/kg ou cerca de 0, 00007% a cerca de 0,0014% (p/p)). Ainda noutra forma de realização, o alimento é suplementado com cerca de 50 U/kg a cerca de 700 U/kg da fitase expressa em levedura (i. e., cerca de 0,7 a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 0,00007% a cerca de 0,001% (p/p)). Ainda noutra forma de realização, o alimento é suplementado com cerca de 50 U/kg a cerca de 500 U/kg da fitase expressa em levedura (i. e., cerca de 0,7 a cerca de 7 mg/kg ou cerca de 0,00007% a cerca de 0,007% (p/p)). Ainda noutra forma de realização, o alimento é suplementado com cerca de 50 U/kg a cerca de 200 U/kg da fitase expressa em levedura (í. e., cerca de 0,7 a cerca de 2,9 mg/kg ou cerca de 0, 00007% a cerca de , 0003% (p/p)). Em cada uma destas formas de realização, é para ser entendido que "kg" se refere a quilogramas do alimento, tal como a composição alimentar final no caso de uma mistura de alimento animal (i. e., o alimento na composição como mistura final) . Além disso, uma unidade (U) de atividade de fitase é definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 ymol de fosfato inorgânico por minuto de 1,5 mmol/L de fitato de sódio a 37 °C e a um pH de 5,5. A fitase expressa em levedura pode ser misturada com o alimento, tal como um alimento animal (i. e., a composição alimentar como mistura final), antes de alimentar o animal com o alimento ou a fitase pode ser alimentada ao animal com o alimento sem misturar antes. Por exemplo, a fitase pode ser adicionada diretamente a um alimento não tratado, granulado ou, de outro modo, processado, tal como um alimento animal ou a fitase pode ser proporcionada separadamente do alimento, por exemplo, num bloco mineral, um comprimido, uma formulação de gel, uma formulação líquida ou em água potável. De acordo com a invenção, alimentar o animal com o alimento "em combinação com" a fitase significa alimentar o alimento misturado com a fitase ou alimentar o alimento e fitase separadamente sem misturar antes. A fitase expressa em levedura pode estar numa forma não encapsulada ou encapsulada para alimentar ao animal ou para mistura com uma mistura de alimento animal. A encapsulação protege a fitase de rutura e/ou oxidação antes da ingestão pelo animal (i. e., encapsulação aumenta a estabilidade da proteína) e proporciona um produto seco para mais fácil alimentação ao animal ou para mais fácil mistura com, por exemplo, uma mistura de alimento animal. A fitase expressa em levedura pode ser protegida neste modo, por exemplo, revestindo a fitase com outra proteína ou quaisquer outras substâncias conhecidas na técnica para serem agentes de encapsulação eficazes, tais como polímeros, ceras, gorduras e óleos vegetais hidrogenados. Por exemplo, a fitase pode ser encapsulada utilizando uma técnica reconhecida na técnica, tal como uma técnica de encapsulação de Na2+-alginato, em que a fitase é revestida com Na2+-alginato seguida por conversão a Ca2+-alginato na presença de iões Ca2+ para encapsulação. Em alternativa, a fitase pode ser encapsulada por uma técnica reconhecida na técnica, tal como granulação (i. e., atomizar um liquido fundido e arrefecer as goticulas para formar uma esfera). Por exemplo, a fitase pode ser comprimida em flocos de algodão hidrogenado ou óleo de soja hidrogenado para produzir um produto seco. A fitase pode ser utilizada numa forma completamente não encapsulada, podem ser adicionadas numa forma completamente encapsulada ou misturas de fitase encapsulada e não encapsulada ao alimento, tal como uma composição alimentar animal ou alimentadas diretamente ao animal sem misturar antes com o alimento. Qualquer fitase para utilização de acordo com o método da presente invenção pode ser igualmente tratada.

De acordo com o método da presente invenção, o alimento contendo fitase pode ser administrado oralmente a animais num alimento, tal como um alimento animal ou num bloco mineral ou em água potável, mas pode ser utilizado qualquer outro método eficaz de administração conhecido dos especialistas na técnica (e. g., uma forma de comprimido) . 0 alimento contendo fitase expressa em levedura pode ser administrado aos animais durante qualquer período de tempo que seja eficaz para aumentar a biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato, para reduzir a razão de alimentação para ganho de peso ou para aumentar a massa óssea e teor mineral do animal. Por exemplo, no caso de uma composição alimentar alimentada a um animal monogástrico, a composição alimentar contendo fitase expressa em levedura pode ser alimentada ao animal diariamente durante o tempo de vida do animal. Em alternativa, a composição alimentar contendo fitase pode ser alimentada ao animal durante um período de tempo mais curto. Os períodos de tempo para alimentar o alimento contendo fitase a animais são não limitativos e deve ser entendido que pode ser utilizado qualquer período de tempo determinado para ser eficaz para intensificar a nutrição animal administrando o alimento contendo fitase. EXEMPLO 1

COMPOSIÇÃO DE MISTURA DE ALIMENTO ANIMAL A mistura de composição do alimento animal para pintainhos (i. e.,a composição alimentar sem fitase) era como se segue:

Tabela 1. Composição da mistura de alimento animal utilizada em ensaios de pintainho e porco.

EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DE FITASE

Inocularam-se culturas de semente de levedura em meio de crescimento com Pichia pastoris X33 transformadas com AOXl-appA, pGAP-appA2 ou AOXl-Mutante U. As culturas de semente foram cultivadas, a 30 °C, durante cerca de 24 horas, até se atingir uma OD60o de cerca de 50. As culturas de semente foram, em seguida, utilizadas para inocular fermentadores (processo descontinuo) contendo meio de crescimento FM-22 estéril contendo 5% de glicose. As culturas de semente de 24 horas foram diluídas cerca de 1:25 a cerca de 1:50 no meio de crescimento FM-22. As culturas de levedura foram incubadas aerobicamente nos fermentadores a 30 °C com controlo de pH a 6,0 (utilizando NH2OH) e com alimentação de glicose continua até as culturas atingirem uma OD60o de cerca de 400 (cerca de 36 horas) .

Para recolher as fitases do meio de cultura, as culturas de levedura foram rapidamente refrigeradas a 8 °C. As células foram separadas do meio de cultura por centrifugação e por microfiltração. As fitases eram 70-80% puras no meio de cultura e foram preparadas para misturar com um veiculo como aditivo alimentar como se segue.

Os meios sem células contendo as fitases secretadas foram concentrados por ultrafiltração (limite de exclusão 10000 MW) . Os retentatos de ultrafiltração (7-5% sólidos) foram transferidos para recipientes estéreis para pulverização. Os retentatos foram pulverizados utilizando técnicas padrão conhecidas na técnica e o pó resultante foi recolhido (4-6% de humidade).

Realizou-se o ensaio microbiológico do pó e o pó foi ensaiado para atividade de fitase. A atividade de fitase do pó (unidades de atividade de fitase/mg de pó) foi utilizada para determinar a quantidade de pó seco para misturar com farelos de trigo (i. e., o veículo) para obter uma mistura fitase/veículo com um número predeterminado de unidades de fitase/grama do veículo. 0 pó de fitase seco foi misturado com os farelos de trigo e empacotado em recipientes à prova de humidade. Os farelos de trigo contendo fitase foram misturados com uma mistura de alimento animal como necessário para obter uma mistura alimentar final com um número predeterminado de unidades de fitase/kg do alimento (cerca de 400 a cerca de 1000 U/kg). EXEMPLO 3

COMPOSIÇÃO DE ADITIVO ALIMENTAR

As seguintes composições são exemplificativas de composições de aditivo alimentar que podem ser misturadas com uma mistura alimentar animal, tal como a mistura alimentar animal descrita no Exemplo 1, para obter uma mistura alimentar final com, por exemplo, cerca de 50 U de fitase/quilograma da mistura alimentar final a cerca de 2000 U de f itase/quilograma do alimento. As composições de aditivo alimentar descritas abaixo não são limitativas e deve ser entendido que pode ser utilizada qualquer composição de aditivo alimentar contendo fitase determinada como sendo eficaz para intensificar o valor nutricional de alimento animal. As composições de aditivo alimentar exemplificativas são mostradas para uma composição de aditivo alimentar contendo 600 unidades de fitase/grama da composição de aditivo alimentar ou 5000 unidades de fitase/grama da composição de aditivo alimentar.

EXEMPLO 4

PROTOCOLO DE ALIMENTAÇÃO

Os pintainhos foram alimentados utilizando o protocolo descrito em Biehl, et al. (J. Nutr. 125:2407-2416 (1995)). Em resumo, os ensaios foram conduzidos com pintainhos macho e fêmea do cruzamento de machos New Hampshire e fêmeas Columbian e foram conduzidos numa sala de laboratório ambientalmente controlada com 24 horas de iluminação fluorescente. Do dia 0 ao dia 7 após eclosão, os pintainhos foram alimentados com uma dieta basal de 23% proteína em bruto, farelo de soja fortificado com metionina como descrito acima no Exemplo 1. No dia 8, os pintainhos foram pesados, voaram em bando e atribuídos aleatoriamente a tratamentos experimentais. Cinco galinheiros de três ou quatro pintainhos por galinheiro receberam cada tratamento dietético durante um período de alimentação experimental de 13 dias e os pintainhos tinham um peso inicial médio de 80 a 100 gramas.

Por todo o período de alimentação de 13 dias, os pintainhos foram confinados em baterias de bico de aço inoxidável termostaticamente controladas e foram também utilizados alimentadores e bebedouros de aço inoxidável. Estes passos foram feitos para evitar contaminação mineral do ambiente. Dietas e água desionizada destilada estavam livremente disponíveis durante todo o período de alimentação.

Os porcos foram submetidos a jejum durante 12 horas antes do início de cada ensaio, foram alimentados com dietas experimentais durante 23 dias e foram submetidos a jejum durante 12 horas após cada ensaio estar completo. Foram utilizados dez porcos por grupo de tratamento e os porcos pesavam em média cerca de 8-120 kg no início de cada ensaio. Os porcos foram colocados em currais individuais que continham um alimentador de aço inoxidável, um bebedouro de aço inoxidável e cerca de barra redonda galvanizada.

Todos os pintainhos em cada grupo de tratamento e os cinco porcos de peso mediano de cada grupo de tratamento foram eutanasiados para ensaio. O peso corporal ganho foi medido e os ossos de tíbia (pintainhos) ou fibula (porcos) foram recolhidos para análise de cinza óssea como reflexão de massa óssea e teor mineral. EXEMPLO 5

MEDIÇÃO DE FOSFATO INORGÂNICO E FOSFATO BIODISPONÍVEL 0 fosfato total nas amostras alimentares utilizadas para gerar uma curva padrão foi quantificado colorimetricamente de acordo com AOAC (1984) como descrito em Biehl et al. 0 fosfato de potássio monobásico (KH2P04) serviu como padrão. Foi gerada uma curva padrão medindo níveis de fosfato inorgânico em alimento basal suplementado com KH2P04 (eixo X) e determinando peso de cinza de tíbia (mg) ou ganho de peso (g) (eixo Y) para animais alimentados com alimento basal suplementado com vários níveis de KH2P04. A biodisponibilidade de fosfato a partir de fitato foi, em seguida, determinada para animais alimentados com alimento basal suplementado com fitase por comparação de peso de cinza de tíbia e ganho de peso nestes animais à curva padrão. EXEMPLO 6

ANÁLISE DE CINZA ÓSSEA

No fim de cada experiência, os pintainhos ou porcos foram eutanasiados e foram quantitativamente removidos os ossos tíbia ou fibula direitos de pintainhos ou porcos, respetivamente. Os ossos foram agrupados por galinheiro replicada e, após remoção de tecido aderente, foram secos durante 24 horas a 100 °C e foram pesados. Após pesagem, os ossos foram secos por cinza durante 24 horas a 600 °C num forno mufla. O peso de cinza foi expresso como uma percentagem de peso de osso seco e também como peso de cinza por osso. EXEMPLO 7

EXPRESSÃO DE FITASE EM LEVEDURAS

De acordo com a presente invenção, qualquer gene de fitase pode ser expresso em levedura e qualquer sistema de expressão de levedura pode ser utilizado de acordo com métodos conhecidos para os especialistas na técnica. São descritos sistemas de expressão de levedura para genes de fitase exemplificativos, tais como os genes appA e appA2 derivados de E. coli e para um mutante dirigido ao local de AppA derivado de E. coli, no pedido de Patente US N° 09/104769 (agora Patente US N° 6451572), pedido de Patente US N° 09/540149 e no pedido de Patente US N° 60/166179 (Publicação PCT N° WO 01/36607 Al) . São descritos abaixo, em resumo, sistemas de expressão de levedura exemplificativos para expressar as enzimas AppA e AppA2 e um mutante dirigido ao local de AppA.

Expressão do gene appA em Saccharomyces cerevisiae. O gene appA foi expresso em Saccharomyces cerevisiae ligadas ao péptido sinal do gene phyA (gene de fitase de Aspergillus niger) . O gene appA foi obtido do ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, onde foi depositado em conformidade com os requisites do Tratado de Budapeste, sob número de acesso ATCC 87441. O gene appA (1,3 kb) foi transformado na estirpe BL21 de E. coli utilizando o vetor de expressão pappAl (Ostanin et al., J. Biol. Chem., 267:22830-36 (1992)). Para preparar o construtor de péptido sinal appA phyA, utilizou-se a reação de polimerase em cadeia (PCR). Foram sintetizados dois iniciadores e o iniciador 5' era de 80 pares de bases em comprimento e continha a sequência de péptido sinal phyA, um local de corte de enzima de restrição Kpnl e sequência complementar ao padrão como se segue: 5' GGG GTA CCA TGG GCG TCT CTG CTG TTC TAC TTC CTT TGT ATC TCC TGT CTG GAG TCA CCT CCG GAC AGA GTG AGC CGG AG 3' (SEQ ID N°: 6) . O iniciador 3' era de 24 pares de bases em comprimento e continha um local EcoRI e sequência complementar ao padrão como se segue: 5' GGG AAT TCA TTA CAA ACT GCA GGC 3' (SEQ ID N°: 7) . A reação de PCR foi corrida durante 25 ciclos com 1 minuto de desnaturação a 95 °C, 1 minuto de emparelhamento a 58 °C e 1 minuto de extensão de cadeia a 72 °C.

Um fragmento de 1,3 kb foi amplificado por PCR e foi digerido com Kpnl e EcoRI e ligado em pYES2, um vetor para expressão em Saccharomyces cerevisiae. O construtor de péptido sinal pYES2-appA-phyA foi transformado na levedura (INVScI, Invitrogen, San Diego, CA) pelo método de acetato de litio.

Os transformantes selecionados foram inoculados em meio YEPD e foi induzida expressão com galactose após ser atingido uma OD60o de 2. As células foram recolhidas 15-20 horas após indução. A enzima fitase AppA foi isolada do sobrenadante de cultura e era a principal proteína presente eliminando a necessidade de uma purificação tediosa.

Expressão do gene appA ou appA2 em Pichia pastoris. appA. 0 molde para a reação de PCR foi como descrito acima. 0 iniciador 5' utilizado para a reação de PCR foi como se segue: 5' GGA ATT CCA GAG TGA GCC GGA 3' (SEQ ID N°: 8). 0 iniciador 3' foi como se segue: 5' GGG GTA CCT TAC AAA CTG CAC G 3'

(SEQ ID N°: 9) . A reação de amplificação incluía 1 ciclo a 94 °C (3 min.), 30 ciclos a 94 °C (0,8 min) , 30 ciclos a 54 °C (1 min.), 30 ciclos a 72 °C (2 min.) e 1 ciclo a 72 °C (10 min). O produto foi, em primeiro lugar, inserido no vetor pGEM T-easy (Promega) , e utilizou-se a estirpe TOP10F' de E. coli como o hospedeiro para amplificar o construtor. O construtor foi, em seguida, inserido, no vetor de expressão de levedura pPIcZaA (Invitrogen) no local EcoRI e utilizou-se, novamente, a estirpe TOP10F' de E. coli como o hospedeiro para amplificar o construtor. O vetor PIcZa contendo appA foi transformado na estirpe X33 de Pichia pastoris por electroporação. As células transformadas foram colocadas em placas em meio de ágar YPD-Zeocina e foram incubadas colónias positivas em meios mínimos com glicerol (BMGY) durante 24 horas. Quando se atingiu uma OD60o de 5, as células foram centrifugadas e foram ressuspensas em meio de metanol a 0,5% (BMMY) para indução. Adicionou-se metanol (100%) a cada 24 horas para manter uma concentração de 0,5-1%. As células foram recolhidas a 192 horas após indução e a proteína AppA foi purificada por precipitação de sulfato de amónio e cromatografia de coluna de DEAE-Sefarose. appA2. O gene appA2 foi isolado (ver pedido de Patente US N° 09/540179) de uma colónia bacteriana que apresentava atividade de fitase particularmente elevada obtida dos teores de cólon de porcos Hampshire-Yorkshire-Duroc híbridos. Para isolar uma colónia bacteriana que apresenta atividade de fitase elevada, a amostra de teores de cólon foi diluída em meio de glicose fluido ruminai anaeróbico, foi agitada vigorosamente durante 3 minutos e foi diluída em série. As amostras diluídas foram cultivadas, a 37 °C, durante 3 dias, num meio fluido de glicose-celobiose-ágar ruminai modificado contendo fitato de cálcio insolúvel. As colónias com uma zona limpa foram ensaiadas para atividade de fitase utilizando fitato de sódio como substrato. A colónia identificada como produzindo atividade de fitase mais elevada foi identificada como uma estirpe de E. coli. Como consequência, o gene appA2 foi isolado utilizando os iniciadores como descritos acima para expressão de appA em Pichia pastoris (SEQ ID N° 8 e 9) . 0 gene appA2 foi clonado no vetor PIcZa e a estirpe X33 de Pichia pastoris foi transformada com o construtor PIcZa-appA2 como descrito acima para expressão de appA em Pichia pastoris. A enzima AppA2 foi expressa como descrito acima para AppA e a proteína AppA2 foi recolhida do sobrenadante de cultura de levedura.

Mutantes dirigidos ao local de AppA.

Os mutantes dirigidos ao local de appA foram preparados como descrito no pedido de Patente US N° 06/166179 (Publicação PCT N° WO 01/36607 Al), aqui incorporada por referência. Em resumo, os mutantes appA de E. coli foram construídos utilizando o método de mutagénese dirigida ao local de megainiciador (Seraphin, B. et al., Nucleic Acids Res. 24:3276-77 (1996); Smith, A.M. et al., Biotechniques 22: 438-39 (1997)). 0 molde para mutagénese foi obtido de ATCC e o gene (1,3 kb) foi transformado na estirpe BL21 de E. coli (N° 87441) utilizando o vetor de expressão pappAl (Ostanin et al., J. Biol. Chem., 267:22830-36 (1992)). O molde foi amplificado como descrito acima para appA expressa em Pichia pastoris utilizando os iniciadores utilizados acima para expressão de appA em Pichia pastoris (SEQ ID N°: 8 e 9). A reação de amplificação incluiu 1 ciclo a 94 °C (3 min.), 30 ciclos a 94 °C (0,5 min), 30 ciclos

a 54 °C (1 min.), 30 ciclos a 72 °C (1,5 min.) e 1 ciclo a 72 °C (10 min). A reação de PCR mutagénese foi realizada como descrita acima utilizando os iniciadores como se segue:

5'CTGGGTATGGTTGGTTATATTACAGTCAGGT3' A131N

(SEQ ID N°: 10) V134N

5'CAAACTTGAACCTTAAACGTGAG3' C2 0 0N (SEQ ID N°: 11)

5'CCTGCGTTAAGTTACAGCTTTCATTCTGTTT3' D207N

(SEQ ID N°: 12) S211N

As reações de PCR mutagénicas incorporaram iniciadores apropriados para fazer os mutantes A131N/V134N/D207N/S211N, C200N/D207N/S211N (Mutante U) e A131N/V134N/C200N/D207N/S211N de appA. A primeira reação de PCR mutagénica (100 yL) foi realizada como descrito acima, utilizando 4 yL da mistura reacional de PCR appA intacta e os iniciadores modificados apropriados listados acima. Todos os produtos de PCR megainiciadores foram resolvidos num gel de agarose de baixa fusão a 1,5%. Os fragmentos esperados foram excisados e eluidos com um kit GENECLEAN II. A reação de PCR mutagénica final (100 yL) foi definida como descrito acima, utilizando 4 yL do produto de PCR appA e variando concentrações do megainiciador purificado (50 ng a 4 yg) , dependendo do seu tamanho. Foram definidos cinco ciclos térmicos a 94 °C durante 1 minuto e 70 °C durante 2 minutos.

Enquanto foram adicionados a 70 °C, adicionaram-se 1 ymol de iniciador seguinte e 2 U de ADN polimerase AmpliTaq e misturou-se suavemente com a mistura reacional e ciclo térmico continuado durante 25 ciclos, a 94 °C, durante 1 minuto, e 70 °C, durante 1,5 minutos.

Os genes que codificam os mutantes dirigidos ao local foram expressos em Pichia pastoris como descrito acima para o gene appA2. Os produtos de proteína foram expressos como descrito acima para AppA e os mutantes dirigidos ao local foram purificados a partir do sobrenadante de cultura de levedura por precipitação de sulfato de amónio e cromatografia de DEAE-Sefarose. EXEMPLO 8

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURAS ALIMENTADAS A PINTAINHOS

Para avaliar o seu potencial como suplementos de alimento animal, as fitases expressas em levedura AppA e AppA2 foram secas e adicionadas à mistura de alimento animal (23% de proteína em bruto) descrita acima no Exemplo 1 utilizando farelos de trigo como veículo. Os pintainhos (quatro pintainhos por galinheiro; peso inicial médio de 97 gramas) foram alimentados com composições alimentares suplementadas com fitase como descrito acima no Exemplo 4. Os grupos de tratamento incluíram vários níveis de KH2PO4 para construir a curva padrão, 500 U/kg de Natuphos®, uma fitase comercialmente disponível (Gist-Brocades) expressa no fungo Aspergillus niger, 500 U/kg de AppA expressa em Pichia pastoris ou em E. coli e vários níveis de AppA2/p (AppA2 expressa em Pichia pastoris utilizando o promotor pGAP constitutivo para expressão génica) como se segue:

Grupos de Tratamento:

Para os vários grupos de tratamento foram determinados ganho de peso, ingestão de alimento, a razão de alimentação para ganho de peso, peso de tíbia seco, peso de cinza de tíbia, peso de cinza de tíbia como percentagem de peso de tíbia seco e a percentagem de fosfato biodisponível com base no peso de cinza de tíbia e ganho de peso. Os resultados são expressos abaixo como uma média para os quatro pintainhos para cada um dos cinco galinheiros (Rl, R2, R3, R4 e R5) e a média para os cinco galinheiros foi também calculada (marcada com "média" nas tabelas). Os grupos de tratamento são marcados Tl-TlO nas tabelas e "g/c/d" indica ganho de peso ou ingestão de alimento em gramas/pintainho/dia.

Ganho de peso (g/c) sem agrupado = b

LSD = 16 13-d Ingestão de alimento (g/c)

SEM agrupado = 7 LSD = 21

Ganho/Alimento (g/kg)

SEM agrupado = 10 LSD = 28

Peso de tíbia seca (mg/c)

SEM agrupado = 16 LSD = 45

Cinza de tibia (mg/c)

SEM agrupado = 10 LSD = 28

Ingestão de P Suplementar (g)

SEM agrupado = 0,007 LSD = 0,022

Cinza de tíbia (%)

SEM agrupado = 0,57 LSD = 1,62

Estimativas de Equivalência de Fósforo Peso de Cinzas de Tibia

Para atividade de Fitase 500 U/kg (cálculos exemplificativos utilizando meios de tratamento de cinza de tibia)

P Biodisponivel (%) SSM agrupado = U,UUb

LSD = 0,016

Resultados de ANOVA (cálculo realizado para cada capoeira de quatro pássaros; legenda de tratamento na página anterior) P Biodisponível(%) SEM agrupado = U,UU7

LSD = 0,021

A suplementação da mistura de alimento animal com quantidades crescentes de KH2PO4 resultou em aumentos lineares (p<,001) em ganho de peso e cinza de tibia. A suplementação da mistura de alimento animal com Natuphos® resultou em aumentos lineares (p<,001) em ganho de peso, cinza de tibia e % de fosfato biodisponivel. A 500 U/kg, as enzimas (AppA e AppA2/p) expressos em levedura foram mais eficazes que AppA ou Natuphos® expressos em E. coli na melhoria de cada uma das respostas in vivo testadas, incluindo a razão de alimentação para ganho de peso, peso de tibia e % de fosfato biodisponivel. De facto, AppA e AppA2/p foram 2-6 vezes mais eficazes a aumentar o nivel de fosfato biodisponivel do que Natuphos®, dependendo do peso de cinza de tibia ou ganho de peso foi utilizado para calcular a percentagem de fosfato biodisponivel. EXEMPLO 9

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURA ALIMENTADAS A PINTAINHOS O procedimento foi como descrito no Exemplo 8, exceto que os pintainhos possuíam um peso inicial médio de 91 gramas e os grupos de tratamento eram como se segue:

Grupos de Tratamento:

A fitase Ronozyme® (Roche) é uma fitase expressa em fungos. 0 Mutante U é o mutante dirigido ao local de AppA descrito acima. As tabelas são marcadas como descrito no Exemplo 8. Os efeitos in vivo de suplementação de fitase descritos no Exemplo 8 foram medidos e os resultados foram como se segue:

Ganho de peso (g/c)

SEM agrupado= 6 LSD = 18

Ingestão de alimento (g/c) sem agrupado =iu

LSD = 27

Ganho/alimento (g/kg)

SEM agrupado = 10 LSD = 28

Peso de tibia seco (mg/c) SEM agrupado = 22

LSD = 61

Ingestão suplementar P (g)

Cinza de tíbia (mg/c) sari agrupaao = iu

LSD = 28

Cinza de tíbia (%) sem agrupado = u,4y

LSD = 1,39

Estimativas de Equivalência de Fósforo

(cálculos exemplificativos utilizando meios de tratamento de cinza de tibia)

** Resultados de ANOVA (cálculo realizado para cada capoeira de quatro pássaros; legenda de tratamento na página anterior)

Biodisponibilidade P (%)

SEM agrupado = 0,006 LSD = 0,018

A 500 U/kg, as enzimas expressas em levedura (Mutante U, AppA e AppA2) foram mais eficazes do que Natuphos® ou Ronozyme® (ambas as enzimas são expressas em sistemas de expressão fúngicos) a melhorar as respostas in vivo testadas. Por exemplo, Mutante U, AppA e AppA2 foram quatro vezes mais eficazes do que Natuphos® em libertar fosfato (ver Fig. 3). EXEMPLO 11

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURAS EM PINTAINHOS O procedimento foi como descrito no Exemplo 8, exceto que os pintainhos tinham um peso inicial médio de 83 gramas e os grupos de tratamento foram como se segue: GRUPO DE TRATAMENTOS: 1. Dieta Basal (0,10% de P; 0,75% de Ca) 2. O mesmo que 1 + 0,05% de P de KH2PO4 3. O mesmo que 1 + 0,10% de P de KH2PO4 4. O mesmo que 1 + 0,15% de P de KH2PO4 5. O mesmo que 1 + 500 U/kg de fitase Natuphos® (lote 1) 6. O mesmo que 1 + 500 U/kg de fitase Natuphos® (lote 2) 7. O mesmo que 1 + 1000 U/kg de fitase Natuphos® (lote 2) 8. O mesmo que 1 + 500 U/kg de Ronozyme® fitase (lote 1) 9. O mesmo que 1 + 500 U/kg de Ronozyme® fitase (lote 2) 10. O mesmo que 1 + 1000 U/kg de Ronozyme® fitase (lote 2) 11. O mesmo que 1 + 500 U/kg de Mutante U fitase 12. O mesmo que 1 + 500 U/kg de AppA fitase 13. 0 mesmo que 1 + 500 U/kg de AppA2 fitase 14. O mesmo que 1 + 500 U/kg AppA2 + novo promotor de fitase (AppA2/p)

As tabelas são como marcadas no Exemplo 8. Os efeitos in vivo de suplementação de fitase descritos no Exemplo 8 foram medidos e os resultados foram como se segue:

Ganho de peso (g/c)

Ingestão de alimento (g/c)

Ganho/alimento (g/kg)

Peso de tibia seco (mg/c)

Ingestão de P suplementar (g)

Cinza de tibia (mg/c)

Cinza de tibia (%)

Estimativas de Equivalência de Fósforo

(cálculos exemplificativos utilizando meios de tratamento de cinza de tíbia)

P Biodisponivel (%) gari — v/vvw

LSD = 0,018 A 500 U/kg, as enzimas expressas em levedura (Mutante U, AppA, AppA2 e AppA2/p) foram mais eficazes do que Natuphos® ou Ronozyme® a melhorar as respostas in vivo testadas incluindo ganho de peso, razão de alimentação para ganho de peso, massa óssea e teor mineral e percentagem de fosfato biodisponivel. As enzimas expressas em levedura foram cerca de quatro vezes mais eficazes a aumentar o nivel de fosfato biodisponivel do que as enzimas expressas em fungos. EXEMPLO 12

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURAS ALIMENTADAS A GALINHAS POEDEIRAS PÓS-MUDA O procedimento foi como descrito no Exemplo 8, exceto que foram testadas galinhas poedeiras pós-muda, determinou-se a produção de ovos e peso de ovos e os grupos de tratamento e dieta basal foram como se segue:

Tratamentos: 1. Dieta basal de milho-farelo de soja deficiente em P (0,10% de Pa; 3,8% de Ca; 17% de CP) 2. Como 1 + 0,10% Pi de KH2P04 3. Como 1 + 150 U/kg de fitase r-AppA2 4. Como 1 + 300 U/kg de fitase r-AppA2 5. Como 1 + 10000 U/kg de fitase r-AppA2

**Nota: Tratamento I descontinuado após semana 4 devido a produção de ovos abaixo de 50%.

As seguintes tabelas são marcadas como descrito no Exemplo 8 e foram medidas algumas das mesmas respostas como descrito no Exemplo 8. Os resultados mostram que AppA2 aumenta a produção de ovos e peso de ovos em galinhas poedeiras pós-muda.

Tratamentos:

Pesos corporais iniciais (g; media de 12 galinhas) sem agrupado = 26

LSD = 78

Pesos corporais de 4 semanas (g: média de 12 galinhas)

SEM agrupado =21 LSD = 64

Pesos corporais de 12 semanas (g: média de 12 galinhas) sara agrupaao =

LSD = 74

Tratamentos:

Ingestão de alimento (g/b/d)1

SEM agrupado = 2 LSD = 5 1 As médias são ingestões de alimento diárias médias de galinhas para o primeiro período de 4 semanas para o tratamento 1 e para o período de 12 semanas completo para os tratamentos 2-5.

Pesos de ovos (g)1 scím agrupaao = w, /

LSD =2,2 1 As médias são pesos de ovos médios de galinhas para o primeiro período de 4 semanas para o tratamento 1 e para o período de 12 semanas completo para os tratamentos 2-5.

Tratamentos :

Produção de ovos por semana (%)

Produção de ovos (%)1 sdm agrupado = z,i

1 As médias são a produção de ovos média de galinhas para o primeiro período de 4 semanas para o tratamento 1 e para o período de 12 semanas completo para os tratamentos 2-5. 2 Devido a variação na semana 1 de produção de ovos (acima), a covariância foi utilizada para analisar a produção de ovos, com médias de mínimos quadrados mostrando o efeito do covariável. EXEMPLO 15

EFEITOS IN VIVO DE FITASES EXPRESSAS EM LEVEDURA ALIMENTADAS A PINTAINHOS 0 procedimento para os estudos resumidos nas seguintes tabelas foi como descrito no Exemplo 8. Os grupos de tratamento são mostrados em cada tabela e as composições de dieta basal são mostradas na seguinte tabela (ver página seguinte). Os resultados mostram que AppA2 (ECP) é tão eficaz como fosfato em melhorar a razão ganho/alimento e em aumentar massa óssea e teor mineral. Os resultados também mostram que AppA2 é mais eficaz que Natuphos® e Ronozyme® a aumentar fosfato biodisponivel. Além disso, os resultados mostram que AppA2 aumenta o peso de ovos e a produção de ovos em galinhas poedeiras tão eficazmente quanto fosfato.

Percentagem de composição de dietas (como base de alimento)

(Continuação)

Torneciao o seguinte por quilograma de dieta completa: Fe, 75 mg (FeS04H20) ; Zn, 100 mg (ZnO) ; Mn, 75 mg (MnO) ; Cu, 8 mg (CuS04H20) ; I, 0,35 mg (Cal2) ; Se, 0,3 mg (Na2Se03) ; NaCL, 3 g. bFornecido o seguinte por quilograma de dieta completa: Fe, 90 mg (FeS04H20) ; Zn, 100 mg (ZnO); Mn, 20 mg (MnO); Cu, 8 mg (CuS04H20) ; I, 0,35 mg (Cal2) ; Se, 0,3 mg (Na2Se03) ; NaCl, 3 g. “Fornecido o seguinte por quilograma de dieta completa: acetato de retinilo, 1,514 pg; colecalciferol, 25 pg; acetato de DL-a-tocoferilo, 11 mg; complexo de bissulfito de sódio menadiona, 2,3 mg; niacina, 22 mg; D-Ca-pantotenato, 10 mg; riboflavina, 4,4 mg; vitamina B12, 11 μg. dFornecido o seguinte por quilograma de dieta completa; acetato de retinilo, 2,273 pg; colecalciferol, 16,5 pg; acetato de DL-a-tocoferilo, 88 mg; menadiona, 4,4 mg (complexo de bissulfito de sódio menadiona); niacina, 33 mg; D-Ca-pantotenato, 24,2 mg; riboflavina, 8,8 mg; vitamina B12, 35 pg; cloreto de colina, 319 mg. “Proporcionados 50 mg de bacitracina por quilograma de dieta completa. fProporcionados 55 mg de mecadoxe por quilograma de dieta completa. 9Proporcionados 38 mg de roxarsona por quilograma de dieta completa. hAnalisado (AOAC, 1999). iCalculado (NRC, 1994; NRC, 1998).

Avaliação de biodisponibilidade de fósforo relativa em pintainhos quando afetados por duas enzimas fitase diferentes (ensaio de Galinha l)a. (Continuação)

a0s valores são médias de cinco galinheiros de quatro pintainhos macho alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós-eclosão; peso inicial médio era 91 g. bA regressão linear de cinza de tíbia (mg) para Dietas 1 a 3 como função de ingestão P suplementar (g) era Y = 257,1 ± 9, 8 + 299, 0 ± 30,7X (r2 = 0,88); Concentrações P biodisponíveis (rendimentos P equivalentes) para Dietas 4 e 5 foram determinadas calculando ingestão P biodisponível equivalente (g) a partir da curva padrão, dividindo isso pela ingestão de alimento (g) o e multiplicando por 100. c,d,e,fAs médias dentro de uma coluna com diferentes expoentes são diferentes, P <0,05.

Biodisponibilidade de fósforo relativa em pintainhos alimentados com enzimas fitase diferentes (ensaio de Galinha 2)a

(Continuação)

“Os valores são médias de cinco galinheiros de quatro pintainhos macho alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós eclusão; peso inicial médio era 83 g. bA regressão linear de cinza de tíbia (mg) para Dietas 1 a 4 como função de ingestão P suplementar (g) era Y = 187,9 ± 8,7 + 393,4 ± 21,2X (r2 = 0,95); Concentrações P biodisponíveis (rendimentos P equivalentes) para Dietas 4-11 foram determinadas calculando ingestão P biodisponível equivalente (g) a partir da curva padrão, dividindo isso pela ingestão de alimento (g) do galinheiro e multiplicando por 100. CA enzima era do mesmo lote que foi utilizado para ensaio 1 de pintainhos. dA enzima era de um lote diferente do que foi utilizado para ensaio 1 de pintainhos. e,f,z,h.i, j,kAs médias dentro de uma colina com diferentes expoentes são diferentes, P <0,05. O efeito de nível de atividade na eficácia de libertação de fósforo de fitase de E. coli em pintainhos (Ensaio 3 de pintainhos)a.

(continuação)

aOs valores são médias de cinco galinheiros de quatro pintainhos macho alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós-eclosão; peso inicial médio era 97 g. bA regressão linear de cinza de tíbia (mg) para Dietas 1 a 4 como função de ingestão P suplementar (g) era Y = 232,0 ± 6, 9 + 389, 9 ± 16,7X (r2 = 0,97); Concentrações P biodisponíveis (rendimentos P equivalentes) para Dietas 5 a 8 foram determinadas calculando ingestão P biodisponivel equivalente (g) a partir da curva padrão, dividindo isso pela ingestão de alimento (g) do galinheiro e multiplicando por 100. c,d,e,f,s,h,iAs médias dentro de uma colina com diferentes expoentes são diferentes, P <0,05. A combinação de fitases 3 e 6 não produz efeitos sinérgicos na libertação de Pi em pintainhos alimentados com uma dieta de milho-farelo de soja (ensaio de Galinha 4)a.

(Continuação)

us vaiuitis sau meuras ue crnco gaiuumiiua ue quauu (jiiiLaiimuo matuu alimentados com as dietas experimentais durante o período de 8 a 22 d pós-eclosão; peso inicial médio era 68 g. bA regressão linear de cinza de tíbia (mg) para Dietas 1 a 4 como função de ingestão P suplementar (g) foi Y = 138,6 ± 4,9 + 371,3 1 14,7X (r2 = 0,97); Concentrações P biodisponíveis (rendimentos P equivalentes) para Dietas 5 a 8 foram determinadas calculando ingestão P biodisponível equivalente (g) a partir da curva padrão, dividindo isso pela ingestão de alimento (g) do galinheiro e multiplicando por 100. c,d,e,f,gAs médias dentro de uma colina com diferentes expoentes são diferentes, P <0,05.

Efeito de fitase de E. coli no desempenho de galinhas poedeiras da semana 1-4.a

“Os dados são medias de quatro replicados de 11 galinhas para as primeiras 4 semanas do período de estudo. bProdução (%) de ovos analisada utilizando covariância; os dados apresentados são médias de mínimos quadrados. cDieta 1 vs dietas 2-5, P <0,01.

Efeito de fitase de E. coli no desempenho de galinhas poedeiras da semana 5-12a.

a0s dados são médias de quatro replicados de 12 galinhas para semanas 5 até 12 do período de estudo. A dieta 1 foi removida do estudo devido a pobre produção de ovos. bProdução (%) de ovos analisada utilizando covariância; os dados apresentados são médias de mínimos quadrados. cDieta 3 vs dietas 4 e 5, P <0,01.

Efeito de fitase de E. coli no desempenho de galinhas poedeiras da semana l-12a.

(Continuação)

aOs dados são médias de quatro replicados de 12 galinhas. a0s dados são médias para as primeiras 4 semanas para dieta 1, mas para todas as 12 semanas para dietas 2-5. bProdução (%) de ovos analisada utilizando covariância; os dados apresentados são médias de mínimos quadrados. cDieta 1 vs dietas 2-5, P <0,01.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Phytex, L.L.C.

<120> ALIMENTO ANIMAL CONTENDO FITASE E MÉTODO <130> EP72 663HV015pau <140> ainda não atribuído <141> em anexo <150> EP 02 802 504.7 <151> 2002-10-31 <150> PCT/US02/34963 <151> 2002-10-31 <150> US 60/335303 <151> 2001-10-31 <160> 14 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 1489 <212> ADN <213> Escherichia coli <22 0> <221> iniciador_ligação <222> (1) . . (22) <22 0> <221> iniciador_ligação <222> (1468) .. (1489) <22 0>

<221> CDS <222> (16)..(108) <22 0>

<221> CDS <222> (182) .. (1480) <4 0 0> 1 taaggagcag aaaca atg tgg tat ttc ctt tgg ttc gtc ggc att ttg ttg 51

Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe val Gly tie Leu Leu 1 5 10 atg tgt teg etc tec ace ctt gtg ttg gta tgg ctg gac ceg ega ttg 99

Met Cys Ser Leu Ser Thr Leu val Leu val Trp Leu Asp Pro Arg Leu 15 20 25 aaa agt taa egaaegtaag cctgatccgg egeattageg tcgatcaggc 148

Lys ser 30 aataatateg gatatcaaag cggaaacata teg atg aaa geg ate tta ate cca 202

Met Lys Ala lie Leu lie Pro 35 ttt tta tet ctt ttg att ceg tta ace ccg caa tet gca ttc get cag 250

Phe Leu Ser Leu Leu lie Pro Leu Thr pro Gin ser Ala Phe Ala Gin 40 45 50 agt gag ccg gag ctg aag ctg gaa agt gtg gtg att gtc age cgt cat 298 ser Glu Pro G]jj Leu Lys Leu Glu Ser val val lie val Ser Arg Mis 55 60 65 ggt gtg cgt gee cca acc aag gee aeg caa ctg atg cag gat gtc acc 346

Gly val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gin Leu Met Gin Asp val Thr 70 75 80 85 cca gac gca tgg cca acc tgg ccg gta aaa ctg ggt tgg ctg aca cca 394

Pro Asp Ala Trp pro Thr Trp pro val Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro 90 95 100 tgt got got gag eta ate gcc tat etc gga cat tac caa ege cag cgt 442

Arg Gly Gly Glu Leu lie Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gin Arg Gin Arg 105 110 115 ctg gtg gcc gac gga ttg ctg gcg aaa aag ggc tgc ccg cag cct ggt 490

Leu val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys pro Gin Pro Gly 120 125 130 cag gtc gcg att att get gat gtc gac gag cgt acc cgt aaa aca ggc 538

Gin val Ala lie lie Ala Asp val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly 135 140 145 gaa gcc ttc gcc gcc gag ctg gca cct gac tgt gca ata acc gta cat 586

Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp cys Ala lie Thr val His 150 155 160 165 acc cag gca gat aeg tcc agt ccc gat ccg tta ttt aat cct eta aaa 634

Thr Gin Ala Asp Thr ser ser pro Asp Pro Leu Phe Asn pro Leu Lys 170 175 180 act ggc gtt tgc caa ctg gat aac gcg aac gtg act gac gcg ate etc 682 thr Gly val Cys Gin Leu Asp Asn Ala Asn val Thr Asp Ala lie Leu 185 190 195 age agg gca gga ggg tea att get gac ttt acc ggg cat egg caa aeg 730

Ser Arg Ala Gly Gly ser lie Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gin Thr 200 205 210 gcg ttt ege gaa ctg gaa egg gtg ett aat ttt tee caa tta aac ttg 778

Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg val Leu Asn Phe ser Gin Leu Asn Leu 215 220 225 tgc ett aac cgt gag aaa cag gac gaa age tgt tea tta aeg cag gca 826 cys Leu Asn Arg Glu Lys Gin Asp Glu ser cys ser Leu Thr Gin Ala 230 235 240 245 tta cca teg gaa etc aag gtg age gee gac aat gtt tea tta acc ggt 874

Leu Pro Ser Glu Leu Lys val Ser Ala Asp Asn val ser Leu Thr Gly 250 255 260 gcg gta age etc gca tea atg ctg aeg gaa ata ttt etc ctg caa caa 922

Ala val ser Leu Ala ser Met Leu Thr Glu lie Phe Leu Leu Gin Gin 265 270 275 gca cag gga atg ccg gag ccg ggg tgg gga agg ate act gat tea cac 970

Ala Gin Gly Met pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg lie Thr Asp Ser His 280 285 290 cag tgg aac acc ttg eta agt ttg cat aac gcg caa ttt tat tta eta 1018

Gin Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gin Phe Tyr Leu Leu 295 300 305 caa ege aeg cca gag gtt gcc ege agt ege gcc acc ccg tta ttg gat 1066

Gin Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp 310 315 320 325 ttg ate atg gca gcg ttg aeg ccc cat cca ccg caa aaa cag gcg tat 1114

Leu lie Met Ala Ala Leu Thr pro His Pro pro Gin Lys Gin Ala Tyr 330 335 340 ggt gtg aca tta ccc act tea gtg ctg ttt att gcc gga cac gat act 1162

Gly val Thr Leu Pro Thr ser val Leu phe lie Ala Gly His Asp Thr 345 350 355 aat ctg gca aat etc ggc ggc gca ctg gag etc aac tgg aeg ett cca 1210

Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro 360 365 370 ggt cag ccg gat aac aeg ccg cca gat gat gaa ctg gtg ttt gaa ege 1258

Gly Gin Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu val Phe Glu Arq 375 380 385 tgg cgt egg eta age gat aac age cag tgg att cag gtt teg ctg gtc 1306

Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gin Trp lie Gin val ser Leu val 390 395 400 405 ttc cag act tta cag cag atg cgt gat aaa aeg ceg eta tea tta aat 1354 phe Gin Thr Leu Gin Gin Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu ser Leu Asn 410 415 420 aeg ceg ccc gga gag gtg aaa ctg ace ctg gca gga tgt gaa gag ega 1402

Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg 425 430 435 aat gtg cag ggc atg tgt teg ttg gee ggt ttt aeg caa ate gtg aat 1450

Asn Ala Gin Gly Met cys ser Leu Ala Gly Phe Thr Gin lie Val Asn 440 445 450 gaa geg ege ata ccg geg tgc agt ttg taa tggtacccc 1489

Glu Ala Arg lie pro Ala Cys Ser Leu 455 460

<210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2

Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe val Gly lie Leu Leu Met Cys Ser Leu 1 5 10 15

Ser Thr Leu val Leu val Trp Leu Asp Pro Arg Leu Lys Ser 20 25 30

<210> 3 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <4Ο0> 3

Met Lys Ala lie Leu lie Pro Phe Leu ser Leu Leu lie Pro Leu Thr 1 5 10 15 pro Gin ser Ala Phe Ala Gin ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu ser 20 25 30 val val lie val Ser Arg His Gly val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr 35 40 45

Gin Leu Met Gin Asp Val Thr pro Asp Ala Trp pro Thr Trp pro val 50 55 60

Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu lie Ala Tyr Leu 65 70 75 80

Gly His Tyr Gin Arg Gin Arg Leu val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys 85 90 95

Lys Gly cys Pro Gin Pro Gly Gin val Ala lie lie Ala Asp val Asp 100 105 110

Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro 115 120 125

Asp cys Ala lie Thr val His Thr Gin Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp 130 135 140 pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly val Cys Gin Leu Asp Asn Ala 145 150 155 160

Asn Val Thr Asp Ala lie Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser lie Ala Asp 165 170 175

Phe Thr Gly His Arg Gin Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg val Leu 180 185 190

Asn Phe Ser Gin Leu Asn Leu Cys Leu ASn Arg Glu Lys Gin Asp Glu 195 200 205

Ser Cys ser Leu Thr Gin Ala Leu Pro ser Glu Leu Lys val ser Ala 210 215 220

Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr 225 230 235 240

Glu lie Phe Leu Leu Gin Gin Ala Gin Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp 245 250 255

Gly Arg lie Thr Asp Ser His Gin Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His 260 265 270

Asn Ala Gin Phe Tyr Leu Leu Gin Arg Thr Pro Glu val Ala Arg Ser 275 280 285

Arg Ala Thr pro Leu Leu Asp Leu lie Met Ala Ala Leu Thr Pro His 290 295 300

Pro Pro Gin Lys Gin Ala Tyr Gly val Thr Leu Pro Thr Ser val Leu 305 310 315 320

Phe lie Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu 325 330 335

Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gin Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly 340 345 350

Gly Glu Leu val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gin 355 360 365

Trp lie Gin val Ser Leu Val Phe Gin Thr Leu Gin Gin Met Arg Asp 370 375 380

Lvs Thr Pro Leu ser Leu Asn Thr pro Pro Gly Glu val Lys Leu Thr 385 390 395 400

Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gin Gly Met Cys ser Leu Ala 405 410 415

Gly Phe Thr Gin Tie val Asn Glu Ala Arg lie Pro Ala Cys Ser Leu ° y 420 425 430

<210> 4 <211> I486 <2l2> ADN <2l3> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (188) .. (1483) <400> 4 taaggagcag aaacaatgtg gtatttactt tggttcgtcg gcattttgtt gatgtgttcg 60 ctctccaccc ttgtgttggt atggctggac ccgcgattga aaagttaacg aacgtaggcc 120 tgatgcggcg cattagcatc gcatcaggca atcaataatg tcagatatga aaagcggaaa 180 catatcg atg aaa gcg ate tta ate cca ttt tta tet ett ctg att ccg 229

Met Lys Ala lie Leu lie Pro Phe Leu Ser Leu Leu lie Pro 1 5 10 tta ace ccg caa tet gca ttc get cag agt gag ccg gag ctg aag ctg 277

Leu Thr pro Gin Ser Ala phe Ala Gin ser Glu pro Glu Leu Lys Leu IS 20 25 30 gaa agt gtg gtg att gte age cgt cat ggt gtg cgt gcc cca acc aag 325

Glu Ser val val lie val ser Arg His Gly val Arg Ala Pro Thr Lys 35 40 45 gcc aeg caa ctg atg cag gat gtc acc cca gac gca tgg cca acc tgg 373

Ala Thr Gin Leu Met Gin Asp val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp 50 55 60 ccg gta aaa ctg got tgg ctg aca cca ege ggt ggt gag eta ate gcc 421

Pro val Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu lie Ala 65 70 75 tat etc gga cat tac caa ege cag cgt ctg gtg gee gac gga ttg ctg 469

Tyr Leu Gly His Tyr Gin Arg Gin Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu 80 85 90 gcg aaa aag ggc tgc ccg cag cct ggt cag gtc gcg att att gtc gat 517

Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gin Pro Gly Gin val Ala lie lie val Asp 95 100 105 110 gtc gac gag cgt acc cgt aaa aca ggc gaa gee ttc gee gcc ggg ctg 565 val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu 115 120 125 gca cct gac tgt gca ata acc gta cat acc cag gca gat aeg tee agt 613

Ala Pro Asp cys Ala lie Thr val His Thr Gin Ala Asp Thr ser ser 130 135 140 , ccc gat ccg tta ttt att cct eta aaa act ggc gtt tgc caa ctg gat 661

Pro Asp Pro Leu Phe lie Pro Leu Lys Thr Gly Val cys Gin Leu Asp 145 150 155 aac gcg aac gtg act gac gcg ate etc age agg gca gga ggg tea att 709

Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala lie Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser lie 160 165 170 get gac ttt acc ggg cat egg caa aeg gcg ttt ege gaa ctg gaa egg 757

Ala asp Phe Thr Gly His Arg Gin Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg 175 180 185 19Õ gtg ett aat ttt ccg caa tea aac ttg aac ett aaa cgt gag aaa cag 805

Val Leu Asn Phe Pro Gin ser Asn Leu Asn Leu Lys Arg Glu Lys Gin 195 200 205 aat gaa age tgt aac tta aeg cag gca tta cca teg gaa etc aag gtg 853

Asn Glu Ser cys Asn Leu Thr Gin Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val 210 215 220 age gee gac aat gtt tea tta ace ggt geg gta age etc gca tea atg 901

Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr cTy Ala val Ser Leu Ala Ser Met 225 230 235 ctg aeg gaa ata ttt etc ctg caa caa gca cag gga atg ccg gag ccg 949

Leu Thr Glu lie Phe Leu Leu Gin Gin Ala Gin Gly Met Pro Glu Pro 240 245 250 999 tgg gga agg ate act gat tea cac cag tgg aac acc ttg eta agt 997

Gly Trp Gly Arg lie Thr Asp Ser His Gin Trp Asn Thr Leu Leu Ser 255 260 265 270 ttg cat aac geg caa ttt tat tta eta caa ege aeg cca gag gtt gcc 1045

Leu His Asn Ala Gin Phe Tyr Leu Leu Gin Arg Thr Pro Glu val Ala 275 280 285 ege agt ege gcc acc ccg tta ttg gat ttg ate aag aca geg ttg aeg 1093

Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu lie Lys Thr Ala Leu Thr 290 295 300 ccc cat cca ccg caa aaa cag geg tat ggt gtg aca tta ccc act tea 1141

Pro His Pro Pro Gin Lys Gin Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser 305 310 315 gtg ctg ttt att gcc gga cac gat act aat ctg gca aat etc ggc ggc 1189

Val Leu Phe lie Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly 320 325 330 gca ctg gag etc aac tgg aeg ett cca ggt cag ccg gat aac aeg ccg 1237

Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gin Pro Asp Asn Thr pro 335 340 345 350 cca ggt ggt gaa ctg gtg ttt gaa ege tgg cgt egg eta age gat aac 1285

Pro Gly Gly Glu Leu val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn 355 360 365 age cag tgg att cag gtt teg ctg gtc ttc cag act tta cag cag atg 1333

Ser Gin Trp lie Gin Val Ser Leu val Phe Gin Thr Leu Gin Gin Met 370 375 380 cgt gat aaa aeg ccg eta tea tta aat aeg ccg ccc gga gag gtg aaa 1381

Arg Asp Lys Thr pro Leu ser Leu Asn Thr Pro pro Gly Glu val Lys 385 390 395 ctg acc ctg gca gga tgt gaa gag ega aat geg cag ggc atg tgt teg 1429

Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gin Gly Met Cys Ser 400 405 410 ttg gcc ggt ttt aeg caa ate gtg aat gaa geg ege ata ccg geg tgc 1477

Leu Ala Gly Phe Thr Gin lie val Asn Glu Ala Arg lie Pro Ala Cys 415 420 425 430 agt ttg taa i486

Ser Leu

<210> 5 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 wet Lys Ala lie Leu lie Pro Phe Leu ser Leu Leu lie Pro Leu Thr 1 5 10 15

Pro Gin Ser Ala Phe Ala Gin Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser 20 25 30 val val lie Val Ser Arg His Gly val Arg Ala pro Thr Lys Ala Thr 35 40 45

Gin Leu Met Gin Asp val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro val 50 55 60

Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu lie Ala Tyr Leu 65 70 75 80

Gly His Tyr Gin Arg Gin Arg Leu val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys 85 90 95

Lys Gly cys Pro Gin Pro Gly Gin val Ala lie lie val Asp val Asp 100 105 110

Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro 115 12Ό 125

Asp cys Ala lie Thr val his Thr Gin Ala Asp Thr ser ser Pro Asp 130 135 140

Pro Leu Phe lie Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gin Leu Asp Ash Ala 145 150 155 160

Asn val Thr Asp Ala lie Leu ser Arg Ala Gly Gly ser lie Ala Asp 165 170 175

Phe Thr Gly His Arg Gin Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu 180 185 190

Asn Phe Pro Gin ser Asn Leu Asn Leu Lys Arg Glu Lys Gin Asn Glu 195 200 205

Ser cys Asn Leu Thr Gin Ala Leu Pro ser Glu Leu Lys val ser Ala 210 215 220

Asp Asn vai Ser Leu Thr Gly Ala Vai ser Leu Alá Ser Met Leu Thr 225 230 235 240

Glu lie Phe Leu Leu Gin Gin Ala Gin Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp 245 250 255

Gly Arg lie Thr Asp ser His Gin Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His 260 265 270

Asn Ala Gin Phe Tyr Leu Leu Gin Arg Thr Pro Glu vai Ala Arg Ser 275 280 285

Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu lie Lys Thr Ala Leu Thr Pro His 290 295 300 pro Pro Gin Lys Gin Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu 305 310 315 320

Phe lie Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu 325 330 335

Glu Leu Asn Trp Thr Leu pro Gly Gin pro Asp Asn Thr pro Pro Gly 340 345 350

Gly Glu Leu val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn ser Gin 355 360 365

Trp lie Gin val ser Leu val Phe Gin Thr Leu Gin Gin Met Arg Asp .370 375 380 I vs Thr Pro Leu ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr 385 390 395 400

Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gin Gly Me* Cys ser Leu Ala L 405 410 415

Gly Phe Thr Gin lie Val Asn Glu Ala Arg Tie Pro Ala cys ser Leu by 420 425 430

<210> 6 <211> 80 c212> ADN <2l3> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador para amplificar o gene appA. <400> 6 ggggtaccat gggcgtctct gctgttctac ttcctttgta tctcctgtct ggagtcacct 60 ccggacagag tgagccggag 80

<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador para amplificar o gene appA. <400> 7 gggaattcat tacaaactgc aggc 24

<210> 8 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador para amplificar o gene appA. <400> 8 ggaattccag agtgagccgg a 21

<210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador para amplificar o gene appA. <400> 9 ggggtacctt acaaactgca eg 22

<210> 10 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador para amplificar a amplificação por PCR da mutagénese de appA. <4 0 0> 10 ctgggtatgg ttggttatat tacagtcagg t 31

<210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador para amplificar a amplificação por PCR da mutagénese de appA. <4 Ο 0> 11 caaacttgaa ccttaaacgt gag 23

<210> 12 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador para amplificar a amplificação por PCR da mutagénese de appA. <4 0 0> 12 cctgcgttaa gttacagctt tcattctgtt t 31

<210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Escherichia coli <4 0 0> 13

Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe val Gly lie Leu Leu Met cys ser Leu 15 10 15 ser Thr Leu val Leu val Trp Leu Asp Pro Arg Leu Lys Ser 20 25 30

<210> 14 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <4 Ο 0> 14

Met Lys Ala lie Leu lie Pro Phe Leu Ser Leu Leu lie Pro Leu Thr pro Gin ser Ala Phe Ala Gin ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu ser 20 25 30 val val lie val ser Arg His Gly val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr 35 40 45

Gin Leu Met Gin Asp Val Thr pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro val 50 55 60

Lys Leu Gly Trp Leu Thr pro Arg Gly Gly Glu Leu lie Ala Tyr Leu 65 70 75 80

Gly His Tyr Gin Arg Gin Arg Leu Val Ala asp Gly Leu Leu Ala Lys 85 90 95

Lys Gly Cys Pro Gin Pro Gly Gin val Ala lie lie Ala Asp val Asp 100 105 110

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Leu Ala Gly cys Glu Glu Arg Asn Ala Gin Gly Met cys ser Leu Ala 405 410 415

Gly Phe Thr Gin Tie val Asn Glu Ala Arg lie Pro Ala Cys Ser Leu 420 425 430

Lisboa, 20 de outubro de 2016

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de reduzir a razão de alimentação para ganho de peso de um animal monogástrico fornecendo ao animal um alimento em que o alimento compreende hexaquisfosfato de mio-inositol, o método compreendendo o passo de alimentar o animal com o alimento em combinação com uma fitase de E. coli expressa em levedura, em que a razão de alimentação para ganho de peso do animal é reduzida, em que o animal é uma espécie aviária.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento.
3. 3. Método das reivindicações 1 a 2, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com desde cerca de 50 a cerca de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento.
4. 4. Método das reivindicações 1 a 2, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 1500 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento.
5. 5. Método das reivindicações 1 a 2, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 1200 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento.
6. 6. Método das reivindicações 1 a 5, em que a fitase possui uma atividade ótima a um pH de menos de cerca de 4.
7. 7. Método das reivindicações 1 a 6, em que a fitase expressa em levedura é clivada com uma protease para intensificar a capacidade da fitase de reduzir a razão de alimentação para ganho de peso do animal comparada a fitase expressa em levedura intacta.
8. 8. Método das reivindicações 1 a 7, em que a levedura é selecionada do grupo consistindo em espécies Saccharomyces, espécies Pichia, espécies Kluyveromyces, espécies Hansenula e espécies Candida.
9. 9. Utilização de uma composição compreendendo hexaquisfosfato de mio-inositol em combinação com uma fitase de E. coli expressa em levedura, para alimentar uma espécie aviária para reduzir a razão de alimentação para ganho de peso.
10. 10. Utilização da reivindicação 9, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com menos de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento.
11. 11. Utilização das reivindicações 9 a 10, em que o animal é alimentado com o alimento em combinação com desde cerca de 50 a cerca de 2000 unidades da fitase expressa em levedura por quilograma do alimento.
12. 12. Utilização das reivindicações 9 a 11, em que a levedura é selecionada do grupo consistindo em espécies Saccharomyces, espécies Pichia, espécies Kluyveromyces, espécies Hansenula e espécies Candida. Lisboa, 20 de outubro de 2016