JP2015511125A - フィチン酸によるフィターゼの安定性の改良、並びにフィターゼ及びフィチン酸を含む組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮出願特許第61/595,923号(2012年2月7日出願)に対する優先権を請求するものであり、該特許文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本教示は、フィチン酸によりフィターゼを安定化する方法に関する。本教示は、フィターゼ及びフィチン酸を含む組成物、顆粒剤、ペレット、及び酵素溶液にも関する。更に、本教示は、フィターゼ及びフィチン酸を含む組成物、フィターゼの熱安定性を含む安定性の改良方法、フィターゼ活性の回収性の改良方法、並びに加熱処理食品又は動物用飼料ペレットの製造方法にも関する。本教示は、本教示の組成物、顆粒剤、ペレット、ペレット改良組成物、及び酵素溶液を使用する、加熱処理食品又は動物用飼料ペレットの製造方法にも関する。
配列番号1は、ブチアウキセラ(Buttiauxella sp.)のフィターゼ変異体BP17のものであり、この変異体は、野生型(配列番号4)と比較して12箇所にアミノ酸置換を含み、シグナル配列(配列番号12)は欠損している。
配列番号2は、ブチアウキセラ(Buttiauxella sp.)のフィターゼ変異体BP11のものであり、この変異体は、野生型(配列番号4)と比較して11箇所にアミノ酸置換を含み、シグナル配列(配列番号12)は欠損している。
配列番号3は、ブチアウキセラ(Buttiauxella sp.)のフィターゼ変異体BP111のものであり、この変異体は、野生型(配列番号4)と比較して21箇所にアミノ酸置換を含み、シグナル配列(配列番号12)は欠損している。
配列番号4は、受託番号NCIMB 41248下で寄託されているブチアウキセラ(Buttiauxella sp.)のP 1〜29株によりコードされている野生型フィターゼのものであり、シグナル配列(配列番号12)を欠損している。
配列番号5は、追加のアミノ酸置換E121Tを有するBP17である。
配列番号6は、追加のアミノ酸置換P394Nを有するBP17である。
配列番号7は、追加のアミノ酸置換D386Nを有するBP17である。
配列番号8は、追加のアミノ酸置換K202N及びN204Tを有するBP17である。
配列番号9は、追加のアミノ酸置換Q151N及びP153Sを有するBP17である。
配列番号10は、追加のアミノ酸置換P373Tを有するBP17である。
配列番号11は、追加のアミノ酸置換Q76Nを有するBP17である。
配列番号12は、野生型シグナル配列である(配列番号4)。
本明細書で使用するとき、用語「フィチン酸」は、イノシトール六リン酸(IP6)を指すが、一般的に、IP6は純粋な形態では存在しておらず、この用語は、IP6の分解産物である、イノシトール五リン酸(IP5)、イノシトール四リン酸(IP4)、イノシトール三リン酸(IP3)、イノシトール二リン酸(IP2)、及びイノシトール一リン酸(IP1)、これらの塩類、並びにこれらの混合物などを含むイノシトールリン酸も包含する。用語「フィチン酸」は、イノシトールを指すものではなく、完全に加水分解された生成物であるフィチン酸(IP0)を指す。したがって、用語「フィチン酸」は、分解産物、加水分解産物、塩類及び類似体(例えば、エステル類及び塩類)を包含する。本明細書で使用するとき、用語IP6、IP5、IP4、IP3、IP2、IP1、及びこれらの塩類は、特定のイノシトールリン酸の任意の異性体を指す。
本教示は、モル過剰量の基質又は可能性のある基質類似体とのプレインキュベート後にフィターゼ酵素を熱安定化することにより、乾燥又は液体形態のいずれの酵素においても安定性が生じるという驚くべき観察結果を提供する。より詳細には、本教示は、フィターゼの安定性は、フィターゼと機能上近接しているフィチン酸を含有させることにより向上することができるということを提供する。更に、本教示は、過剰量のフィチン酸により食品及び動物用飼料の加工中のフィターゼの安定性を向上することができ、かつ向上されたフィターゼ活性を有する加熱処理食品及び動物用飼料ペレットを得ることができるということを提供する。
一部の実施形態では、フィチン酸は、非加水分解性のイノシトールリン酸であるIP6を含む。典型的には、市販のフィチン酸は純粋なIP6ではない。一部の実施形態では、フィチン酸は部分的に加水分解されたイノシトールリン酸(例えば、IP6、IP5、IP4、IP3、IP2、及びIP1)の混合物である。したがって、有用な種類のフィチン酸はフィチン酸分解産物、加水分解産物、塩類、及び類似体(例えば、エステル及び塩類)である。本教示において使用するためのフィチン酸源にはイノシトール(フィチン酸の完全加水分解産物−IP0)も存在し得るものの、我々は、同一の条件下ではイノシトールはフィターゼを安定化しないことを見出している。したがって、本教示に従うと、飼料又は食品組成物におけるフィターゼの安定化にはイノシトールリン酸が有用である。
本明細書で使用するとき、用語「フィターゼ」は、フィチン酸塩及びフィチン酸を含有するリン酸エステルの加水分解を触媒し、無機リン酸塩を放出することのできるタンパク質又はポリペプチドを意味する。一部のフィターゼは、フィチン酸塩の他に、中程度にリン酸化されている少なくとも一部のイノシトールリン酸塩を加水分解することができる。
一実施形態では、フィターゼ及び/又はフィチン酸は溶液である。
フィターゼの安定性は、液体状態及び/又は固体状において、フィチン酸の使用により安定化されていない対照フィターゼと比較して向上させることができる。
酵素の熱安定性を測定するための方法の1つには、酵素の変性温度(Tm)を測定するというものがある。
一実施形態では、組成物は液体飼料などの液体である。
コア、顆粒剤、及び多層化顆粒剤は、回転噴霧、湿式造粒、乾式造粒、噴霧乾燥、ディスクペレッター式造粒、押出成型、パンコーティング、球状化、ドラム式造粒、流動層式凝集、高せん断下造粒、流動層噴霧コーティング、結晶化、沈殿、エマルションゲル、スピニングディスク式噴霧、並びにその他の流延成形法、及び顆粒加工などの各種製造法により製造することができる。このような加工法は当該技術分野において知られており、米国特許第4689297号及び同第5324649号(流動層加工法)、欧州特許第656058(B1)号並びに米国特許第454332号(押出加工法)、米国特許第6248706号(高せん断式造粒法)、並びに欧州特許第804532(B1)号及び米国特許第6534466号(流動層コア及びミキサーコーティングを利用する加工法の組み合わせ)に記載されている。
ペレットには、各種既知の何らかのペレット加工法に従い、例えば、以降に更に記載される加工法に従い、本明細書に記載の顆粒剤及び/又は多層化顆粒剤を含有させることができる。
一実施形態では、食品又は動物用飼料は液体飼料などの液体である。別の実施形態では、食品又は動物用飼料は固体である。本明細書で使用するとき、用語「動物」には、すべての動物、例えば、非反芻動物及び反芻動物(牛、羊、山羊及び馬など)が挙げられる。非反芻動物の例としては、豚、家禽(鶏及び七面鳥など)、魚(鮭など)、犬、猫及び人間などの単胃動物が挙げられる。一実施形態では、動物用飼料は鶏用飼料(鶏用飼料)である。一実施形態では、動物用飼料は豚(複数)(豚(単数))用飼料である。
本教示は、各種改質、例えば、グリコシル化を有する、フィターゼを提供する。詳細には、本開示はフィターゼのグリコシル化に関する。一部の実施形態では、本開示は、酵素を改質し又は変更を加え、グリコシル化部位を導入すること又はグリコシル化部位数を増加させることに関する。この改質は、ポリペプチドになすことができ、又はコードしている核酸になすことができる。一部の実施例では、改質酵素はフィターゼであり、一部の実施例では、酵素はフィターゼBP17である。フィターゼBP17のアミノ酸配列(配列番号1)は、NetNGlyc 1.0予測アルゴリズム(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)による解析に従うと、3箇所の潜在的なN結合型グリコシル化部位を含有する。グリコシル化されることが予想されるアスパラギン残基は、成熟型フィターゼBP17配列(シグナル配列を含まない)の残基N169、N173及びN285(下記の配列番号1においてボールド体で表記しかつ下線を付して示す)である。
更なる実施形態では、本開示は、製造工程中に酵素のグリコシル化度を増加させることにも関する。一部の実施例では、糸状菌宿主での発現が製造方法として使用され、例えば、トリコデルマ(Trichoderma)種の真菌、及び特に、例えばトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)における発現が使用される。
更なる実施形態では、記載の様相を組み合わせることができる。換言すれば、グリコシル化部位の数が増加するようアミノ酸配列を変更することにより改質されている記載の酵素は、改変宿主、例えば、endoT遺伝子を欠失している宿主において産生させることができる。これは酵素のグリコシル化度を最大化させる。一部の実施例では、宿主はトリコデルマ(Trichoderma)種の真菌であり、例えば、トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)である。
フィターゼを含む多層化顆粒剤にフィチン酸(Sigma)を組み込み、続く蒸気処理に向けフィターゼの保護を行った。次にこれらのフィターゼ含有顆粒剤を動物用飼料と混合し、蒸気処理が組み込まれている動物用飼料ペレット製造装置を通過させる。
酵素顆粒剤は、米国特許第5324649号に記載の流動層噴霧加工を使用し製造することができる。本明細書では、Vector FL−1流動層噴霧塗装機を使用した。フィターゼは12,000単位/g(総乾燥顆粒剤重量に基づく)で加えた。総顆粒剤の0.10重量%〜0.40重量%、又は酵素層中濃度15〜60ミリモル濃度でフィチン酸を加えた。硫酸ナトリウムシード(コアとも呼ばれる)を流動層チャンバに装填した。スクロース、トウモロコシデンプン、フィチン酸及び灯油又は菜種油又は消泡剤Foamblast 882(登録商標)限外ろ過フィターゼ濃縮物(UFC)に溶解させ、又は分散させて「噴霧液1」を調製した。固形分の総濃度を約40%に維持する目的で、この混合物に追加の水を加えた。トウモロコシデンプン及び灯油又は菜種油又は消泡剤の酵素UFCへの良好な分散を維持させるためには持続的に撹拌する必要があった。
次に、顆粒剤60gに対しトウモロコシ−大豆ミール120kgの割合で、多層化顆粒剤を60%コーンミール及び40%大豆ミールの混合物(すなわち、マッシュ)と加え合わせ混合した。ペレット化前の混合物における最終的なフィターゼ活性は、約5単位/gであった。
下表1.1中の計算は、0.1% w/wフィチン酸を装填した顆粒剤に関し見ることができるものであり、酵素層中のフィチン酸濃度は、酵素層固形分1kgあたり10.19ミリモルであり、すなわち10.19ミリモル濃度である。表3において示されるとおり、フィチン酸を0.1% w/w〜1.0% w/w(10.19〜101.9ミリモル濃度)で顆粒剤に使用した場合に、ペレット化性能の向上が観察された。
表1.2ペレット化試験において作製及び試験した顆粒剤処方例を要約する。
DSCは、1時間あたり90℃のスキャン速度を用い、20ミリモル濃度塩化カルシウムを加えた0.25M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5)中、0.5mg/mL(0.01ミリモル濃度)のBP17フィターゼ濃度に対し、MicroCal VP−DSCで実施した。すべてのフィチン酸サンプルのpHは、酢酸緩衝液及びフィターゼに対し添加する前に水酸化ナトリウムにより5.5に調整し、すべてのサンプルが確実に同一のpH(5.5)を有するようにした。すべてのサンプルに関し、DSCの参照セル中で酢酸緩衝液を測定した。
その他のフィターゼに対するフィチン酸の安定化に関し一般化の可能性を探索するため、DSMの顆粒剤製品Rononzyme P−(CT)から抽出されたフィターゼ抽出物を使用しDSC実験を実施した。
配列番号1
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- 組成物におけるフィターゼの安定性を向上させる方法であって、少なくとも10ミリモルのフィチン酸を前記組成物に導入することを含み、前記フィターゼ及び前記フィチン酸は機能上近接している、方法。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、溶液である、請求項1に記載の方法。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、固体状である、請求項1に記載の方法。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、固体基材に対し噴霧乾燥される、請求項1又は3に記載の方法。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、顆粒剤に組み込まれる、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記顆粒剤が多層化顆粒剤である、請求項5に記載の方法。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、多層化顆粒剤の同一の層に組み込まれる、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記顆粒剤が、食品又は動物用飼料に含有され、食品又は動物用飼料ペレットのペレット化後の活性回収率が、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%である、請求項5〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィターゼのDSC Tmが、少なくとも10ミリモル濃度のフィチン酸により安定化させていない対照フィターゼと比較して、少なくとも1℃、少なくとも1.3℃、少なくとも1.4℃、又は少なくとも1.5℃上昇している、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィターゼのDSC Tmが、少なくとも10ミリモル濃度のフィチン酸により安定化させていない対照フィターゼと比較して、少なくとも2℃、少なくとも4℃、少なくとも6℃、少なくとも7℃、少なくとも7.5℃、少なくとも7.6℃、少なくとも8℃上昇している、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記安定化させたフィターゼと少なくとも1種の食品又は動物用飼料原料とを混合し、得られた混合物を蒸気処理によりペレット化した後の前記フィターゼ活性が、少なくとも10ミリモル濃度のフィチン酸により安定化させていない対照フィターゼのフィターゼ活性と比較して少なくとも15%、少なくとも17%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも23%、少なくとも25%、少なくとも27%、又は少なくとも30%高い、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記安定化させたフィターゼと少なくとも1種の食品又は動物用飼料原料とを混合し、前記得られた混合物を蒸気処理によりペレット化した後、前記フィターゼ活性が、少なくとも10ミリモル濃度〜150ミリモル濃度の濃度範囲の対照フィターゼのフィターゼ活性と比較して少なくとも15%、少なくとも17%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも23%、少なくとも25%、少なくとも27%、又は少なくとも30%高い、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記食品又は前記動物用飼料が液体である、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記フィターゼがフィターゼBP17である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィターゼがRonozyme P−(CT)である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィターゼが、エンドN−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の欠失を含むトリコデルマ(Trichoderma)宿主細胞において産生されたフィターゼBP17である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- フィチン酸及びフィターゼを含む顆粒剤組成物であって、前記フィターゼ及び前記フィチン酸が機能上近接している、組成物。
- 前記フィチン酸が少なくとも10ミリモル濃度、少なくとも20ミリモル濃度、少なくとも30ミリモル濃度、少なくとも50ミリモル濃度、少なくとも80ミリモル濃度、又は少なくとも100ミリモル濃度であり、前記フィターゼが500ミリモル濃度未満、400ミリモル濃度未満、300ミリモル濃度未満、200ミリモル濃度未満、150ミリモル濃度未満、又は100ミリモル濃度未満である、請求項17に記載の組成物。
- 前記フィチン酸が10〜100ミリモル濃度、20〜90ミリモル濃度、30〜80ミリモル濃度、又は40〜70ミリモル濃度である、請求項18に記載の組成物。
- 前記フィターゼが、対照フィターゼと比較して安定的である、請求項17〜19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、固体基材に対し噴霧乾燥される、請求項17〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、多層化顆粒剤に組み込まれる、請求項17〜21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フィターゼ及び前記フィチン酸が、前記多層化顆粒剤の同一層に組み込まれる、請求項22に記載の組成物。
- 前記安定度がDSC Tmの上昇を含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記フィターゼのDSC Tmが、少なくとも10ミリモル濃度のフィチン酸により安定化させていない対照フィターゼと比較して少なくとも1℃、少なくとも1.3℃、少なくとも1.4℃、又は少なくとも1.5℃だけ上昇している、請求項24に記載の組成物。
- 前記フィターゼのDSC Tmが、少なくとも10ミリモル濃度の濃度範囲のフィチン酸により安定化させていない対照フィターゼと比較して少なくとも2℃、少なくとも4℃、少なくとも6℃、少なくとも7℃、少なくとも7.5℃、少なくとも7.6℃、少なくとも8℃上昇している、請求項20に記載の組成物。
- 前記フィターゼと少なくとも1種の食品又は動物用飼料原料とを混合し、前記得られた混合物を蒸気処理によりペレット化した後の前記フィターゼの活性回収率が、フィチン酸により安定化させていない対照フィターゼと比較して少なくとも15%、少なくとも17%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも23%、少なくとも25%、少なくとも27%、又は少なくとも30%高い、請求項17〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記安定化させたフィターゼと少なくとも1種の食品又は動物用飼料原料とを混合し、前記得られた混合物を蒸気処理によりペレット化した後の前記フィターゼの活性回復率が、少なくとも10ミリモル濃度のフィチン酸により安定化させていない対照フィターゼの活性回復率と比較して少なくとも15%、少なくとも17%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも23%、少なくとも25%、少なくとも27%、少なくとも30%、少なくとも32%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも42%、又は少なくとも45%高い、請求項17〜26のいずれか一項に記載の方法。
- イノシトール六リン酸、イノシトール五リン酸、イノシトール四リン酸、イノシトール三リン酸、イノシトール二リン酸、イノシトール一リン酸、並びに前記フィターゼによる前記フィチン酸の加水分解により生じるこれらの混合物などのリン酸化度の低いイノシトールリン酸塩を含む、請求項17〜28のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フィターゼが、フィターゼBP17又はRononzyme P−(CT)である、請求項17〜29のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フィターゼが、前記エンドN−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子の欠失を含むトリコデルマ(Trichoderma)宿主細胞において産生されたフィターゼBP17である、請求項17〜30のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記フィターゼと少なくとも1種の食品又は動物用飼料原料とを混合し、得られた混合物を蒸気処理によりペレット化した後の、固体状のフィターゼの活性回収率を向上させる方法であって、
少なくとも10ミリモル濃度のフィチン酸を前記フィターゼに対し提供する工程と、
前記フィターゼと少なくとも1種の食品又は動物用飼料原料とを混合する工程と、
前記得られた混合物を蒸気処理によりペレット化する工程と、を含み、
前記フィターゼの活性回収率が、少なくとも10ミリモル濃度のフィチン酸により安定化させていない対照フィターゼと比較して少なくとも15%、少なくとも17%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも23%、少なくとも25%、少なくとも27%、又は少なくとも30%高い、方法。 - 顆粒剤を含むペレット組成物であって、前記顆粒剤がフィチン酸及びフィターゼを機能上近接させて含み、前記フィチン酸の濃度が少なくとも10ミリモル濃度である、ペレット組成物。
- 前記顆粒剤が多層化顆粒剤である、請求項33に記載の組成物。
- 前記フィターゼ及びフィチン酸が、前記多層化顆粒剤の同一層に組み込まれる、請求項34に記載の組成物。
- 前記顆粒剤が、硫酸ナトリウムコアを更に含み、前記フィチン酸及びフィターゼが前記硫酸ナトリウムコアを取り囲む層に含有され、前記フィチン酸及びフィターゼ層がデンプン、スクロース、及び菜種油を含み、前記組成物が、硫酸ナトリウムを含む第1の外側コーティング、並びにPVA及びタルクを含む第2の外側コーティングを更に含む、請求項1〜16及び32のいずれか一項に従って製造された請求項17〜31及び33〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記顆粒剤が、硫酸ナトリウムコアを更に含み、前記フィチン酸及びフィターゼが前記硫酸ナトリウムコアを取り囲む層に含有され、前記フィチン酸及びフィターゼ層がデンプン、スクロース、及び菜種油を含み、前記組成物が、PVA及びタルクを含む第1の外側コーティング、スクロース及びデンプンを含む第2の外側コーティング、並びにPVA及びタルクを含む第3の外側コーティングを更に含む、請求項1〜16及び32のいずれか一項に従って製造された請求項17〜31及び33〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- 加熱処理食品又は動物用飼料ペレットの製造方法であって、
請求項17〜30及び32〜36のいずれか一項に記載の組成物を、少なくとも1種の食品又は動物用飼料原料と混合する工程と、
得られた前記混合物を蒸気によりペレット化する工程と、を含む、製造方法。 - 飼料組成物の製造方法であって、
試料成分を、コア及びコーティングを含む顆粒剤と混合する工程であって、前記コアが、フィターゼ及びフィチン酸を機能上近接させて含む、混合する工程と、
前記組成物を蒸気処理する工程と、
前記組成物をペレット化する工程と、を含む、製造方法。 - 前記コーティングが塩を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記塩が、クエン酸ナトリウム、NaCl、Na2CO3、NaNO3、Na2HPO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4、NH4H2PO4、(NH4)2SO4、KCl、K2HPO4、KH2PO4、KNO3、Na2SO4、K2SO4、KHSO4、MgSO4、ZnSO4、及びCuSO4からなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記フィチン酸の濃度が、少なくとも10ミリモル濃度である、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィターゼがBP17である、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィターゼがRonozyme P−(CT)である、請求項39〜43のいずれか一項に記載の方法。
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