JP2010517572A - 改変した特性を有する変異ブティアウクセラ（ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）属種フィターゼ - Google Patents

Abstract

本発明は改変した特性を有する変異フィターゼ酵素に関するものである。
【選択図】図４

Description

本発明は、変異ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）属種フィターゼ、当該フィターゼをコードする核酸、及び異種発現の方法に関する。本発明で包含されるフィターゼは、でんぷん液化の方法、アルコール発酵の方法、及び食物や動物の飼料におけるリン酸塩の消化の促進方法を含む産業用途で使用され得る。

リン（Ｐ）は成長に必須の元素である。従来の家畜の飼料、例えば、穀物、植物性油かす、及び種子に由来する副生産物で見られるリンのかなりの量が、フィチン酸塩として知られている分子中に共有結合しているリン酸の形態である。この形態のリンのバイオアベイラビリティは一般的に、家禽や豚のような非反すう動物においてかなり低い。なぜなら、非反すう動物ではフィチン酸塩分子からリンを分離するための消化酵素を欠いているためである。

非反すう動物がフィチン酸塩を利用できないことのいくつかの重要な結果が注目される。例えば、無機リン（例えば、第二リン酸カルシウム、脱フッ素化リン酸塩）又は動物性食品（例えば、肉と骨粉、フィッシュミール）がリンにおける動物の栄養必要量を満たすために加えられる場合、費用が発生する。さらに、フィチン酸塩は、胃腸管内の多くの鉱物（例えば、カルシウム、亜鉛、鉄、マグネシウム、及び銅）と結合又はキレートし、それにより、それらの鉱物を吸収できない状態にする。その上、飼料中に存在するフィチン酸塩の大部分は、肥料内のリン量を増やしながら胃腸管を通り抜ける。これにより、環境に負担となる生態学上のリンが増加される。

飼料添加物としての微生物フィターゼは、典型的な非反すう動物の食料でフィチン酸リンのバイオアベイラビリティを改良することがわかっている（Ｃｒｏｍｗｅｌｌ他、１９９３年等参照）。結果として、動物の飼料中へ無機リンを添加する必要性が減少し、同様に排出された肥料中のリン濃度を低下させる。（Ｋｏｒｎｅｇａｙ他、１９９６年等参照）。飼料添加物に加えて、フィターゼは低フィチン飼料部分の生産に使用され得る。例えば、フィターゼは、低フィチンのコーンスチープ（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ）酒及び低フィチンのコーングルテン（ｃｏｒｎ ｇｌｕｔｅｎ）等の生産に用いられる穀物の湿式粉砕、又は、グルコース及びアルコール（例えば、エタノール）の生産に用いられるでんぷん加水分解酵素と組み合わせた乾式粉砕等で使用され得る。

フィターゼをこれらの用途で使用する利点にも関わらず、驚くべきことに、公知のフィターゼの大部分は、飼料、でんぷん液化、及びアルコール発酵産業において幅広い支持を得ていない。この理由は酵素により異なる。典型的な懸念事項は、所望の用途の環境における酵素の高い製造コスト、及び／又は、不十分な安定性／活性に関する。フィターゼが産業用途における広範囲な使用に魅力的である場合、フィターゼは多くの酵素学的評価基準を満たすべきである。重要な酵素学的評価基準としては、高い総合的比活性度、低ｐＨ最適条件、胃腸タンパク質分解酵素への耐性及び熱安定性を含む。

熱安定性は、飼料用酵素としてのフィターゼの成功した用途及びでんぷん液化処理での使用に最も重要な前提条件の１つである。なぜなら、飼料及び／又は液化処理においてフィターゼは高温にさらされるためである。例えば、飼料のペレット化処理において、温度は６０乃至９５℃であり、でんぷん液化処理において、温度は７５乃至１２０℃である。

フィターゼをコードするブティアウクセラ属種Ｐ１−２９遺伝子のＤＮＡ配列は、２００６年４月２７日に公開された、国際公開番号ＷＯ０６／０４３１７８で報告された。同報告の配列番号１と配列番号２、及びブティアウクセラ属種Ｐ１−２９（配列番号３）のフィターゼ遺伝子のアミノ酸配列を参照されたい。様々な固有特性に基づいて、前記ブティアウクセラ属種Ｐ１−２９フィターゼは、種々の商業的用途に用いられる熱安定フィターゼにおける変異誘発プログラムを開始する優れた出発点となった。国際公開番号ＷＯ０６／０４３１７８は、ブティアウクセラ属種Ｐ１−２９フィターゼの多数の変異体を開示する（表１等参照）。国際公開番号ＷＯ０６／０４３１７８で開示され、本明細書でＢＰ−１１として指定される変異体等、少なくとも１の変異体が、さらに修飾されている。本発明は、ブティアウクセラ属種Ｐ１−２９フィターゼ又はＢＰ−１１変異体と比べ、例えばａ）改良された熱安定性、ｂ）増加された比活性、及び／又はｃ）熱安定性を保持しつつ増加された比活性を有するがそれらに限られない、改良された特性等の改変された特性を有する変異体に関する。

一の側面において本発明は、フィターゼをコードする変異ＤＮＡ配列の発現産物であるフィターゼに関し、前記変異ＤＮＡ配列はブティアウクセラ属種フィターゼの前駆体に由来する。一の実施態様において前記フィターゼは、ブティアウクセラ属種株Ｐ１−２９に由来する。

他の側面において本発明は、フィターゼ変異体に関し、前記変異体は、ブティアウクセラ属種株Ｐ１−２９に由来するフィターゼのＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に対応する置換を含む。

別の側面において本発明は、配列番号１のＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に対応する置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３４から４４６の変異置換を含めて少なくとも９５％の配列同一性を有する単離フィターゼに関する。一の実施態様において前記置換は、配列番号１のＡ１２２Ｔ、Ｄ１２５Ａ、Ｔ１６７Ｉ、Ｆ１９７Ｓ、Ｔ２０９Ｋ、Ａ２１１Ｐ、Ｋ２４０Ｅ、Ａ２４２Ｓ、Ｓ２８１Ｌ、Ｑ２８９Ｙ、Ａ２９４Ｅ、及びＮ３０３Ｋを含む。別の実施態様において前記置換は、配列番号１のＲ５１、Ｒ５５、Ｔ５８、Ｋ５９、Ｄ１２５、Ｒ１２７、Ｋ１６４、Ｎ２３９、Ｇ２４８、Ｔ２５２、Ｅ２５５、Ｅ２７６、Ｈ２８６、Ｆ２９０、Ｍ２９３、Ｎ３０３、Ｈ３３９、Ｄ３４０、Ｔ３４１、及び／又はＤ３６１の位置に対応する。

追加の側面において本発明は、ＢＰ−１１に指定されたフィターゼの変異体に関し、前記変異体が配列番号４のＲ２４、Ｒ２８、Ｔ３１、Ｋ３２、Ｄ９８、Ｒ１００、Ｋ１３７、Ｎ２１２、Ｇ２２１、Ｔ２２５、Ｅ２２８、Ｅ２４９、Ｈ２５９、Ｆ２６３、Ｍ２６６、Ｎ２７６、Ｈ３１２、Ｄ３１３、Ｔ３１４、及び／又はＤ３３４の位置に対応する置換を含む。一の実施態様においてＢＰ−１１の変異体は、Ｄ９８に対応する位置に置換を有する。好ましい実施態様において、前記置換はＤ９８Ａである。

さらに別の側面において本発明は、配列番号３を含む、フィターゼ活性を有するポリペプチドに関する。一の実施態様において本発明は、配列番号３のアミノ酸配列から成る、フィターゼ活性を有するポリペプチドに関する。

他の側面において本発明は、本発明で包含されるフィターゼ変異体をコードする単離ＤＮＡ及び前記ＤＮＡを含む発現ベクターに関する。

さらに他の側面において本発明は、改良したフィターゼの特性を有する変異ブティアウクセラ属種に関する。一の実施態様において前記改良したフィターゼの特性は、天然のブティアウクセラ属種、より明確には株Ｐ１−２９に由来するブティアウクセラ属種フィターゼと比べ、強化された熱安定性となる。他の実施態様において前記変異体は、ＢＰ１１と比べ、改良された特性を有する。

他の側面において本発明は、フィターゼ活性を有するタンパク質を含む酵素組成物に関し、前記酵素組成物は産業用途で使用される。一の実施態様において前記酵素組成物は、動物飼料組成物と成り得る。他の実施態様において前記酵素組成物は、でんぷん分解（例えば、液化）処理で使用され得る。他の実施態様において、本発明で包含されるフィターゼを含む酵素組成物は、追加酵素、例えば、グルコアミラーゼ、アルファ・アミラーゼ、タンパク質分解酵素、セルラーゼ及びそれらの組み合わせ等を含む。

一の側面において本発明は、ブティアウクセラ属フィターゼ又は糸状真菌細胞の培地由来のそれらの変異体を含む発酵培地に関する。一の側面において糸状真菌細胞は、Ｔ．リーセイ等のトリコデルマ属細胞である。一の側面において前記フィターゼは、例えば、配列番号１、配列番号２又は配列番号３等のように配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する。

他の側面において本発明は、フィターゼ活性を有し、配列番号１と少なくとも７５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するフィターゼをコードする異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結された、糸状菌性の宿主細胞中で転写活性を有するプロモーターを含むＤＮＡ構築物で糸状菌性の宿主細胞を形質転換することにより、糸状菌性の宿主細胞中でフィターゼを生産する方法であって、前記形質転換された糸状菌性の宿主細胞を適切な培養地中で培養し、前記フィターゼの発現及び前記フィターゼを生産可能にする方法に関する。また、前記方法は、生産されたフィターゼを回収することを含む。一の実施態様において前記糸状菌性の宿主細胞は、Ｔ．リーセイ等のトリコデルマ属細胞である。一の側面において前記フィターゼは、配列番号１と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。他の側面において前記フィターゼは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の配列を有する。別の側面において本発明は、上記に概説された方法に従って得られたトリコデルマ属細胞である。

図１Ａは、天然のシグナル配列及び成熟タンパク質（配列番号２）を含む、ブティアウクセラ属 Ｐ１−２９（ＢＰ−ＷＴ）（配列番号１）由来のフィターゼ遺伝子にコードされたポリペプチドを表す。シグナル配列には、下線が引かれている。 図１Ｂは、シグナル配列を含まないが、Ｎ−端末Ｈｉｓタグを含む変異体ＢＰ−１１の成熟タンパク質を表す（配列番号４）。ＢＰ−１１変異体は、ＢＰ−ＷＴと並べた場合、１１アミノ酸残基の置換を有する。これらの置換は、図中で強調され、下線が引かれている。 図１Ｃは、変異ブティアウクセラ属フィターゼ（ＢＰ−１７）（配列番号３）の成熟タンパク質を表す。前記ＢＰ−１７変異体は、ＢＰ−１１と同様の１１のアミノ酸置換にさらに一の追加置換を有する。この置換は、図中で強調され、下線が引かれている。 図２は、実施例３でより詳細に記載される発現ベクターｐＣＤＰ（ＳＨＯＫ）を図解する。 図３は、実施例３で別途記載される大腸菌及びＢＰ−ＷＴで発現されたＢＰ−１７のｐＨプロフィールの比較を示す。 図４は、実施例３で別途記載されるＢＰ−ＷＴ及びＢＰ−１７変異体のペプシン耐性を示す。 図５は、実施例４で別途記載されるｐＴＲＥＸ４／フィターゼ融合構築物を図解する。 図６は、実施例６で別途記載されるｐＴＲＥＸ４／フィターゼ直接構築物を図解する

本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び学術的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者により通常理解されるものと同様の意義を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、「微生物学及び分子生物学辞典（ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ出版、ニューヨーク州（１９９４年）及びＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ、「ハーパー・コリンズ生物学辞典（ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ」、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ出版、ニューヨーク州（１９９１年）を使用することにより、本発明で使用されている多くの用語についての一般的意義が提供される。

本発明の実施又は試験において、本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料が使用され得るが、より好ましい方法及び材料を記載する。数値範囲において、範囲を定義する数値も包括される。他で指示されない限り核酸配列は、５’末端から３’末端の方向へそれぞれ左から右に記載され、アミノ酸配列はアミノ側からカルボキシ側の方向へ左から右に記載される。

本明細書で用いられる見出しは、全体として明細書を参照することによりもたらされる種々の側面又は実施態様を限定するものではない。従って、以下に定義される用語は、全体として明細書を参照することにより、より詳細に定義される。

定義
本明細書で使用される「フィターゼ」又は「フィターゼ活性」の語は、フィチン酸塩を加水分解して（１）ミオイノシトール、及び／又は、（２）それらの一、二、三、四、及び／又は五リン酸塩及び（３）無機リン酸塩とする反応の触媒となることが可能なタンパク質又はポリペプチドを示す。例えば、触媒活性を有する酵素は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ＥＣ番号３．１．３．８又はＥＣ番号３．１．３．２６で定義される。

本明細書で使用される「ブティアウクセラ属種フィターゼ」の語は、ブティアウクセラ属種から得られるフィターゼタンパク質を示す。一の実施態様において、ブティアウクセラ属種フィターゼは、ＮＣＩＭＢ（海産及び食品微生物のナショナルコレクション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍａｒｉｎｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ）、スコットランド、イギリス）登録番号ＮＣＩＭＢ４１２４８のアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様においてブティアウクセラ属種フィターゼは、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸残基３４から４４６を含む。

本明細書で使用される「ブティアウクセラ属種フィターゼに対応する」の語は、ブティアウクセラ属種フィターゼと同様の機能特性又は配列を有するが、ブティアウクセラ属種を起源として得られたとは限られない酵素を示す。

「ブティアウクセラ属」の語は、腸内細菌科のグラム陰性、条件的嫌気性細菌の属を示し、ブティアウクセラ属種は、Ｂ．ａｇｒｅｓｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｎｎｅｒａｓｅ、Ｂ．ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｅ、Ｂ．ｇａｖｉｎｉａｅ、Ｂ．ｉｚａｒｄｉｉ、Ｂ．ｎｏａｃｋｉａｅ、及びＢ．ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅを含む。ブティアウクセラ属種の株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）及びＤＳＭＺ、ドイツ国立生物学材料資源センター（ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ）から入手可能である。

「野生型フィターゼ」又は「野生型」の語は、自然界で見られるアミノ酸配列を有する酵素を示す。

「変異ブティアウクセラ属種フィターゼ」の語は、親フィターゼ又は前駆体フィターゼのアミノ酸配列に由来するが、少なくとも１のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は、欠失（これらを合わせて突然変異と言う）により、親フィターゼ又は前駆体フィターゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素を意味する。

「成熟フィターゼ」の語は、分泌シグナル配列の除去等のシグナル処理後のフィターゼを示す。

「ＢＰ−１１」の語は、配列番号４の７乃至４１９の位置のアミノ酸配列を含むフィターゼを示す。ＢＰ−１１は、配列番号１を有する野生型ブティアウクセラ属種フィターゼの変異体である。

「ＢＰ−１７」の語は、配列番号３のアミノ酸配列を含むフィターゼを示す。

本明細書で使用される「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。当業者に理解されるように、以下で定義され、本明細書でより詳細に記載される本発明の核酸配列は、タンパク質配列を作成するのに使用され得る。

「と同等のアミノ酸残基」、「に対応するアミノ酸」及びそれらと文法的に同等の語は、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列で示されるものと同様の位置及び効果を有するタンパク質のアミノ酸残基を示すよう本明細書で使用される。当業者は、比較するフィターゼタンパク質中の指定された残基との同等性を理解するであろう。

二のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列に関して「パーセント配列同一性」は、２つの配列が最適に並べられた場合、それらの配列において同一の残基のパーセンテージを示す。従って、８０％のアミノ酸配列同一性は、最適に並べられた二のポリペプチド配列中のアミノ酸の８０％が同一であることを意味する。パーセント同一性は、例えば、配列を並べ、二つの並べられた配列間の最もよく一致する位置になる具体的な数を計算し、これをより短い配列の長さで割り、その結果に１００をかけることによる、二個の分子間の配列情報を直接比較することで決定され得る。当該解析を補助するのに、例えば、「タンパク質配列及び構造の図（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編集、上巻３、３５３乃至３５８ページ、ペプチド解析に用いられるＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎによるローカル・ホモロジー・アルゴリズム（１９８１年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２、４８２乃至４８９ページに適応する、国立生物医学研究基金（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ワシントンＤＣにおけるＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．等の容易に利用可能なコンピュータ・プログラムが使用され得る。ヌクレオチド配列の同一性を決定するプログラムは、ウィスコンシン・シークエンス・アナリーシス・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８（ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、マディソン、ウィスコンシンから入手可能）で利用可能であり、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎによるアルゴリズムに依存する、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＧＡＰプログラムである。これらのプログラムは、メーカーにより推奨されるデフォルトパラメータと共に容易に利用され、上述のウィスコンシン・シークエンス・アナリーシス・パッケージで説明される。配列相同性の決定に適切なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３乃至４１０ページ（１９９０年）で記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。

本明細書で使用される、ポリペプチドとの関連での「特性」又はそれらと文法的に同等の語は、選択又は検出され得るポリペプチドの任意の特質又は属性を示す。これらの特性は、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、及び分泌される性質を含むが、それらに限られない。

「熱に安定」及び「熱安定の」の語は、高温にさらされた後に特定量の酵素活性を保有する本発明のフィターゼを示す。

熱安定性等の特性との関連での「増加した安定性」の語は、他のフィターゼと比べ、時間経過後に、より高く保有された酵素活性を示す。

本明細書で置換可能に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかで、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を示す。これらの語は、単鎖、二本鎖、又は三本鎖のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基、又は他の天然に、化学的に、生化学的に修飾された、非天然又は誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、それらに限られない。

本明細書で使用される「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を示し、個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）と同様に、コード領域に前後した領域を含む。

本明細書で使用される「ＤＮＡ構築物」、「形質転換ＤＮＡ」、および「発現ベクター」は、宿主細胞又は有機体へ配列を導入するのに使用されるＤＮＡを示し、本明細書で置換可能に使用される。前記ＤＮＡは、ＰＣＲ又は当業者に知られる任意の他の適切な技術によりｉｎ ｖｉｔｒｏで作成され得る。前記ＤＮＡ構築物、形質転換ＤＮＡ、又は組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれ得る。通常発現ベクター、ＤＮＡ構築物、又は形質転換ＤＮＡの組み換え発現カセット部分は、他の配列に混じって、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。好ましい実施態様において、発現ベクターは、宿主細胞で異種ＤＮＡ断片を組み込み、発現する性質を有する。

本明細書で使用される「ベクター」の語は、１以上の細胞型へ核酸を導入するよう設計されたポリヌクレオチド構築体を示す。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット等を含む。

本明細書で使用される、核酸配列を細胞に導入することに関連する「導入される」の語は、細胞内に核酸配列を転移するのに適切な任意の方法を示す。このような導入方法は、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、接合、及び形質導入を含むが、これらに限られない。また、前記方法は、真核又は原核細胞へ核酸配列が組み込まれることも含み、当該核酸配列は前記細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコン（ａｕｔｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）に変換され、又は一時的に発現される（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）ことを含む。

「最適アラインメント」の語は、最も高いパーセント同一性値を与えるアラインメントを示す。

「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は、本明細書で置換可能に使用される。本願の開示及び特許請求の範囲において、従来の一文字コードと三文字コードがアミノ酸残基に対して使用される。アミノ酸に対する三文字コードは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従って定義される。また、遺伝子情報の縮退のため、ポリペプチドは２以上のヌクレオチド配列によりコードされ得る。

本発明の変異体は［最初のアミノ酸残基／位置／置換されたアミノ酸残基］の順に記載される。例えば、配列番号１の５１の位置におけるアルギニン（Ｒ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換は、Ｒ５１Ｅとして表される。特定の位置で２以上のアミノ酸に置換される場合、当該置換は、１）Ｒ５１Ｅ、Ｒ５１Ａ、Ｒ５１Ｈ又はＲ５１Ｗ、２）Ｒ５１Ｅ、Ａ、Ｈ、又はＷ、又は３）Ｒ５１／Ｅ／Ａ／Ｈ／Ｗとして表される。特定のアミノ酸を示すことなく置換される位置が本明細書で示される場合、任意のアミノ酸残基が当該位置にあるアミノ酸残基と置換され得ることが理解される。変異フィターゼが他のフィターゼと比較し、欠失を含む場合、当該欠失は「^＊」で示される。例えば、Ｒ５１の位置での欠失は、Ｒ５１^＊として表される。２以上の連続したアミノ酸の欠失は、例えば、（５１−５４）^＊として示される。

「プロ配列」は、シグナル配列と成熟タンパク質の間のタンパク質の分泌に必要なアミノ酸配列である。プロ配列の分裂は、成熟活性タンパク質をもたらす。

「シグナル配列」又は「シグナル・ペプチド」の語は、タンパク質の成熟型又は前駆体型の分泌に関与する任意のヌクレオチド及び／又はアミノ酸の配列を示す。シグナル配列のこの定義は、機能的なものであり、タンパク質の分泌の遂行に関与する、タンパク質遺伝子のＮ−末端部によりコードされるそれら全てのアミノ酸配列を含むことを意味する。全てではないが、それらはしばしば、タンパク質のＮ−末端部又は前駆体タンパク質のＮ−末端部に結合される。

「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明に係るＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主を示す。

「に由来する」及び「から得られる」の語は、目的の有機体の株により作成された又は作成し得るフィターゼのみではなく、前記株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ、前記ＤＮＡ配列を含む宿主有機体で作成されるフィターゼも示す。さらに当該語は、合成及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ、目的のフィターゼの識別特性を有するフィターゼを示す。

「単離される」、「回収される」又は「精製される」の語は、それらの当初の環境から分離される物質を示す。

「飼料」及び「食物」はそれぞれ、動物及び人間によりそれぞれ食され、摂取され、消化されることを意図された又はそれに適した任意の天然又は人工の食べ物、食事等又は前記食事の成分を意味する。

「食物又は飼料添加物」は、食物又は飼料に添加されることを意図した又はそれに適した基本的に純粋な化合物又は複合成分組成物を示す。当該添加物は通常、ビタミン、鉱物又は酵素を強化し、キャリヤー及び／又は賦形剤に適した飼料等の１以上の化合物を含む。また、当該添加物は通常、動物の飼料に添加されるのに適した形態で供給される。

「でんぷん液化」の語は、でんぷんがより短い鎖でより粘着性の少ないデキストリンに変換される処理を示す。

「天然ブティアウクセラ属フィターゼ（ｎ−ブティアウクセラ属フィターゼ）」の語は、ブティアウクセラ属フィターゼの内因性発現により生産されるブティアウクセラ属フィターゼを示す。例えば、「ｎ−ブティアウクセラ属フィターゼ」の語は、ブティアウクセラ属種からブティアウクセラ属フィターゼ（すなわち配列番号１）の内因性発現を意味する。

「組み換えブティアウクセラ属フィターゼ（ｒ−ブティアウクセラ属フィターゼ）」、「組み換えにより発現したブティアウクセラ属フィターゼ」及び「組み換えにより生産したブティアウクセラ属フィターゼ」の語は、異種ポリヌクレオチドの発現により宿主細胞内で生産された成熟ブティアウクセラ属フィターゼタンパク質配列又は変異体を示す。例えば、「ｒ−ブティアウクセラ属フィターゼ」の語は、ブティアウクセラ属フィターゼ（すなわち、配列番号１、２又は３）が、ブティアウクセラ属フィターゼ又は変異体をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主で発現することを意味する。

「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関わる調節配列である。

「転写コントロール下」の語は、転写の開始又は促進に寄与する要素へ操作可能に連結されることに依存したポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写として当該技術分野によく理解される。

「翻訳コントロール下」の語は、ｍＲＮＡが形成された後に起こる制御過程を示すとして当該技術分野によく理解される。

本明細書で使用されるように、タンパク質及びそれらをコードする遺伝子を記載する場合、前記遺伝子に用いられる語はイタリック体で表される（例えば、ブティアウクセラ属フィターゼをコードする遺伝子）。一般に、タンパク質に用いられる語はイタリック体ではなく、一般に、最初の文字は大文字で書かれる。

「操作可能に連結された」の語は、複数の要素が機能的に関連するように配列された並列状態を示す。例えば、配列の転写をコントロールする場合、プロモーターは、コーディング領域に操作可能に連結されている。

「選択マーカー」の語は、導入された核酸又はベクターを含有する宿主を容易に選択することを可能にする、宿主で発現可能な遺伝子を示す。選択可能マーカーの例は、宿主細胞で栄養性優位等の代謝性優位を与える抗微生物剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は遺伝子を含むが、これらに限られない。

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連して「異種」の語は、宿主細胞で自然に起こらないポリヌクレオチド又はタンパク質を示す。

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連した「内因性」の語は、宿主細胞で自然に起こるポリヌクレオチド又はタンパク質を示す。

本明細書で使用される「回収される」、「単離される」、及び「分離される」の語は、自然に関連付けられる少なくとも１の成分から移動される化合物、タンパク質、細胞、核酸又はアミノ酸を示す。

本明細書で細胞に関連して用いられる「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「遺伝子組み換え」の語は、前記細胞が、そのゲノムに統合するか又は複数の世代に渡って維持されるエピソームプラスミドとして非野生型（例えば、異種）核酸配列を有することを意味する。

本明細書で使用される「発現」の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生産される過程をいう。当該過程には、転写及び翻訳の両方が含まれる。

本発明の実施又は試験において、本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の任意の方法及び材料が使用され得るが、模範的なより好ましい方法及び材料を記載する。ここで言及される全ての発行物は、当該発行物に引用されるものと関連した方法及び／又は材料が開示及び記載されるものとして参照により本明細書に組み込まれる。

当該明細書を通して他の用語の定義が現れる場合がある。実施態様がより詳細に開示される前に、本発明は特定の開示される実施態様に限られず、当然に、それらは変化され得ることが理解されるべきである。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施態様のみについて記載する目的のためにあって、本発明を限定することを意図しないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲によってのみ制限される。

数値範囲が与えられた場合、その数値範囲の上限値と下限値の間に介在する数値の全てが、文脈から明確に別段の指示がない限り、下限値の単位の十分の一まで、本明細書に具体的に開示される。所定の数値範囲内の一定の数値又は介在数値と他の一定の数値又は介在数値の間の狭い数値範囲も全て本発明に含まれる。これらの狭い範囲の上限及び下限数値は、独立的にその狭い範囲に含まれ得る本発明の範囲となり得るか、又は範囲から除外される。また、上限、下限のいずれか又は両方が前記狭い範囲に含まれるか又は含まれない場合であっても、特別に除外される場合を除いて、これらの狭い範囲を含む各範囲も本発明の中に包含される。記載される範囲が、上限、下限の一方又は両方の値を含む場合、これらのいずれか又は両方の値を除外する範囲も、本発明に含まれる。

本発明及び添付される請求項で使用される単数形（英文で「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈で明確に指示されない限り、複数の対象を含む。従って、例えば、「一遺伝子（ａ ｇｅｎｅ）」の言及は、複数のこれらの候補物質を含み、「細胞（ｔｈｅ ｃｅｌｌ）」の言及は、１以上の細胞及び当業者に知られるそれらの同等物等の言及を含む。

本明細書で開示される発行物は、専らそれらの本願出願前に開示があったとの想定のみに基づいて記載されている。本明細書に記載されるいかなる事項も、本発明がそのような発行物より後に出願されたことを認めるものと解釈されてはならない。

フィターゼ酵素／変異体
親酵素又は前駆体酵素として使用されるフィターゼ酵素は、ブティアウクセラ属種フィターゼ及びブティアウクセラ属種フィターゼに対応するそれらの酵素を含む。いくつかの実施態様において親ブティアウクセラ属種フィターゼは、ＮＣＩＭＢ（海産及び食品微生物のナショナルコレクション、スコットランド、イギリス）登録番号ＮＣＩＭＢ４１２４８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において親ブティアウクセラ属種フィターゼは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸残基３４から４４６（例えば、配列番号２）を含む。いくつかの実施態様において親ブティアウクセラ属種フィターゼは、Ｂ．ａｇｒｅｓｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｎｎｅｒａｓｅ、Ｂ．ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｅ、Ｂ．ｇａｖｉｎｉａｅ、Ｂ．ｉｚａｒｄｉｉ、Ｂ．ｎｏａｃｋｉａｅ、及びＢ．ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅに由来する。国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８が参照により明確に本明細書に組み込まれる。この文献には親ブティアウクセラ属種及びブティアウクセラ属種フィターゼ酵素に対応するフィターゼから入手可能又はこれに由来するフィターゼを開示する。いくつかの実施態様において野生型ブティアウクセラ属種フィターゼは、配列番号１のポリペプチド又は配列番号２のポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。

本発明は、変異フィターゼ（例えば、変異ブティアウクセラ属種フィターゼ）に関する。特に、国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８は、配列番号３としてそこに開示される配列を有する野生型フィターゼ酵素の変異誘発について開示する。また、当該野生型フィターゼ酵素は、本願において配列番号１及び配列番号２として述べられる。多くの好ましい変異が国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８で教示される。変異フィターゼは少なくとも１のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含み、アミノ酸置換が特に好まれる。アミノ酸置換、挿入又は欠失は、フィターゼペプチド中の任意の残基で起こり得る。本発明のフィターゼ変異体は、本願明細書中の配列番号２のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有しない変異体である。

本発明の好ましい実施態様において変異体は、ブティアウクセラ属種フィターゼ中のＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に対応する置換を含み、より明確には、配列番号１中の上記と同等の位置に対応する置換を含む。いくつかの実施態様において前記置換は、残るＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹに対応する１９のアミノ酸のいずれかを含む。いくつかの実施態様において前記変異体は、配列番号１に対応するＡ１２２Ｔ、Ｄ１２５Ａ、Ｔ１６７Ｉ、Ｆ１９７Ｓ、Ｔ２０９Ｋ、Ａ２１１Ｐ、Ｋ２４０Ｅ、Ａ２４２Ｓ、Ｓ２８１Ｌ、Ｑ２８９Ｙ、Ａ２９４Ｅ、及びＮ３０３Ｋのアミノ酸置換を含む。

いくつかの実施態様において前記フィターゼは、ＢＰ−１１に指定されるフィターゼの変異体であり、前記ＢＰ−１１変異体は、配列番号４のアミノ酸残基７乃至４１９を含む。ＢＰ−１１は、ＢＰ−ＷＴ（配列番号１及び配列番号２）の変異体である。

いくつかの実施態様においてＢＰ−１１フィターゼの前記変異体は、配列番号４のＲ２４、Ｒ２８、Ｔ３１、Ｋ３２、Ｄ９８、Ｒ１００、Ｋ１３７、Ｎ２１２、Ｇ２２１、Ｔ２２５、Ｅ２２８、Ｅ２４９、Ｈ２５９、Ｆ２６３、Ｍ２６６、Ｎ２７６、Ｈ３１２、Ｄ３１３、Ｔ３１４、及び／又は、Ｄ３３４の位置に対応する少なくとも１の置換を含むか、又は配列番号４のアミノ酸残基７から４１９の変異置換を含めた少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施態様において前記変異体は、１以上の置換、例えば、２、３、４以上の置換を含む。別の実施態様においてＢＰ−１１の変異体は、Ｄ９８に対応する位置に置換を有する。置換は残る１９アミノ酸のいずれかに生じ得るが、好ましい実施態様において置換は、Ｄ９８Ａである。別の実施態様において、位置Ｄ９８に対応する置換を有するＢＰ−１１変異体は、配列番号４の位置Ｒ２４、Ｒ２８、Ｔ３１、Ｋ３２、Ｒ１００、Ｋ１３７、Ｎ２１２、Ｇ２２１、Ｔ２２５、Ｅ２２８、Ｅ２４９、Ｈ２５９、Ｆ２６３、Ｍ２６６、Ｎ２７６、Ｈ３１２、Ｄ３１３、Ｔ３１４、及び／又は、Ｄ３３４に対応する群からの１以上の置換を含む。いくつかの実施態様において前記変異体は、ＢＰ−１１フィターゼと同等又はより高い活性を有する。

特に好ましい実施例においてフィターゼ変異体は、配列番号３のポリペプチドを含む。別の実施態様においてフィターゼ変異体は、配列番号３のポリペプチドから成る。

いくつかの実施態様において、配列番号１の位置Ａ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３でアミノ酸置換を含む発明に係る変異体はさらに、配列番号１の野生型フィターゼのアミノ酸残基３４から４４６における変異置換を含め少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、及び少なくとも９５％の配列同一性を有するフィターゼを含む。

いくつかの実施態様において、配列番号１の位置Ａ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３に対応する置換に加え、発明に係る変異体は、アミノ酸残基５９、７０、１９３、２０４、２２１、２２３、２２５、２６８、３３６、及び３５１に対応する１以上の置換を含む。いくつかの実施態様において前記変異体は、配列番号１のＫ５９Ｅ、Ｎ７０Ｙ、Ｈ１９３Ｒ、Ｔ２０４Ｉ、Ｓ２２１Ｎ、Ｄ２２３Ｅ、Ｇ２２５Ａ、Ａ２６８Ｖ、Ｉ３３６Ｆ、及びＮ３５１Ｄに対応する置換を含む。

いくつかの実施態様において本発明に係る変異体は、機能的な断片を含む。機能的な断片は酵素機能を保有するブティアウクセラ属種フィターゼの一部を意味し、好ましくは、前記断片はそれの由来するフィターゼからのフィターゼポリペプチドと比べ本質的に同量の酵素機能、又はより多量の酵素機能を保有する。いくつかの実施態様において断片である変異体は、配列番号１の位置Ａ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３に対応する置換、及び、配列番号１の少なくとも３５０、少なくとも３７５、又は少なくとも４００のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施態様において発明に係る変異体（例えば、配列番号３）は、少なくとも３５０、少なくとも３７５、又は少なくとも４００のアミノ酸残基を有する断片である。

変異体は、カセット、ＰＣＲ変異誘発又は当該技術分野で周知のその他の技術を使用し、フィターゼタンパク質をコードするＤＮＡ中でヌクレオチドのランダム変異導入法、部位飽和突然変異誘発、及び部位特定的変異誘発で調製され得、その後細胞培養中に変異体を生産する。Ｍｏｒｉｎａｇａ他、（１９８４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２、６４６乃至６４９ページ、Ｎｅｌｓｏｎ及びＬｏｎｇ、（１９８９年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０、１４７乃至１５１ページ、及び、Ｓａｒｋａｒ及びＳｏｍｍｅｒ（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ８、４０４乃至４０７ページが参照される。また、変異フィターゼタンパク質断片は、確立した技術を使用しｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で調製され得る。

ポリヌクレオチド
本発明はさらに、発明に係る変異フィターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。遺伝子情報の縮退のため、元のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸のいくつかにおいて三文字コドンが変化される中でヌクレオチド配列が生成され、それにより元のヌクレオチド配列と同様のフィターゼをコードする、異なるヌクレオチド配列を生成しえることが当業者に認識される。例えば、全ての三文字コドンに用いられる三文字コドンの３番目の位置に変化を有するヌクレオチド配列は、元の配列と約６６％同一であるが、修正されるヌクレオチド配列は（例えば、同じ第一アミノ酸配列を有する）同等のフィターゼをコードするだろう。

ポリヌクレオチドは、例えば、クローンＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリ」）から、化学合成、ｃＤＮＡクローニング、ＰＣＲ（米国特許４，６８３，２０２又はサイキ他、（１９８８年）２３９、４８７乃至４９１ページ）、合成的に確立した方法（Ｂｅｕｃａｇｅ他、（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２２、１８５９乃至１８６９ページ及びＭａｔｔｈｅｓ他、（１９８４年）ＥＭＢＯ Ｊ．３、８０１乃至８９５ページ）、又はブティアウクセラ属種等の所望の細胞から実質的に精製されたゲノムＤＮＡ又はそれらの断片のクローニングによる、当該技術分野で知られる標準的処理により得られる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、２００１年、分子クローニング・研究室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第３版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＭ及びＨａｍｅｓ，ＢＤ編集、１９９５年、ＤＮＡクローニング１・実践的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）及びＤＮＡクローニング２・実践的アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）、オックスフォード大学出版、オックスフォード等参照）。ゲノムＤＮＡ由来の核酸配列、及びそれの派生物は、コード領域に加えて調節領域を含み得る。

国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８（配列番号１及び配列番号２）で提供されるポリヌクレオチド配列が、フィターゼ活性を有する酵素をコードする他の株に由来するポリヌクレオチドの同一又は相同の断片を得るのに有用であることが理解される。ブティアウクセラ属 Ｐ１−２９（ＢＰ−ＷＴ）に由来するフィターゼ遺伝子を含むポリヌクレオチド配列（配列番号５）は、表１で明らかにされる。ＢＰ−１７変異体に由来するフィターゼ遺伝子を含むポリヌクレオチド配列（配列番号１４）は、以下の表２に示される。

特性
いくつかの実施態様において本発明に係る変異フィターゼは、改変した特性を有する。好ましくは、本発明に係る変異は、改良された特性を有する。いくつかの実施態様において、変化され、例えば、改良された特性は、基質特異性、触媒活性、熱安定性、ｐＨ活性プロフィール、比活性、及び／又は、フィチン酸塩からリン酸基を放出する能力である。

いくつかの実施態様において本発明で包含される変異体は、親フィターゼ（例えば、ＢＰ−ＷＴ又はＢＰ−１１）と比べ、増加した熱安定性を有する。いくつかの実施態様において前記変異は、ＢＰ−ＷＴ又はＢＰ−１１のいずれかと比べ、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも５．０、少なくとも８．０、少なくとも１０．０、少なくとも１５．０、少なくとも１８．０、及び少なくとも２０．０の熱安定性差（ＴＤ）を有する。

いくつかの実施態様において本発明で包含される変異体（例えば、ＢＰ−１７）は、４．５、５．０、５．５又は６．０のｐＨで、少なくとも３℃、少なくとも５℃、少なくとも１０℃、少なくとも１２℃、少なくとも１５℃、及び少なくとも２０℃の熱安定性の増加を有する。より明確には、本発明の変異体（例えば、ＢＰ−１７）は約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃又はそれ以上での熱安定性がある。いくつかの実施態様において、本酵素がｐＨ５．５において指定された温度に１０分間の露出後、その活性が５０％以上を保有している場合、本発明に係るフィターゼは熱安定性を有するものとされる。

いくつかの実施態様において変異体は、より高いタンパク質分解安定性（残存活性）を持つ。タンパク質分解の安定性は、国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８で公開されている方法で決定することができ、その実施例１２に具体的に述べられている。いくつかの実施態様において、本発明で包含された変異は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８５％の残存活性を有する。

いくつかの実施態様においてフィターゼ変異体は、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、及びｐＨ５．０において、親フィターゼ、又はそれら熱安定性変異体（例えば、ＢＰ−ＷＴ、配列番号２、又はＢＰ−１１）の１００％以上、１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上の比活性を有する。いくつかの実施態様において前記変異体は、ＢＰ−１１フィターゼ又はＢＰ−ＷＴ（配列番号２）フィターゼと比べ、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、及び少なくとも２５％以上の比活性を有する。いくつかの実施態様において本発明で包含される変異体は、ＢＰ−ＷＴ又はＢＰ−１１と本質的には同レベルの熱安定性を保有するが、同じ条件下（例えば、ｐＨ）であれば本質的には比活性の増加が認められる。

いくつかの実施態様において本発明に係る前記変異フィターゼは、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、少なくとも２００Ｕ／ｍｇ、少なくとも３００Ｕ／ｍｇ、少なくとも３５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも４００Ｕ／ｍｇ、少なくとも４５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５００Ｕ／ｍｇ、少なくとも６００Ｕ／ｍｇ、少なくとも７００Ｕ／ｍｇ、少なくとも８００Ｕ／ｍｇ、少なくとも９００Ｕ／ｍｇ、少なくとも１０００Ｕ／ｍｇ、少なくとも１２００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。ここで、比活性は、国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８の実施例１で詳しく述べられているように、２ｍＭフィターゼ、０．８ｍＭＣａＣｌ_２を含む２００ｍＭナトリウム緩衝酢酸溶液、ｐＨ３．５の溶液のフィターゼをインキュベートし決定される。いくつかの実施態様において、その比活性は至適ｐＨ４．０で決定される。

いくつかの実施態様において、配列番号５によりコードされたフィターゼと比べ、本発明で包含される変異フィターゼは、少なくとも１１０、少なくとも１２０、及び少なくとも１３０以上の比活性比を有する。

いくつかの実施態様においてｐＨ活性の最大値は、対応するブティアウクセラ属種フィターゼ（例えば、配列番号１又は配列番号２）よりも、少なくとも０．１、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．２５、少なくとも０．３、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも１．０ｐＨ単位低い。又は、ＢＰ−１１フィターゼより、少なくとも０．１、少なくとも０．１５、少なくとも０．２、少なくとも０．２５、少なくとも０．３、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、及び少なくとも１．０ｐＨ単位低い。いくつかの実施態様において、本発明で包含される変異体は、ｐＨ２．０からｐＨ６．０の領域で活性を有し、また、いくつかの実施態様においてはｐＨ４．０からｐＨ５．５の付近、またｐＨ４．０からｐＨ４．５の付近に最大活性を有する。

いくつかの実施態様において本発明で包含される変異体は、フィチン酸塩を本発明で包含される変異フィターゼ（例えば、ＢＰ−１７）に処理することを含む、リン酸塩化合物の製造方法に使用され得る。フィチン酸塩はミオイノシトール、二、三、四、又は五リン酸塩とすることが出来る。その他の適切な有機リン酸塩はイノシトール四リン酸及びイノシトールオリゴリン酸を含む。

宿主細胞内でのフィターゼの生成
いくつかの実施態様において本発明は、フィターゼ活性を有する酵素の生成方法であって、（ａ）本明細書で開示されるように少なくとも１のアミノ酸残基の少なくとも１の修飾を含む、本発明に係る変異フィターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を供給すること、（ｂ）前記形質転換した宿主細胞を、宿主細胞がフィターゼを生産するのに適した条件下で培養すること、及び（ｃ）フィターゼを回収することを含む、前記方法を提供する。

いくつかの実施態様において発現ベクターは、配列番号１のＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に対応するアミノ酸残基で置換を有するアミノ酸配列を含む、フィターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。また、他の実施態様において前記置換は、配列番号１のＡ１２２Ｔ、Ｄ１２５Ａ、Ｔ１６７Ｉ、Ｆ１９７Ｓ、Ｔ２０９Ｋ、Ａ２１１Ｐ、Ｋ２４０Ｅ、Ａ２４２Ｓ、Ｓ２８１Ｌ、Ｑ２８９Ｙ、Ａ２９４Ｅ、及びＮ３０３Ｋに対応する。いくつかの実施態様において前記発現ベクターは、配列番号４のＲ２４、Ｒ２８、Ｔ３１、Ｋ３２、Ｄ９８、Ｒ１００、Ｋ１３７、Ｎ２１２、Ｇ２２１、Ｔ２２５、Ｅ２２８、Ｅ２４９、Ｈ２５９、Ｆ２６３、Ｍ２６６、Ｎ２７６、Ｈ３１２、Ｄ３１３、Ｔ３１４、及び／又は、Ｄ３３４の位置に対応する置換を含む変異フィターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。他の実施態様において前記ベクターは、配列番号３を含むフィターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。

発明のいくつかの実施態様において宿主株は、本明細書の発明に係るフィターゼ活性を有する異種フィターゼ又は変異体を発現するよう遺伝子工学的に改変される。

宿主細胞
本発明で包含されるフィターゼの生産に有用な宿主細胞は、細菌性細胞、真菌細胞、及び植物細胞を含む。宿主細胞は、細胞及び細胞の子孫の両方を含み、さらに本発明に係る変異フィターゼの生産に使用され得る細胞から作成されたプロトプラストを含む。

いくつかの実施態様において宿主細胞は真菌細胞であり、好ましくは糸状菌宿主細胞である。「糸状菌」の語は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａの一部である全ての糸状体を示す（Ｃ．Ｊ．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｕｓ（１９６２年）、ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ ＭＹＣＯＬＯＧＹ、ウィリー、ニューヨーク州参照）。これらの糸状菌は、キチン、セルロース、及びその他の複合多糖類よりなる細胞壁を有する栄養菌糸体によって、特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に酵母とは区別される。糸状菌親細胞は、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａの無性変形で従来Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍとして分類される）、ペニシリン属種、フミコーラ属種（例えば、Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ及びＨ．ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム属種（例えば、Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、グリオクラディウム属種、アスペルギルス属種（例えば、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｓｏｊａｅ、Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、及びＡ．ａｗａｍｏｒｉ）、フザリウム属種（例えば、Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ、Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｉｍ及びＦ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、アカパンカビ属種（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）、ボタンタケ属種、ケカビ属種（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）、クモノスカビ属種及びエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属種（Ｉｎｎｉｓ他、（１９８５年）Ｓｃｉ．２２８、２１−２６ページも参照されたい）を含む細胞であるが、それらに限られない。発明のフィターゼ（及び／又はアルファアミラーゼ）の発現に有用なＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ株は、例えば、Ｗａｒｄ他（１９９３年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９、７３８乃至７４３ページ及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ他（２００２年）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ４１、８９乃至９８に開示される。いくつかの実施態様において宿主は、トルコデルマ属の株、特にＴ．リーセイの株である。Ｔ．リーセイの株は公知であり、非限定的な例は、ＡＴＣＣ番号１３６３１、ＡＴＣＣ番号２６９２１、ＡＴＣＣ番号５６７６４、ＡＴＣＣ番号５６７６５、ＡＴＣＣ番号５６７６７、及びＮＲＲＬ１５７０９を含む。いくつかの実施態様において宿主株は、ＲＬ−Ｐ３７に由来する。ＲＬ−Ｐ３７は、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ他（１９８４年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０、４６乃至５３ページに開示される。

いくつかの実施態様において、宿主細胞はグラム陽性細菌性細胞である。非限定的な例は、ストレプトミセス属の株（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、及びＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ）及びバチルス属の株を含む。本明細書で使用される「バチルス属」は、当業者に知られる「バチルス属」中の全ての種を含み、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含むが、それらに限られない。

いくつかの実施態様において宿主細胞は、大腸菌又はシュードモナス属種等のグラム陰性菌株である。

他の実施態様において宿主細胞は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属種、ピチア属種、又はカンディダ属種等の酵母細胞とすることが出来る。

いくつかの実施態様において宿主株は、前もって、遺伝子工学を通して操作されていることが出来る。いくつかの実施態様において、菌性宿主細胞の多様な天然の遺伝子は、不活性にされている。これらの遺伝子は例の遺伝子のために、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びエクソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）（例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、及びｅｇｌ３）等のセルロース分解酵素をコードする遺伝子を含む。例えば、米国特許第５，６５０，３２２号はｃｂｈ１遺伝子及びｃｂｈ２遺伝子に欠失を有するＲＬ−Ｐ３７の派生株を開示する（例えば、米国特許５，８４７，２７６及び国際公開番号ＷＯ０５／００１０３６等参照）。

他の実施態様において宿主細胞は、植物細胞とすることができ、本発明は双子葉植物（例えば、トマト、じゃがいも、大豆、綿、及びタバコ）及び、小麦（コムギ属種）、米（イネ属種）、大麦（オオムギ属種）、オート麦（カラスムギ属種）、ライ麦（ライムギ属種）、とうもろこし（トウモロコシ属）、モロコシ（モロコシ属種）、及びあわ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ種）等のイネ科単子葉植物を含むがそれらに限られない単子葉植物の両方に適用される。

ベクター
本発明のフィターゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物を含む有用なベクター及び宿主細胞の形質転換法は、当該技術で周知であり、標準的技術及び方法論が使用され得る。

発明で包含される変異フィターゼをコードする核酸を含む、発明に係るＤＮＡ構築物は、宿主細胞内で変異体を転写及び／又は発現するよう構築される。一の実施態様においてＤＮＡ構築物は、変異フィターゼコード配列に操作可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、エンハンサ、活性化配列、細胞特異的発現配列、シグナル配列、及び／又はターミネータ）を含む発現ベクターにより宿主細胞に移される。

変異フィターゼをコードするポリヌクレオチドを有するＤＮＡ構築物を含む発現ベクターは、特定の菌性宿主有機体内で自主的に複製するか、又は宿主のＤＮＡと統合出来る任意のベクターとすることが出来る。いくつかの実施態様において発現ベクターは、プラスミド又はバクテリオファージである。いくつかの実施態様において発現ベクターは、あらかじめ組立てられ、ハイレベルの転写に必要な配列及び選択マーカーを含む。いくつかの実施態様において、変異フィターゼ遺伝子又はその部分に用いられるコード領域は、発現構築プロモーター及びターミネータ配列の転写調節下となるように、多目的の発現ベクターに挿入される。いくつかの実施態様において遺伝子又はその部分は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。

菌性宿主細胞内でのフィターゼの生産に関して簡潔に、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９年）、上記Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８７年）、Ｂｅｎｎｅｔｔ及びＬａｓｕｒｅ編集、真菌内での遺伝子操作（ＭＯＲＥ ＧＥＮＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＦＵＮＧＩ）、アカデミックプレス社（１９９１年）、７０乃至７６ページ及び３９６及び４２８ページのｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ他（１９９１年）、Ｎｕｎｂｅｒｇ他（１９８４年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２３０６乃至２３１５ページ、Ｂｏｅｌ他、（１９８４年）ＥＭＢＯ Ｊ．３、１５８１乃至１５８５ページ、糸状菌の生物工学（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＯＦ ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ ＦＵＮＧＩ）、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ他編集、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、ボストン、マサチューセッツ州、（１９９２年）、第６章のＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、Ｋｉｎｇｈｏｒｎ他（１９９２年）糸状菌の応用分子遺伝学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ）、Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ出版、ロンドン、Ｋｅｌｌｅｙ他、（１９８５年）ＥＭＢＯ Ｊ．４、４７５乃至４７９ページ、Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、（１９８７年）Ｇｅｎｅ６１、１５５乃至１６４ページ、及び、米国特許番号第５，８７４，２７６号を参照されたい。適したベクターのリストは、真菌株遺伝子ストックセンターカタログ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ、ＦＧＳＣ、ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ）で見られる。適したベクターは、例えば、インビトロジェン・ライフ・テクノロジー及びプロメガから得られるものを含む。菌性宿主細胞内の使用に適した特定のベクターは、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮ（商標）２０１、ｐＤＯＮＲ（商標）２２１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＭ（登録商標）３Ｚ、及びｐＧＥＭ（登録商標）４Ｚ等のベクターを含む。

いくつかの実施態様において前記ベクターは、菌性宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムと統合し、複製される任意のベクターとすることが出来る。真菌株遺伝子ストックセンターカタログ（ＦＧＳＣ、ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ）で前記ベクターのいくつかの非限定的な例が提供される。適した表現及び／又は統合ベクターの追加例は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９年）、上記Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８７年）、Ｂｅｎｎｅｔｔ及びＬａｓｕｒｅ編集、真菌内での遺伝子操作（ＭＯＲＥ ＧＥＮＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＦＵＮＧＩ）、アカデミックプレス出版、３９６及び４２８ページのｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ他（１９９１年）及び米国特許番号第５，８７４，２７６号で提供される。特に有用なベクターは、ｐＴＲＥＸ、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００、及びｐＥＮＴＲ／Ｄを含む。細菌性細胞での使用に適したプラスミドは、大腸菌の複製が可能なｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１９、及び例えばバチルス属種で複製が可能なｐＥ１９４が含まれる。

いくつかの実施態様において、本発明で包含される変異フィターゼをコードする核酸は、宿主細胞内で転写活性を示す適したプロモーターに操作可能に連結される。一般に変異フィターゼの発現は、既知の、又は後に当該技術分野で発見された任意の適したプロモーター下で実行される。いくつかの実施態様において前記変異フィターゼは、宿主に由来するプロモーター下で発現される。いくつかの実施態様において、フィターゼ変異体は宿主細胞内で活性な異種プロモーター下で発現される。例えば、トリコデルマ属細胞が宿主細胞として使用される場合、好ましいプロモーターはトリコデルマ属宿主細胞中で活性である。

いくつかの実施態様において前記プロモーターは、構成的又は誘導プロモーターである。「構成的プロモーター」は、ほとんどの環境及び発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導」又は「抑制」プロモーターは、環境又は発生制御下で活性なプロモーターである。いくつかの実施態様においてプロモーターは、環境要因の変化から誘導可能又は抑制可能である。前記環境要因は、炭素、窒素、又はその他の栄養素利用性、温度、ｐＨ、オスモル濃度、重金属の存在、抑制剤の濃度、圧力、又は当該技術分野で知られている上記要因の組み合わせを含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において前記誘導又は抑制プロモーターは、所定の炭素源レベル、所定のエネルギー源レベル、所定の異化代謝産物レベル、又は当該技術分野で知られている上記レベルの組み合わせ等の代謝因子により誘導又は抑制可能である。一の実施態様においてプロモーターは、宿主細胞に由来するものである。例えば、Ｔ．リーセイが宿主である場合、プロモーターは、登録番号Ｄ８６２３５でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に保管されるｃｂｈ１プロモーター等の天然Ｔ．リーセイプロモーターである。

適したプロモーターの非限定的な例は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｘｙｎ１、及びｘｙｎ２、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｓの抑制酸性ホスファターゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）プロモーター（例えば、Ｇｒａｅｓｓｌｅ他（１９９７年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３、７５３乃至７５６ページ等参照）、グルコース抑制ＰＣＫ１プロモーター（例えば、Ｌｅｕｋｅｒ他、（１９９７年）、Ｇｅｎｅ１９２、２３５乃至２４０ページ等参照）、マルトース誘導、グルコース抑制ＭＥＴ３プロモーター（例えば、Ｌｉｕ他、（２００６年）、Ｅｕｋａｒｙ．Ｃｅｌｌ５、６３８乃至６４９ページ等参照）、ｐＫｉプロモーター及びｃｐｃ１プロモーターを含む。有用なプロモーターのその他の例は、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ及びＡ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子由来のプロモーター（例えば、Ｎｕｎｂｅｒｇ他、（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、２３０６乃至２３１５ページ及びＢｏｅｌ他、（１９８４年）ＥＭＢＯ Ｊ．３、１５８１乃至１５８５ページ等参照）を含む。また、Ｔ．リーセイｘｌｎ１遺伝子のプロモーターも有用となり得る（例えば、欧州特許公開第１３７２８０Ａ１号等参照）。

いくつかの実施態様において前記プロモーターは、温度感受性プロモーターである。好ましい温度感受性プロモーターの活性は、温度の上昇により抑制される。いくつかの実施態様においてプロモーターは、カタボライト・リプレッションプロモーター又はオスモル濃度の変化により抑制されるプロモーターである。いくつかの実施態様において前記プロモーターは、培地中の多糖類、二糖類、又は単糖の濃度で誘導又は抑制可能である。

いくつかの実施態様において変異フィターゼコード配列は、シグナル配列に操作可能に連結する。シグナル配列は、発明に不可欠ではないが、シグナル配列として宿主細胞内で活性のある任意のシグナル配列とすることが出来る。シグナル配列をコードするＤＮＡは、宿主細胞、プロモーター、又はフィターゼに自然に付随するものであることが出来る。いくつかの実施態様においてシグナル配列は、発現される変異フィターゼ遺伝子に自然に付随する。追加の実施態様において、真菌性宿主細胞に導入されるＤＮＡ構築物又はベクターを含むシグナル配列及びプロモーター配列は、同一起源に由来する。例えば、いくつかの実施態様においてシグナル配列は、ｃｂｈ１プロモーターに操作可能に連結されるｃｂｈ１シグナル配列である。

いくつかの実施態様において発現ベクターは、効率的な終結に備え、構造遺伝子の下流にある転写終結配列も含む。いくつかの実施態様において、終止配列及びプロモーター配列は同一起源に由来する。他の実施態様において終止配列は、宿主細胞に相同である。特に適した終了配列は、トリコデルマ属株、特にＴ．リーセイに由来するｃｂｈ１である。他の有用な真菌性ターミネータは、Ａ．ｎｉｇｅｒ又はＡ．ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ遺伝子由来のターミネータを含む（例えば、上記Ｎｕｎｂｅｒｇ他（１９８４年）及び上記Ｂｏｅｌ他（１９８４年）等参照）。

いくつかの実施態様において発現ベクターは、選択マーカーを含む。好ましい選択マーカーの例は、抗菌薬耐性（例えば、ハイグロマイシン及びフレオマイシン）を与えるものを含む。また、栄養選択マーカーも、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ及びｐｙｒ４として当該技術分野で知られるマーカーを含め、本発明で使われる。トリコデルマ属の形質転換のベクター系で有用なマーカーは、当該技術分野で知られている（例えば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、糸状菌の生物工学（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＯＦ ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ ＦＵＮＧＩ）、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ他編集、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、ボストン、マサチューセッツ州、（１９９２年）、第６章、Ｋｉｎｇｈｏｒｎ他（１９９２年）糸状菌の応用分子遺伝学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ）、Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ出版、ロンドン等参照）。いくつかの実施態様において選択マーカーは、酵素アセトアミダーゼをコードし、形質転換細胞を窒素源としてアセトアミドで成長させるａｍｄＳ遺伝子である。選択マーカーとしてのＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｍｄＳ遺伝子の使用は、例えば、Ｋｅｌｌｅｙ他、（１９８５年）ＥＭＢＯ Ｊ．４、４７５乃至４７９ページ及びＰｅｎｔｔｉｌａ他、（１９８７年）Ｇｅｎｅ６１、１５５乃至１６４ページで開示される。

フィターゼ変異体、プロモーター、ターミネータ、及び他の配列をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物をライゲートするのに使用する方法、及び、適したベクターにそれらを挿入する方法は、当該技術分野でよく知られている。連結は一般に、適当な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドリンカーが慣行的実務に従って使用される（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）、及びＢｅｎｎｅｔｔ及びＬａｓｕｒｅ編集、真菌内での遺伝子操作（ＭＯＲＥ ＧＥＮＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＩＮ ＦＵＮＧＩ）、アカデミックプレス社，サンディエゴ（１９９１年）、７０乃至７６ページ等参照）。加えて、既知の組み換え技術を用いて構築され得る（例えば、インビトロジェン・ライフ・テクノロジー、ゲートウェイ・テクノロジー）。

形質転換、発現及び宿主細胞の培養
ＤＮＡ構成物又はベクターの宿主細胞への導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション、（例えば、リポフェクション介在及びＤＥＡＥ−デキストリン介在トランスフェクション）、カルシウムリン酸ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡコートマイクロ入射核の高速度砲撃、及びプロトプラスト融合等の技術を含む。

アスペルギルス属及びトリコデルマ属に関する形質変換法は、例えば、Ｙｅｌｔｏｎ他、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１、１４７０乃至１４７１ページ、Ｂｅｒｋａ他（１９９１年）、酵素生物工学の応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｋｅｌｌｙ及びＢａｌｄｗｉｎ編集、Ｐｌｅｎｕｍ−Ｐｒｅｓｓ出版（ニューヨーク州）、Ｃａｏ他、（２０００年）Ｓｃｉ．９、９９１乃至１００１ページ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、（１９８９年）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６、５３乃至５６ページ、Ｐｅｎｔｉｌｌａ他、（１９８７年）Ｇｅｎｅ６１、１５５乃至１６４ページ、ｄｅ Ｇｒｏｏｔ他、（１９９８年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、８３９乃至８４２ページ、米国特許６，０２２，７２５、米国特許６，２６８，３２８及び欧州特許２３８０２３で開示される。トリコデルマ属での異種タンパク質の発現は、米国特許６，０２２，７２５、米国特許６，２６８，３２８、Ｈａｒｋｋｉ他（１９９１年）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３、２２７乃至２３３ページ、Ｈａｒｋｋｉ他、（１９８９年）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ．７、５９６乃至６０３ページ、欧州特許第２４４，２３４号、第２１５，５９４号、及びＮｅｖａｌａｉｎｅｎ他、「トリコデルマ属の分子生物学及び同種遺伝子及び異種遺伝子の両方の遺伝子発現への応用（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ）」、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＹＣＯＬＯＧＹ、Ｌｅｏｎｇ及びＢｅｒｋａ編集、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社出版、ニューヨーク州（１９９２年）１２９乃至１４８ページで開示される。また、国際公開番号ＷＯ９６／００７８７及びＢａｊａｒ他（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８、８２０２乃至２８２１２ページもフザリウム属株の形質転換に参照される。

また、植物の形質転換に有用なＤＮＡ構築物の作成方法及び植物形質転換法は周知である。これらの方法のいくつかは、アグロバクテリウムツメファシエンス介在遺伝子転移、微粒子銃、プロトプラストのＰＥＧ介在形質転換、エレクトロポレーション等を含む。例えば、米国特許第５，７８０，７０８号、米国特許第６，８０３，４９９号、米国特許第６，７７７，５８９号、Ｆｒｏｍｍ他（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８、８３３乃至８３９ページ、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ他（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９、１６９乃至１７７ページ、Ｂｒｉｓｓｏｎ他、（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ３１０、５１１乃至５１４ページ、タカマツ他、（１９８７年）ＥＭＢＯ Ｊ６、３０７乃至３１１ページ、Ｃｏｒｕｚｚｉ他、（１９８４年）ＥＭＢＯ Ｊ３、１６７１乃至１６８０ページ、Ｂｒｏｇｌｉｅ他（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４、８３８乃至８４３ページ、Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ及びＳｉｎｉｂａｌｄｉ ＲＭ（１９９１年）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ１７、８５乃至１０５ページ、科学及び技術のマクグロー・ヒル年鑑（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、ニューヨーク州、１９１乃至１９６ページのＨｏｂｂｓ Ｓ又はＭｕｒｒｙ ＬＥ（１９９２年）、及び、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８８年）、植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アカデミックプレス出版、ニューヨーク、ニューヨーク州、４２１乃至４６３ページが参照にされる。形質転換細胞は、生理塩及び栄養素を含有する適した培地を用いて、振盪フラスコ培養、研究所又は工業発酵器内での（連続、バッチ、及び流加（供給バッチ、Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）式発酵を含む）小規模又は大規模発酵に適した条件下で標準的技術を用いて培養され得る（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．他、セルロース分解の生化学及び遺伝子工学（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＯＦ ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ）、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．他編集、アカデミックプレス出版、７１乃至８６ページ、１９８８年及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．他、（１９９７年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３、１２９８乃至１３０６ページ等参照）。一般的な商業用に調製された培地（例えば、酵母麦芽エキス（ＹＭ）ブロス、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス及びサブロードデキストロース（ＳＤ）ブロスも本願発明で使用される。糸状真菌細胞に用いられる好ましい培養条件は、当該技術分野で知られ、科学文献で及び／又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ及びＦｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ等の菌源から見つけることが出来る。

いくつかの実施態様において、遺伝学的に安定した形質転換細胞は、フィターゼ変異体をコードする核酸が安定的に、宿主株染色体に統合されるベクター系を用いて構築される。その後、形質転換体は既知の技術で精製される。

一の非限定的な例では、ａｍｄＳマーカーを含む安定した形質転換体が、より速い成長率及びアセトアミドを含む固体培地上で不規則な輪郭よりむしろ滑らかな輪郭から成る円状コロニーの形成により、不安定な形質転換細胞と区別される。さらに、いくつかの場合で安定性の追加試験は、固体非選択培地（すなわち、アセトアミドを欠く培地）上での形質転換体の成長、前記培地からの胞子の採取、アセトアミドを含む選択培地上で連続的に発芽及び成長する胞子のパーセンテージを決定することにより行われる。あるいは、当該技術分野で知られている他の方法が、形質転換体を選択するのに使用され得る。

一の特定の実施態様において、形質転換に用いるトルコデルマ属種の調製は、真菌菌糸からのプロトプラストの調製を含める（Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、（１９８９年）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６、５３乃至５６ページ参照）。いくつかの実施態様において前記菌糸は、発芽した植物の胞子からが得られる。菌糸は、細胞壁を消化し、プロトプラストを結果として生じる酵素と処理される。次にプロトプラストは、懸濁化剤中で浸透安定剤の存在により保護される。これらの安定剤は、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。これらの安定剤の濃度は通常、０．８Ｍから１．２Ｍの間で変化する。懸濁化剤中、約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。

菌性の成長が確立された後形質転換細胞は、本明細書に定義されるように、フィターゼ変異体の発現を起こすか、又は可能にするのに有効な条件下に暴露される。フィターゼ変異体コード配列が誘導プロモーターの管理の下にある場合、誘発剤（例えば、砂糖、金属塩又は殺菌薬）が発現を起こすのに有効な濃度で培地に添加される。

フィターゼ発現／活性における分析評価
本発明に包含されるフィターゼ活性を有するフィターゼ変異体をコードする異種ポリヌクレオチドを用いて形質転換された細胞株によるフィターゼ活性を有するフィターゼ変異体の発現を評価するため、フィターゼ活性及び／又は生成に特定的なタンパク質レベルでの分析評価、ＲＮＡレベルでの分析評価、又は機能バイオアッセイの使用による分析評価が行われ得る。使用される分析評価は一般に、（核酸コード配列に基づいて）適切に標識されたプローブを用いた、ノーザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡ又はＲＮＡ解析）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び従来のサザンブロット法、及びオートラジオグラフを含む。

加えて、フィターゼ活性を有するフィターゼ変異体の生成及び／又は発現は、例えば、無機リン酸塩の放出によるフィターゼ活性（ＦＴＵ）を直接測定する分析評価等、直接サンプル内で測定され得る。無機リン酸塩は、酸性のモリブデン酸塩／バンデート（ｖａｎｄａｔｅ）試薬で黄色複合体を形成する。また、当該黄色複合体は、分光光度計内の４１５ｎｍの波長で測定され、放出された無機リン酸塩はリン酸塩標準曲線で定量化された。フィターゼの１単位（ＦＴＵ）は、欧州標準（ＣＥＮ／ＴＣ３２７，２００５−ＴＣ３２７ＷＩ００３２７０ＸＸ）で与えられた反応条件下で、分あたりのフィチン酸塩から無機リン酸塩１ミクロモルを放出する酵素の量である。

加えて、遺伝子発現は、例えば、細胞、組織切片の免疫組織化学的染色又は例えばウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ等による組織培養基の免疫学的検定法等の免疫学的方法により評価され得る。そのような免疫学的検定法は、質的及び量的にフィターゼの発現を評価するのに使用出来る。そのような方法の詳細は、当業者に知られ、そのような方法の実施に用いられる多くの試薬が商業的に利用可能である。

フィターゼ活性の分析評価は当該技術分野で周知であり、一例は、Ｆｉｓｋｅ及びＳｕｂｂａＲｏｗ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６６、３７５乃至３９２ページ（１９２５年）により開発された無機リン酸塩の単体分離に用いられる古典的な分析評価である。この方法の変形は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３、２４５乃至２５２ページ（１９９７年）で見られる。代替的な方法は、食品用公定化学品集（ＦＯＯＤ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＣＯＤＥＸ）、第４版、フードケミカルズコデックス委員会、医学研究所、ナショナルアカデミープレス出版、ワシントンＤＣ、１９９６年の８０９乃至８１０ページで記載される。前記参考文献の各々は、本明細書に組み込まれる。次に、多くの前記分析評価において比色分析は、分光光度計用いて行われ、無機リン酸塩（Ｐ_ｉ）の既知濃度の対象物及び／又は既知のフィターゼ活性を有する酵素との反応により生成された対象物と比較される。活性の１単位は、既定の反応条件下、分当たりフィチン酸塩から１μｍｏｌのＰ_ｉを放出するのに必要とされる酵素サンプルの量として決定される。また、米国特許第６，２２１，６４４号及び米国特許第６，１３９，９０２号も参照される。

本発明のいくつかの実施態様において、トリコデルマ属かアスペルギルス属宿主により発現されるフィターゼ活性を有するフィターゼ変異体は、培地のリットル当たり１グラムのタンパク質量（ｇ／Ｌ）より多く、２ｇ／Ｌより多く、５ｇ／Ｌより多く、１０ｇ／Ｌより多く、２０ｇ／Ｌより多く、２５ｇ／Ｌより多く、３０ｇ／Ｌより多く、５０ｇ／Ｌより多く、また１００ｇ／Ｌよりも多い。

タンパク質の回収
本発明の核酸配列の発現で生成されたポリペプチドは、細胞培養の発酵から回収又は単離され、当該技術分野で確固としている技術に係る多様な方法により実質的に精製される。当業者は、最も適切な単離及び精製手法を選ぶことが出来る。本発明に係るフィターゼは、培地又は宿主細胞溶解物から回収され得る。もし膜結合型である場合、前記フィターゼは、適した洗剤溶液（例えば、トリトン−Ｘ１００）を用いて、又は酵素的切断により膜から放出され得る。フィターゼの発現で使用される細胞は、例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、又は細胞溶解剤等の様々な物理的又は化学的手法により破壊される。組み換え細胞タンパク質又はポリペプチドからフィターゼを精製することが望まれ得る。以下の手順は、適当な精製法の模範例である。すなわち、イオン交換カラム上の分別法、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ法、シリカ又はＤＥＡＥ等の陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー法、クロマト分画法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、硫酸アンモニウム沈降法、例えば、セファデックスＧ−７５を用いたゲルろ過法、汚染物質を除去するタンパク質Ａセファロースカラム法、及びフィターゼのエピトープ標識形態に結合する金属キレートカラム法による精製法である。様々なタンパク質精製法が使用され、これらの方法は当該技術分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ１８２、（１９９０年）、Ｓｃｏｐｅｓ、タンパク質精製、原理と実践（ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ出版、ニューヨーク州（１９８２年）で記載される。選択される精製法は、例えば、使用される生成工程及び生成されたフィターゼの特定の形態の性質に依存する。

（ｎ−ブティアウクセラ属フィターゼ又はｒ−ブティアウクセラ属フィターゼを含む）細胞培養で生成されたフィターゼ変異体は一般に、培地内に分泌され、例えば、細胞培養液から不要成分を除去することにより、精製又は単離され得る。いくつかの場合において前記フィターゼ変異体は、細胞溶解物からの回収を必要とする細胞形態で生成される。この場合において酵素は、当業者に通常使用される技術を用いて、生成された細胞から精製される。当該技術分野で技能のものによってきまりきって使われたテクニックを使用することで生産された細胞から精製される。実施例は、高分解能の材料を用いたイオン交換（例えばＭｅｄｖｅ他、（１９９８年）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ８０８、１５３ページ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、Ｔｏｍａｚ及びＱｕｅｉｒｏｚ（１９９９年）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ８６５、１２３ページ）、二相分配（例えば、Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ他（１９９９年）、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ７、２８７等参照）、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ法、シリカ又はＤＥＡＥ等の陽イオン交換樹脂のクロマトグラフィー法、クロマト分画法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、硫酸アンモニウム沈降法、及び／又は例えば、セファデックスＧ−７５を用いたゲルろ過法を含む、親和性クロマトグラフィー（例えば、Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ他、（１９８４年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１６、２１５ページ等参照）、イオン交換クロマトグラフィー法（例えば、Ｇｏｙａｌ他、（１９９１年）Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３６、３７ぺージ、Ｆｌｉｅｓｓ他、（１９８３年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７、３１４ページ、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ他（１９８４年）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６、３３６ページ及びＥｌｌｏｕｚ他、（１９８７年）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ３９６、３０７ページ等参照）を含むが、これらに限られない。

発酵
本発明のいくつかの実施態様において、異種フィターゼ変異体を発現する真菌細胞は、バッチ又は連続した発酵条件下で育成される。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の成分は発酵の初期に配置され、発酵中、人為的な変化は受けない。従って、発酵の開始で前記培地は、目的微生物が接種される。この方法において、発酵は前記系への任意成分の追加なしに行われることが可能とされる。通常、バッチ式発酵は、炭素源の追加に関して「バッチ式」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度等の因子を制御する試みが頻繁に行われる。バッチ式系の代謝及びバイオマス組成は、発酵が終了する時間まで常に変化する。バッチ式培養内において、細胞は静的誘導期から対数高成長期を通り、最終的に成長率が減少又は停止する静止期まで発育する。非処理の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。一般に、対数期の細胞は、最終生成物の生成バルク量に影響する。

標準的バッチ式系の変形は、本願発明で使用される「流加発酵」系である。この典型的バッチ式系の変形において、前記基質は発酵が進行するにつれて徐々に添加される。異化代謝産物抑制により細胞の代謝が抑制される傾向がある場合、及び培地における基質量の制限が望ましい場合に、流加系は有益である。流加系における実際の基質濃度の測定は、困難であり、従って、ｐＨ、溶解酸素等の測定可能な因子及びＣＯ_２等の消耗気体の分圧の変化に係る基準について試算される。バッチ式及び流加式発酵は一般的であり、当該技術分野に知られている。

連続発酵は開放系であり、既定発酵培地は継続的にバイオリアクターへ添加され、等量のならし培地が工程中、同時に回収される。連続発酵は一般的に、一定高密度での培養で維持され、細胞は主に対数期成長にある。

連続発酵は、細胞成長及び／又は最終生成物濃度に影響する一因子又は任意数の因子の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を可能にさせる。例えば、一の実施態様において、炭素源又は窒素源等の栄養素の限定は、定率で維持され、他の全てのパラメーターは、加減され得る。他の系において、成長に影響する多くの因子は、継続的に変化し得る一方、培地濁度により測定される前記細胞の濃度は一定に保たれる。継続的な系は、定常状態の成長条件を維持する。従って、培地が取り除かれたための細胞の損失は、発酵における細胞成長率とバランスが保たれる。生成物の形成率を最大にする技術と同様に連続発酵方法に用いる栄養素及び成長因子の調節方法は、産業微生物学の技術分野において公知である。

用途及び使用方法
本発明の実施態様において、本発明に係る少なくとも１のフィターゼを含む酵素組成物が提供される。本発明に係る組成物は、当該技術分野で知られている方法により調製され、液状、又は乾燥状態の組成物とすることが出来る。

液状組成物は、ファイターゼ酵素以外を含有する必要はなく、前記ファイターゼ酵素は、実質的に精製されているか、又は未精製のいずれかの状態とすることが出来るが、好ましくは精製された状態である。しかしながら、通常、グリセロール、ソルビトール又はモノプロピレン・グリコール等の安定剤も添加される。また、液状組成物は、塩、砂糖、防腐剤、ｐＨ調整剤（すなわち、緩衝剤）、タンパク質、又はフィチン酸塩（フィターゼ基質）等、１以上の他の添加物も含み得る。典型的な液状組成物は、水性、又は、油性のスラリーである。

乾燥状態の組成物は、スプレー乾燥された組成物とすることができ、その場合、組成物は乾燥状態の前記酵素以外を含有する必要がない。しかしながら、乾燥状態の組成物は通常、いわゆる顆粒と言われ、例えば、食物又は飼料成分と容易に混合され得るか、又は、より好ましくはプレミックス（ｐｒｅ−ｍｉｘ）の構成を形成し得る。好ましい酵素顆粒の粒子径は、混合物の他の成分の粒子径と適合する。

いくつかの実施態様において、本発明で包括される変異フィターゼを含む酵素組成物は、任意で以下の酵素の一又はそれらの組み合わせと、組み合わせて使用されることが出来る。酵素はすなわち、グルコアミラーゼ、アルファ・アミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、サイクロデキストリン・グリコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、他のフィターゼ、及びそれらの組み合わせである。

いくつかの実施態様においてフィターゼ組成物は、食物又は動物飼料の組成物である。食物又は動物飼料組成物は、飼料又は食物の１０乃至１５，０００Ｕ／ｋｇ（例えば、１００乃至５，０００Ｕ／ｋｇ、２００乃至２，０００Ｕ／ｋｇ及びまた５００乃至１０００Ｕ／ｋｇ）の濃度でフィターゼを含み得る。フィターゼ組成物は、例えば家禽や豚等の家畜及び魚やエビを含む水生の家畜の消化管で活性のある添加物として使用され得る。本発明は食物又は動物飼料の生成方法であって、本発明に係るフィターゼが前記食物又は動物飼料と混合されることを特徴とする前記方法を意図する。液状組成物は、任意のペレット化の後に食物又は動物飼料へ添加されることが出来る。

いくつかの実施態様において動物飼料は、以下の成分の１以上を含む。成分はすなわち、ａ）小穀物等のシリアル（例えば、小麦、大麦、ライ麦、燕麦、及びそれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ又はモロコシ等の大粒の穀類、ｂ）トウモロコシグルテンミール、ディスチラーズドライドグレインソルブルズ（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｄｒｉｅｄ Ｇｒａｉｎ Ｓｏｌｕｂｌｅｓ、ＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦全粒粉、小麦ショーツ、米糠、もみ殻、オート麦外皮、パーム核、及び柑橘類パルプ等のシリアル由来の副生産物、ｃ）タンパク質大豆、向日葵、ピーナッツ、ルピナス、えんどう、空豆、綿、キャノーラ、フィッシュミール、乾燥プラズマタンパク質、肉骨粉、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、胡麻等から得られるタンパク質、ｄ）野菜及び動物源から得られる油脂、ｅ）鉱物及びビタミン、ｆ）酵素、ベタイン、香味料、精油、抗生物質成長促進剤、抗コクシジウム剤、プロバイオティクス、及びプレバイオティクス等の栄養補助食品である。

動物肥料中のリンのレベルの減少方法であって、動物飼料中に含まれるフィチン酸塩を変換するのに有効な量で発明に係る動物飼料が、動物に供給されることを特徴とする前記方法が提供される。

さらに本発明で包括されるフィターゼ組成物は、でんぷん分解の方法で使用され得る。フィターゼ組成物は、でんぷん液化工程、糖化工程及び／又は発酵工程の間、添加され得る。アルファ・アミラーゼは、（例えば、醸造、及び焼付けで）供給体としての例えば、製粉穀類等の減少された植物原料を用いた工業でんぷん加水分解過程で、でんぷんの１−４リンケージを破壊するのに使用される。アミラーゼはでんぷんの破壊に必要とされ、当該酵素の適切な活性を得ることは時折問題が多い。時にフィチン酸塩が抑制作用をアミラーゼに与えることが知られている。従って、本発明に係るフィターゼを含む酵素組成物はでんぷん加水分解過程で使用され、アルファ・アミラーゼ（欧州特許０８１３６０７Ｂ）へのフィチン酸塩の抑制作用を減少し得る。

フィターゼ、フィチン酸塩及びより下級のリン酸塩フィチン酸塩派生物は、様々な産業用途、特に清掃技術、リソグラフィー技術及び化学技術と同様、パーソナルケア製品、医療品、食物、及び栄養製品での他の多くの用途で見られる。

以下の実施例は具体化を目的としてのみ提供され、いかなる方法でも本発明の範囲を限定する意図はない。

実験
略語
開示と以下の実験の項において、以下の略語が適用される。℃（摂氏温度）、ｒｐｍ（毎分回転数）、Ｈ_２Ｏ（水）、ｄＨ_２Ｏ（脱イオン水）、ｄＩＨ_２Ｏ（脱イオン水、Ｍｉｌｌｉ−Ｑろ過）、ａａ又はＡＡ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロベースペア）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇ又はｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μＬ（マイクロリットル）、ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメータ）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、Ｕ（ユニット）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ又はｓ（秒）、ｍｉｎ又はｍ（分）、ｈｒ又はｈ（時間）、ＡＭＭ溶液（７．５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４、１５ｍＭモリブデン酸アンモニウム及びアセトン（１：１：２））、ＡＢＳ（吸光度）、ＥｔＯＨ（エタノール）、ＰＰＳ（生理的食塩水、ｍ／ｖ（質量／体積）、ＭＴＰ（マイクロタイタープレート）。

以下の分析評価及び方法が、下記の実施例で使用される。

変異体の提供に使用される方法は、以下に記載される。しかしながら、異なる方法が親分子の変異体の提供に使用され得ることに留意されるべきであり、本発明は実施例で使用される方法に限定されない。変異体の作成及び変異体の選択に適した任意の手段が使用され得ることを意図する。

ブティアウクセラ属種株Ｐ１−２９を、登録番号４１２４８でＮＣＩＭＢに保管された。植物原料からの当該株の単離及び分類学的同定は、国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８で記載される（実施例１乃至４参照）。さらに、染色体ＤＮＡのクローニング、大腸菌内でのブティアウクセラ属種株Ｐ１−２９由来のフィターゼ遺伝子の増幅及び発現も記載される（実施例５及び６参照）。また、国際公開番号２００６／０４３１７８で開示されるブティアウクセラ属種株Ｐ１−２９フィターゼはＢＰ−ＷＴとしても本明細書に示され、本明細書で配列番号１及び配列番号２として参照される。

フィターゼ酵素活性分析評価
当該分析評価を２つの緩衝系で行った。ｐＨ４．０乃至５．５において、酢酸ナトリウム緩衝液を使用した。ＨＣＬを用いて２５０ｍＭ酢酸ナトリウムを指示ｐＨ値へ滴定して調製した。ｐＨ２．０乃至３．５に用いる緩衝液は、ＨＣＬを用いて２５０ｍＭグリシンを指示ｐＨ値へ滴定して調製した。ｐＨ４．０での分析評価を標準値として用いた。緩衝液に加え、６ｍＭフィチン酸塩、１．０ｍＭＣａＣｌ_２、及び０．０５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを反応混合物に含めた。反応を１時間、３７℃で実行させた。リン酸塩の放出を例えば、Ｈｅｉｎｏｎｅｎ他（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ，Ｊ．Ｋ．、Ｌａｈｔｉ，Ｒ．Ｊ．、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３（２）、３１３乃至３１７ページ（１９８１年））で開示されるようなモリブデン酸塩分析評価を用いて測定した。簡潔には、新たに調製した２００μｌＡＭＭ溶液を、各マイクロタイタープレートウェル内の１００μｌ反応混合物に加えた。３９０ｎｍでの吸収度を、ＡＭＭ試薬の添加後１０分以後、３０分以内に測定した。リン酸塩の量は、既知濃度のリン酸塩溶液を用いた校正曲線を描くことにより決定した。フィターゼ変異体特有の吸収値（Ａ２８０）を、タンパク質のアミノ酸組成に基づき、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェア（インビトロジェン）を用いて計算した。

比活性度の分析評価
フィターゼ活性を、マイクロタイタープレート内で共役酵素反応を用いて決定した。酵素製剤を、希釈緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０５％プルロニックＦ−６８、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で希釈した。５μｌの酵素溶液へ、７５μｌのフィターゼ分析混合物（５００ｍＭグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ４．０、１０．６７ｍＭフィチン酸塩、１ｍＭＣａＣｌ_２、０．０５％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ−６８）を添加した。分析試料を１時間、３７℃でインキュベートした。次に、１０μｌの分析試料を、４０μｌの検出分析混合物（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、２５μＭ ＡＤＨＰ（ＭｏＢｉＴｅｃ、ゲッティンゲン、ドイツ）、０．２５ｕ／ｍｌマルトセフォスフォリラーゼ（ｍａｌｔｏｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、０．３１２５ｍＭマルトース、１．５６２５ｕ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、０．３１２５ｕ／ｍｌホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）と混合し、１時間、３７℃でインキュベートした。３０μｌの２７００ｕ／ｍｌカタラーゼ水溶液を添加し、反応を停めた。次に、励起波長として５３５ｎｍを使用し、５９５ｎｍでの蛍光を測定した。リン酸塩の量は、既知濃度のリン酸塩溶液を用いた校正曲線を用いて決定した。

Ａ２８０ｎｍでの吸収測定により、タンパク質定量をした。フィターゼ変異体特有の吸収値（Ａ２８０）は、タンパク質のアミノ酸組成に基づき、Ｇｉｌｌ及びｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２、３１９乃至３２６ページ（１９８９年））を用いて計算した。

熱安定性
変異体の熱安定性について、酵素の不活化温度により特性解析を行った。不活化温度は、１０分間の異なる温度でのインキュベーション及びその後の室温への冷却の後、フィターゼ酵素の残留活性を測定することで決定した。不活化温度は、室温で同一条件、同一期間インキュベートした後の残留活性と比べ、残留活性が５０％になる温度である。５０％の残留活性に対応する温度を決定するため、測定活性データから補間（ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎｓ）及び外挿（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎｓ）の適切であるところを計算した。℃における熱安定性差は、２つの酵素の相互の不活化温度を引き算することにより計算した。

ＢＰ−１１変異体の精製
ＢＰ−１１をコードするプラスミドを用いて形質転換したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを、２０ｍｇ／lネオマイシンを添加した標準ＬＢ培地を用いて３７℃、１６０ｒｐｍの振盪フラスコ内で培養し、精製を行った。この工程で、有意量のフィターゼ活性が培地に蓄積された。約２Ｌの培養ブロスをｐＨ８．０に調整し、ろ過後、１０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡセファロース樹脂（キアゲン）を詰めたカラムに適用した。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０でＯＤ２８０が０．０５未満に落ちるまで洗った。次に、固定されたフィターゼを２５０ｍＭイミダゾール塩酸塩を含む同様の緩衝液で溶出した。溶出物は、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に対して透析し、４℃で保管した。次に、酵素溶液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で平衡にしたＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラムに適用し、溶出を１０カラム体積以上の０乃至１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配を用いて行った。任意に、４℃で保管する前に、溶出物を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に対して透析した。

ペプシン安定性
ペプシンインキュベーション後にｐＨ３．５、３７℃の残留活性を測定し、対照条件と比較して前記変異体のペプシン安定性の特性解析を行った（残留活性＝ペプシンインキュベーション後の活性／対照条件下でのインキュベーション後の活性）。ペプシンインキュベーションを、３７℃で２時間、ｐＨ２．０の０．２５ｍｇ／ｍｌペプシン、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで行った。対照条件は、３７℃で２時間、ｐＨ５．０、１ｍＭ ＣａＣｌ_２及び５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡで行った。

以下の実施例において、別に記載されない限り、ＢＰ−ＷＴ（配列番号１）の配列に従って、フィターゼ変異体の配列におけるアミノ酸残基に番号を付けた。

実施例１．フィターゼ変異体の生成及び特性解析
フィターゼ変異体は一般に、ヌクレオチド配列配列番号５の変異誘発により構築した。前記変異誘発の方法は、例えば、Ｍｏｒｉｎａｇａ他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４年）２、６４６乃至６４９ページ）、Ｎｅｌｓｏｎ及びＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９年）、１８０、１４７乃至１５１ページ）で開示される方法、又は国際公開番号ＷＯ９２／１８６４５で開示されるＥｒｒｏｒ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓプロトコルを用いた。変異誘発ＰＣＲの別の適した方法は、Ｃａｄｗｅｌｌ及びＪｏｙｃｅ（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．３（１９９４年）、１３６乃至１４０ページ）で開示される。

フィターゼ酵素変異体は、以下の１以上の発現宿主内の異種発現後に特性解析を行った。前記発現宿主はすなわち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。フィターゼ変異体は、配列番号１と、２のアミノ酸の位置、３のアミノ酸の位置、４のアミノ酸の位置、５のアミノ酸の位置、６のアミノ酸の位置、７のアミノ酸の位置、８のアミノ酸の位置、９のアミノ酸の位置、１０のアミノ酸の位置、１１のアミノ酸の位置、１２のアミノ酸の位置を含め、１以上のアミノ酸の位置で異なるものに由来する。変異誘発の適切な反復ラウンドを行った。国際公開番号ＷＯ２００６／０４３１７８で記載されるプロトコルに従って、様々な変異体がＢＰ−ＷＴで認められた。特に、ＢＰ−ＷＴより増加した熱安定性を有する、ＢＰ−１１に指定された１の変異体、Ａ１２２Ｔ／Ｄ１２５Ａ／Ｔ１６７Ｉ／Ｆ１９７Ｓ／Ｔ２０９Ｋ／Ａ２１１Ｐ／Ｋ２４０Ｅ／Ａ２４２Ｓ／Ｓ２８１Ｌ／Ｑ２８９Ｙ／Ａ２９４Ｅ／Ｎ３０３Ｋが認められた（配列番号６に対応する、配列番号４のアミノ酸残基７から４１９参照）。

実施例２．ＢＰ−１１の変異体
ＢＰ−１１の変異体を得るため、ランダム然変異誘発、定方向突然変異誘発、及び部位飽和突然変異誘発を含む３つの異なる方法を用いた。

Ａ．例えば、ＢＰ−１１等のＢＰ−ＷＴ変異体を得るため、国際公開番号ＷＯ２００６／０４３０７８で記載される内容に従って、ランダム然変異誘発及びハイスループット・スクリーニングを行った。

当該方法で得られたＢＰ−１１の１の特定の変異体をＢＰ−１９に指定した。ＢＰ−１９は、配列番号４に対応する５４（Ｙ５４Ｈ）、８４（Ｓ８４Ｇ）、１９０（Ｓ１９０Ｇ）、２２０（Ｉ２２０Ｖ）、及び２８９（Ｎ２８９Ｄ）の位置での置換でＢＰ−１１と異なる。

比活性を測定するため上述の分析評価を使用し、ＢＰ１９が、ＢＰ−１１より２６％高いｐＨ４．０における比活性を有することが測定された。表３が参照にされる。

Ｂ．ＢＰ−ＷＴ骨格及び配列番号４のＧ２２１Ｓ、Ｔ２２５Ｍ、及びＮ２７６Ｒの位置に対応するＢＰ−１１骨格で３つの特異残基の定方向突然変異誘発を行った。ＢＰ−ＷＴ骨格から変異体ＢＰ１５を得、ＢＰ−１１骨格から変異体ＢＰ１６を得た。親フィターゼに関連した比活性は表３で記載される。

Ｃ．様々な位置での変異ＢＰ−１１分子に基づく部位飽和突然変異誘発ライブラリを行った。前記位置は、配列番号４のＲ２４、Ｒ２８、Ｔ３１、Ｋ３２、Ｄ９８、Ｒ１００、Ｋ１３７、Ｎ２１２、Ｇ２２１、Ｔ２２５、Ｅ２２８、Ｈ２５９、Ｆ２６３、Ｍ２６６、Ｎ２７６、Ｈ３１２、Ｄ３１３、Ｔ３１４、及びＤ３３４を含めた。ライブラリについて、始めにハイスループット・スクリーニングで改良した活性の選抜を行った。次に、いくつかの変異体について上述の比活性の選抜を行った。選択された変異体はさらに、約９７％の精度に精製され、比活性を分析した。Ｄ９８の位置の２つの変異体において改良した比活性（Ｄ９８Ａ及びＤ９８Ｑ）が得られた。ａｓｐ（Ｄ）（Ｄ９８Ａ）の代わりにａｌａ（Ａ）を有する変異体を単離し、ＢＰ１７として指定した（配列番号３参照）。ａｓｐ（Ｄ）（Ｄ９８Ｑ）の代わりにｇｌｎ（Ｑ）を有する変異体を単離し、ＢＰ−２０として指定した。

ＢＰ−１６、ＢＰ−１７、ＢＰ−１８、ＢＰ−１９、及びＢＰ−２０を含むＢＰ−１１の変異体について、上述のようにフィターゼ活性の全ての試験を行った。

実施例３．ＢＰ−１７の大腸菌内での発現
ＢＰ−１７変異体のＤＮＡ配列を、「６ｘＨｉｓタグ」が後に続いく野生型ブティアウクセラ属フィターゼのシグナル配列及び成熟ブティアウクセラ属フィターゼ変異体ＢＰ−１７に対応するコード配列をコードするＤＮＡ配列を含めることにより、大腸菌での発現のために修飾した。標準的遺伝子工学の方法を用いて、当該ヌクレオチド配列を、大腸菌ｄｇｐ遺伝子プロモーター及び同様に大腸菌由来であるｔｕｆＡ遺伝子の転写ターミネーターの間に挿入した。

発現カセットを、大腸菌ベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン）のＳａｃＩ及びＡｐａＩ制限部位の間に挿入し、プラスミドｐＣＤＰ（ＳＨＯＫ）を作成した。発現ベクターｐＣＤＰ（ＳＨＯＫ）の構造は図２に図解される。

ｐＣＤＰ（ＳＨＯＫ）により形質転換された大腸菌株ＸＬ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’を、５０ｍｇ／１のカナマイシンを添加した標準ＬＢ培地を用いて、３７℃及び２００ｒｐｍの振盪フラスコで培養した。この工程で、ｐＣＲ２．１で形質転換された受容株では検出されない有意量のフィターゼ活性が培地に蓄積され、同様の培地上で培養した。約２１個の当該培養ブロスをｐＨ８．０に調整し、２５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（インビトロジェン）を詰めたカラムに適用した。前記カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０でＯＤ_２８０が０．０５未満に落ちるまで洗い、その後、２００ｍＭイミダゾール塩酸塩を含む同様の緩衝液を用いて結合したフィターゼを溶出した。溶出物を２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５に対して透析し、４℃で保管するか、又は−２０℃で凍結保存した。凍結融解の繰り返しによる活性の損失は見られなかった。

大腸菌及び野生型ブティアウクセラ属フィターゼ（ＢＰ−ＷＴ）で発現されたＢＰ−１７のｐＨプロフィールを以下の通り測定した。塩酸でｐＨ６、５．５、５、４．５、４．２５、４．０、３．７５、３．５に調整された２５０ｍＭ酢酸ナトリウム及び７．５ｍＭフィチン酸ナトリウムを含む溶液を、範囲ｐＨ３．５乃至ｐＨ６．０のｐＨプロフィールの作成に用いた。３．０及び２．５のｐＨ値における酵素の活性を、塩酸で指示されたｐＨに調整された２５０ｍＭグリシン及び７．５ｍＭナトリウムフィターゼを含む基質溶液内で測定した。大腸菌で生産されたＢＰ−１７のｐＨプロフィールが野生型ブティアウクセラ属フィターゼのｐＨプロフィールから有意に逸脱していることがわかった（図３）。

（約３０Ｕ／ｍｌに希釈された）前記酵素を、３ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む０．２５Ｍ塩酸グリシン緩衝液、ｐＨ２．０中のペプシンの異なる濃度に、２時間、３７℃で処理した。インキュベーション後、残存活性はｐＨ５．５で分析評価した。図４で示すように、ＢＰ−１７は基本的にはペプシンに安定である。ＢＰ−１７の高いペプシン安定性は、１μｇ／ｍｌのペプシンで基本的に完全に分解される野生型ブティアウクセラ属フィターゼの非常に低いペプシン安定性と対照的である（図４）。

実施例４乃至８では、野生型と変異ブティアウクセラ属フィターゼを直接又はトリコデルマ・リーセイの融合タンパク質として発現させた。全ての場合において、１０ｇ／Ｌより高い、非常に強いレベルの発現が見られた。

実施例４．Ｋｅｘ２部位を有さない融合タンパク質としての野生型ブティアウクセラ属フィターゼの構築及びＴ．リーセイ内の発現
野生型ブティアウクセラ属フィターゼのオープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡを、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（ＢｉｏＰａｒｋ Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ Ｓｔｒ．１１、Ｄ−９３０５３レーゲンスブルク、ドイツ）で合成した。クローニングの目的で制限部位、ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩを含めた（表４、配列番号８参照）。フィターゼオープン・リーディング・フレーム（配列番号８）を、ベクターｐＴｒｅｘ４のＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位に挿入した（図５参照）。結果として出来た構築物を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（ヘラクレス、カリフォルニア州）のＢｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いた微粒子銃でＴ．リーセイ由来の株に形質転換した。使用される形質転換プロトコルは、Ｆｏｒｅｍａｎ（国際公開番号ＷＯ２００５／００１０３６）に記載される。安定した形質転換体を得た後、ブティアウクセラ属フィターゼタンパク質の発現解析のため、形質転換体をＦｏｒｅｍａｎ（国際公開番号ＷＯ２００５／００１０３６）で概説されるように、振盪フラスコ培地で育成した。国際公開番号ＷＯ２００５／００１０３６の形質転換及び発現解析プロトコルは、参照によりそれらの全てが本明細書に組み込まれる。ＭＭアセトアミドプレートでの数日の育成の後、安定した形態を示す形質転換体を、３０ｍｌのプロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地を含む２５０ｍｌの振盪フラスコに植菌した。プロフロ培地は、３０ｇ／Ｌ α−ラクトース、６．５ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＣａＣＬ_２、１ｍｌ／Ｌ １０００Ｘ微量元素塩溶液、２ｍｌ／Ｌ １０％Ｔｗｅｅｎ ８０、２２．５ｇ／Ｌプロフロ綿実粉（トレーダーズ・プロテイン（Ｔｒａｄｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、メンフィス、テネシー州）、及び０．７２ｇ／Ｌ ＣａＣＯ_３を含む。２日間の２８℃、２２５ｒｐｍでの培養後、１０％のプロフロ培養液を、３０ｍｌのラクトース・ディファインド・メディウム（Ｌａｃｔｏｓｅ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉａ）を含む２５０ｍｌの振盪フラスコに移した。ラクトース・ディファインド・メディウムの組成物は以下の通りである。すなわち、５ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、３３ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ緩衝液、９ｇ／Ｌカザミノ酸、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、５ｍｌ／ＬマヅＤＦ６０−Ｐ消泡剤（ｍａｚｕｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ガーニー、イリノイ）、１ｍｌ／Ｌ １０００Ｘ微量元素塩溶液、ｐＨ５．５である。４０ｍｌ／Ｌの４０％（ｗ／ｖ）ラクトース溶液を滅菌後に先の培地に加えた。ラクトース・ディファインド・メディウムの振盪フラスコは、２８℃、２２５ｒｐｍで２−３日間培養した。培養上清のサンプルを、適当量の還元剤を含む４×ＮｕＰＡＧＥサンプル溶液（インビトロジェン カールスバッド、カリフォルニア）と混合し、４−１２％ ＮｕＰＡＧＥプレキャストゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけ、ＭＯＰＳ泳動緩衝液（インビトロジェン カールスバッド、カリフォルニア）を用いた。タンパク質検出のため、ゲルはシンプリー・ブルー・ステイン（インビトロジェン カールスバッド、カリフォルニア）で染色した。見かけの分子量が、約９６ｋＤａのタンパク質バンドが染色されたゲル上で観測された。融合タンパク質の期待分子量は約９６ｋＤａである。このタンパク質は１０ｇ／Ｌより多く発現していることがわかった。

実施例５．Ｋｅｘ２部位を有する融合タンパク質としての野生型ブティアウクセラ属フィターゼの構築及びＴ．リーセイ内の発現
野生型ブティアウクセラ属フィターゼのオープン・リーディング・フレームは、テンプレートとしてＧＥＮＥＡＲＴによって合成されたＤＮＡ（表４、配列番号８参照）を使用し、ＰＣＲで増幅した。使用したＰＣＲ機器は、ペルチェ・サーマル・サイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）である。ＰＣＲで使用したＤＮＡポリメラーゼは、ＨＥＲｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。フィターゼのオープン・リーディング・フレーム増幅に使用したプライマーは、プライマーＳＫ６６７（フォワード）５’−ＣＡＣＴＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧ−３’（配列番号９）と、プライマーＳＫ６６４ ５’−ＧＡＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＣＴＧＧＡ−３（配列番号１３）である。フォワード・プライマーは、クローニング目的のためのＳｐｅＩ部位と共に、Ｋｅｘ２タンパク質分解酵素による効率的な切断のためのアミノ酸配列ＶＡＶＥＫＲ（配列番号１０）を含む。野生型ブティアウクセラ属フィターゼのオープン・リーディング・フレーム増幅のためのＰＣＲ条件は以下の通りである。すなわち、工程１、９４℃、１分、工程２、９４℃、３０秒、工程３、５８℃、３０秒、工程４、７２℃、１分、工程２、３、及び４をさらに２４サイクル繰り返した後、工程５、７２℃、５分、工程６、４℃で保存した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （キアゲン）を使用し精製し、制限酵素ＳｐｅＩとＡｓｃＩ（ロシュ）で分解した。分解されたＤＮＡを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用し精製し、ＳｐｅＩとＡｓｃＩ部位でｐＴｒｅｘ４ベクターにライゲートした（図５参照）。ライゲーション反応物をＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換した。形質転換とタンパク質発現の確認は実施例４参照。見かけの分子量が約９６ｋＤａのタンパク質バンドが染色されたゲル上で観測された。融合タンパク質の期待分子量は約９６ｋＤａである。このタンパク質は１０ｇ／Ｌより多く発現していた。

実施例６．直接設計としての野生型ブティアウクセラ属フィターゼの構築及びＴ．リーセイ内の発現
野生型ブティアウクセラ属フィターゼのオープン・リーディング・フレームは、テンプレートとしてＧＥＮＥＡＲＴによって合成されたＤＮＡ（表５、配列番号６参照）を使用し、ＰＣＲで増幅した。使用したＰＣＲ機器は、ペルチェ・サーマル・サイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）である。ＰＣＲに使用したＤＮＡポリメラーゼは、ＨＥＲｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。フィターゼのオープン・リーディング・フレーム増幅に使用したプライマーは、プライマーＳＫ６８０（フォワード）５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１１）とプライマーＳＫ６ ５’−ＣＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１２）である。フォワード・プライマーは、ｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングするために必要な４つの追加ヌクレオチド（配列−ＣＡＣＣ）を５’末端に含む。野生型ブティアウクセラ属フィターゼのオープン・リーディング・フレーム増幅のためのＰＣＲ条件は以下の通りである。すなわち、工程１、９４℃、１分、工程２、９４℃、３０秒、工程３、５８℃、３０秒、工程４、７２℃、１分、工程２、３、及び４をさらに２４サイクル繰り返した後、工程５、７２℃、５分、工程６、４℃で保存した。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を使用し精製した。精製したＰＣＲ産物は、まずｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、その後、ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換した。フィターゼの正しいオープン・リーディング・フレームを有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターはメーカーの説明書に従い、ＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン）を使用してｐＴｒｅｘ３ｇベクターに再結合させた（図６参照）。結果として得られた構築物を、実施例４のように形質転換し、タンパク質発現を確認した。融合タンパク質の期待分子量は約４６ｋＤａである。このタンパク質は１０ｇ／Ｌより多く発現していた。

実施例７．Ｋｅｘ２部位を有する融合タンパク質としてのＢＰ−１７変異ブティアウクセラ属フィターゼの構築及びＴ．リーセイ内の発現
ＢＰ−１７変異オープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡを、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（ＢｉｏＰａｒｋ Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．１１、Ｄ−９３０５３レーゲンスブルク、ドイツ）で合成した（表５、配列番号７参照）。クローニング目的の制限サイトＳｐｅＩとＡｓｃＩと共に、融合タンパク質のＫｅｘ２タンパク質分解酵素切断のためのアミノ酸配列ＶＡＶＥＫＲ（配列番号１０）を含む。フィターゼのオープン・リーディング・フレーム（配列番７）はベクター、ｐＴｒｅｘ４、のＳｐｅＩとＡｓｃＩ部位に導入された（図５参照）。結果として得られた構築物を、実施例４のように形質転換し、タンパク質発現を確認した。融合タンパク質の期待分子量は約９６ｋＤａである。このタンパク質は１０ｇ／Ｌより多く発現していた。

実施例８．直接設計としてのＢＰ−１７変異ブティアウクセラ属フィターゼの構築及びＴ．リーセイ内の発現
ＢＰ−１７変異オープン・リーディング・フレームをコードするＤＮＡは、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（ＢｉｏＰａｒｋ Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ１１、Ｄ−９３０５３レーゲンスブルク、ドイツ）により合成した（表５、配列番号７参照）。ＰＣＲ機器は、ペルチェ・サーマル・サイクラー ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）である。ＰＣＲに使用したＤＮＡポリメラーゼは、ＨＥＲｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。フィターゼのオープン・リーディング・フレーム増幅に使用したプライマーは、プライマーＳＫ６８０（フォワード）５’−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＡＡＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１１）とプライマーＳＫ６５’−ＣＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１２）である。フォワード・プライマーは、ｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングするために必要な４つの追加ヌクレオチド（配列−ＣＡＣＣ）を５’末端に含む。野生型ブティアウクセラ属フィターゼのオープン・リーディング・フレーム増幅のためのＰＣＲ条件は以下の通りである。すなわち、工程１、９４℃、１分、工程２、９４℃、３０秒、工程３、５８℃、３０秒、工程４、７２℃、１分、工程２、３、及び４をさらに２４サイクル繰り返した後、工程５、７２℃、５分、工程６、４℃で保存した。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を使用し精製した。精製したＰＣＲ産物を、まずｐＥＮＴＲＹ／ＤＴＯＰＯベクター（インビトロジェン）にクローニングし、その後、ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌細胞（インビトロジェン）に形質転換した。正しいフィターゼのオープン・リーディング・フレームを有するｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターはメーカーの説明書に従い、ＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン）を使用してｐＴｒｅｘ３ｇベクターに再結合させた（図６参照）。結果として得られた構築物を、実施例４のように形質転換し、タンパク質発現を確認した。見かけの分子量が約４６ｋＤａのタンパク質のバンドが染色されたゲルで確認された。融合タンパク質の期待分子量は約４６ｋＤａである。このタンパク質は１０ｇ／Ｌより多く発現していることがわかった。

Claims (31)

1. 単離フィターゼ変異体であって、配列番号１のＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に対応する置換を含み、配列番号１のアミノ酸残基３４から４４６の変異置換を含めて少なくとも９５％の配列同一性を有する前記変異体。
2. 前記変異体が、配列番号１のＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に対応する置換を含む、請求項１に記載のフィターゼ。
3. 前記置換がさらに、配列番号１のＡ１２２Ｔ、Ｄ１２５Ａ、Ｔ１６７Ｉ、Ｆ１９７Ｓ、Ｔ２０９Ｋ、Ａ２１１Ｐ、Ｋ２４０Ｅ、Ａ２４２Ｓ、Ｓ２８１Ｌ、Ｑ２８９Ｙ、Ａ２９４Ｅ、及びＮ３０３Ｋを含み、配列番号１のアミノ酸残基３４から４４６の変異置換を含めて少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のフィターゼ。
4. 前記変異体が配列番号３の配列を有する、請求項１に記載のフィターゼ。
5. ブティアウクセラ属種フィターゼの変異体であって、配列番号１のＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に対応する置換から成る前記変異体。
6. 単離フィターゼ変異体であって、配列番号４のＲ２４、Ｒ２８、Ｔ３１、Ｋ３２、Ｄ９８、Ｒ１００、Ｋ１３７、Ｎ２１２、Ｇ２２１、Ｔ２２５、Ｅ２２８、Ｈ２５９、Ｆ２６３、Ｍ２６６、Ｎ２７６、Ｈ３１２、Ｄ３１３、Ｔ３１４、及び／又はＤ３３４の位置に対応する置換を含む前記変異体。
7. 前記置換が配列番号４のＤ９８の位置に対応する、請求項６に記載のフィターゼ変異体。
8. フィターゼの変異体であって、配列番号１のアミノ酸残基の３４から４４６の位置と９８％の配列同一性を含み、配列番号１のＡ１２２、Ｄ１２５、Ｔ１６７、Ｆ１９７、Ｔ２０９、Ａ２１１、Ｋ２４０、Ａ２４２、Ｓ２８１、Ｑ２８９、Ａ２９４、及びＮ３０３の位置に置換を含む前記変異体。
9. 請求項１に記載のフィターゼをコードするＤＮＡ。
10. 請求項６に記載のフィターゼをコードするＤＮＡ。
11. 請求項９に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
12. 請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
13. 配列番号２のフィターゼと比べ、増加した熱安定性を有する、請求項１に記載のフィターゼ変異体。
14. 請求項１に記載のフィターゼを含む酵素組成物。
15. 請求項６に記載のフィターゼを含む酵素組成物。
16. 前記組成物が動物飼料組成物である、請求項１４に記載の酵素組成物。
17. 前記組成物がでんぷん液化処理で使用される、請求項１４に記載の酵素組成物。
18. 前記組成物がアルコール発酵処理で使用される、請求項１４に記載の酵素組成物。
19. グルコアミラーゼ、アルファ・アミラーゼ、タンパク質分解酵素、セルラーゼ、キシラナーゼ及びそれらの組み合わせの群から選択される酵素をさらに含む、請求項１４に記載の酵素組成物。
20. 糸状真菌細胞の培地から生成された請求項１に記載のフィターゼを含む発酵培地。
21. 前記糸状真菌細胞がトリコデルマ属細胞である、請求項２０に記載の発酵培地。
22. 前記トリコデルマ属細胞がＴ．リーセイである、請求項２１に記載の発酵培地。
23. 前記フィターゼが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の発酵培地。
24. 宿主細胞内でフィターゼを生産する方法であって、
    ａ）配列番号３と少なくとも７５％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するフィターゼをコードする異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結された、宿主細胞内で転写活性を有するプロモーターを含むＤＮＡ構築物で宿主細胞を形質転換する工程、
    ｂ）前記形質転換された宿主細胞を適切な培養地中で培養し、前記フィターゼを発現させる工程、及び
    ｃ）前記フィターゼを生産する工程
    を含む、前記方法。
25. 前記宿主細胞が真菌細胞、細菌性細胞、又は植物細胞である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記真菌細胞が酵母細胞又は糸状真菌細胞である、請求項２５に記載の方法。
27. 生産されたフィターゼを回収する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
28. 前記宿主細胞が糸状真菌宿主細胞であり、前記糸状真菌宿主細胞がトリコデルマ属細胞である、請求項２６に記載の方法。
29. 前記トリコデルマ属細胞がＴ．リーセイ細胞である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記フィターゼが配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２４に記載の方法。
31. 前記フィターゼが配列番号３の配列を有する、請求項３０に記載の方法。

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