JP2016500267A - アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）由来のグルコアミラーゼを発現するトリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞、及びその使用方法 - Google Patents

アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ）由来のグルコアミラーゼを発現するトリコデルマ・レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞、及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞（ＡｆＧＡＴＲ）において発現される、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）由来の真菌グルコアミラーゼが、提供されている。トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞は、天然に発現されるＡｆＧＡアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）より高いレベル又は少なくとも同等のレベルにてＡｆＧＡＴＲを発現する。ＡｆＧＡ１ＴＲ及びＡｆＧＡ２ＴＲを含むＡｆＧＡＴＲは、高温及び低ｐＨにて高活性を呈するため、アスペルギルス・カワチイ（Aspergillus kawachii）のαアミラーゼ（ＡｋＡＡ）などのαアミラーゼの存在下で、ＡｆＧＡＴＲは糖化プロセスにおいて効率的に利用され得る。ＡｆＧＡＴＲは好都合にもデンプンの糖化を触媒して、アスペルギルス・ニガーアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）により、又はアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）において発現される天然のＡｆＧＡにより触媒される糖化の産物と比べてＤＰ１（即ち、グルコース）が著しく富化されたオリゴ糖組成物を生ずる。ＡｆＧＡ１ＴＲ、ＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体などのＡｆＧＡＴＲは、ＡｎＧＡ及び天然に発現されるＡｆＧＡよりも低用量で使用して、同等なレベルのグルコースを生成し得る。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年１２月１１日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８６３４９号による優先権の利益を主張するものであり、その全体が本明細書において参照により援用されている。
本明細書には配列番号１〜１４を含む配列表が添付され、その全体が本明細書において参照により援用されている。
（発明の分野）
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）（ＡｆＧＡＴＲ）由来のグルコアミラーゼを発現するトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞、又はその変異体、及びその使用方法。
デンプンはアミロース（１５〜３０％ ｗｔ／ｗｔ）とアミロペクチン（７０〜８５％ ｗｔ／ｗｔ）の混合物からなる。アミロースは、約６０，０００〜約８００，０００の分子量（ＭＷ）を有するα−１，４−結合型グルコース単位の線状鎖からなる。アミロペクチンは、２４〜３０グルコース単位毎にα−１，６分岐点を包含した分岐鎖状ポリマーで、ＭＷは１億にもなる場合がある。
現在、デンプン由来の糖を濃縮デキストロースシロップ形態で製造する際には、（１）αアミラーゼによる、固体デンプンのデキストリン（平均重合度約７〜１０）への液化（又は減粘）と、（２）グルコアミラーゼ（アミログルコシダーゼ又はＧＡとも呼ばれる）による、得られた液化デンプン（即ち、デンプン加水分解産物）の糖化と、を含む、酵素により触媒されるプロセスが用いられる。得られるシロップは高グルコース含量を有する。市販のグルコースシロップの多くは、続いて酵素により、イソシロップとして知られるブドウ糖／果糖混合物へと異性化される。また、得られたシロップを、酵母菌などの微生物を用いて発酵させ、例えば、エタノール、クエン酸、乳酸、コハク酸、イタコン酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸塩、リジン、他の有機酸、他のアミノ酸、及び他の生化学物質を含む商品を生産することができる。発酵及び糖化を同時に実施することで（即ち、ＳＳＦプロセス）、経済性と効率性を向上させることができる。
グルコアミラーゼ（グルカン１，４−α−グルコヒドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．３）は、連続したグルコース単位を、デンプン又は関連するオリゴ及び多糖類分子の非還元末端から除去するのを触媒する、エキソ作用型カルボヒドラーゼを加水分解するデンプンである。グルコアミラーゼは、デンプン（例えば、アミロース及びアミロペクチン）の直鎖状及び分枝状グルコシド結合の両方を加水分解し得る。他方、αアミラーゼは、内部のα−１，４−グルコシド結合を無作為に切断することにより、デンプン、グリコーゲン、及び関連する多糖類を加水分解する。グルコアミラーゼは、デンプン糖化、醸造、焼成、食品業界向けシロップ類の生産、発酵プロセス用の供給原料の生産、及び動物飼料の消化率向上の目的を含む、多様な目的に使用されてきた。
グルコアミラーゼは、多くの細菌類、菌類及び植物の株から生成される。例えば、グルコアミラーゼは、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）の株により生成される。Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ ｐｒｏｏｆ ｒａｗ ｓｔａｒｃｈ−ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＭＳ−０９」，Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓ．２９（５）：１５１〜１５４；Ｓｅｌｌａｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９７６）「Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ Ｆｒｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐ．，３ｒｄ，Ｓ．Ｊ．Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｐｐｌ．Ｓｃｉ．，Ｂａｒｋｉｎｇ，ＵＫ，ｐｐ．６３５〜４３；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ｂｙ ｓｏｉｌ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ｏｆ ａ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ）」，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９（７）：６８１〜８５；Ｃｈｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ」，Ｐａｋｉｓｔａｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．７（１１）：１９８８〜９２。しかしながら、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）は、ヒト及び植物に対して非常にアレルギー性であり、かつ病原となる。よって、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）は、食用製造製品の工業プロセスに用いられるグルコアミラーゼに対して生存可能な産生宿主ではない。Ａ．フミガタス（A. fumigatus）のグルコアミラーゼを好適な宿主から生成することに対するニーズが存在している。
トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）（ＡｆＧＡＴＲ）において発現される、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）由来のグルコアミラーゼは、高温にてかつ酸性ｐＨで長時間にわたって糖化を触媒する。核酸をコードするアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）（配列番号１及び２）由来の、及びポリヌクレオチドを発現するトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞由来の公知のグルコアミラーゼの例が、提供されている。トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞は、天然に発現されるＡｆＧＡアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）より高いレベル又は少なくとも同等なレベルにてＡｆＧＡＴＲを発現する。ＡｆＧＡ１ＴＲ及びＡｆＧＡ２ＴＲをはじめとするＡｆＧＡＴＲは、高温かつ低ｐＨにて高活性を呈するため、アスペルギルス・カワチイ（Aspergillus kawachii）のαアミラーゼ（ＡｋＡＡ）のようなαアミラーゼの存在下で、糖化プロセスにおいて効率的に利用され得る。ＡｆＧＡＴＲは好都合にもデンプンの糖化を触媒することにより、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）、又はアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）において発現される天然のＡｆＧＡが触媒する糖化の産物と比べて、ＤＰ１（即ち、グルコース）が著しく富化されたオリゴ糖組成物を生ずる。ＡｆＧＡ１ＴＲ、ＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体などのＡｆＧＡＴＲは、ＡｎＧＡ及び天然に発現されるＡｆＧＡよりも低用量で使用して、同等なレベルのグルコースを生成し得る。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を、植物（例えば、シリアル及び穀粒）由来の酵素と併用してもよい。また、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を、宿主細胞により分泌される酵素、又は宿主細胞に内在する酵素と併用してもよい。例えば、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を糖化反応又はＳＳＦプロセスに加えてもよく、この糖化反応中に又はＳＳＦプロセス中に、１種以上のアミラーゼ、追加のグルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、又はその他の酵素が、産生宿主により分泌される。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はまた、内在性かつ非分泌型の産生宿主酵素と共に作用し得る。別の実施例において、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、糖化中に又はＳＳＦ中に、産生宿主細胞により他の酵素と共に分泌され得る。ＡｆＧＡＴＲグルコアミラーゼ、又はその変異体は、シロップ及び／又は生化学物質（例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸、その他の生化学物質及び生体適合物質）用のデンプンの直接加水分解が関与するプロセスにおいて、反応温度が基質の糊化温度未満である場合に、使用できる。糖化中に又はＳＳＦ中に、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、他の酵素と共に、トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞により分泌され得る。
したがって、配列番号１２又は１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞であって、前記トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞が、同一の条件下でＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と同じアミノ酸配列を有するＡｆＧＡ又はその変異体を発現するアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）宿主細胞と同等のレベルにて、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する、組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞が提供されている。
また、配列番号１２又は１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞であって、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と同じアミノ酸配列を有するＡｆＧＡ又はその変異体よりも熱安定性に優れ、かつＡｆＧＡ又はその変異体がＡ．フミガタス（A. fumigatus）宿主細胞において発現される、組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞も提供されている。
また、（ａ）配列番号１２又は１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現するＴ．レーシ（T. reesei）宿主細胞を提供する工程と、（ｂ）前記組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の生成を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、（ｃ）前記組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を単離する工程と、を含む、組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の生成方法であって、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と同じアミノ酸配列を有するＡｆＧＡ又はその変異体よりも熱安定性に優れ、かつＡｆＧＡ又はその変異体がＡ．フミガタス（A. fumigatus）宿主細胞において発現される、組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の生成方法も、提供されている。
また、開示されている宿主細胞により生成された組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が提供されている。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、７４℃、ｐＨ ５．０にて１０分間にわたって少なくとも７０％の活性を有し得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、ＡｆＧＡ１ＴＲであり得る。ＡｆＧＡ１ＴＲは、５５°〜７４℃の温度範囲でｐＨ ５．０にて１０分間にわたって少なくとも７０％の活性を有し得る。ＡｆＧＡ１ＴＲの至適温度は、約６８℃であり得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はまた、ＡｆＧＡ２ＴＲであり得る。ＡｆＧＡ２ＴＲは、６１°〜７４℃の温度範囲でｐＨ ５．０にて１０分間にわたって少なくとも７０％の活性を有し得る。ＡｆＧＡ２ＴＲの至適温度は、約６９℃であり得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、配列番号１２に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、配列番号１２を含み得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はまた、配列番号１３に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、配列番号１２からなり得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はまた、配列番号１３に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、配列番号１３を含み得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はまた、配列番号１３に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり得る。組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、配列番号１３からなり得る。
また、デンプンを含む組成物を糖化してグルコースを含む組成物を生成する方法であって、前記方法が、（ｉ）請求項４〜１５のいずれか一項に記載の単離されたＡｆＧＡＴＲ又はその変異体をデンプン組成物と接触させる工程と、（ｉｉ）デンプン組成物を糖化して前記グルコース組成物を生成する工程と、を含み、前記ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体が、デンプンを含む組成物からグルコースを含む組成物への糖化を触媒する、方法も提供されている。グルコースを含む組成物は、同一の条件下でＡｎＧＡにより生成されたＤＰ１を含む第２の組成物と比較して、ＤＰ１が富化され得る。グルコースを含む組成物はまた、同一の条件下で、野生型ＡｆＧＡにより生成されたＤＰ１を含む第２の組成物と比較してＤＰ１が富化され得る。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はＡｆＧＡＴＲ２であってもよく、グルコースを含む組成物は、同一の条件下で、ＡｆＧＡ１ＴＲにより生成されたＤＰ１を含む第２の組成物と比較してＤＰ１が富化され得る。ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体は、同一の条件下でＡｎＧＡの用量の約４０％〜５０％にて投与され、同じＤＰ１収率を生じ得る。
液化デンプン、ゼラチン化されたデンプン、又は粒状デンプンを包含するデンプンを含む組成物もまた、提供されている。糖化は、約３０℃〜約６５℃の温度範囲で実施することができる。温度範囲は、４７℃〜６０℃であってもよい。糖化は、ｐＨ ２．０〜ｐＨ ６．０のｐＨ範囲で実施することができる。このｐＨ範囲は、ｐＨ ３．５〜ｐＨ ５．５であってもよい。また、このｐＨ範囲は、ｐＨ ４．０〜ｐＨ ５．０であってもよい。
デンプン組成物をαアミラーゼと接触させる工程を更に含み得る糖化方法もまた、提供されている。αアミラーゼはＡｋＡＡであり得る。糖化方法は、デンプン組成物をプルリナーゼ（pullulinase）と接触させる工程を、更に含み得る。
グルコース組成物を発酵させて発酵最終（ＥＯＦ）産物を生成する工程を更に含み得る糖化方法もまた、提供されている。この発酵はまた、同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応であり得る。発酵は、ｐＨ ２〜８、２５℃〜７０℃の温度範囲で２４〜７０時間実施することができる。ＥＯＦ産物はエタノールを含み得る。ＥＯＦ産物は、８％〜１８％（ｖ／ｖ）のエタノールを含み得る。本方法は、マッシュ及び／又は糖化液をプルラナーゼ、αアミラーゼ及びＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体と接触させる工程を、更に含み得る。本方法はまた、（ａ）マッシュを調製する工程と、（ｂ）マッシュを濾過して糖化液を得る工程と、（ｃ）糖化液を発酵させて発酵飲料を得る工程と、を更に含んでいてもよく、ここで、プルラナーゼ、αアミラーゼ及びＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体は、（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は（ｉｉ）工程（ｂ）の糖化液、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の発酵済み糖化液に加えられる。ＥＯＦ産物は、代謝産物を含んでもよい。代謝産物は、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコδ−ラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、ω ３脂肪酸、ブタノール、アミノ酸、リジン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、又はイソプレンであってもよい。
付加的なグルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、βアミラーゼ、付加的なαアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、αグルコシダーゼ、βグルコシダーゼ、リアーゼ、加水分解酵素、又はこれらの組み合わせを前記デンプン組成物に添加することを更に含み得る方法もまた提供されている。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、０．１〜２グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇｄｓの用量にて添加され得る。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、約４９．５μｇタンパク質／ｇ固形分の用量にて添加され得る。プルラナーゼもまた、添加され得る。単離されたＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、前記トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞により分泌され得る。宿主細胞は、αアミラーゼを更に発現し、かつ分泌できる。宿主細胞は、プルラナーゼを更に発現し、かつ分泌できる。
デンプンを含む前記組成物を前記宿主細胞と接触させる工程を更に含み得る糖化方法もまた、提供されている。宿主細胞は、グルコース組成物を発酵できる。
また、開示されている糖化方法により生成されたグルコースを含む組成物も想到される。また、開示されている糖化方法により生成された液化デンプンも想到される。また、開示されている糖化方法により生成された発酵飲料も想到される。
また、単離されたＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体を含む、デンプン含有の組成物の糖化の使用も想到される。組成物は培養細胞物質であってよい。組成物は、グルコアミラーゼを更に含み得る。ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体は精製されていてもよい。ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体は、宿主細胞により分泌され得る。
また、グルコースを含む組成物の生成における、ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体の使用も想到される。また、液化デンプンの生成における、ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体の使用も想到される。また、発酵飲料の生成における、ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体の使用も想到される。開示されている発酵飲料の糖化方法、又は発酵最終産物に関して開示されている使用であって、発酵飲料又は発酵最終産物が、ｉ）フルモルトビール、「ビール純粋令」に従って醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第二のビール）、第三のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽酒、ノンアルコールビール、及びノンアルコール麦芽酒からなる群から選択されるビールと、ｉｉ）果物風味の麦芽飲料、酒風味の麦芽飲料、及びコーヒー風味の麦芽飲料からなる群から選択されるシリアル飲料又は麦芽飲料と、からなる群から選択される、方法、又は使用もまた、想到される。
また、（ｉ）１種以上の食品原料と、（ｉｉ）請求項４〜１５に記載の単離されたＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体と、を混合する工程を含み、食品原料中に存在するデンプン成分の加水分解を前記プルラナーゼ及び前記単離されたＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体が触媒してグルコースを生成する、食品組成物の生成方法も想到される。食品組成物は、食品、焼成組成物、食品添加物、動物性食品製品、飼料製品、飼料添加物、油、肉、及びラードからなる群から選択され得る。食品原料は、焼成原料又は添加剤を含み得る。１種以上の食品原料は、穀粉、老化防止アミラーゼ、ホスホリパーゼ、リン脂質、マルトース生成αアミラーゼ、又はマルトース生成性αアミラーゼ活性を有するその変異体，相同体、若しくは突然変異体、ベーカリー用キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、及びリパーゼからなる群から選択され得る。１種以上の食品原料は、（ｉ）バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）由来のマルトース生成αアミラーゼ、（ｉｉ）バチルス（Bacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、サーモミセス（Thermomyces）、又はトリコデルマ（Trichoderma）由来のベーカリー用キシラナーゼ、（ｉｉｉ）フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）由来のグリコリパーゼ、からなる群から選択され得る。食品組成物は、練り粉又は練り粉製品、好ましくは加工された練り粉製品を含み得る。本方法は、食品組成物を焼成して焼成食品を生産する工程を含み得る。本方法は、（ｉ）デンプン基質を調製する工程と、（ｉｉ）デンプン基質にプルラナーゼ及びＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体を加える工程と、（ｉｉｉ）焼成食品の生産工程（ｂ）の間に又はその後にデンプン基質に熱を加える工程と、を更に含み得る。
また、ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体を含む食品組成物の生成に用いられる組成物も、想到される。また、食品組成物の調製におけるＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体の使用も想到される。食品組成物は、練り粉又は練り粉製品、好ましくは、加工された練り粉製品を含み得る。食品組成物はベーカリー組成物であってよい。また、練り粉製品の劣化、好ましくは有害な老化を遅延又は軽減するための、練り粉製品におけるＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体の使用も想到される。
添付の図面は、本明細書において援用され、その一部を構成しており、かつ本明細書で開示する様々な方法及び組成物を図示している。図面は次の通りである。
ＡｆＧＡ１の触媒コア、及び炭水化物結合ドメイン（それぞれ、配列番号１の残基２７〜４７６及び５２４〜６３１、又は全長のＣｌｕｓｔａｌＷによるアラインメントを、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３（ＡｆＧＡ２）（それぞれ、配列番号２の残基２７〜４７６及び５２４〜６３１）、ネオサートーヤ・フィシェリ（Neosartorya fisheri）ＮＲＲＬ １８１（それぞれ、配列番号３の残基２８〜４７６及び５２０〜６２７）、タラロマイセス・スチピテイタス（Talaromyces stipitatus）ＡＴＣＣ １０５００（それぞれ、配列番号４の残基２８〜４７８及び５３０〜６３７）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）ＡＴＣＣ １８２２４（それぞれ、配列番号５の残基３１〜４８１及び５３４〜６４１）、並びにアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＦＧＳＣ Ａ４（それぞれ、配列番号６の残基５５〜４９３及び５４４〜６６１）由来のグルコアミラーゼの対応する残基と共に示す。図１において、アスタリスクで指示してある残基は、配列番号１〜６における保存残基に対応するＡｆＧＡ１残基である。 ＡｆＧＡ１の触媒コア、及び炭水化物結合ドメイン（それぞれ、配列番号１の残基２７〜４７６及び５２４〜６３１、又は全長のＣｌｕｓｔａｌＷによるアラインメントを、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３（ＡｆＧＡ２）（それぞれ、配列番号２の残基２７〜４７６及び５２４〜６３１）、ネオサートーヤ・フィシェリ（Neosartorya fisheri）ＮＲＲＬ １８１（それぞれ、配列番号３の残基２８〜４７６及び５２０〜６２７）、タラロマイセス・スチピテイタス（Talaromyces stipitatus）ＡＴＣＣ １０５００（それぞれ、配列番号４の残基２８〜４７８及び５３０〜６３７）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）ＡＴＣＣ １８２２４（それぞれ、配列番号５の残基３１〜４８１及び５３４〜６４１）、並びにアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＦＧＳＣ Ａ４（それぞれ、配列番号６の残基５５〜４９３及び５４４〜６６１）由来のグルコアミラーゼの対応する残基と共に示す。図１において、アスタリスクで指示してある残基は、配列番号１〜６における保存残基に対応するＡｆＧＡ１残基である。 ＡｆＧＡ１ポリペプチド、ｐＪＧ２２２（Ｔｒｅｘ３ｇＭ−ＡｆＧＡ１）をコードするポリヌクレオチドを含む、ｐＪＧ２２２発現ベクターのマップを示す。 グルコアミラーゼ活性（相対単位）のｐＨ依存性を示す。グルコアミラーゼとしては、（１）アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）において発現される野生型ＡｆＧＡ、（２）トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）において発現されるＡｆＧＡ１ＴＲ、及び（２）アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）において発現されるＡｎＧＡが挙げられる。５０℃にて可溶性デンプンからグルコースを放出させることにより、グルコアミラーゼ活性をアッセイした。 グルコアミラーゼ活性（相対単位）の温度依存性を示す。グルコアミラーゼとしては、（１）アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）において発現される野生型ＡｆＧＡ、（２）トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）において発現されるＡｆＧＡ１ＴＲ、及び（３）ＡｎＧＡが挙げられる。ｐＨ ５．０にて可溶性デンプンからグルコースを放出させることにより、グルコアミラーゼ活性をアッセイした。 ｐＨ ４．５及び５．０にて乾燥固形分３５％のデンプンからグルコースを放出させることによりアッセイされた、ＡｆＧＡ１ＴＲ及びＡｎＧＡグルコアミラーゼ活性を示す。 ｐＨ ４．５及び５．０にて乾燥固形分３５％のデンプンからグルコースを放出させることによりアッセイされた、ＡｆＧＡ１ＴＲ及びＡｎＧＡグルコアミラーゼ活性を示す。 ＡｆＧＡＴＲ１、プルラナーゼ及びＡｋＡＡを含有する組成物が、乾燥固形分３５％のデンプンをＤＰ１に加水分解し、ＤＰ１をＤＰ２に転換したことを示す。 ＡｆＧＡＴＲ１、プルラナーゼ及びＡｋＡＡを含有する組成物が、乾燥固形分３５％のデンプンをＤＰ１に加水分解し、ＤＰ１をＤＰ２に転換したことを示す。 ＡｆＧＡＴＲ１、プルラナーゼ及び可変用量のＡｋＡＡを含有する組成物が、乾燥固形分３５％のデンプンをＤＰ１に加水分解し、ＤＰ１をＤＰ２に転換したことを示す。 ＡｆＧＡＴＲ１、プルラナーゼ及び可変用量のＡｋＡＡを含有する組成物が、乾燥固形分３５％のデンプンをＤＰ１に加水分解し、ＤＰ１をＤＰ２に転換したことを示す。 ＡｆＧＡ１ＴＲ又はＡｎＧＡを含有し、かつαアミラーゼ（ＯＰＴＩＭＡＸ Ｌ−１００）及びＰＵ（ＧＣ６３６）を更に含有する組成物が、乾燥固形分３５％のデンプンから還元糖を放出した後の、９６％ ＤＰ１含有の高グルコース組成物中に見出されたＤＰ２の量を示す。 ＡｆＧＡ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｐＪＧ３１３（Ｔｒｅｘ３ｇＭ−ＡｆＧＡ２））を含んでなる、ｐＪＧ３１３発現ベクターのマップを示す。 トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）において発現されるグルコアミラーゼ（相対単位）ＡｆＧＡ２ＴＲのｐＨ依存性を示す。５０℃にて可溶性デンプン基質からグルコースを放出させることにより、グルコアミラーゼ活性をアッセイした。 トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）において発現されるＡｆＧＡ２ＴＲのグルコアミラーゼ活性（相対単位）の温度依存性を示す。ｐＨ ５．０にて可溶性デンプン基質からグルコースを放出させることにより、グルコアミラーゼ活性をアッセイした。 ｐＨ ５．０にて５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中でのＡｆＧＡ２ＴＲの熱安定性を示す。可溶性デンプン基質への添加に先立って、サーモサイクラー中で所望される温度にて２時間酵素をインキュベートした。 Ｔ．レーシ（T. reesei）において発現されるＡｆＧＡ１ＴＲのＳＤＳゲルを示す。カラムＭには、タンパク質分子量（ＭＷ）ラダーがｋＤａ単位で含有される。カラム１〜４は、発酵経過時間をそれぞれ４０．５時間、６４．５時間、８８．３時間、及び１１２時間とした、ＡｆＧＡＴＲを生成するＴ．レーシ（T. reesei）発酵により得られた試料を表す。７５ｋＤａにて矢印で標識された帯域は、ＡｆＧＡ１ＴＲである。
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）（ＡｆＧＡ１ＴＲ又はＡｆＧＡ２ＴＲ）及びその変異体由来の真菌グルコアミラーゼが、提供されている。ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体は、ｐＨ ５．０の最適ｐＨを有し、かつｐＨ ３．５〜ｐＨ ７．５の範囲にわたって少なくとも７０％の活性を有する。酵素は６８℃において至適温度を有し、ｐＨ ５．０で試験した場合に、５５°〜７４℃の温度範囲にわたって少なくとも７０％活性を有する。ＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体は、ｐＨ ５．３の最適ｐＨを有し、かつｐＨ ３．３〜ｐＨ ７．３の範囲にわたって少なくとも７０％の活性を有する。酵素の至適温度は６９℃であり、ｐＨ ５．０で試験した場合に、６１〜７４℃の温度範囲にわたって少なくとも７０％活性を有する。これらの特性により、同一の反応条件下で、これらの酵素をαアミラーゼと併用できる。これにより、ｐＨ及び温度がαアミラーゼ又はグルコアミラーゼの使用に最適となるよう調節されなければならないバッチプロセスとして糖化反応を実施する必要がなくなる。
ＡｆＧＡＴＲ（ＡｆＧＡ１ＴＲ及びＡｆＧＡ２ＴＲを含む）又はその変異体などのグルコアミラーゼの例示的な用途は、デンプン糖化プロセス、例えば、ＳＳＦ、食品組成物の調製、洗濯物、食器類及び他の表面の洗浄用、編織布処理（例えば、糊抜き）用の洗浄組成物のような洗浄組成物の調製に使用できる。ＡｆＧＡＴＲは好都合にもデンプンの糖化を触媒して、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のグルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）により触媒される糖化の産物と比べてＤＰ１（即ち、グルコース）が著しく富化されたオリゴ糖組成物を生ずる。ＡｆＧＡＴＲは、発酵又はＳＳＦ中に、その他の酵素とともに宿主細胞により分泌され得る。例えば、ＡｆＧＡＴＲは、ＡｎＧＡよりも糖化速度が高くなり、２４時間で９６％超のグルコースを生成することを、実証している。ＡｆＧＡＴＲはまた、ＡｎＧＡよりも低用量にて使用して、同等なレベルのＤＰ１を生じ得る。少なくとも５０％の用量節約が期待できる。ＡｆＧＡＴＲはまた、糖化中に、統計的にＡｎＧＡよりも有意に熱安定性に優れる。ＡｆＧＡＴＲは、植物（例えば、穀草及び穀物）由来の酵素と併用できる。ＡｆＧＡＴＲはまた、Ｔ．レーシ（T. reesei）のような宿主細胞により分泌される、又はそのような宿主細胞に内在する酵素と併用できる。例えば、ＡｆＧＡＴＲは、１種以上のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、又はその他の酵素が産生宿主により分泌されている糖化、発酵又はＳＳＦプロセスの間に、該プロセスに加えることができる。ＡｆＧＡＴＲは、アクセサリ（accessory）のαアミラーゼと併用することにより、更に糖化速度を上昇させ得る。例えば、０．１ＳＳＵ／ｇｄｓのＡｋＡＡを添加することにより、糖化速度が上昇する。ＡｆＧＡＴＲは、ＡｋＡＡ及びプルラナーゼとの併用によって、単一のｐＨプロセスにおいて同じグルコース収率にてＡｎＧＡよりも０．１％だけ低いＤＰ３を有することが見出された。また、ＡｆＧＡＴＲは、内在性かつ非分泌型の産生宿主の酵素と組み合わさって機能し得る。別の実施例においては、発酵中又はＳＳＦ中に、ＡｆＧＡＴＲが他の酵素と共に産生宿主細胞によリ分泌され得る。ＡｆＧＡＴＲはまた、基質の糊化温度未満の反応温度で、シロップ及び／又は生化学物質（例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸、その他の生化学物質及び生体適合物質）用のデンプンを直接加水分解するのにも有効であり得る。
１．用語の定義及び略語
この発明を実施するための形態に従い、以下の略語及び定義を適用する。単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば「酵素」という場合には、複数のこうした酵素が含まれ、「添加量」という場合には、当業者には周知の１つ以上の添加量及びその等価物などが含まれる。
特に定義されない限りは、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。以下の用語を下記に示す。
１．１．略語及び頭字語
以下の略語／頭字語は、特に指示がない限り、以下の意味を有する。
Figure 2016500267
Figure 2016500267
１．２．用語の定義
用語「アミラーゼ」又は「デンプン分解酵素」は、特に、デンプンの分解を触媒できる酵素を指す。αアミラーゼは、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合を開裂させる加水分解酵素である。概して、αアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子内部のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グルコシド結合をランダムに切断して、（１〜４）−α−結合型Ｄ−グルコース単位を３つ以上含有する多糖類を生成するエンド作用型酵素として記述されている。対照的に、βアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２；α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルト加水分解酵素）などのエキソ作用型のデンプン分解酵素、及びマルトース生成αアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１３３）のような幾つかの製品固有のアミラーゼは、基質の非還元末端から多糖類分子を開裂させる。βアミラーゼ、αグルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３；α−Ｄ−（１→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、並びにマルトテトラオシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）及びマルトヘキサオシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．９８）のような製品固有のアミラーゼは、特定の長さのマルトオリゴ糖、又は特定のマルトオリゴ糖の濃縮シロップを生成し得る。
本明細書において用いられている用語「グルコアミラーゼ」（ＥＣ ３．２．１．３）（別名：グルカン１，４−αグルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、γアミラーゼ、リソソームαグルコシダーゼ、酸マルターゼ、エキソ−１，４−αグルコシダーゼ、グルコースアミラーゼ、γ−１，４−グルカングルコヒドロラーゼ、酸マルターゼ、１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、又は４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ）は、デンプン並びに関連するオリゴ糖及び多糖の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素の部類を指す。これらはエキソ作用型の酵素であり、アミロース及びアミロペクチン分子の非還元末端からグルコシル残基を放出する。この酵素は、α−１，６及びα−１，３結合も加水分解するものの、α−１，４結合の場合と比較してその速度はかなり遅い。用語「デンプンの加水分解」は、水分子の付加によるグリコシド結合の開裂を指す。
用語「プルラナーゼ」（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４１、プルラン６−グルカノ加水分解酵素）は、アミロペクチン分子中のα １〜６グルコシド結合を加水分解する能力のある酵素の部類を指す。
本明細書において用いられている「酵素ユニット」は、特定条件のアッセイ下で、１時間当たりに生成される生成物量を指す。例えば、「グルコアミラーゼ活性ユニット」（ＧＡＵ）は、６０℃、ｐＨ ４．２にて、可溶性デンプン基質（４％ ＤＳ）から１時間当たり１ｇのグルコースを生成する酵素量として定義される。「可溶性デンプンユニット」（ＳＳＵ）は、ｐＨ ４．５、５０℃にて、可溶性デンプン基質（４％ ＤＳ）から１分当たり１ｍｇのグルコースを生成する酵素量である。ＤＳは「乾燥固形分」を意味する。
本明細書において用いられている「乾燥固形分」含量は、乾燥重量パーセント基準での、スラリーの全固形分を指す。用語「スラリー」は、不溶性固形分を含有する水性混合物を指し、用語「高ｄｓ」は、３８％を超える乾燥固形分を含有する水性デンプンスラリーを指す。
用語「ブリックス」は、所定の温度で溶液の糖含量を測定するための周知の比重計を指す。ブリックス計は、糖水溶液１００ｇ当たりに存在するショ糖のグラム数を測定する（総可溶化糖含量）。ブリックス測定の実施には、多くの場合、比重計又は屈折計が用いられる。
用語「重合度」（ＤＰ）は、既定の糖中の無水−グルコピラノース単位の数（ｎ）を指す。グルコ−ス及びフルクトースなどの単糖類は、ＤＰ１の例である。マルトース及びスクロースなどの二糖類は、ＤＰ２の例である。ＨＳ又はＤＰ４＋（＞ＤＰ３）は、３を超える重合度を有するポリマーを意味する。用語「ＤＥ」つまり「デキストロース当量」は、シロップ中の総炭水化物画分としての、還元糖、即ち、Ｄ−グルコースの割合として定義される、還元糖の総濃度に関する工業規格であり、乾燥重量基準でのＤ−グルコースの割合として表される。加水分解されていないデンプン粒のＤＥは本質的に０であり、Ｄ−グルコースのＤＥは１００である。
本明細書において用いられている用語「デンプン」は、アミロース及びアミロペクチンで構成され、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘ（Ｘは任意の数字であり得る）を有する、植物の複合多糖炭水化物で構成される任意の材料を指す。この用語には、穀類、草、塊茎及び根などの植物性材料が包含され、より具体的には、小麦、大麦、トウモロコシ、ライ麦、米、ソルガム、糠、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカから得られる材料などが包含される。用語「デンプン」は、粒状デンプンを含む。用語「粒状デンプン」は、未加工の、即ち加熱調理されていないデンプン、例えば、糊化を受けていないデンプンを指す。
用語「グルコースシロップ」は、グルコース固形分を含有する水性組成物を指す。グルコースシロップのＤＥは、少なくとも２０である。幾つかの実施形態において、グルコースシロップは、水の含有率が２１％以下であり、デキストロースとして計算された還元糖の含有率が２５％以上である。グルコースシロップは、少なくとも９０％のＤ−グルコース、おそらく少なくとも９５％のＤ−グルコースを含む。幾つかの実施形態において、用語グルコース及びグルコースシロップは、互換可能に用いられる。
用語「総糖含量」は、デンプン組成物中に存在する総糖含量を指す。
用語「乾燥成分屈折率」（ＲＩＤＳ）は、制御温度下でＤＥ既知のデンプン溶液の屈折率を測定し、次に、トウモロコシ精製業協会（Corn Refiners Association）の重要データー表（the Critical Data Tables）などの適切な相関を利用して、ＲＩを乾燥成分量に変換したもとして定義される。
用語「接触」は、酵素が基質を最終生成物に転換することができるようにするために、それぞれの酵素をそれぞれの基質に十分に近接させて配置することを指す。当業者に理解されるように、酵素溶液をそれぞれの基質と混ぜると、接触をもたらすことができる。
ポリペプチドに関しての用語「野生型」、「親の」、又は「参照」は、１つ以上のアミノ酸位において人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関しての用語「野生型」、「親の」、又は「参照」は、人工的なヌクレオシドの変化を含まない、天然型ポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型、親の、又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然型ポリヌクレオチドに限定されるわけではなく、野生型、親の、又は参照ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが包含される。更に、本明細書において文脈から明らかとなるように、特定の配列を「野生型」と呼ぶこともあるが、だからといって例中の接頭辞「野生型」が付加されていない他の配列が、野生型ではないことを意味するわけではないことは、理解されるであろう。
本明細書において、発現レベルに関連して使用される用語「同等の（comparable）」は、別段文脈が明らかに指示していない限り、関心対象の試料の間で２０％超のばらつきがないことを指す。
野生型タンパク質の参照には、成熟型のタンパク質が包含されると解釈される。「成熟」ポリペプチドとは、シグナル配列の欠落したポリペプチド又はその変異体を意味する。例えば、シグナル配列は、ポリペプチドの発現中に切断され得る。成熟ＡｆＧＡ１又はＡｆＧＡ２は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２の位置１〜６１２に及ぶ長さの６１２個のアミノ酸であり、ここで、位置はＮ末端から数えられる。野生型ＡｆＧＡ１又はＡｆＧＡ２のシグナル配列は１９アミノ酸長であり、配列番号１１に記載の配列を有する。成熟ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２、又はその変異体は、異なるタンパク質からとられたシグナル配列を含み得る。成熟タンパク質は、成熟ポリペプチドとシグナル配列ポリペプチドとの融合タンパク質である場合もある。
ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２又はその変異体の推定「触媒コア」は、配列番号１の残基４１〜４５３に及ぶ。アミノ酸残基５３４〜６３０は、ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２又はその変異体の推定「炭水化物結合ドメイン」を構成する。ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２、又はその変異体の「リンカー」又は「リンカー領域」は、「触媒コア」と「炭水化物結合ドメインとの間の領域に及ぶ。
ポリペプチドに関しての用語「変異体」は、特定の野生型、親の、又は参照ポリペプチドとは異なっており、天然に生じる又は人工的なアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を１つ以上含むポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関しての用語「変異体」は、特定の野生型、親の、又は参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列において異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親の、若しくは参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの同一性（identity）は、文脈から明らかとなるであろう。
グルコアミラーゼのような本酵素の事例において「活性」は、本明細書に記載されているようにして測定され得る酵素活性を指す。
対象とする細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用する場合、用語「組み換え型」は、対象が天然の状態から改変を受けていることを意味する。それ故、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態の中に見られない遺伝子を発現したり、自然界で見られるものと異なるレベル又は異なる条件下で天然の遺伝子を発現したりする。組み換え核酸は、１つ以上のヌクレオチドが天然の配列とは異なっており、かつ／又は異種配列と作動可能に連結されており、例えば、発現ベクターにおいて異種プロモーターと作動可能に連結されている。組み換えタンパク質は、１つ以上のアミノ酸が天然の配列とは異なっている、及び／又は異種配列と融合されている可能性がある。ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２又はその変異体をコードする核酸を含むベクターは、組み換えベクターである。
用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、自然界で見られる通り天然に関連付けられる少なくとも１つの他の物質又は成分からより分けられた、化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の物質若しくは成分（例えば、組み換え宿主細胞から単離されたＡｆＧＡＴＲ）を指す。「単離された」ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体としては、限定されないが、異種宿主細胞（即ち、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）ではない宿主細胞）において発現される分泌済みＡｆＧＡＴＲを含有する培養ブロスが挙げられる。
本明細書において用いられている用語「精製」は、物質（例えば、単離されたポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、比較的純粋な状態であること、例えば、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、又は更には少なくとも約９９％純粋であることを指す。
酵素に関連して、用語「熱安定性」及び「熱安定」は、高温に曝露された後も活性を保有する酵素の能力を指す。アミラーゼ酵素のような酵素の熱安定性は、そのＴｍで測定でき、ここで、酵素活性の半分は定義済み条件の下で消失する。Ｔｍは、高温への曝露（即ち、負荷）後の残存グルコアミラーゼ活性を測定することによって計算することもできる。
酵素に関連して、「ｐＨ範囲」は、酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
本明細書において或る酵素に関連して用いられている用語「ｐＨ安定の」及び「ｐＨ安定性」は、所定の期間（例えば、１５分、３０分、及び１時間）にわたって、広いｐＨ値の範囲にわたる活性を維持する、その酵素の能力に関する。
本明細書において用いられている用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」と同義であり、互換可能に用いられる。そのようなアミノ酸配列は、活性を呈する場合に「酵素」と呼ばれ得る。アミノ酸残基についての従来の１文字コード又は３文字コードが用いられ、アミノ酸配列は標準のアミノ末端からカルボキシ末端に向かう方向（即ち、Ｎ→Ｃ）で示される。
用語「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二重鎖、及びポリペプチドをコードすることが可能な合成分子が包含される。核酸は１本鎖であっても又は２本鎖であってもよく、化学修飾されていてもよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換可能に用いられる。遺伝子コードは縮重性であるため、特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンが用いられ得るものであり、本発明の組成物及び方法には、或る特定のアミノ酸配列をコードする複数のヌクレオチド配列が包含される。特に指示がない限り、核酸配列は５’から３’末端に向かう方向で示される。
本明細書において用いられている「ハイブリッド形成」は、ブロットハイブリッド法及びＰＣＲ法の間に生じるものとして、或る１本の核酸鎖が、相補鎖と二本鎖を形成する、即ち、塩基対を生じるプロセスを指す。厳密なハイブリッド形成条件は、次の条件下でのハイブリッド形成により例示される：６５℃及び０．１Ｘ ＳＳＣ（ここで、１Ｘ ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｎａ３クエン酸塩、ｐＨ ７．０）。ハイブリッド形成した核酸二本鎖は、ハイブリッド形成させた核酸の半分が相補鎖との塩基対形成から外れる溶解温度（Ｔｍ）により特徴づけられる。二本鎖内でミスマッチしていたヌクレオチドはＴｍが低くなる。グルコアミラーゼ変異体をコードする核酸は、配列番号８のヌクレオチドと、その同一の相補鎖との間で形成される二本鎖と比較して、Ｔｍが１℃〜３℃以上低い場合がある。
本明細書において用いられている「合成」分子は、生物により生成されるというよりは、生体外での化学的又は酵素学的合成により生成される。
本明細書において用いられている、ある細胞に関連して用いられる用語「形質転換される」、「安定形質転換される」、及び「トランスジェニックの」とは、その細胞が、その細胞のゲノムに組み込まれるか、又は複数世代を通して維持されるエピソームとして保有される、天然でない（例えば、異種の）核酸配列を包含することを意味する。
核酸配列を細胞内に挿入する状況における用語「導入された」とは、当該技術分野において既知のように「形質移入」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。
「宿主株」又は「宿主細胞」は、発現ベクター、ファージ、ウィルス、又は他のＤＮＡ構築体、例えば、関心対象（ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどを導入された有機体である。例示的な宿主株は、所望のポリペプチドの発現、及び／又は糖類の発酵が可能な微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌、及び酵母菌（Ｔ．レーシ（T. reesei）など））である。用語「宿主細胞」は、細胞から生成されるプロトプラストを含む。
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連して用いられる用語「異種の」は、宿主細胞中に天然に存在しない、ポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関連して用いられる用語「内在性の」は、宿主細胞中に天然に存在する、ポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
本明細書において用いられている用語「発現」は、ポリペプチドが核酸配列に基づいて生成されるプロセスを指す。このプロセスは、転写と翻訳の両方を含む。
「選択マーカー（selective marker又はselectable marker）」は、宿主において発現可能な遺伝子であって、それによって、その遺伝子を保有する宿主細胞の選択を容易にするものを指す。選択マーカーの例としては、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）、及び／又は代謝優位性（宿主細胞に対する栄養上の優位性など）を付与する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット及び同様物などが挙げられる。
「発現ベクター」は、所望のポリペプチドをコードする、或るＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体であって、そのコード配列が、好適な宿主において、そのＤＮＡの発現に影響を与えることが可能である好適な制御配列に、作動可能に連結されたＤＮＡ構築体を指す。そのような制御配列には、転写に作用するプロモーター、転写を調節するための任意選択的なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードしている配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が包含され得る。
用語「作動可能に連結された」とは、特定の複数の構成要素が、意図した態様で機能することを可能にする関係（並置であることが挙げられるが、これに限定されない）にあることを意味する。例えば、コード配列の発現が調節配列の調節下になるよう、調節配列はコード配列に作動可能に連結される。
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ末端部分に結合したアミノ酸配列であり、そのタンパク質が細胞外に分泌されるのを促進する。成熟型の細胞外タンパク質には、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列は存在しない。
本明細書において用いられている「生物学的に活性な」は、配列が、酵素活性などの特定の生物活性を有することを指す。
本明細書において用いられている「布片」は、染みが付けられた布地などの材料片である。この材料は、例えば、綿、ポリエステル、又は天然繊維と合成繊維との混合物から製造された布地であってよい。布片は、更に、濾紙又はニトロセルロースなどの紙、あるいはセラミック、金属、又はガラスなどの硬質材料片でもあり得る。アミラーゼに関し、染みはデンプン性のものであるものの、血液、乳汁、インク、草類、お茶、ワイン、ホウレンソウ、肉汁、チョコレート、卵、チーズ、クレイ、顔料、油、又はこれらの化合物の混合物を含み得る。
本明細書において用いられている「小さな見本（smaller swatch）」は、一穴パンチ装置により切り出された見本部分、若しくは、多穴パンチのパターンが標準的な９６ウェルマイクロタイタープレートに合うものである特別製造された９６穴パンチ装置により切り出された見本部分であり、又は、該部分は、別のやり方で見本から取り出される。見本は、織物、紙、金属、又はその他の好適な材料であり得る。小さな見本は、２４、４８、又は９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに配置する前又は後のいずれかで付着させた染みを有し得る。小さな見本は、材料の小片に染みを付着させることによって作製することもできる。例えば、小さな見本は、汚れが付いた直径１．５９又は０．６４ｃｍ（５／８”又は０．２５”）の布地の切れ端であってもよい。特別製造されるパウチは、９６枚の見本を９６ウェルプレートの全てのウェルに同時に供給するような方式で設計される。この装置は、同じ９６ウェルプレートに単に複数回装填をすることにより１ウェル当たり２枚以上の見本を供給可能である。任意のフォーマットのプレート、例えば、限定するものではないが、２４ウェル、４８ウェル、及び９６ウェルプレートなどに見本を同時に供給するための多穴パンチ装置が考えられる。別の考えられる方法では、被汚染試験プラットフォームは、汚れ物質により被覆されている金属、プラスチック、ガラス、セラミック、又は別の好適な材料から作製されたビーズであり得る。次に、１つ以上の被覆ビードを、好適な緩衝液及び酵素を含有させた９６、４８、若しくは２４ウェルプレート、又はより大きいフォーマットのウェルに配置する。
本明細書において、「ＡｆＧＡＴＲを含む培養細胞物質」又は類似の用語は、成分としてＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含む細胞可溶化物又は上清（培地を含む）を指す。細胞物質は、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を生成させる目的で培養により増殖させた異種宿主由来のものであってよい。
「配列同一性の割合（％）」は、デフォルトのパラメーターでＣＬＵＳＴＡＬ Ｗのアルゴリズムを使用して整列させたときに、或る変異体が、少なくとも特定の割合で、野生型ＡｆＧＡ１又はＡｆＧＡ２と一致するアミノ酸残基を有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターは、次の通りである。
Figure 2016500267
欠失は、参照配列と比較して非同一性である残基として計数される。いずれかの末端に存在する欠失も、含まれる。例えば、配列番号１２の成熟ＡｆＧＡ１ポリペプチドのＣ末端に６つのアミノ酸の欠失を有する変異体は、成熟ポリペプチドに対して９９％（６０６／６１２同一残基×１００、整数に四捨五入）の配列同一性（％）を有することになる。このような変異体は、成熟ＡｆＧＡ１ポリペプチドに対し「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されることになる。
「融合」ポリペプチド配列は、２つのポリペプチド配列間のペプチド結合により連結される、即ち、作動可能に連結される。
用語「糸状菌」は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の全ての糸状形態を指す。
句「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」は、エタノール生成微生物などの微生物と、ＡｆＧＡ又はその変異体などの少なくとも１種の酵素が同一のプロセス工程中に存在する、生化学物質の産生プロセスを指す。ＳＳＦは、同じ反応容器中で、デンプン基質（粒状、液化、又は可溶化）を糖（グルコースなど）に同時加水分解する工程と、糖を、アルコール、又はその他の生化学物質若しくは生体適合物質に発酵する工程とを包含する。
本明細書において用いられている「エタノール生成微生物」は、糖又はオリゴ糖をエタノールに変換する能力を有する微生物を指す。
用語「発酵飲料」は、微生物発酵、例えば、細菌及び／又は酵母発酵などの発酵プロセスを含む方法により生産される、任意の飲料を指す。
「ビール」はこのような発酵飲料の例であり、用語「ビール」は、デンプンを含有する植物材料の発酵／醸造により生産される任意の発酵糖化液を含むことを意味する。多くの場合、ビールは、麦芽若しくは補助剤、又は麦芽及び補助剤の任意の組み合わせのみから生成される。ビールの例には、フルモルトビール、「ビール純粋令」に従って醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第二のビール）、第三のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽酒、ノンアルコールビール、ノンアルコール麦芽酒、及び同様物が包含されるものの、別の穀草及び麦芽飲料、例えば、果実風味の麦芽飲料（例えばレモン、オレンジ、ライム、又はベリー風味といったシトラス風味の麦芽飲料）、酒風味の麦芽飲料（例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラ風味の麦芽酒）、あるいはコーヒー風味の麦芽飲料（カフェイン風味の麦芽酒）、及び同様物も包含される。
用語「麦芽」は、麦芽入り大麦又は小麦などの任意の麦芽入り穀物を指す。
用語「補助剤」は、大麦又は小麦麦芽などの麦芽ではない任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料を指す。補助剤の例としては、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造用粉砕酵母、米、ソルガム、精製コーンデンプン、大麦、大麦デンプン、脱穀された大麦、小麦、小麦スデンプン、炒って加熱処理された穀草、穀草フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ及びシロップ（コーンシロップ、サトウキビシロップ、反転型糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ、並びに同様物）が挙げられる。
用語「マッシュ」は、任意のデンプン及び／又は糖含有植物材料、例えば、製粉用穀物（例えば、破砕大麦麦芽、破砕大麦、及び／若しくはその他の補助剤、又はこれらの組み合わせを含む）などの水性スラリーを指し、このスラリーは、水と混合した後に、糖化液及び粕に分離される。
用語「糖化液」は、マッシュ中の製粉用穀物の抽出後に放出される未発酵の液体を指す。
「ヨウ素陽性デンプン」又は「ＩＰＳ」は、（１）液化及び糖化後に加水分解されていないアミロース、又は（２）老化したデンプンポリマーを指す。糖化デンプン又は糖液をヨウ素により試験したとき、高ＤＰｎアミロース又は老化デンプンポリマーはヨウ素と結合し、特徴的な青色をもたらす。したがって、糖蒸留酒は、「ヨウ素陽性糖類」、又は「青色糖類」と呼ばれる。
用語「老化デンプン」又は「デンプンの老化」は、デンプンペースト又はゲルに経時的に自然に生じる変化を指す。
用語「約」は、言及されている値の±１５％を指す。
２．アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）のグルコアミラーゼ（ＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２）
グルコアミラーゼ活性を有するＡ．フミガタス（A. fumigatus）種由来のポリペプチドである、ＡｆＧＡ１又はその変異体を単離及び／又は精製したものが提供されている。グルコアミラーゼは、触媒ドメイン、それに続くリンカー領域、及びそれらのドメインが連結されるデンプン結合ドメインを含めた、３つの別個の構造ドメインからなる。ＡｆＧＡ１ポリペプチドは、配列番号１２に示す成熟ＡｆＧＡ１ポリペプチドであり得る。ポリペプチドには、Ｎ末端及び／又はＣ末端にて追加のアミノ酸配列を融合させることもできる。追加のＮ末端配列は、例えば、配列番号１１で示される配列を有し得るシグナルペプチドであってよい。いずれかの末端に融合されているその他のアミノ酸配列としては、タンパク質の標識又は精製に有用な融合パートナーポリペプチドが挙げられる。
例えば、ＡｆＧＡ１前駆体には、下記の配列（配列番号１）が包含される。
Figure 2016500267
グルコアミラーゼ活性を有するＡ．フミガタス（A. fumigatus）種由来のポリペプチドである、ＡｆＧＡ１又はその変異体を単離及び／又は精製したものもまた提供されている。グルコアミラーゼは、触媒ドメイン、それに続くリンカー領域、及びそれらのドメインが連結されるデンプン結合ドメインを含めた、３つの別個の構造ドメインからなる。ＡｆＧＡ２ポリペプチドは、配列番号１３に示す成熟ＡｆＧＡ２ポリペプチドであり得る。ポリペプチドには、Ｎ末端及び／又はＣ末端にて追加のアミノ酸配列を融合させることもできる。追加のＮ末端配列は、例えば、配列番号１１で示される配列を有し得るシグナルペプチドであってよい。いずれかの末端にて融合されている他のアミノ酸配列としては、タンパク質の標識又は精製に有用な融合タンパク質ポリペプチドが挙げられる。
例えば、ＡｆＧＡ２前駆体には、下記の配列（配列番号２）が包含される。
Figure 2016500267
上記のボールド体のアミノ酸は、ＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２の両方に対するＣ末端炭水化物結合（ＣＢＭ）ドメイン（配列番号７）を構成する。グリコシル化リンカー領域は、ＣＢＭドメインを含むＮ末端の触媒コアに連結する。ＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２中のＣＢＭドメインは、αアミラーゼ、βアミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを含むデンプン分解酵素の多くで見つかっている、ＣＢＭ２０ドメインに保存されている。ＣＢＭ２０は、２つのデンプン結合部位１及び２を備える逆平行β−バレル構造として折りたたまれる。これらの２つの部位は機能的に異なると考えられる、即ち、部位１は、初期デンプン認識部位として作用し得るのに対し、部位２は、デンプンの適切な領域を特異的に認識するのに関与し得る。Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（５）：６４７〜６１を参照されたい。
デンプン結合部位１及び２に保存されるＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２のＣＢＭドメイン中の残基は、以下の配列において数字１及び２でそれぞれ示してある。
Figure 2016500267
変異体ＡｆＧＡ１又はＡｆＧＡ２は、配列番号７のＣＢＭドメインの、一部のアミノ酸残基を含んでいてもよいし、又は含んでいなくてもよい。あるいは、変異体は、配列番号７のＣＢＭドメインに対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％の配列同一性を有するＣＢＭドメインを含んでもよい。変異体は、異種又は遺伝子操作されたＣＢＭ２０ドメインを含んでもよい。
ＡｆＧＡ又はその変異体は、例えば、リンカー配列の適切なグリコシル化を可能にする、例えば、糸状真菌細胞などの真核宿主細胞で発現させることもできる。
ＡｆＧＡ１をコードする代表的なポリヌクレオチドは、配列番号８に示すポリヌクレオチド配列である。ＡｆＧＡ２をコードする代表的なポリヌクレオチドは、配列番号１４に示すポリヌクレオチド配列である。（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００７１９５、Ａ．フミガタスゲノム。）上記のＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２前駆体配列にイタリックで示してあるポリペプチド配列、ＭＰＲＬＳＹＡＬＣＡＬＳＬＧＨＡＡＩＡ（配列番号１１）は、適切な宿主細胞においてタンパク質が発現されたときに切断される、Ｎ末端シグナルペプチドである。
ＡｆＧＡ１のポリペプチド配列は、ＡｆＧＡ２を含む他の真菌グルコアミラーゼと類似している。例えば、ＡｆＧＡ１が高い配列同一性を有する真菌グルコアミラーゼは、次の通りである。
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３（配列番号２）（ＡｆＧＡ２）由来のグリコシル加水分解酵素に対して９９％の配列同一性
ネオサートーヤ・フィシェリ（Neosartorya fisheri）ＮＲＲＬ １８１（配列番号３）由来のグリコシル加水分解酵素に対して９２％の配列同一性
タラロマイセス・スチピテイタス（Talaromyces stipitatus）ＡＴＣＣ １０５００（配列番号４）由来の推定グルコアミラーゼに対して８２％の配列同一性
ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）ＡＴＣＣ １８２２４（配列番号５）由来の推定グルコアミラーゼに対して８１％の配列同一性
アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＦＧＳＣ Ａ４（配列番号６）由来の仮定（hypothetical）グルコアミラーゼに対して８１％の配列同一性
配列番号１のＡｆＧＡ１の前駆体形態をクエリー配列として用いたＢＬＡＳＴアラインメントにより、配列同一性が決定された。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０を参照のこと。配列同一性はまた、任意選択的に酵素の成熟形態を基準とし得る。
ＡｆＧＡ１ポリペプチドの変異体が提供されている。変異体は、配列番号１の残基１〜６３１のポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるか、又はこれを含むことができ、その変異体は、配列番号２〜６中の１つ以上の対応するアミノ酸の、置換、挿入、又は欠失から選択される、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。ＡｆＧＡ２ポリペプチドの変異体もまた、提供されている。変異体は、配列番号２の残基１〜６３１のポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるか、又はこれを含むことができ、その変異体は、配列番号１及び／又は３〜６中の１つ以上の対応するアミノ酸の、置換、挿入、又は欠失から選択される、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。例えば、配列番号１の残基１〜６１２のポリペプチドに対して、少なくとも９９％の配列同一性を有するポリペプチドからなる変異体は、配列番号１のＡｆＧＡ１と比較して、１〜６個のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有してもよい。挿入又は欠失は、例えば、ポリペプチドの末端のいずれかにあり得る。あるいは、変異体は、配列番号１又は２の１〜６３１のポリペプチドに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドからなるポリペプチドを「含む」ことができる。変異体において、追加のアミノ酸残基が、ポリペプチドのいずれかの末端に融合され得る。変異体は、変異体が所与のアミノ酸配列を「含む」又は「これからなる」のいずれかにかかわらず、グリコシル化され得る。
ＡｆＧＡ１（配列番号１）；ＡｆＧＡ２（配列番号２）；ネオサートーヤ・フィシェリ（Neosartorya fisheri）ＮＲＲＬ １８１（配列番号３）由来のグルコアミラーゼ；タラロマイセス・スチピテイタス（Talaromyces stipitatus）ＡＴＣＣ １０５００（配列番号４）由来のグルコアミラーゼ；ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffei）ＡＴＣＣ １８２２４（配列番号５）由来のグルコアミラーゼ；及びグルコアミラーゼアスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＦＧＳＣ Ａ４（配列番号６）間のＣｌｕｓｔａｌＷによるアラインメントが、図１に示してある。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照のこと。原則として、関連するタンパク質配列のアラインメントにおいてアミノ酸が保存されている度合いは、タンパク質機能に対するそのアミノ酸位置の相対的重要性に比例する。つまり、関連する配列の全てに共通するアミノ酸は、重要な機能的役割を果たしている傾向があり、容易に置換され得ない。同様に、配列間で異なる位置は、タンパク質の活性は維持したままその他のアミノ酸により置換され得るか、あるいは別様に修飾され得る傾向がある。
図１に示すアラインメントは、例えば、グルコアミラーゼ活性を有する変異体ＡｆＧＡポリペプチドを構築するうえでの手引きとなり得る。配列番号１のＡｆＧＡ１ポリペプチドの変異体としては、限定されないが、配列番号２（ＡｆＧＡ２）、３、４、５、及び６からなる群から選択されるポリペプチド中の対応するアミノ酸の置換、挿入、又は欠失から選択されるアミノ酸修飾を有するものが挙げられる。配列番号１のＡｆＧＡ１、及び配列番号２、３、４、５及び６のグルコアミラーゼにおける位置間の一致は、図１に示すアラインメントを参照することで値付けされる。例えば、図１のアラインメントを参照すると、変異体ＡｆＧＡ１ポリペプチドは置換Ｄ２３Ｎを有することができ、この場合、Ａｓｎは、配列番号６中の対応するアミノ酸である。変異体ＡｆＧＡ１ポリペプチドとしてはまた、１、２、３、又は４つの、ランダムに選択されるアミノ酸修飾を有するものも挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸の修飾は、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法などの周知の方法を使用してなすことができる。同様に、配列番号２のＡｆＧＡ２ポリペプチドの変異体としては、限定されないが、配列番号１（ＡｆＧＡ１）、３、４、５、及び６からなる群から選択されるポリペプチド中の対応するアミノ酸の置換、挿入、又は欠失から選択されるアミノ酸修飾を有するものが挙げられる。
ＡｆＧＡ１ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸もまた、提供される。ＡｆＧＡ１をコードする核酸はゲノムＤＮＡであり得る。あるいは、核酸は、配列番号８を含むｃＤＮＡであり得る。同様に、ＡｆＧＡ２ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸もまた、提供されている。ＡｆＧＡ２をコードする核酸もまた、ゲノムＤＮＡであり得る。あるいは、核酸は、配列番号１４を含むｃＤＮＡであり得る。当業者には良好に理解される通り、遺伝子コードは縮重し、即ち、場合によっては複数のコドンが同一のアミノ酸をコードし得る。核酸としては、ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２又はその変異体をコードする、全てのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡ配列が挙げられる。
ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２又はその変異体は「前駆体」、「未熟」又は「全長」（この場合、ＡｆＧＡ１、ＡｆＧＡ２又はその変異体は、シグナル配列を含む）であってもよいし、又は「成熟」（この場合、シグナル配列を欠く）していてもよい。グルコアミラーゼ変異体はまた、得られるポリペプチドがグルコアミラーゼ活性を保持する限りは、Ｎ又はＣ末端で切断されていてもよい。
２．１．ＡｆＧＡ変異体の特徴
変異体ＡｆＧＡポリペプチドは、グルコアミラーゼ活性を保持し、野生型ＡｆＧＡポリペプチドよりも高い又は低い比活性を有し得る。ＡｆＧＡ変異体の特徴としては、ほかにも、例えば、安定性、ｐＨ範囲、温度プロファイル、酸化安定性、及び熱安定性が挙げられる。例えば、変異体は、２４〜６０時間のｐＨ安定性が、ｐＨ ３〜約ｐＨ ８、例えば、ｐＨ ３．０〜７．８、例えば、ｐＨ ３．０〜７．５、ｐＨ ３．５〜７．０、ｐＨ ４．０〜６．７、又はｐＨ ５．０．であり得る。ＡｆＧＡ変異体は、野生型ＡｆＧＡの性能特徴を保ちつつ野生型ＡｆＧＡよりも高レベルで発現させることができる。ＡｆＧＡ変異体はまた、親グルコアミラーゼと比べて異なる酸化安定性を有し得る。例えば、酸化安定性の低下は、デンプン液化用組成物において好都合なものであり得る。変異体ＡｆＧＡは、野生型グルコアミラーゼと比較して温度プロファイルが異なり得る。そのようなＡｆＧＡ変異体は、焼成、又は高温が必要とされるその他のプロセスで使用するのに好都合である。発現及び酵素活性レベルは、以降に開示されるものを含む、当業者に既知の標準アッセイ法を使用して評価することができる。
３．ＡｆＧＡ及びその変異体の生成
ＡｆＧＡ又はその変異体は、例えば、宿主細胞からＡｆＧＡ又はその変異体を分泌させることにより、宿主細胞から単離され得る。ＡｆＧＡ又はその変異体を含む培養細胞物質は、宿主細胞からのＡｆＧＡ又はその変異体の分泌の後に、得ることができる。ＡｆＧＡ又はその変異体は、使用に先立って任意選択的に精製される。ＡｆＧＡ遺伝子は、当該技術分野において周知の方法に従ってクローニングかつ発現され得る。好適な宿主細胞としては、細菌、植物、又は酵母菌細胞、例えば、糸状性真菌細胞が挙げられる。特に有用な宿主細胞としては、トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）が挙げられる。トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞は、天然に発現されるＡｆＧＡアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）より高いレベル又は少なくとも同等のレベルにてＡｆＧＡＴＲを発現する。
幾つかの実施形態において、ＡｆＧＡは、宿主において少なくとも１０ｇ／リットルにて非相同的に発現される。幾つかの実施形態において、ＡｆＧＡは、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、又は１１０ｇ／リットルにて非相同的に発現される。幾つかの実施形態において、ＡｆＧＡはトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主において非相同的に発現され、該発現は少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、又は１１０ｇ／リットルである。幾つかの実施形態において、ＡｆＧＡはアスペルギルス宿主において非相同的に発現され、該発現は少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、又は１１０ｇ／リットルである。
宿主細胞は、同種又は異種アミラーゼ、即ち、宿主細胞と同一の種のものではないアミラーゼ、又は１種以上の他の酵素をコードする核酸を更に発現し得る。アミラーゼは変異体アミラーゼであり得る。加えて、宿主は１種以上のアクセサリー酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。これらは、液化、糖化、発酵、ＳＳＦなどのプロセスに有益であり得る。なお、宿主細胞は、炭素原材料（類）の消化に用いられる酵素に加えて、生化学物質を生成し得る。このような宿主細胞は、酵素を加える必要性を低減又は排除するため、発酵又は同時糖化発酵プロセスに有用であり得る。
３．１．ベクター
ＡｆＧＡ又はその変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築体を構築して、宿主細胞で発現させることができる。ＡｆＧＡ１をコードする代表的な核酸としては配列番号８が挙げられる。ＡｆＧＡ２をコードする代表的な核酸としては配列番号１４が挙げられる。遺伝子暗号において周知の縮重により、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリペプチドを常用の手法により設計及び作成することができる。特定の宿主細胞のコドンの使用を最適化することも、当業界では周知である。ＡｆＧＡ又はその変異体をコードする核酸を、ベクターに組み込むことができる。以下に記載のものなどの周知の形質転換法を使用し、ベクターを宿主細胞に移入させることができる。
ベクターは、宿主細胞中に形質変換させ、細胞内で複製させることのできる任意のベクターであり得る。例えば、ＡｆＧＡ又はその変異体をコードする核酸を含むベクターを形質転換させ、ベクターを増殖及び増幅する手法として細菌宿主細胞において複製させることができる。コードする核酸が、機能性のＡｆＧＡ又はその変異体として発現され得るよう、ベクターを発現宿主中に形質変換させることもできる。発現宿主として提供される宿主細胞としては、例えば、糸状真菌を挙げることができる。真菌遺伝子保管管理センター（ＦＧＳＣ）の株カタログには、真菌宿主細胞における発現に好適なベクターが掲載されている。ＦＧＳＣ、株カタログ、ミズーリ大学、ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ（最新改訂版２００７年１月１７日）を参照されたい。代表的なベクターとしては、ｐＪＧ２２２（Ｔｒｅｘ３ｇＭ−ＡｆＧＡ１）（図２）及びｐＪＧ３１３（Ｔｒｅｘ３ｇＭ−ＡｆＧＡ２）（図１０）が挙げられ、それらの各ベクターは、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７ Ａ１号）を含み、真菌宿主中のｃｂｈ１プロモーターの制御下にて、ＡｆＧＡをコードする核酸の発現を可能にしている。両方のｐＪＧ２２２及びｐＪＧ３１３は、ＡｆＧＡ変異体をコードする核酸を含み、かつ発現するように、通例の技術を用いて改変できる。
ＡｆＧＡ又はその変異体をコードする核酸は、好適なプロモーターに作動可能に連結し得、このプロモーターにより、宿主細胞における転写が可能となる。プロモーターは、最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞にとって同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードしている遺伝子に由来し得る。真菌宿主における転写の際に有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の中性αアミラーゼ、Ａ．ニガー（A.niger）の酸安定性αアミラーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）のグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼ、Ａ．オリゼ（A. oryzae）のアルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼ（A. oryzae）のトリオースリン酸異性化酵素、又はＡ．ニデュランス（A. nidulans）のアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。ＡｆＧＡ又はその変異体をコードする遺伝子が、大腸菌（E. coli）などの細菌種で発現されるとき、好適なプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーター及びファージλプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択され得る。酵母種の発現に好適なプロモーターの例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモーター及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、図２に記載のｐＪＧ２２２ベクターは、ＡｆＧＡ１に作動可能に連結されたｃｂｈ１プロモーターを含有する。図１０に示すｐＪＧ３１３ベクターは、ＡｆＧＡ２に作動可能に結合されたｃｂｈ１プロモーターを含む。ｃｂｈ１は、Ｔ．レーシ（T. reesei）由来の内在する誘導性プロモーターである。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｂｙ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉ ｇｅｎｅ（ｃｂｈ１）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，」Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）４０（２）：１５８〜６５を参照のこと。
コード配列はシグナル配列に作動可能に連結され得る。シグナル配列をコードするＤＮＡは、発現対象のＡｆＧＡ遺伝子に対して自然に関連付けられているＤＮＡ配列であり得る。例えば、ＤＮＡは、ＡｆＧＡ又はその変異体をコードする核酸に作動可能に結合された配列番号１１のＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２シグナル配列をコードし得る。ＤＮＡは、Ａ．フミガタス（A. fumigatus）以外の種に由来するシグナル配列をコードする。ＤＮＡ構築体又はベクターを含むシグナル配列及びプロモーター配列は、真菌宿主細胞に導入することができ、同じ源に由来するものであってもよい。例えば、シグナル配列は、ｃｂｈ１プロモーターに作動可能に連結されたｃｂｈ１シグナル配列である。
発現ベクターはまた、好適な転写終結配列、及び真核細胞においては、ＡｆＧＡ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列に作動可能に結合されたポリアデニル化配列も含み得る。転写終結及びポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ源から好適に由来し得る。
ベクターには、宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を更に含有させることもできる。このような配列例としては、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点が挙げられる。
ベクターには、選択マーカー、例えば、バチルス・スブチリス（B.subtilis）又はバチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のｄａｌ遺伝子、あるいは例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与する遺伝子などの、単離宿主細胞における欠損を補填する産物の遺伝子を含ませてもよい。更に、ベクターは、アスペルギルス（Aspergillus）選択マーカー、例えば、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｓＣ、即ち、ヒグロマイシン耐性を生じるマーカーを含んでいてもよく、又は選択は、当該技術分野において既知のものなどの同時形質転換によって達成され得る。例えば、国際公開第９１／１７２４３号を参照されたい。
細胞内発現は幾つかの態様、例えば、特定の細菌又は真菌を宿主細胞として使用して、多量のＡｆＧＡ又はその変異体を生産させ、その後精製する場合に、有利であり得る。また、培養培地へのＡｆＧＡ又はその変異体の細胞外分泌を使用して、単離されたＡｆＧＡ又はその変異体を含む培養細胞物質を製造することもできる。
発現ベクターは、典型的には、例えば、選択された宿主生物においてベクターの自律複製を可能にするエレメント、及び選択目的で１つ以上の表現型で検出可能なマーカーなどの、クローニングベクター成分を含む。発現ベクターは、通常、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル及び場合により、リプレッサー遺伝子又は１つ以上の活性化遺伝子などの調節ヌクレオチド配列を含む。加えて、発現ベクターには、ＡｆＧＡ又はその変異体に、宿主細胞の細胞小器官（ペルオキシソームなど）、又は特定の宿主細胞区画を標的とさせ得るアミノ酸配列をコードする配列を含ませることができる。そのような標的配列としては、限定されないが、既知のペルオキシソーム標的シグナルである配列セリン−リジン−ロイシン（ＳＫＬ）が挙げられる。制御配列の指示の下で発現した場合、ＡｆＧＡ又はその変異体の核酸配列は、発現に関して適切な様式にて、制御配列に作動可能に結合される。
ＡｆＧＡ又はその変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の因子をコードするＤＮＡ構築体をそれぞれリゲートするため、及び複製に必要な情報を包含する好適なベクターにそれらを挿入するために使用される手順は、当業者に広く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、及び３ｒｄ ｅｄ．，２００１を参照されたい）。
３．２．宿主細胞の形質転換及び培養
ＤＮＡ構築体又は発現ベクターのいずれかを含むトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞は、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の組み換え生産において、宿主細胞として好都合に使用される。細胞は、宿主染色体にＤＮＡ構築体（１つ以上のコピー）を都合よく組み込むことにより、酵素をコードするＤＮＡ構築体で形質転換することができる。ＤＮＡ配列がより安定的に細胞に維持される傾向があることから、この組み込みは一般的に有利なものと考えられる。ＤＮＡ構築体の宿主染色体への組み込みは、例えば、同種又は異種組み換え法によるものなどの従来法により実施することができる。あるいは、細胞は、異なる種類の宿主細胞に関連して上記される通りに発現ベクターにより形質転換させることができる。
形質転換させる発現ベクターにより遺伝子の欠損が補填され得る場合、発現宿主から遺伝子を欠失させることも有利である。不活性化された遺伝子を１つ以上有する真菌宿主細胞を得るにあたり既知の方法を使用することができる。遺伝子の不活性化は、完全な又は部分的な欠失により、挿入による不活性化により、又は遺伝子が機能性タンパク質の発現を阻害されるように意図される目的のために遺伝子を非機能的にする任意の他の手段により、実行できる。クローニングされているトリコデルマ種（Trichoderma sp.）、又はその他の糸状菌宿主に由来する任意の遺伝子、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２遺伝子を欠失させることができる。遺伝子の欠失は、不活性化させることが所望される遺伝子の形態を、当該技術分野において既知の方法によりプラスミドに挿入することで実行できる。
宿主細胞へのＤＮＡ構築体又はベクターの導入には、形質転換、電気穿孔法、核微量注入法、形質導入、トランスフェクション、例えば、リポフェクションを介した及びＤＥＡＥ−デキストリンを介したトランスフェクション、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いたインキュベーション、ＤＮＡコーティングされた微粒子銃による高速導入、及びプロトプラスト融合といった技術が含まれる。一般的な形質転換法が当該技術分野において既知である。例えば、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）を参照されたい。トリコデルマ（Trichoderma）における異種タンパク質の発現が、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号に記載されている。同様に、アスペルギルス（Aspergillus）株の形質転換に関しては、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１〜１００１も参照される。遺伝的に安定な形質転換体をベクター系で構築することで、ＡｆＧＡ又はその変異体をコードする核酸を宿主細胞染色体に安定的に組み込むことができる。その後、形質転換体は、既知の手法により選別され、精製される。
形質転換のためのトリコデルマ種（Trichoderma sp.）の調製は、例えば、菌類の菌糸からのプロトプラスト調製を包含し得る。Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６を参照のこと。菌糸は、出芽させた栄養胞子から得ることができる。細胞壁を消化する酵素により菌糸を処理することで、プロトプラストが得られる。懸濁培地に浸透圧安定剤を存在させることでプロトプラストを保護する。これらの安定剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム及び同様物が挙げられる。通常、これらの安定剤の濃度は、０．８Ｍ〜１．２Ｍの間の様々な値を取り、例えば、１．２Ｍのソルビトール溶液を、懸濁培地において使用することができる。
宿主トリコデルマ種（Trichoderma sp.）株へのＤＮＡ取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。一般的に、約１０〜５０ｍＭのＣａＣｌ２が取り込み用溶液に使用される。更に好適な化合物としては、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ ６．０）及びポリエチレングリコールなどの緩衝系が挙げられる。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させ、培地の内容物をトリコデルマ種（Trichoderma sp.）株の細胞質へ送達するものと考えられる。この融合は、宿主の染色体に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーを高頻度に残すことになる。
通常、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）の形質転換では、典型的には密度１０５〜１０７／ｍＬ、特に２×１０６／ｍＬにて浸透性処理を受けたプロトプラスト又は細胞を使用する。適切な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトール及び５０ｍＭのＣａＣｌ２）中の、これらのプロトプラスト又は細胞を、１００μＬの体積にて、所望のＤＮＡと混合させてよい。概して、高濃度のＰＥＧが取り込み用溶液に加えられる。０．１〜１容量の２５％ ＰＥＧ ４０００をプロトプラスト懸濁液に加えることができるものの、約０．２５容量をプロトプラスト懸濁液に加えることが有用である。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、及び同様物などの添加剤を取り込み用溶液に加えて、形質転換を促進させることもできる。同様の手順が他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６．０２２．７２５号を参照のこと。
３．３．発現
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の生産方法は、酵素の生成を促す条件下で上述したようにトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞を培養することと、細胞及び／又は培養培地から酵素を回収することと、を含み得る。トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞は、天然に発現されるＡｆＧＡアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）より高いレベル又は少なくとも同等のレベルにてＡｆＧＡＴＲを発現する。
細胞の培養に使用される培地は、対象とする宿主細胞を増殖させ、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の発現を得るのに好適な任意の従来培地であり得る。好適な培地及び培地成分は市販元から入手可能であり、あるいは公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のカタログに記載の通り）。
宿主細胞から分泌される酵素は全ブロス製剤で使用することができる。本方法において、組み換え微生物の馴化全発酵ブロス（spent whole fermentation broth）の調製は、グルコアミラーゼの発現が得られる、当該技術分野において既知の任意の培養法を使用して実施され得る。それ故、発酵には、グルコアミラーゼの発現又は単離を可能とする好適な培地中及び条件下で行われる、フラスコ振盪培養法、実験用又は工業用発酵槽中での小規模又は大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、流加発酵、又は固相発酵などを含む）が含まれると理解することができる。本明細書において定義されている用語「馴化全発酵ブロス」は、培養培地、細胞外タンパク質（例えば、酵素）、及び細胞バイオマスを含有する、発酵材料の未分画成分として定義される。用語「馴化全発酵ブロス」には、当該技術分野において周知の方法を用いて可溶化又は透過処理された細胞バイオマスが包含されることも理解される。
宿主細胞から分泌される酵素は、周知の手順により、培養培地から簡便に回収されてよく、周知の手順としては、遠心分離又は濾過による培地からの細胞の分離、及び硫酸アンモニウムのような塩を用いた培地のタンパク質成分の沈殿に続いて、クロマトグラフィ法（イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィなど）を使用することによって分離することなどが挙げられる。
ベクターにおいて、ＡｆＧＡ又はその変異体をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらし得るよう、制御配列に作動可能に連結させることができ、即ち、ベクターは発現ベクターである。調節配列は、例えば、調節配列により命令される転写レベルが、転写性モジュレーターに対して更に応答的になるよう、更なる転写調節エレメントを付加することにより改変することもできる。調節配列は、特に、プロモーターを含み得る。
宿主細胞は、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の発現を可能にする好適な条件下で培養され得る。酵素の発現は、持続的に生成される常時発現型、あるいは発現を開始するための刺激を必要とする誘導型であり得る。誘導発現の場合、タンパク質産生は、必要とされたときに、例えば、培養培地に誘導物質、例えば、デキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はセファロース（Sepharose）を加えることにより開始することができる。ポリペプチドは、ＴＮＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系などの生体外無細胞系で、組み換えにより産生させることもできる。
発現宿主は、好気的条件下で、宿主に適切な培地において培養することもできる。宿主の要求と所望されるＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の産生とに応じて、振盪、又は撹拌と通気との併用を実施することができ、宿主に適切な温度、例えば、約２５℃〜約７８℃（例えば、３０℃〜４５℃）で生成が行われる。培養は、約１２〜約１００時間又はそれ以上実施することができる（及び、例えば、２４〜７２時間の間の任意の時間数）。典型的には、培養ブロスは、同様にＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の産生に関連する宿主に必要とされる培養条件に応じて、ｐＨ約４．０〜約８．０である。
３．４．ＡｆＧＡＴＲ活性の同定
宿主細胞におけるＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の発現を評価するために、アッセイを行うことで、発現タンパク質、対応するｍＲＮＡ、又はグルコアミラーゼ活性を測定することができる。例えば、好適なアッセイとしては、適切に標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用するノザンブロット、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、及びインサイツハイブリダイゼーションが挙げられる。また、好適なアッセイとしては、例えば、培養培地のグルコースなどの還元糖を直接測定するアッセイによって試料中のＡｆＧＡＴＲ活性を測定することなどが挙げられる。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キット番号１５−ＵＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）又は、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒなどの装置を使用して測定することもできる。グルコアミラーゼ活性はまた、下に記載するＰＡＨＢＡＨアッセイ又はＡＢＴＳアッセイなどの任意の公知の方法で測定され得る。
３．５．ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体の精製方法
発酵、分離、及び濃縮法は当該技術分野において周知であり、濃縮ＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液を調製するために都合のよい手法を使用することができる。
アミラーゼ溶液を得る目的で、発酵後に発酵ブロスを得て、残存する未加工の発酵材料を含む、微生物細胞及び各種懸濁固体が従来の分離手法により除去される。濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空ドラム濾過、限外濾過、遠心分離後限外濾過、抽出、又はクロマトグラフィなどが一般的に使用される。
回収率を最適化するためには、ＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液の濃縮が望ましい。未濃縮の溶液を使用するためには、精製酵素沈殿物を回収するためにインキュベート時間を延長させる必要のある場合もある。
酵素含有溶液は、従来の濃縮法を使用し、所望の酵素濃度が得られるまで濃縮する。酵素含有溶液の濃縮は、本願で記載の任意の手法により実施され得る。精製法の例としては、回転真空濾過及び／又は限外濾過が挙げられるがこれらに限定されない。
酵素溶液は、濃縮ＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチド含有溶液の酵素活性が所望の濃度になるまで濃縮して濃縮酵素溶液とする。
濃縮は、例えば、金属ハロゲン化物沈殿剤などの沈殿剤を使用して実施してもよい。金属ハロゲン化物沈殿剤としては、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物、及び２種類以上のこれらの金属ハロゲン化物の配合物が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な金属ハロゲン化物としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、及びこれらの金属ハロゲン化物のうちの２種以上の配合物が挙げられる。金属ハロゲン化物沈殿剤、塩化ナトリウムも保存料として使用できる。
金属ハロゲン化物沈殿剤は、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を沈殿させるのに有効な量で使用される。酵素の沈殿をもたらすのに少なくとも有効な量及び最適な量の金属ハロゲン化物の選択、並びにインキュベート時間、ｐＨ、温度及び酵素濃度を含む、回収率を最大にするための沈殿条件は、所定の試験後に当業者には容易に明らかとなろう。
一般的に、少なくとも約５％ ｗ／ｖ（重量／体積）〜約２５％ ｗ／ｖの金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に加え、通常、少なくとも８％ ｗ／ｖを加える。一般的に、約２５％ ｗ／ｖ以下の金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に加え、通常、約２０％ ｗ／ｖ以下を加える。金属ハロゲン化物沈殿剤の最適濃度は、とりわけ、特異的ＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチドの性質、及び濃縮酵素溶液中でのＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチドの濃度に依存するであろう。
酵素を沈殿させる別の代替法は、有機化合物を使用するものである。有機化合物沈殿剤の例としては、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物が挙げられる。該有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン化物沈殿剤の添加に先立って、それと同時に、又はその後に行ってもよく、両沈殿剤（有機化合物及び金属ハロゲン化物）の添加は、順番に又は同時に行われてもよい。
一般的に、有機沈殿剤は、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩（ナトリウム又はカリウム塩など）、及び４−ヒドロキシ安息香酸の線状又は分岐状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物からなる群から選択され、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜１２個含有する。有機化合物沈殿剤は、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸の線状又は分岐状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物であってよく、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜１０個含有する。有機化合物の例は、４−ヒドロキシ安息香酸の線状アルキルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物であり、ここで、アルキル基は、炭素原子を１〜６個含有する。４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル、及びこれらの有機化合物のうちの２種以上の配合物を使用することもできる。追加の有機化合物としては、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチルパラベンと名づける）、４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルパラベンと名づける）が挙げられるがれらに限定されず、この両者はアミラーゼ保存剤である。更なる記載に関しては、例えば、米国特許第５，２８１，５２６号を参照されたい。
有機化合物沈殿剤を添加すると、ｐＨ、温度、ＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチド濃度、沈殿剤濃度、及びインキュベーション時間に関する沈殿条件に、高い柔軟性がもたらされるという利点が得られる。
有機化合物沈殿剤は、金属ハロゲン化物沈殿剤を用いることによる酵素の沈殿を向上させるのに有効な量で使用する。有機化合物沈殿剤の少なくとも有効な量及び最適な量の選択、並びにインキュベート時間、ｐＨ、温度及び酵素濃度を含む、回収率を最大にするための沈殿条件は、業者には、所定の試験後に本願の見地から当容易に明らかとなろう。
一般的に、少なくとも約０．０１％ ｗ／ｖの有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に加え、通常、少なくとも約０．０２％ ｗ／ｖを加える。一般的に、約０．３％ ｗ／ｖ以下の有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に加え、通常、約０．２％ ｗ／ｖ以下を加える。
金属ハロゲン化物沈殿剤及び有機化合物沈殿剤を含有する濃縮ポリペプチド溶液は、精製する酵素に必然的に依存することになるｐＨに調整することができる。概して、ｐＨは、グルコアミラーゼの等電点付近のレベルに調整される。ｐＨは、等電点（ｐＩ）からｐＨ単位が約２．５低いｐＨから、等電点（ｐＩ）からｐＨ単位が約２．５高いｐＨまでの範囲のｐＨに調整することができる。
精製酵素の沈殿を得るのに必要とされるインキュベート時間は、具体的な酵素の性質、酵素濃度、並びに具体的な沈殿剤（１つ又は複数）及びその（それらの）濃度に応じて異なる。一般的に、酵素を沈殿させるのに有効な時間は、約１〜約３０時間であり、通常、約２５時間を超過することはない。有機化合物沈殿剤の存在下では、インキュベーション時間はいっそう短縮され、約１０時間未満となり、多くの場合では約６時間になる。
一般的に、インキュベート中の温度は約４℃〜約５０℃である。通常、方法は、約１０℃〜約４５℃の温度（例えば、約２０℃〜約４０℃）で実施される。沈殿を誘発する最適温度は、溶液条件、及び使用する酵素又は沈殿剤（１つ又は複数）に従い変化する。
精製酵素沈殿物の最終的な回収率、及び実施するプロセスの効率は、酵素を含む溶液を撹拌すること、加える金属ハロゲン化物、及び加える有機化合物により向上される。撹拌工程は、金属ハロゲン化物及び有機化合物を加える間、及び続くインキュベート時間の間の両方に行う。好適な撹拌方法としては、機械的撹拌又は振盪、積極的な通気、あるいは任意の類似の手法が挙げられる。
インキュベート期間後、続いて、精製酵素は、解離した（dissociated）顔料及びその他の不純物から分離され得ると共に、従来の分離法、例えば濾過、遠心分離、精密濾過、回転真空濾過、限外濾過、加圧濾過、クロス式膜精密濾過、クロスフロー式膜精密濾過、又は同様の方法などにより回収され得る。精製酵素沈殿物の更なる精製は、沈殿物を水で洗浄することにより得ることができる。例えば、精製酵素沈殿物を、金属ハロゲン化物沈殿剤を含有する水、又は金属ハロゲン化物及び有機化合物沈殿剤を含有する水で洗浄する。
発酵中に、ＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチドは、培養ブロス中に溜まる。所望のＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体の単離及び精製の際、培養ブロスを遠心分離又は濾過して細胞を除去し、結果として得られた無細胞液を酵素精製に使用できる。一実施形態では、無細胞ブロスには、約７０％飽和硫酸アンモニウムにより塩析を行い、次に、７０％飽和沈殿画分を緩衝液に溶解させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムなどのカラムにかけ、及び溶出し酵素活性化区分を回収する。更なる精製の際、イオン交換クロマトグラフィなどの従来手法を使用することもできる。
精製酵素は、洗濯及び洗浄用途に有用である。例えば、それらは洗濯洗剤及び染み抜き剤に使用することができる。精製酵素は、液体（溶液、スラリー）又は固体（顆粒剤、粉末）のいずれかの最終生成物として製造することができる。
より具体的な精製例は、Ｓｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．１９５ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒａｗ ｓｔａｒｃｈ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７〜４８４に記載されており、本明細書において簡約されている。４リットルのストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）ＴＫ２４培養液の上清から得られた酵素を、飽和度８０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて処理した。１０，０００×ｇ（２０分かつ４℃）での遠心分離によって沈殿物を回収し、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）に再溶解させた。溶解させた沈殿物を次に同じ緩衝液に対して透析した。透析したサンプルを、次に予め２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、（ｐＨ ７．０）、５ｍＭのＣａＣｌ２により平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムに装填し、同じ緩衝液により線流速７ｍＬ／ｈｒで溶出した。カラムからの画分を回収し、酵素アッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥをもとに判定されるものとして活性について評価した。タンパク質は更に次の通りに精製した。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ；カタログ番号１９８１２）を、５ｍＭのＣａＣｌ２及び１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）により平衡化した。酵素を、５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）中の（ＮＨ４）２ＳＯ４につき、１．５から０Ｍの直線濃度勾配で溶出させた。活性画分を回収し、酵素を、飽和度８０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて沈殿させた。沈殿物を上記の通りに回収し、再溶解し、透析した。その後、流速６０ｍＬ／時間で、５ｍＭ ＣａＣｌ２含有の２０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）であらかじめ平衡させたＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−５１６７−０１）に、透析済み試料を適用した。活性画分を集めて、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液に加えた。活性酵素画分を、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５カラムに対し前述同様に再度クロマトグラフィ処理をし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断される通り均質な酵素を得た。その方法及びバリエーションの概要については、Ｓｕｍｉｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５０：４７７〜４８４を参照のこと。
生産規模の回復のため、ＡｆＧＡＴＲ又はグルコアミラーゼ変異体ポリペプチドは、上に概説したように、ポリマーによる凝集を介し細胞を除去することにより部分的に精製することができる。あるいは、酵素は、精密濾過による精製後に、入手可能な膜及び装置を使用して限外濾過により濃縮することができる。しかしながら、或る種の用途に関しては、酵素を精製する必要はなく、全部ブロス培養物を溶解し、更なる処理はせずに使用することができる。次に、酵素は例えば顆粒へと加工することができる。
４．ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体の組成物及び使用
ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体は、多様な工業用途に有用である。例えば、ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体は、デンプン変換プロセスにおいて有用であり、具体的には、液化を受けたデンプンの糖化プロセスにおいて有用である。所望の最終製品は、酵素によるデンプン基質の変換により生産され得る任意の生成物であってよい。例えば、所望の製品は、ＨＦＣＳの調製などの他のプロセスで使用できる、又はアスコルビン酸中間体類（例えば、グルコン酸；２−ケト−Ｌ−グロン酸；５−ケト−グルコン酸；及び２，５−ジケトグルコン酸など）；１，３−プロパンジオール；芳香族アミノ酸類（例えば、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンなど）；有機酸類（例えば、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、イソクエン酸、及びオキサロ酢酸など）；アミノ酸類（例えば、セリン及びグリシンなど）；抗生物質類；抗菌剤類；酵素類；ビタミン類；ホルモン類などの、多数の他の有用な製品に変換できる、グルコースに富むシロップであってよい。
デンプンの変換プロセスは、燃料用アルコール、又は飲むためのアルコール（即ち、飲用アルコール）を生産するように設計された発酵プロセスに先立って、又はそれと同時に行われるプロセスであってもよい。当業者は、これらの最終産物の生産に使用することのできる多様な発酵条件を承知しているであろう。ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体はまた、食品の調製に関係する組成物及び方法に有用である。ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体のこれらの多様な用途は、以降により詳細に記載される。
４．１．デンプン基質の調製
一般的な当業者は、本開示のプロセスで使用するデンプン基質の調製に使用し得る、利用可能な方法をよく理解している。例えば、有用なデンプン基質は、塊茎類、根類、茎類、豆類、穀草類又は未精製の穀物から得ることができる。より具体的には、粒状デンプンは、トウモロコシ、トウモロコシ穂軸、小麦、大麦、ライ麦、ライコムギ、ミロ、サゴ、アワ、キャッサバ、タピオカ、ソルガム、米、さや豆、豆、バナナ、又はジャガイモから得ることができる。トウモロコシは約６０〜６８％のデンプンを含有し、大麦は約５５〜６５％のデンプンを含有し、キビは約７５〜８０％のデンプンを含有し、小麦は約６０〜６５％のデンプンを含有し、精白米は７０〜７２％のデンプンを含有する。具体的に想定されているデンプン基質は、トウモロコシデンプン及び小麦デンプンである。穀類由来のデンプンは摩砕されていても、未精製でもよく、穀粒、糠、及び／又は穂軸といったトウモロコシ固形分を含む。デンプンは、高精製した生デンプン、又はデンプン精製プロセスで得られる原材料であってよい。また、様々なデンプンが市販されている。例えば、トウモロコシデンプンは、Ｃｅｒｅｓｔａｒ、Ｓｉｇｍａ、及びＫａｔａｙａｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、小麦デンプンはＳｉｇｍａから、サツマイモデンプンはＷａｋｏ ＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から、そしてジャガイモデンプンはＮａｋａａｒｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｊａｐａｎ）から入手可能である。
デンプン基質は、粉砕した全粒から得た粗デンプンであってよく、この粗デンプンは、非デンプン画分（例えば、胚芽の残分及び繊維など）を含有している。粉砕には、湿式又は乾式粉砕又は磨砕のいずれかが含まれ得る。湿式粉砕法では、未精製の穀物を水又は希酸に浸して、穀物をその構成部分（例えば、デンプン、タンパク質、胚芽、油、穀粒繊維）に分離する。湿式粉砕法は胚芽と穀粉（ミール）（即ち、デンプン顆粒とタンパク質）を効率的に分離し、シロップの調製に特に好適である。乾式粉砕法又は磨砕法では、未精製の穀粒を挽いて細かい粉末にし、多くの場合、穀物をその構成部分に分画せずに加工する。幾つかの場合では、仁由来の油が回収される。一般的に、乾式摩砕された穀類は、デンプンに加えて、大量の非デンプン炭水化物化合物を含むことになる。デンプン基質の乾式粉砕を使用して、エタノール及びその他の生化学物質を生産することができる。加工対象のデンプンは、高精製のデンプン品質のものであってよく、例えば、純度が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９．５％であってもよい。
４．２．デンプンの糊化及び液化
本明細書において用いられている用語「液化」又は「液化する」とは、デンプンを、より粘性が低くかつ短鎖のデキストリンに転換するプロセスを意味する。一般的に、このプロセスは、αアミラーゼを加えるのと同時の、又はそれに続くデンプンの糊化を包含するものの、場合により追加の液化誘導酵素を加えてもよい。幾つかの実施形態では、上述したように調製したデンプン基質を、水と共にスラリー化する。デンプンスラリーは、乾燥固形分の重量％として約１０〜５５％、約２０〜４５％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、又は約３０〜３５％のデンプンを含み得る。αアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）は、例えば、計量型ポンプでスラリーに添加され得る。この用途で典型的に使用されるαアミラーゼは、熱的に安定な細菌αアミラーゼであり、例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（GeoBacillus stearothermophilus）のαアミラーゼである。αアミラーゼは、通常、例えば、デンプン乾燥物質１ｋｇ当たり約１５００ユニットで供給する。αアミラーゼの安定性及び活性を最適化するため、スラリーのｐＨは、典型的には約ｐＨ ５．５〜６．５に調整し、及び典型的には、約１ｍＭのカルシウム（約４０ｐｐｍ遊離カルシウムイオン）を加える。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）変異体、又はその他のαアミラーゼは、異なる条件を要求し得る。液化後にスラリー中に残存する細菌αアミラーゼは、続く反応工程においてｐＨを低下させることを含む多様な方法を介し、あるいは酵素がカルシウムに依存する場合に、スラリーからカルシウムを除去することにより、失活させてもよい。
αアミラーゼが加えられたデンプンスラリーを、蒸気で１０５℃に加熱されたジェットクッカーを連続的に通過させて、汲み上げてもよい。これらの条件下では、糊化が急速に生じ、せん断力と組み合わされた酵素活性により、デンプン基質の加水分解が開始される。ジェットクッカー中滞留時間は短時間である。部分的に糊化したデンプンを、１０５〜１１０℃に維持された一連の保持管に注入した後、約５〜８分間保持して、糊化プロセスを完了することができる（「第１液化」）。８５〜９５℃又はそれ以上の温度の保持槽において約１〜２時間かけて、必要とされるＤＥへの加水分解を完了する（「第２液化」）。逆混合を防ぐために、これらの槽はバッフルを備えてもよい。本明細書において用いられている用語「第２液化時間（分）」は、第２液化の開始からデキストロース当量（ＤＥ）が測定された時点までに経過した時間を指す。次に、スラリーを室温に冷却させる。この冷却工程は、３０〜１８０分であってよく、例えば９０分〜１２０分である。
上記のプロセスから得られる液化デンプンは、典型的には、約９８％のオリゴ糖類及び約２％のマルトース及び０．３％のＤ−グルコースを含有する。液化デンプンは、典型的には、約１０〜５０％、約１０〜４５％、約１５〜４０％、約２０〜４０％、約２５〜４０％、又は約２５〜３５％の乾燥固形分含量（ｗｔ／ｗｔ）有するスラリーの形態である。
ＡｋＡＡ、ＡｔＡｍｙ１、ＡｆＡｍｙ１及びＡｃＡｍｙ１、並びにそれらの変異体は、液化プロセスにおいて、細菌性αアミラーゼに代えて使用することができる。これらのαアミラーゼ及びその変異体による液化は、好都合にも、ｐＨを約ｐＨ ５．５〜６．５に調整する必要なく、低ｐＨで実施することができる。これらのαアミラーゼその変異体は、ｐＨ範囲２〜７にて（例えば、ｐＨ ３．０〜７．５、ｐＨ ４．０〜６．０、又はｐＨ ４．５〜５．８にて）、液化に使用することができる。これらは、約８５℃〜９５℃の温度範囲（例えば、８５℃、９０℃、又は９５℃など）にて液化活性を維持することができる。例えば、液化は、乾燥固形分２５％のトウモロコシデンプン溶液において、８００μｇのＡｃＡｍｙ１又はその変異体により、例えば、ｐＨ ５．８及び８５℃、又はｐＨ ４．５及び９５℃で１０分実施することができる。液化活性は、当該技術分野において既知の多数の粘度アッセイのいずれかを使用しアッセイすることができる。
４．３．糖化
液化デンプンは、任意選択に別の酵素（類）の存在下にて、ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体を使用することにより、より低ＤＰ、特にＤＰ１の糖類に富むシロップに糖化することができる。糖化産物の正確な組成は、使用される酵素の組み合わせ、並びに加工される粒状デンプンの種類に依存する。好都合にも、提供されるＡｆＧＡＴＲ及びその変異体を使用して得られるシロップは、糖化デンプン中の総オリゴ糖類の約６５％超、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９６％の重量割合でＤＰ１を含み得る。
液化は、一般的に、連続的なプロセスとして実施されるのに対し、糖化は、多くの場合バッチプロセスとして実施される。糖化は、典型的には、温度約５５〜７５℃、ｐＨ約４．０〜６．７（例えば、ｐＨ ５．０）にて最も効果的であるので、液化デンプンの冷却とｐＨ調整が必要となる。糖化は、例えば、約４０℃、約５５℃、又は約６５℃〜約７０℃、約７５℃、又は約８０℃の温度で実施することができる。糖化は、通常、充填又は排出するのに数時間を必要とし得る撹拌槽で実施する。酵素は、典型的には、槽が充填されるに伴い乾燥固形分に対し一定比で加えられ、あるいは充填段階の開始時に、単回添加物として加えられる。シロップを作製するための糖化反応は、典型的には、約２４〜７３時間、例えば、２４〜４８時間実施する。最大又は所望のＤＥが得られたとき、例えば８５℃で５分間加熱して反応を停止させる。更にインキュベートすることで、酵素による逆転反応及び／又は熱力学的な平行作用により、堆積したグルコースはイソマルトース及び／又はその他の元の生成物へと再重合されるので、低ＤＥから、最終的には約９０ＤＥまでが得られる。ＡｆＧＡＴＲポリペプチド又はその変異体を使用するとき、糖化は、約４０℃〜約８０℃、例えば、約５５℃〜約７５℃又は約６５℃〜約７０℃の温度範囲で最適に実施される。糖化は、約ｐＨ ３．０〜約ｐＨ ７．５のｐＨ範囲にわたって（例えば、ｐＨ ３．５〜ｐＨ ７．０、ｐＨ ４．０〜ｐＨ ６．７、又はｐＨ ５．０）行うことができる。
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、組成物の形態でスラリーに添加され得る。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、約０．６〜１０ｐｐｍ ｄｓ（例えば、２ｐｐｍ ｄｓ）の量で、粒状デンプン基質のスラリーに添加することができる。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、全ブロス、清澄化、部分精製、又は精製酵素として加えることができる。精製ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体の比活性は、例えば、ＡＢＴＳアッセイにより測定したときに約１８７．７Ｕ／ｍｇであり得る。精製ＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体の比活性は、例えば、ＡＢＴＳアッセイにより測定したときに約２１３．７Ｕ／ｍｇであり得る。また、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を全ブロス製剤として加えることもできる。
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、単離された酵素溶液としてスラリーに添加され得る。例えば、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する宿主細胞によって生成された培養細胞物質の形態で添加することができる。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はまた、酵素が持続的に反応に供給されるように、発酵又はＳＳＦプロセスの間に、宿主細胞から反応培地に分泌され得る。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を生成し、かつ分泌する宿主細胞はまた、グルコアミラーゼなどの更なる酵素を発現し得る。例えば、米国特許第５，４２２，２６７号は、アルコール飲料の生産用の酵母におけるグルコアミラーゼの使用を開示している。例えば、トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）などの宿主細胞は、糖化中にエンジニアリングによってＡｆＧＡＴＲ又はその変異体、及びＡｋＡＡ、ＡｃＡｍｙ１、天然のトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）のαアミラーゼ又はその変異体を含むがそれらに限定されないαアミラーゼを共発現し得る。宿主細胞は、内在性のグルコアミラーゼ、及び／又は他の酵素類、タンパク質類、又は他の物質を発現しないように、遺伝的に改変されていてもよい。宿主細胞は、広域スペクトルの各種糖分解性酵素を発現するよう遺伝子操作され得る。例えば、組み換え酵母菌宿主細胞は、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、ペントース糖を利用する酵素、αアミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、及び／又はイソプルラナーゼをコードする核酸を含んでもよい。例えば、国際公開第２０１１／１５３５１６ Ａ２号を参照のこと。
４．４．異性体
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を用いた処理により生産された可溶性デンプン加水分解物は、高フルクトースのトウモロコシシロップ（ＨＦＣＳ）などの、高フルクトースデンプン系シロップ（ＨＦＳＳ）に変換できる。この変換は、グルコースイソメラーゼ、特に固体支持体上に固定化されたグルコースイソメラーゼを使用して行うことができる。ｐＨは、約６．０〜約８．０、例えば、ｐＨ ７．５に上昇させ、Ｃａ２＋はイオン交換により除去する。好適なイソメラーゼとしては、Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ（登録商標）、ＩＴ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）ＩＭＧＩ、及びＧ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｋｅｔｏｍａｘ（登録商標）、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３、Ｇ−ｚｙｍｅ（登録商標）Ｇ９９３液体、及びＧｅｎＳｗｅｅｔ（登録商標）ＩＧＩが挙げられる。異性体化後、混合物は、典型的には約４０〜４５％フルクトース、例えば、４２％フルクトースを含有する。
４．５．発酵
可溶性デンプン加水分解物、具体的にはグルコースに富むシロップは、典型的には約３２℃（例えば３０℃〜３５℃）の温度で、発酵生物と上記デンプン加水分解物を接触させることによって、発酵させることができる。ＥＯＦ生産物としては、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、イタコン酸及び他のカルボン酸類、グルコδ−ラクトン、エリソルビン酸ナトリウム、リジン及び他のアミノ酸類、ω ３脂肪酸、ブタノール、イソプレン、１，３−プロパンジオール、並びに他の生体材料などの代謝産物が挙げられる。
エタノール生成微生物としては、アルコール脱水素酵素及びピルビン酸脱炭酸酵素を発現する、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）などの酵母、及び細菌、例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas moblis）が挙げられる。エタノール生成微生物は、キシロースをキシルロースに変換する、キシロース還元酵素及びキシリトール脱水素酵素を発現することができる。エタノール生成微生物の改良株、例えば、更に高温に耐性を示し得る改良株は、当該技術分野において既知であり、使用することができる。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ Ｇｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｘｕｅ Ｂａｏ ２７（７）：１０４９〜５６を参照されたい。市販の酵母としては、ＥＴＨＡＮＯＬ ＲＥＤ（登録商標）（ＬｅＳａｆｆｒｅ）、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）（Ｌａｌｌｅｍａｎｄ）、ＲＥＤ ＳＴＡＲ（登録商標）（Ｒｅｄ Ｓｔａｒ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（登録商標）（ＤＳＭ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、及びＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（登録商標）（Ａｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。発酵により、クエン酸及び乳酸などのその他の代謝産物を生産する微生物も当該技術分野において既知である。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ，ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５（３）：２４４〜６３；Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）「Ｄｉｒｅｃｔ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７（２）：１４５〜５２を参照のこと。
糖化及び発酵プロセスは、ＳＳＦプロセスとして実施してもよい。発酵は、例えば、続いてエタノールの精製及び回収が含まれ得る。発酵中、ブロス又は「ビール」のエタノール含量は、約８〜１８％ ｖ／ｖ例えば、１４〜１５％ ｖ／ｖに達し得る。ブロスは、蒸留して富化された、例えば純度９６％のエタノール溶液を生産することもできる。更に、発酵により生じるＣＯ２は、ＣＯ２気体洗浄装置により回収し、圧縮し、及び他の用途のために、例えば、炭酸飲料、又はドライアイスの生産用に販売することもできる。発酵プロセス由来の固体廃棄物は、タンパク質に富む製品、例えば、家畜用飼料として使用することもできる。
上述したように、ＳＳＦプロセスは、ＳＳＦの間中に連続してＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現させ、かつ分泌させるトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）のような真菌細胞を使用して実施することができる。また、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する真菌細胞は、発酵性の微生物（例えば、エタノール産生微生物）でもあり得る。したがって、エタノール産生は、外因性酵素をほとんど又は全く加える必要がなくなるよう、十分にＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する真菌細胞を使用して実施することができる。真菌宿主細胞は、適切に遺伝子操作した菌株に由来し得る。また、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体に加えて、他の酵素を発現し、かつ分泌する真菌宿主細胞を使用することもできる。そのような細胞は、αアミラーゼ及び／若しくはプルラナーゼ、フィターゼ、αグルコシダーゼ、イソアミラーゼ、βアミラーゼセルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、βグルコシダーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、ＡｆＧＡＴＲ以外のグルコアミラーゼ、又は他の酵素を発現し得る。
このプロセスの変化形が、「流加発酵」システムであり、このシステムでは、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。流加発酵システムは、異化産物抑制によって細胞の代謝が阻害される可能性があり、培地中の基質の量が限定されていることが望ましい場合に有用である。流加システムにおける実際の基質濃度は、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの排出ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ発酵及び流加発酵は一般的なものであり、当該技術分野では周知のものである。
連続発酵は、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に加え、等量の調整済の培地を加工用に同時に取り出す開放システムである。連続発酵では一般的に培養物は一定の高密度に維持され、細胞は主として対数期増殖する。連続発酵により、細胞成長、及び／又は生産物濃度の調節が可能となる。例えば、炭素源又は窒素源などの律速栄養素が固定速度に維持され、他の全てのパラメーターは適度に調節される。増殖は一定に維持されることから、培地が抜き出されることによる細胞の損失は、発酵中の細胞増殖率に対し調整すべきである。連続発酵プロセスを最適化し、生成物の形成速度を最大化する方法は、工業微生物学の技術分野において周知である。
４．６．ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含む組成物
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、αアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）と併用され得る。幾つかの実施形態において、αアミラーゼは、有効量にて添加された場合に３．０〜７．０、好ましくは３．５〜６．５のｐＨ範囲で活性を有する、酸安定性αアミラーゼである。αアミラーゼは、真菌αアミラーゼ又は細菌性αアミラーゼであり得る。更に、αアミラーゼは、野生型αアミラーゼ又はその変異体であり得る。
真菌αアミラーゼの好ましい例としては、アスペルギルス（Aspergillus）（例えば、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．カワチイ（A. kawachii）及びＡ．オリザエ（A. oryzae））；トリコデルマ（Trichoderma）種、クモノスカビ（Rhizopus）種、ムコール（Mucor）種、並びにペニシリウム（Penicillium）種を含むがそれら限定されない糸状性真菌の菌株から得られるものが挙げられる。乳酸桿菌（Lactobacilli）種及びストレプトムース（Streptomuces）種。酸安定性αアミラーゼは、細菌の株から導出され得る。好ましい細菌の株としては、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、枯草菌（B. subtilis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、及びＢ．コアグランス（B. coagulans）などのバチルス（Bacillus）種が挙げられる。特に好ましいのは、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、及びＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）である。本発明の組成物及びプロセスに用いられる細菌性αアミラーゼの１つとしては、米国特許第５，０９３，２５７号、同第５，７６３，３８５号、同第５，８２４，５３２号、同第５，９５８，７３９号、同第６，００８，０２６号、同第６，０９３，５６３号、同第６，１８７，５７６号、同第６，３６１，８０９号、同第６，８６７，０３号１号；米国特許出願公開第２００６／００１４２６５号；及び国際公開第９６／２３８７４号、同第９６／３９５２８号、同第９７／１４１２１３号、同第９９／１９４６７号、及び同第０５／００１０６４号に記載されているαアミラーゼの１つを挙げることができる。
例示的なαアミラーゼとしては、比活性及び熱安定性に優れるＡｋＡＡ又はＡｃＡｍｙ１及びその変異体が挙げられる。ＡｋＡＡの好適な変異体としては、αアミラーゼ活性を有し、野生型ＡｋＡＡに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するものが挙げられる。ＡｃＡｍｙ１の好適な変異体としては、αアミラーゼ活性を有し、野生型ＡｃＡｍｙ１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するものが挙げられる。ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体は、好都合にも、ＡｎＧＡ又はＴｒ−ＧＡにより触媒される糖化プロセスにおいて生成されるグルコースの収率を高める。
組成物に用いることが考えられる市販のαアミラーゼ及び方法としては、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ；ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ；ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ；ＧＺＹＭＥ（商標）９９７；及びＣＬＡＲＡＳＥ（商標）Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）；ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）１２０−Ｌ、ＬＣ及びＳＣ並びにＳＵＰＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（商標）Ｘ及びＳＡＮ（商標）ＳＵＰＥＲ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）並びにＦｕｅｌｚｙｍｅ（商標）ＬＦ（Ｄｉｖｅｒｓａ）が挙げられる。幾つかの実施形態において、αアミラーゼとしては、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ又はＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡのような、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のαアミラーゼが挙げられる。幾つかの実施形態においては、酵素組成物として、ＢＰ−ＷＴ，ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ及び任意選択的にＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤが挙げられる。他の実施形態においては、組成物として、ＢＰ−１７、ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ、及び任意選択的にＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤが挙げられる。
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と共に使用することができる、他の好適な酵素としては、ＡｆＧＡＴＲ以外のグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、βアミラーゼ、イソアミラーゼ、αグルコシダーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、βグルコシダーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、酸化還元酵素、又はこれらの組み合わせなどが挙げられる。
例えば、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）などの脱分枝酵素、例えば、Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ（登録商標）は、当業者に周知の有効量にて添加できる。プルラナーゼは、典型的には、１００Ｕ／ｋｇ（ｄｓ）で加えられる。プルラナーゼは一般的にバチルス（Bacillus）種により分泌される。例示的なプルラナーゼは、バチルス・デラミフィカンス（Bacillus deramificans）（米国特許第５，８１７，４９８号、１９９８）、バチルス・アシドプルーライティカス（Bacillus acidopullulyticus）（欧州特許第０，０６３，９０９号）及びバチルス・ナガノエンシス（Bacillus naganoensis）（米国特許第５，０５５，４０３号）に関して記述されている。プルラナーゼ活性を有する酵素で商業的に使用される酵素は、例えば、バチルス（Bacillus）種から製造される（Ｄａｎｉｓｃｏ−Ｇｅｎｅｎｃｏｒ製の商標名ＯＰＴＩＭＡＸ（商標）のＬ−１０００、及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ製のＰｒｏｍｏｚｙｍｅ（商標））。
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）アミラーゼ／トランスフェラーゼ（ＢＭＡ）：バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）アミラーゼは、分枝糖を、グルコアミラーゼにより容易に加水分解される形態に変換する能力を有する（Ｈａｂｅｄａ Ｒ．Ｅ．，Ｓｔｙｒｌｕｎｄ Ｃ．Ｒ ａｎｄ Ｔｅａｇｕｅ，Ｗ．Ｍ．；１９８８ Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ，４０，３３〜３６）。酵素は、ｐＨ ５．５かつ温度７５℃にて最大活性を呈する（Ｄａｖｉｄ，Ｍ．Ｈ．，Ｇｕｎｔｈｅｒ Ｈ ａｎｄ Ｖｉｌｖｏｏｒｄｅ，Ｈ．Ｒ．；１９８７，Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ，３９ ４３６〜４４０）。酵素は、遺伝的にエンジニアリングされたバチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）においてクローニング、発現され、かつ商業的規模で生産されてきた（Ｂｒｕｍｍ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｂｅｄａ Ｒ．Ｅ，ａｎｄ Ｔｅａｇｕｅ Ｗ．Ｍ．，１９９１ Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ，４３ ３１５〜３２９）。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグルコアミラーゼによる酵素液化デンプンの糖化中に、グルコース収率を高めるための酵素は、商標名ＭＥＧＡＤＥＸ（商標）で販売されている。
イソアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）はまた、当該技術分野において周知の有効量で添加され得る。また、プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）、例えば、Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ（登録商標）も好適である。プルラナーゼは、典型的には、１００Ｕ／ｋｇ（ｄｓ）で加えられる。更に好適な酵素類としては、真菌性プロテアーゼ、細菌性プロテアーゼなどのプロテアーゼ類が挙げられる。真菌プロテアーゼには、Ａ．ニガー（A. niger）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）などのアスペルギルス（Aspergillus）、ムコール（Mucor）（例えば、Ｍ．ミエヘイ（M. miehei））、クモノスカビ（Rhizopus）、及びトリコデルマ（Trichoderma）から得られるものが含まれる。
βアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）は、エキソ作用型のマルトース生成アミラーゼであり、１，４−αグルコシド結合の加水分解を触媒してアミロペクチン及び関連するグルコースポリマーを生ずることで、マルトースを放出させる。βアミラーゼは、様々な植物及び微生物から単離されてきた。Ｆｏｇａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９７９）ｉｎ ＰＲＯＧＲＥＳＳ ＩＮ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１１２〜１１５を参照されたい。これらのΒアミラーゼは、４０℃〜６５℃の範囲の至適温度、及び約４．５〜約７．０の範囲の最適ｐＨを有する。想定されているΒアミラーゼとしては、大麦由来のΒアミラーゼであるＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＢＢＡ １５００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＤＢＡ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＭＥ、Ｏｐｔｉｍａｌｔ（商標）ＢＢＡ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）、及びＮｏｖｏｚｙｍ（商標）ＷＢＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
５．焼成及び食品調製のための組成物及び方法
本発明は、また、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含む「食品組成物」（食品製品、動物飼料、及び／又は、食品／飼料添加物などが挙げられるが、これらに限定されない）、及びＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を、１種類以上の食品原料と混合することを含む、そのような食品組成物の調製方法、又はその使用にも関する。
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は食品組成物の調製に使用してもよく、この調製においてはポリペプチドの添加後に、食品組成物が焼成される。本明細書において用いられている用語「焼成組成物」は、焼成用製粉穀物、練り粉、焼成用添加物、及び／又は焼成食品が挙げられるがこれらに限定されない、焼成食品の提供プロセスで調製される任意の組成物及び／又は添加剤を意味する。食品組成物又は添加剤は液体又は固体であり得る。
本明細書において用いられている用語「製粉穀物」は、粉砕又は磨砕された穀物を意味する。用語「製粉穀物」は、磨砕又はすり潰されたサゴ又は塊茎製品も意味する。一部の実施形態では、製粉穀物は、粉砕又はすり潰された穀草又は植物材料以外の構成成分も含有する。追加の構成成分の例としては、膨張剤が挙げられるが、これらに限定されない。穀物としては、小麦、オート麦、ライ麦、及び大麦が挙げられる。塊茎産物としては、製粉タピオカ、製粉キャッサバ、及びカスタード粉末が挙げられる。用語「製粉穀物」には、磨砕トウモロコシ粉、トウモロコシミール、米粉、全粉粒、ふくらし粉入りの小麦粉、タピオカ粉、キャッサバ粉、米粉、強化小麦粉、及びカスタード粉末も含まれる。
焼成用及び食品生産用の穀粉の商用又は家庭での使用では、穀粉において適当なレベルのグルコアミラーゼ活性を維持することが重要である。活性レベルが高過ぎると、製品が粘着性になり及び／又は締りがなくなり、したがって商品にならない恐れがある。グルコアミラーゼ活性が不十分な穀粉では、適切な酵母の作用に十分な糖を含有できず、乾燥した、もろいパン又は焼成製品となってしまう。したがって、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を単独で、又はαアミラーゼ（１種又は複数種）と組み合わせて製粉穀物に加え、製粉穀物中に内在するグルコアミラーゼの活性レベルを増加させることもできる。
アミラーゼを単独で、又はその他のアミラーゼと組み合わせて加えて、焼成製品の劣化、即ち、クラム硬化を防止又は遅延させることができる。抗劣化アミラーゼの量は、典型的には、製粉穀物１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの酵素タンパク質の範囲であり、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ（ｄｓ）である。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と組み合わせて使用できる追加の抗劣化アミラーゼとしては、エンド型アミラーゼ、例えば、バチルス（Bacillus）由来の細菌性エンド型アミラーゼが挙げられる。追加のアミラーゼは、例えば、バチルス（Bacillus）由来のその他のマルトース生成αアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１３３）であってもよい。Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）は、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）株ＮＣＩＢ １１８３７由来の例示的なマルトース生成αアミラーゼであり、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｔａｒｃｈ ５０：３９〜４５に記載されている。その他の抗劣化エンド型アミラーゼの例としては、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）又はＢ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）などのバチルス（Bacillus）由来の細菌性αアミラーゼが挙げられる。老化防止アミラーゼは、βアミラーゼなどの、エキソ型アミラーゼでもよく、例えば、βアミラーゼは、大豆などの植物原材料由来、又はバチルス（Bacillus）などの細菌原材料由来でもよい。
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含む焼成用組成物は、ホスホリパーゼ又はホスホリパーゼ活性を有する酵素を更に含むことができる。ホスホリパーゼ活性を有する酵素は、リパーゼユニット（ＬＵ）で測定することのできる活性を有する。ホスホリパーゼは、リン脂質類から脂肪酸を取り除き、リゾリン脂質を形成させる、Ａ１又はＡ２活性を有していてもよい。ホスホリパーゼは、リパーゼ活性、即ち、トリグリセリド基質に対する活性を有しても有さなくてもよい。ホスホリパーゼは、典型的には３０〜９０℃（例えば、３０〜７０℃）の範囲に至適温度を有する。加えるホスホリパーゼは、動物由来、例えば、膵臓由来（例えば、ウシ又はブタ膵臓由来）、ヘビ毒液又は蜂毒液由来であり得る。あるいは、ホスホリパーゼは、微生物由来、例えば、糸状真菌、酵母、又は細菌由来であってもよい。
ホスホリパーゼは、焼成後しばらくの間、特に焼成後最初の２４時間の間のパンの柔らかさを向上させる量で加えられる。ホスホリパーゼの量は、典型的には、製粉穀物１ｋｇ当たり０．０１〜１０ｍｇの範囲の酵素タンパク質、例えば、０．１〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。即ち、ホスホリパーゼ活性は、一般的に、製粉穀物１ｋｇ当たり２０〜１０００ＬＵ／ｋｇの範囲であり、ここでリパーゼユニットは、アラビアゴムを乳化剤とし、トリブチリンを基質とし、３０℃、ｐＨ ７．０にて１分当たり１μｍｏｌの酪酸を放出させるのに必要とされる酵素量として定義される。
練り粉組成物は、一般的に、小麦全粒粉又は小麦粉、及び／又はその他種類のミール、製粉穀物、又はデンプン（トウモロコシ粉、トウモロコシデンプン、ライ麦ミール、ライ麦粉、オート麦粉、オートミール、大豆粉、ソルガムミール、ソルガム粉、ジャガイモミール、ジャガイモ粉、又はジャガイモデンプン）を含む。練り粉は、新鮮、凍結、又は半焼成のものであってよい。練り粉は、発酵させた練り粉、又は発酵させる練り粉であってよい。練り粉は、化学膨張剤（例えば、重炭酸ナトリウム）を加えること、あるいはイーストを加えること（即ち練り粉を発酵させること）などにより、多様な方法により膨らますことができる。練り粉は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン菓子用酵母）、例えば、Ｓ．セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の市販株の培養など、好適な酵母培養物を加えて膨らますこともできる。
練り粉にはまた、その他の従来の練り粉原料、例えば、タンパク質（乳汁粉末、グルテン、及び大豆など）、卵（例えば、全卵、卵黄、又は卵白））、酸化剤（アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ素酸カリウム、アゾジカーボンアミド（ＡＤＡ）、又はアンモニウム過硫酸塩）、Ｌ−システインなどのアミノ酸、糖、又は塩類（塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム、又は硫酸カルシウムなど）を含ませることもできる。練り粉には、更に脂肪、例えば、トリグリセリド（粒状脂肪又はショートニングなど）を含ませることもできる。練り粉には、更に乳化剤、例えば、モノ又はジグリセリド、モノ又はジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はリゾレシチンなどを含ませることもできる。例えば、練り粉は、乳化剤の添加を行うことなく製造することができる。
練り粉製品は、揚げ焼き、揚げ、ロースト、焼成、蒸し上げ、及び茹で上げされた練り粉を含む、任意の加工のなされた練り粉製品（例えば蒸しパン及び餅類など）であってよい。一実施形態では、食品はベーカリー製品である。典型的なベーカリー（焼成）製品としては、ローフ類、ロール類、丸パン類、ベーグル類、ピザ生地などのパン類、ペストリー、プレッツェル類、トルティーヤ類、ケーキ類、クッキー類、ビスケット類、クラッカー類などが挙げられる。
所望により、追加の酵素を抗劣化アミラーゼ及びホスホリパーゼとともに使用してもよい。追加の酵素は、例えば、アミログルコシダーゼ、βアミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼなどの第２のアミラーゼであってよく、あるいは追加の酵素は、ペプチダーゼ、特に、エキソペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば、国際公開第９５／００６３６号に開示されるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、分岐酵素（１，４−αグルカン分岐酵素）、４−αグルカノトランスフェラーゼ（デキストリングリコシルトランスフェラーゼ）、又は酸化還元酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコース酸化酵素、ピラノース酸化酵素、リポオキシゲナーゼ、Ｌ−アミノ酸酸化酵素、又はカルボヒドレートオキシダーゼであってよい。追加の酵素（１種又は複数種）は、哺乳類及び植物を含む任意の由来であってよく、特に微生物（細菌、酵母、又は真菌）由来であってよく、当該技術分野で一般に使用される手法により得ることができる。
キシラナーゼは、典型的には微生物由来であり、例えば、バクテリア、又は真菌（アスペルギルス（Aspergillus）株など）由来である。キシラナーゼには、例えば、トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）から製造された市販のキシラナーゼ製剤であるＰｅｎｔｏｐａｎ（登録商標）及びＮｏｖｏｚｙｍ ３８４（登録商標）が含まれる。アミログルコシダーゼはＡ．ニガー（A. niger）アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ（登録商標）など）であってよい。その他の有用なアミラーゼ製剤としては、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ（登録商標）Ａ １０００又はＡ ５０００（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）及びアミラーゼ（登録商標）Ｈ又はアミラーゼ（登録商標）Ｐ（ＤＳＭ）が挙げられる。グルコース酸化酵素は、真菌グルコース酸化酵素、特に、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグルコース酸化酵素（Ｇｌｕｚｙｍｅ（登録商標）など）であってよい。プロテアーゼの例はＮｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）である。
柔らかい又はクリスピー様の特徴のいずれかであり、精白、色白又は色黒のいずれかである、練り粉からあらゆる種類の焼成製品を調製するためのプロセスを使用することができる。例としてはパンがあり、具体的には、白パン、全粒粉パン、ライ麦パン（典型的には、ローフ状又はロール状のもの）であり、例えば、フレンチバゲットタイプのパン、ピタパン、トルティーヤ、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クッキー、パイクラスト、クリスプブレッド、蒸しパン、ピザなどがあるが、これらに限定されない。
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、老化防止アミラーゼ、ホスホリパーゼ、及び／又はリン脂質と共に穀粉を含むプレミックス中に使用され得る。プレミックスには、その他の練り粉を改良する及び／又はパンを改良する添加剤、例えば、上記の酵素を含む任意の添加剤を含有させることができる。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、焼成用添加物として使用される、老化防止アミラーゼと、ホスホリパーゼとを含む酵素製剤の成分であってもよい。
酵素製剤は、場合により、粒状又は凝集粉末の形態である。製剤は、粒子の９５重量％超が２５〜５００μｍの範囲内にある狭い粒度分布を有してよい。顆粒と凝集粉末は、従来法（例えば、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を流動層造粒機内で担体上へ噴霧すること）により調製され得る。担体は、好適な粒径を有する粒子コアからなってよい。担体は、可溶性又は不溶性の、例えば、塩（ＮａＣｌ又は硫酸ナトリウムなど）、糖（スクロース又はラクトースなど）、糖アルコール（ソルビトールなど）、デンプン、米、コーングリッツ、又は大豆であってよい。
封入粒子、即ち、グルコアミラーゼ粒子は、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含み得る。封入グルコアミラーゼ粒子を調製するために、酵素を、全てのグルコアミラーゼ粒子を懸濁させるのに十分な量の食品グレードの脂質と接触させる。本明細書で使用するとき、食品グレードの脂質は、水には不溶性であるものの、炭化水素又はジエチルエーテルなどの無極性有機溶媒には可溶性である、任意の天然の有機化合物であり得る。好適な食品グレードの脂質としては、飽和又は不飽和である脂肪又は油のいずれかの形態のトリグリセリドが挙げられるがこれらに限定されない。飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例の例としては、酪酸（乳汁脂肪由来）、パルミチン酸（動物及び植物性脂肪由来）、及び／又はステアリン酸（動物及び植物性脂肪由来）が挙げられるがこれらに限定されない。不飽和トリグリセリドを作る脂肪酸及びそれらの組み合わせの例としては、パルミトレイン酸（動物及び植物性脂肪由来）、オレイン酸（動物及び植物性脂肪由来）、リノール酸（植物油由来）、及び／又はリノレン酸（亜麻仁油由来）が挙げられるがこれらに限定されない。その他の好適な食品グレードの脂質としては、上記トリグリセリド由来のモノグリセリド及びジグリセリド、リン脂質及び糖脂質が挙げられるがこれらに限定されない。
食品グレードの脂質、特に液体形態のものを、脂質材料が、少なくとも大部分、例えば、１００％のグルコアミラーゼ粒子の表面の少なくとも一部分を覆うような様式で、粉末形態のグルコアミラーゼ粒子と接触させる。したがって、各グルコアミラーゼ粒子はそれぞれ脂質に封入される。例えば、全て又は実質的に全てのグルコアミラーゼ粒子には、薄く連続的な脂質の封入フィルムが備わっている。これは、最初に大量の脂質を容器に注ぎ入れ、次に脂質が各グルコアミラーゼ粒子の表面を十分に濡らすようグルコアミラーゼ粒子をスラリーにすることによりなすことができる。短時間撹拌した後、相当量の脂質を表面上に保持する封入グルコアミラーゼ粒子を回収する。所望の場合には、グルコアミラーゼ粒子にこのように適用されるコーティングの厚みを、使用する脂質の種類を選択すること、及び、より厚い皮膜を形成するための操作を繰り返すことによって、調節することもできる。
装填される送達分散媒の保管、取り扱い、及び組み込みは、パッケージ化ミックスを用いて実施できる。パッケージ化ミックスは、封入グルコアミラーゼを含み得る。しかしながら、パッケージミックスは、製造元又は焼成者が必要とする追加的な原材料を更に含むことができる。封入グルコアミラーゼが練り粉に混入された後、焼成者は、製品のための通常の生産プロセスを続ける。
グルコアミラーゼ粒子の封入による利点は２点ある。第１に、食品グレードの脂質は、熱に不安定な酵素の焼成プロセス中に、これらの酵素を熱分解から保護する。その結果、グルコアミラーゼは、発酵と焼成段階の間は、安定化され、保護されているが、最終的な焼成製品の中では保護コーティングから放出され、ポリグルカンのグルコシド結合を加水分解する。装填される送達分散媒は、活性酵素の焼成食品への持続放出性ももたらす。即ち、焼成プロセス後、活性グルコアミラーゼは、劣化機序に対抗する速度で、保護コーティングから持続的に放出され、それにより、その劣化機序速度を低減する。
一般的に、グルコアミラーゼ粒子に適用される脂質の量は、脂質の性質、脂質がグルコアミラーゼ粒子に適用される態様、取り扱う練り粉混合物の組成、関連する練り粉混合操作の強さの程度により、グルコアミラーゼの総重量の数パーセントから、その重量の何倍にも変わり得る。
装填される送達分散媒、即ち、脂質で被覆された酵素を、焼成食品の貯蔵寿命を延長するのに効果的な量で焼成食品を調製するために使用される原材料に加える。焼成者は、所望の抗劣化効果を得るのに必要とされる、上記の通りに調製された封入αアミラーゼの量を計算する。封入グルコアミラーゼの所要量は、封入される酵素濃度、及び特定の穀粉に対するグルコアミラーゼの割合を元に算出する。幅広い濃度が有効であることが見出されているものの、これまでに議論されている通り、抗劣化において観察可能な改良はグルコアミラーゼ濃度と直線的には対応せず、但し特定の最低濃度を超えると、グルコアミラーゼ濃度が大幅に上昇するためほとんど追加の改良はない。ベーカリー製品製造者の不注意による測定誤差で、少な目になってしまうことに対処するために、具体的な焼成による生産で実際に使用されるグルコアミラーゼ濃度は、必要最小量よりはるかに高くてもよい。酵素濃度の下限は、焼成者が得ることを望む最低限の抗劣化効果をもとに決定する。
焼成食品の調製方法は、ａ）脂質でコーティングされたグルコアミラーゼ粒子を調製する工程であって、実質的に全ての該グルコアミラーゼ粒子がコーティングされる、調製する工程と、ｂ）穀粉を含有する練り粉を混合する工程と、ｃ）脂質コーティングされた該グルコアミラーゼを、該混合が完了する前に該練り粉へ加え、該脂質コーティングが該グルコアミラーゼから取り除かれる前に該混合を終了する工程と、ｄ）該練り粉を発酵させる工程と、ｅ）該練り粉を焼成し、該焼成食品を提供する工程であって、該グルコアミラーゼが該混合段階、該発酵段階及び該焼成段階では不活性であり、該焼成食品中では活性である工程と、を含んでもよい。
封入グルコアミラーゼは、混合サイクル中、例えば、混合サイクルの終了近くに練り粉に加えることができる。封入グルコアミラーゼは、練り粉中に封入グルコアミラーゼを十分に分散させる混合段階で加えるが、混合段階は、グルコアミラーゼ粒子（１又は複数）から保護コーティングが剥がれ始める前に終了させる。練り粉に、封入グルコアミラーゼを混合するためには、練り粉の種類及び量、並びに混合機の動作及び速度に応じて、１〜６分以上が必要とされるであろうが、平均すると２〜４分である。したがって、多変数が正確な手順を決定し得る。第１に、封入グルコアミラーゼの量は、封入グルコアミラーゼを練り粉ミックス中に行き渡らせるのに十分な合計量を有する必要がある。封入グルコアミラーゼ調製物が高濃度である場合は、この封入グルコアミラーゼが練り粉へ添加される前に、プレミックスに追加の油を添加することが必要な場合がある。処方と生産プロセスには、特定の改変が必要な場合がある。しかしながら、パン練り粉調合物中に指定された油の２５％が練り粉に保持されていて、混合サイクルの終了近くに添加されたときに、濃縮封入グルコアミラーゼに対する担体として使用された場合、一般的に良好な結果が達成できる。練り粉に封入グルコアミラーゼを適切に混合するためには、パン又は他の焼成食品（特にフランス式のパンなどの低脂肪含量の製品）では、乾燥穀粉の重量のおよそ１％の封入グルコアミラーゼ混合物で十分である。好適な割合の範囲は広く、調合物、最終製品、及び個々の焼成者に必要とされる生産方法によって異なる。第２に、封入グルコアミラーゼ懸濁液は、練り粉に完全に混合されるのに十分な時間にわたって、但し、過剰な機械作用により封入グルコアミラーゼ粒子から保護脂質コーティングが剥がされるようものではない時間にわたって、混合物に添加される必要がある。
食品を油、肉、ラード、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含む組成物とする、食品組成物が想到される。この文脈で、用語「［油／肉／ラード］組成物」とは、それぞれ、油、肉、又はラードをもとにする、これからなる及び／又はこれを含有する任意の組成物を意味する。本発明のポリペプチドを油／肉／ラード組成物、及び／又は添加成分と混合することを含む、油、若しくは肉、若しくはラード組成物、及び／又はＡｆＧＡＴＲ若しくはその変異体を含む添加剤を調製するための方法が想到される。
食品組成物は、ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体を含む動物飼料組成物、動物飼料添加剤、並びに／又はペットフードであり得る。ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体を１種以上の動物飼料原材料及び／又は動物飼料添加成分及び／又はペットフード原材料に混合することを含む、そのような動物飼料組成物、動物飼料添加剤組成物及び／又はペットフードの調製方法が想到される。ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体は、動物飼料組成物及び／又は動物飼料添加剤組成物、及び／又はペットフードの調製に使用され得る。
用語「動物」は、全ての非反芻及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物は、馬及び単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、豚及び家畜豚（子豚、育成豚、雌豚など）、鶏（七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏など）、魚（鮭、鱒、テラピア、ナマズ、及び鯉など）、及び甲殻類（海老及び車海老など）が挙げられるがこれらに限定されない。更なる実施形態では、動物は反芻動物であり、畜牛、幼若牛、ヤギ、羊、キリン、バイソン、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、レイヨウ、エダツノレイヨウ、及びニルガイが挙げられるがこれらに限定されない。
この文脈において、用語「ペットフード」は、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、高級ラット、モルモット、飼育用鳥類（カナリア、インコ、及びオウムなど）、飼育用爬虫類（亀、とかげ、及びヘビなど）、並びに飼育用水生生物（熱帯魚、及び蛙など）であるがこれらに限定されない家庭内飼育用動物のための飼料を意味するものと理解されることが意図される。
用語「動物用飼料組成物」、「飼料」及び「飼葉」は互換可能に用いられ、かつａ）シリアル類、例えば、小粒穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、エンバク、及びこれらの組み合わせ）、及び／又は大粒穀物（例えば、コーン又はサトウモロコシなど）など、ｂ）シリアル類を原料とする製品、例えば、コーングルテンミール、蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特にコーン系の蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、粗びき小麦粉、小麦ショート（wheat shorts）、米ぬか、もみ殻、オーツ麦のもみ殻、パーム核、及び柑橘パルプ、ｃ）タンパク質類、例えば、大豆、ヒマワリ、落花生、ルピナス、エンドウ豆、ソラマメ、綿、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉飼料、ポテトタンパク質、乳清、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質、ｄ）植物資源及び動物資源から得られる油類及び脂肪類、ｅ）ミネラル類及びビタミン類、からなる群から選択される１種以上の飼料材料を含み得る。
６．織物湯通し組成物及び使用
また、ＡｆＧＡＴＲを使用した、布地を処理する（例えば、織物の糊抜きなど）組成物及び方法も、想到される。布地の処理方法は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号を参照されたい）。例えば、布地の感触及び外観は、その布地をＡｆＧＡＴＲの溶液と接触させる工程を含む方法により改善することができる。布地は、圧力下で溶液により処理され得る。
ＡｆＧＡＴＲは、織物の製織の間に若しくはその後に、又は糊抜き段階若しくは１種以上の追加の布地加工工程中に適用することができる。織物の製織の間、織り糸は相当な機械的な歪に曝される。機械式織機での製織前、縦糸は、引張り強度を向上させ、かつ断裂を防止するために、しばしば糊付けデンプン又はデンプン誘導体により被覆される。製織の間に又はその後にＡｆＧＡＴＲを適用して、これらの糊付けデンプン又はデンプン誘導体を取り除くことができる。製織後にＡｆＧＡＴＲを使用して、均一かつ耐洗浄的な効果を確保するために布地を更に加工する前に、糊付け用コーティングを取り除くことができる。
ＡｆＧＡＴＲを単体で、又は他の糊抜き用化学試薬及び／若しくは糊抜き用酵素と共に、（例えば、水性組成物中の）洗剤添加剤として使用して、綿含有布地などの布地の糊抜きを行ってよい。また、ＡｆＧＡＴＲは、インディゴ染色デニム布地及び衣類のストーンウォッシュ加工したような見た目を作り出すための組成物及び方法において使用することもできる。衣服の製造に際し、布地を裁断し、衣服又は衣類に縫製し、その後仕上げることができる。特にデニムジーンズの製造に関し、異なる酵素による仕上げ方法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による湯通し工程により開始され、この間、衣類はアミロース分解酵素による作用を受け、布地には柔軟性がもたらされ、木綿は以降の酵素による仕上げ工程による作用を受けやすくなる。ＡｆＧＡＴＲは、デニム衣類の仕上げ方法（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜き方法及び、布地への柔らかさの付与方法、並びに／又は仕上げ加工にて使用することができる。
７．洗浄用組成物
本組成物及び方法の一態様は、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を成分として含む洗浄用組成物である。アミラーゼポリペプチドは、手洗い、洗濯物洗浄、食器洗浄、及び他の硬質表面の洗浄のための洗剤組成物の成分として使用することができる。
７．１．概略
好ましくは、本ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、洗剤中のアミラーゼに対して従来から使用されている濃度にて、又はそれに近い濃度にて、洗剤に混入される。例えば、グルコアミラーゼポリペプチドは、洗浄／食器洗い液１Ｌ当たりアミラーゼ０．００００１〜１ｍｇ（高純度酵素タンパク質として計算）に相当する量で加えることができる。次に例示する通り、配合例を本明細書において提供する。
グルコアミラーゼポリペプチドは、唯一の酵素として、又は他のデンプン分解酵素などの他の酵素と共に、洗剤組成物の成分となり得る。そのため、非散布顆粒、安定化液体、又は保護化酵素の形態で洗剤組成物に含有させることもできる。非散布顆粒は、米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示される通りに生成されてもよく、場合により、当該技術分野において既知の方法によりコーティングされてもよい。ワックスコーティング材料の例は、平均分子量１，０００〜２０，０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、エトキシ化脂肪アルコール（ここで、アルコールは、１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する）、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適したフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号において与えられる。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール（プロピレングリコールなど）、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより、安定化させてもよい。その他の酵素安定剤は、技術分野において既知である。保護化酵素は、例えば、欧州特許第２３８ ２１６号に開示される方法に従って調製することができる。ポリオールは、長きにわたりタンパク質安定剤として、並びにタンパク質溶解度を改良するとして認識されてきた。
洗剤組成物は、例えば、粉末、顆粒、ペースト、又は液体などの任意の有用な形態であってよい。液体洗剤は水性であってよく、典型的には、最大で約７０％の水及び０％〜約３０の有機溶媒から構成され得る。液体洗剤は、水を約３０％含有するコンパクトジェルタイプの形態であってもよい。
洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含み、それぞれアニオン性、非イオン性、カチオン性、又は双極性であり得る。洗剤は、通常、０％〜約５０％のアニオン性界面活性剤、例えば、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルキル硫酸塩（脂肪族アルコール硫酸塩）（ＡＳ）、アルコールエトキシ硫酸塩（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、第ニ級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、又は石鹸を含有し得る。組成物には、０％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２／０６１５４号に記載のものなど）を含有させることもできる。
洗剤組成物には、追加して、１つ以上のその他の酵素、例えば、任意の組み合わせでプロテアーゼ、その他のアミロース分解酵素、クチナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペルヒドロラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、及び／又はラッカーゼなどを含ませることもできる。
洗剤には、約１〜約６５％の洗剤結合剤、又は錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＭＰＡ）、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有させてもよい。洗剤は無ビルダー系であってよく、即ち、洗剤ビルダーを本質的に不含有である。酵素は、酵素の安定性に適合性のある任意の組成物に使用することができる。酵素は、一般的に、既知の形態の封入により、例えば、造粒又はヒドロゲル中への隔離により、有害な成分から保護することができる。酵素、及び具体的にはデンプン結合ドメインを有する又は有さないアミラーゼを、洗濯及び食器洗い用途、表面クリーナー、並びにデンプン又はバイオマスからのエタノール産生用組成物を含む、多様な組成物に使用することができる。
洗剤は、１種類以上のポリマーを含んでいてもよい。例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー類、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー類が挙げられる。
洗剤は、Ｈ２Ｏ２供給源、例えば、過ホウ酸塩又は過炭酸塩（過酸を形成する漂白活性化剤、例えば、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）と組み合わせてもよい）を含む漂白系を含有し得る。あるいは、漂白系は、ペルオキシ酸（例えば、アミド、イミド、又はスルホン型ペルオキシ酸）を含むものであってもよい。漂白系は、酵素系漂白系、例えば、国際公開第２００５／０５６７８３号に記載されるものなどのペルヒドロラーゼであってもよい。
洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤、例えば、プロピレングリコール又はグリセロールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸塩エステルを用いて安定化されてもよく、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号及び国際公開第９２／１９７０８号に記載される通りに配合することもできる。
洗剤には、他の従来の洗剤成分、例えば、クレイを含む布地コンディショナ、起泡促進剤、抑泡剤、防食剤、汚れ懸濁化剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、変色防止剤、光学的光沢剤、又は香料を含有させてもよい。
ｐＨ（使用濃度の水溶液で測定）は通常、中性又はアルカリ性であり、例えば、ｐＨ約７．０〜約１１．０である。
本グルコアミラーゼを含有させるための特定の形態の洗剤組成物を以降に記載する。
７．２．重質液体（ＨＤＬ）洗濯洗剤組成物
ＨＤＬ洗濯洗剤組成物例には、アニオン性洗浄界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシ化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、及び場合により非イオン性界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキルアルコキシ化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシ化アルコール及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）を含有する、洗浄界面活性剤（１０〜４０％ ｗｔ／ｗｔ）が含まれ、非イオン性洗浄界面活性剤に対するアニオン性洗浄界面活性剤（６．０〜９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）の重量比は１：１超である。好適な洗浄界面活性剤には、カチオン性洗浄界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物も含まれる。
組成物には、場合により、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（アルコキシル化ポリアルキレンイミンなどの、分岐状親水及び疎水特性を有するアルコキシル化ポリマーからなる群から０．０５重量％〜１０重量％の範囲で選択される）、及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、マレイン酸無水物、グリセロールなどの飽和多価アルコール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む、親水性主鎖、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ１〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖（１種又は複数種）を含む）からなる界面活性増強ポリマーを含ませることもできる。
組成物には、汚れ放出ポリマー（アニオン性末端保護ポリエステル、例えば、ＳＲＰ１、糖、ジカルボン酸、ポリオール及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのモノマー単位をランダム又はブロック構成で含むポリマー、ランダム又はブロック構成のエチレンテレフタレート系ポリマー及びそれらのコポリマー、例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲の、アクリル酸、マイレン酸（若しくはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸、及びこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１種のモノマーを含むポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、及び／又はポリエチレングリコールなどのカルボキシレートポリマーを０．１重量％〜１０重量％含む）、セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロース、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物など、から選択されるものを含む）、並びに高分子カルボキシレート（マレエート／アクリレートランダムコポリマー又はポリアクリレートホモポリマーなど）などの追加のポリマーを含有させることもできる。
組成物は、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）；付着補助剤（例としては、多糖類、好ましくはセルロース系ポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）、及びランダム又はブロック構成の、ＤＡＤＭＡＣとビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、及びそれらの混合物とのコポリマー、カチオン性グアーガム、カチオン性セルロース（カチオン性ヒドロキシエチル（hydoxyethyl）セルロースなど）、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアシルアミド、及びそれらの混合物）を更に含んでもよい。
組成物には、更に移染防止剤、例えば、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドン及びＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、及び／又はこれらの混合物、キレート剤、例えば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸テトラナトリム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及びそれらの塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノジ酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体、を含ませることもできる。
組成物に好ましく含有される酵素（一般的に、約０．０１重量％活性酵素〜０．０３重量％活性酵素）は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシル基転移酵素、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物から選択される。組成物には酵素安定剤を含ませることもできる（例えば、プロピレングリコール又はグリセロールなどのポリオール、糖又は糖アルコール、乳酸、可逆性プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、又はホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステル、あるいはフェニルボロン酸誘導体、例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸などを含む）。
組成物は、場合により、シリコーン又は脂肪酸系抑泡剤、色相染料、カルシウム及びマグネシウムカチオン、視覚的シグナル成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、及び／又は構造剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微小結晶セルロース、セルロース系材料、微小繊維セルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、及びこれらの混合物からなる群から選択される）を含む。
組成物は任意の液体形態であってよく、例えば、液体又はジェル形態、あるいはこれらの組み合わせてあってよい。組成物は、任意の単回用量形態であってよく、例えば、パウチであってもよい。
７．３．重質乾燥／固形分（ＨＤＤ）洗濯洗剤組成物
例示的なＨＤＤ洗濯用洗剤組成物は、アニオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又は不規則鎖状の、置換又は非置換のアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はそれらの混合物）、非イオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又は不規則鎖状の、置換又は非置換のＣ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート）、カチオン性洗浄用界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル四級アンモニウム化合物、アルキル四級ホスホニウム化合物、アルキル三級スルホニウム化合物、及びそれらの混合物）、双性イオン性及び／又は両性洗浄用界面活性剤（例えば、アルカノールアミンスルホベタイン）、両性（ampholytic）界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びそれらの混合物などの洗浄界面活性剤；リン酸塩非含有ビルダー（例えば、０ｗｔ％〜１０ｗｔ％未満の範囲のゼオライトビルダー、例としては、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ及びゼオライトＭＡＰなど）、リン酸塩ビルダー（例えば、０ｗｔ％〜１０ｗｔ％未満の範囲のトリポリリン酸ナトリウム）、クエン酸、クエン酸塩、及びニトリロ三酢酸、ケイ酸塩（例えば、０ｗｔ％〜１０ｗｔ％未満の範囲のケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム若しくはメタケイ酸ナトリウム、又は層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））；炭酸塩（例えば、０ｗｔ％〜８０ｗｔ％未満の範囲の炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウム）などのビルダー；光漂白剤（例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びそれらの混合物）、疎水性若しくは親水性の漂白活性剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸若しくはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（3,5,5-trimethy hexanoyl oxybenzene sulfonate）、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）、ニトリル第４級アンモニウム化合物（nitrile quat）、及びそれらの混合物）、過酸化水素源（例えば、例として、過ホウ酸、過炭酸、過硫酸、過リン酸、又は過ケイ酸の１水和物ナトリウム塩又は４水和物ナトリウム塩などの、無機過水和物塩）、予備形成済の親水性及び／若しくは疎水性の過酸（例えば、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、過イミド酸及び塩、ペルオキシ１硫酸及び塩、並びにそれらの混合物）などの漂白剤、並びに／又は漂白触媒（例えば、イミン漂白促進剤（例としては、イミニウムカチオン及びポリイオン）、イミニウム双性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、全フッ素化イミン、環状糖ケトン、及びそれらの混合物など、並びに金属含有漂白触媒（例えば、亜鉛又はアルミニウムなどの補助的な金属カチオンと、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びその水溶性の塩などの金属イオン封鎖剤とを伴う、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンのカチオン）を含む。
組成物は、好ましくは酵素、例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシル基転移酵素、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物を含む。
組成物は、任意選択で、追加の洗剤成分、例えば、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、色調剤、追加のポリマー（布地一体性（fabric integrity）かつカチオン性のポリマーなど）、染料固定成分（dye-lock ingredient）、布地柔軟化剤、光沢剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布地付着補助剤、及び／又はシクロデキストリンを含んでもよい。
７．４．自動食器洗い（ＡＤＷ）洗剤組成物
例示的なＡＤＷ洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で存在する非イオン性界面活性剤（エトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシキャップされたポリ（オキシアルキル化）アルコール、又はアミンオキシド界面活性剤など）；５〜６０％の範囲のビルダー［リン酸塩ビルダー（例えば、一リン酸塩、二リン酸塩、トリポリリン酸塩、他のオリゴマー性ポリリン酸塩（oligomeric-poylphosphate）、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ））、及びリン酸塩非含有ビルダー（例えば、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）並びにそれらの塩及び誘導体、グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＧＬＤＡ）並びにそれらの塩及び誘導体、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）並びにそれらの塩及び誘導体、カルボキシメチルイヌリン並びにそれらの塩及び誘導体、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）、及びそれらの塩などのアミノ酸系化合物、０．５％〜５０重量％の範囲のポリカルボン酸のホモポリマー及びコポリマー並びにそれらの部分中和した又は完全中和した塩、単量体ポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸、及びそれらの塩など）］；寸法安定性を付与するための、約０．１重量％〜約５０重量％の範囲のスルホン化／カルボキシル化ポリマー；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の乾燥補助剤［例えば、ポリエステル、特にアニオン性ポリエステルであって、任意選択で３〜６個の官能基（典型的には、重縮合を促す酸、アルコール又はエステル官能基）を有する更なるモノマーを伴うもの、ポリカーボネート−、ポリウレタン−、及び／又はポリ尿素−ポリオルガノシロキサン化合物又はそれらの前駆化合物（特に反応性環状カーボネート及び尿素タイプのもの）］；約１重量％〜約２０重量％の範囲のケイ酸塩（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム及び結晶質フィロケイ酸塩などのケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム）；無機漂白剤（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩などの過水和物塩）及び有機漂白剤（例えば、過酸化ジアシル及び過酸化テトラアシル、例えば、ジペルオキシドデカン二酸（diperoxydodecanedioc acid）、ジペルオキシテトラデカン二酸（diperoxytetradecanedioc acid）、及びジペルオキシヘキサデカン二酸（diperoxyhexadecanedioc acid）のような有機過酸）；漂白活性剤（即ち、約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の有機過酸前駆物質）；漂白触媒（例えば、マンガン−トリアザシクロノナン及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ、及びＦｅビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミンアセタートコバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体）；約０．１重量％〜５重量％の範囲の金属処理剤（例えば、ベンゾトリアゾール（benzatriazole）、金属塩及び錯体、並びに／又はケイ酸塩）；自動食器洗浄用洗剤組成物１グラム当たり活性酵素約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の酵素（例えば、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクタートリアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びそれらの混合物など）；並びに酵素安定剤成分（例えば、オリゴ糖、多糖類、及び無機二価金属塩など）を含む。
７．５．追加の洗剤組成物
本発明のアミラーゼを加えることができる追加の洗剤配合物例を、以降の付番した段落に記載する。
１）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約７％〜約１２％と；アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１−２エチレンオキシド（ＥＯ））又はアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約４％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１４％〜約２０％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約２〜約６％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１５％〜約２２％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約６％と；クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）約０％〜約１５％と；ナトリウム過ホウ酸塩（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約１１％〜約１８％と；ＴＡＥＤ約２％〜約６％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸、コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％と；酵素（純粋な酵素として計算）０．０００１〜０．１％タンパク質と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料、光学的光沢剤、光漂白剤）０〜５％とを含む、洗剤組成物。
２）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約６％〜約１１％と；アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１８アルコール、１−２ＥＯ）又はアルキル硫酸塩（例えば、Ｃ１６〜１８）約１％〜約３％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１４〜１５アルコール、７ＥＯ）約５％〜約９％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１５％〜約２１％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約２４％〜約３４％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約４％〜約１０％と；クエン酸ナトリウム／クエン酸（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７／Ｃ６Ｈ８Ｏ７）０％〜約１５％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜６％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％とを含む、洗剤組成物。
３）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約５％〜約９％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）約７％〜約１４％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、Ｃ１６〜２２脂肪酸）約１〜約３％と；炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１０％〜約１７％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約３％〜約９％と；ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４として）約２３％〜約３３％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約４％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約８％〜約１６％と；ＴＡＥＤ約２％〜約８％と；ホスホン酸塩（例えば、ＥＤＴＭＰＡ）０％〜約１％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０〜３％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％とを含む、洗剤組成物。
４）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約８％〜約１２％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ）約１０％〜約２５％と；炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約１４％〜約２２％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約５％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約２５％〜約３５％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約１０％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＶＰ、ＰＥＧ）１〜３％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
５）水性液体洗剤組成物であって、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２１％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）約１２％〜約１８％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、オレイン酸）約３％〜約１３％と；アルケニルコハク酸（Ｃ１２〜１４）０％〜約１３％と；アミノエタノール約８％〜約１８％と；クエン酸約２％〜約８％と；ホスホン酸塩０％〜約３％と；ポリマー（例えば、ＰＶＰ、ＰＥＧ）０％〜約３％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％と；エタノール０％〜約３％と；プロピレングリコール約８％〜約１４％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、懸濁剤、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％とを含む、水性液体洗剤組成物。
６）水性構成液体洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２１％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）３〜９％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、オレイン酸）約３％〜約１０％と；ゼオライト（ＮａＡｌＳｉＯ４として）約１４％〜約２２％と；クエン酸カリウム約９％〜約１８％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＶＰ）０％〜約３％と；固着ポリマー（例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー；モル比２５：１、ＭＷ ３８００など）０％〜約３％と；グリセロール０％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、分散剤、抑泡剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％とを含む、水性構成液体洗剤組成物。
７）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、脂肪アルコール硫酸塩約５％〜約１０％と；エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約３％〜約９％と；脂肪酸としての石鹸０〜３％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約５％〜約１０％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約２０％〜約４０％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約２％〜約８％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約１２％〜約１８％と；ＴＡＥＤ約２％〜約７％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、抑泡剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
８）顆粒として配合される洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約８％〜約１４％と；エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド約５％〜約１１％と；脂肪酸としての石鹸０％〜約３％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約４％〜約１０％と；可溶性ケイ酸塩（Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約１％〜約４％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約３０％〜約５０％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約３％〜約１１％と；クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約５％〜約１２％と；ポリマー（例えば、ＰＶＰ、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、ＰＥＧ）約１％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、抑泡剤、香料）０〜５％と、を含む洗剤組成物。
９）顆粒として配合される洗剤組成物であって、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約６％〜約１２％と；非イオン性界面活性剤約１％〜約４％と；脂肪酸としての石鹸約２％〜約６％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約１４％〜約２２％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１８％〜約３２％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）約５％〜約２０％と；クエン酸ナトリウム（例えば、Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７）約３％〜約８％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３Ｈ２Ｏ）約４％〜約９％と；漂白活性化剤（例えば、ＮＯＢＳ又はＴＡＥＤ）約１％〜約５％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約２％と；ポリマー（例えば、ポリカルボキシレート、又はＰＥＧ）約１％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、香料）０〜５％とを含む、洗剤組成物。
１０）水性液体洗剤組成物であって、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約１５％〜約２３％と；アルコールエトキシ硫酸塩（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、２−３ＥＯ）約８％〜約１５％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）約３％〜約９％と；脂肪酸としての石鹸（例えば、ラウリン酸）０％〜約３％と；アミノエタノール約１％〜約５％と；クエン酸ナトリウム約５％〜約１０％と；ヒドロトロープ（例えば、トルエンスルホン酸ナトリウム）約２％〜約６％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）０％〜約２％と；カルボキシメチルセルロース０％〜約１％と；エタノール約１％〜約３％と；プロピレングリコール約２％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、ポリマー、分散剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％とを含む、水性液体洗剤組成物。
１１）水性液体洗剤組成物であって、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩（酸として計算）約２０％〜約３２％と；アルコールエトキシレート（例えば、Ｃ１２〜１５アルコール、７ＥＯ、又はＣ１２〜１５アルコール、５ＥＯ）６〜１２％と；アミノエタノール約２％〜約６％と；クエン酸約８％〜約１４％と；ホウ酸（例えば、Ｂ４Ｏ７）約１％〜約３％と；ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、アンカリングポリマー、例えば、ラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーなど）０％〜約３％と；グリセロール約３％〜約８％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、ヒドロトロープ、懸濁剤、香料、光学的光沢剤）０〜５％とを含む、水性液体洗剤組成物。
１２）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、アニオン性界面活性剤（線状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホン酸塩、石鹸）約２５％〜約４０％と；非イオン性界面活性剤（例えば、アルコールエトキシレート）約１％〜約１０％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約８％〜約２５％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）約５％〜約１５％と；硫酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＳＯ４）０％〜約５％と；ゼオライト（ＮａＡ１ＳｉＯ４）約１５％〜約２８％と；過ホウ酸ナトリウム（例えば、ＮａＢＯ３・４Ｈ２Ｏ）０％〜約２０％と；漂白活性化剤（ＴＡＥＤ又はＮＯＢＳ）約０％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、香料、光学的光沢剤）０〜３％とを含む、洗剤組成物。
１３）直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩の全て、又は一部が、（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩によって置換されている、上記組成物１）〜１２）に記載した、洗剤組成物。
１４）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩約９％〜約１５％と；アルコールエトキシレート約３％〜約６％と；ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド約１％〜約５％と；ゼオライト（例えば、ＮａＡｌＳｉＯ４）約１０％〜約２０％と；層状二ケイ酸塩（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ製ＳＫ５６）約１０％〜約２０％と；炭酸ナトリウム（例えば、Ｎａ２ＣＯ３）約３％〜約１２％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）０％〜約６％と；クエン酸ナトリウム約４％〜約８％と；過炭酸ナトリウム約１３％〜約２２％と；ＴＡＥＤ約３％〜約８％と；ポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）０％〜約５％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、光漂白剤、香料、抑泡剤）０〜５％とを含む、洗剤組成物。
１５）少なくとも６００ｇ／Ｌのかさ密度を有する顆粒として配合される洗剤組成物であって、（Ｃ１２〜Ｃ１８）アルキル硫酸塩約４％〜約８％と；アルコールエトキシレート約１１％〜約１５％と；石鹸約１％〜約４％と；ゼオライトＭＡＰ又はゼオライトＡ約３５％〜約４５％と；炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３として）約２％〜約８％と；可溶性ケイ酸塩（例えば、Ｎａ２Ｏ、２ＳｉＯ２）０％〜約４％と；過炭酸ナトリウム約１３％〜約２２％と；ＴＡＥＤ １〜８％と；カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０％〜約３％と；ポリマー（例えば、ポリカルボン酸塩及びＰＶＰ）０％〜約３％と；酵素（純粋な酵素タンパク質として計算）０．０００１〜０．１％と；微量成分（例えば、光学的光沢剤、ホスホン酸塩、香料）０〜３％とを含む、洗剤組成物。
１６）上記１）〜１５）に記載される通りの洗剤配合物であって、追加成分として、又はすでに記載されている漂白系の代替として、安定化又は封入された過酸を含有する配合物。
１７）上記１）、３）、７）、９）、及び１２）に記載される通りの洗剤配合物であって、過ホウ酸塩が過炭酸塩により置き換えられている、配合物。
１８）上記１）、３）、７）、９）、１２）、１４）、及び１５）に記載される通りの洗剤配合物であって、マンガン触媒を更に含有する、配合物。マンガン触媒は、例えば、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ，」Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６３７〜６３９（１９９４）に記載の化合物のうちの１つである。
１９）液体非イオン性界面活性剤、例えば、線状アルコキシル化一級アルコールなど、ビルダー系（例えば、リン酸）、及び酵素（１種又は複数種）、及びアルカリを含む非水性洗剤液体として配合された洗剤組成物。洗剤には、アニオン性界面活性剤及び／又は漂白系を含ませることもできる。
上記の通り、本発明のアミラーゼポリペプチドは、従来洗剤において採用されていた濃度で組み込むことができる。本発明では、洗剤組成物において、酵素は、洗浄液１Ｌ当たり０．００００１〜１．０ｍｇ（純粋な酵素タンパク質として計算）のアミラーゼポリペプチドに相当する量で添加され得ることが想到される。
洗剤組成物には、その他の従来の洗剤原材料、例えば、解膠剤、充填材、消泡剤、抗腐食剤、汚れ懸濁剤、金属イオン封鎖剤、抗汚れ再付着剤、脱水剤、染料、殺菌剤、蛍光剤、増粘剤、及び香料も含有させることができる。
洗剤組成物は、染みの付着した布地の前処理剤、及びすすぎ時添加型布地柔軟剤組成物に好適な洗濯添加剤組成物を含む、手洗い（手動）又は機械（自動）洗濯洗剤組成物として配合することもでき、あるいは一般的な家庭用硬質表面洗浄操作で使用するための洗剤組成物として配合することもでき、あるいは手動又は自動食器洗い操作のために配合することもできる。
本明細書に記載の任意の洗浄組成物には任意の数の追加の酵素を含有させることもできる。一般的には、酵素（１種又は複数種）は選択された洗剤と適合する必要があり（例えば、最適ｐＨが適合する、その他の酵素及び非酵素成分と適合するなど）、並びに酵素（１種又は複数種）は有効な量で存在させる必要がある。次の酵素が例として提供される。
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼとしては、動物、野菜又は微生物起源のものが挙げられる。化学修飾した又はタンパク質を遺伝子操作した変異体、並びに天然にプロセシングを受けたタンパク質が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、アルカリ性微生物プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、又はキモトリプシン様プロテアーゼであってよい。アルカリプロテアーゼの例は、例えばバチルス（Bacillus）由来のサブチリシン、例えば、サブチリシンＮｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７及びサブチリシン１６８である（例えば、国際公開第８９／０６２７９号を参照）。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、フザリウム（Fusarium）プロテアーゼ（例えば、国際公開第８９／０６２７０号及び国際公開第９４／２５５８３号を参照）である。有用プロテアーゼの例としては、国際公開第９２／１９７２９号、国際公開第９８／２０１１５号、国際公開第９８／２０１１６号、及び国際公開第９８／３４９４６号に記載の変異体も挙げられるがこれらに限定されない。市販のプロテアーゼ酵素としては、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＬＡＳＥ（商標）、ＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）、及びＢＬＡＺＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）が挙げられるがこれらに限定されない。その他のプロテアーゼの例としては、バチルス・アミロリキファシエンス（Bacillus amylo liquifaciens）由来のＮｐｒＥ、及びセルロモナス種（Cellulomonas sp.）株６９Ｂ４由来のＡＳＰが挙げられる。
リパーゼ：好適なリパーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾した、若しくはタンパク質分解により修飾された、又はタンパク質を遺伝子操作した変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ（Humicola）由来のリパーゼ（異名：サーモマイセス（Thermomyces））例えば、Ｈ．ラヌギノーサ由来（H. lanuginosa）（Ｔ．ラヌギノサス（T. lanuginosus））（例えば、欧州特許第２５８０６８号及び欧州特許第３０５２１６号を参照されたい）、Ｈ．インソレン（H. insolen）由来（例えば、国際公開第９６／１３５８０号を参照されたい）、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ（例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）又はＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）、例えば、欧州特許第２１８ ２７２号を参照されたい）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）（例えば、欧州特許第３３１ ３７６号を参照されたい）、Ｐ．スツッツェリ（P. stutzeri）（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）、シュードモナス（Pseudomonas）種の株ＳＤ ７０５（例えば、国際公開第９５／０６７２０号及び国際公開第９６／２７００２号を参照されたい）、Ｐ．ウィスコンシンシ（P. wisconsinensi）（例えば、国際公開第９６／１２０１２号を参照されたい）、バチルス（Bacillus）リパーゼ（例えば、Ｂ．スブチリシン（B. subtilis）、例えば、Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１：２５３〜３６０（１９９３）を参照されたい）、Ｂ．ステアロサーモフィル（B. stearothermophilu）（例えば、日本特許第６４／７４４９９２号を参照されたい）、又はＢ．プミル（B. pumilu）（例えば、国際公開第９１／１６４２２号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。配合物に用いることが考えられる追加のリパーゼ変異体としては、例えば、国際公開第９２／０５２４９号、国際公開第９４／０１５４１号、国際公開第９５／３５３８１号、国際公開第９６／００２９２号、国際公開第９５／３０７４４号、国際公開第９４／２５５７８号、国際公開第９５／１４７８３号、国際公開第９５／２２６１５号、国際公開第９７／０４０７９号、国際公開第９７／０７２０２号、欧州特許第４０７２２５号、及び欧州特許第２６０１０５号、に記載のものが挙げられる。幾つかの市販のリパーゼ酵素としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）及びＬｉｐｏｌａｓｅ Ｕｌｔｒａ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
ポリエステラーゼ：例えば、国際公開第０１／３４８９９号、国際公開第０１／１４６２９号、及び米国特許第６９３３１４０号に記載のものなどの好適なポリエステラーゼを組成物に含有させることができる。
アミラーゼ：この組成物は、生産性を増強させるものではないアミラーゼなどの、アミラーゼと組み合わせることができる。これらとしては、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）；ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、及びＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）などの市販のアミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
セルラーゼ：セルラーゼを組成物に加えることができる。好適なセルラーゼには、細菌又は真菌由来のものが含まれる。化学修飾した突然変異体又はタンパク質を遺伝子操作した突然変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フミコラ（Humicola）属、フザリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号、米国特許第５，６４８，２６３号、米国特許第５，６９１，１７８号、米国特許第５，７７６，７５７号、及び国際公開第８９／０９２５９号などに開示される、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）から生成される真菌セルラーゼが挙げられる。用いることが企図された典型的なセルラーゼは、布に対し有益な色ケア効果を有するものである。このようなセルラーゼの例は、例えば、欧州特許第０４９５２５７号、欧州特許第０５３１３７２号、国際公開第９６／１１２６２号、国際公開第９６／２９３９７号、及び国際公開第９８／０８９４０号に記載のセルラーゼである。その他の例は、国際公開第９４／０７９９８号、国際公開第９８／１２３０７号、国際公開第９５／２４４７１号、国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９号、欧州特許第５３１３１５号、米国特許第５，４５７，０４６号、米国特許第５，６８６，５９３号、及び米国特許第５，７６３，２５４号に記載のものなどのセルラーゼ変異体である。市販のセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）及びＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）；ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＤＡＸ ＨＡ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．）；及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：上記組成物に用いることが考えられる好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼには、植物、細菌又は真菌起源のものが含まれる。化学修飾した突然変異体又はタンパク質を遺伝子操作した突然変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、国際公開第９３／２４６１８号、国際公開第９５／１０６０２号、及び国際公開第９８／１５２５７号に記載される、コプリナス由来、例えば、Ｃ．シネレウス（C. cinereus）由来のペルオキシダーゼ、及びそれらの変異体が挙げられる。市販のペルオキシダーゼとしては、例えば、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ及びＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
洗剤組成物には、２，６−β−Ｄ−フルクタン加水分解酵素を含ませてもよく、これは、家庭用及び／又は工業用織物／洗濯物上に存在するバイオフィルムの除去／洗浄に有効である。
洗剤酵素（１種又は複数種）は、１種以上の酵素を含有する別個の添加剤を加えることにより、又はこれらの酵素の全てを含む組み合わせた添加剤を加えることにより、洗剤組成物に含有させることもできる。洗剤添加剤、即ち、別個の添加剤又は組み合わせた添加剤は、例えば、顆粒剤、液体、及びスラリーなどとして配合することができる。洗剤添加剤配合物の例としては、顆粒、特に非散布顆粒、液体、特に安定化された液体又はスラリーが挙げられるがこれらに限定されない。
非散布顆粒は、米国特許第４，１０６，９９１号及び同第４，６６１，４５２号に開示される通りに生成されてもよく、場合により、当該技術分野において既知の方法によりコーティングされてもよい。ワックスコーティング材料の例は、平均分子量１，０００〜２０，０００を有するポリ（エチレンオキシド）製品（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、１６〜５０個のエチレンオキシド単位を有するエトキシ化ノニルフェノール、エトキシ化脂肪アルコール（ここで、アルコールは、１２〜２０個の炭素原子を含有し、１５〜８０個のエチレンオキシド単位が存在する）、脂肪アルコール、脂肪酸、及び脂肪酸のモノ及びジ及びトリグリセリドである。流動層技術による適用に適したフィルム形成コーティング材料の例は、例えば、英国特許第１４８３５９１号において与えられる。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従い、ポリオール（プロピレングリコールなど）、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより、安定化させてもよい。保護化酵素（Protected enzyme）を、欧州特許第２３８，２１６号に開示される方法に従い調製してもよい。
洗剤組成物は、任意の便利な形態であってよく、例えば、バー、錠剤、粉末、顆粒、ペースト、又は液体であってよい。液体洗剤は水性であってよく、典型的には、最大で約７０％の水及び０％〜約３０の有機溶媒を含有する。約３０％以下の水を含有するコンパクト洗剤ジェルも想到される。洗剤組成物には、場合により１種以上の界面活性剤を含ませることができ、界面活性剤は、半極性などの非イオン性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は双極性であってよい。界面活性剤は、約０．１重量％〜約６０％重量％の広範な範囲で存在させることができる。
含有させる際、洗剤には、典型的には、約１％〜約４０％でアニオン性界面活性剤、例えば、線状アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩（脂肪族アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、第ニ級アルカンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハク酸、又は石鹸などを含有させる。
含有させる際、洗剤には、通常、約０．２％〜約４０％で非イオン性界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシル−Ｎ−アルキル誘導体（「グルカミド」）を含有させる。
洗剤には、０〜約６５％で洗剤ビルダー、又は錯化剤、例えば、ゼオライト、二リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えば、ＨｏｅｃｈｓｔのＳＫＳ−６）を含有させてもよい。
前記洗剤は、１種類以上のポリマーを含んでいてもよい。ポリマーの例としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えば、ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー類）、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマー類が挙げられる。
洗剤組成物の酵素（１種又は複数種）は、従来の安定化剤、例えば、ポリオール（例えば、プロピレングリコール又はグリセロール）、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）、又はフェニルボロン酸誘導体（例えば、４−ホルミルフェニルボロン酸）を使用して安定化することもできる。組成物は、国際公開第９２／１９７０９号及び国際公開第９２／１９７０８号に記載の通りに配合することができる。
洗剤組成物には、特に酵素変異体を、洗浄液１Ｌ当たり酵素タンパク質約０．０１〜約１００ｍｇに相当する量で加えることができるものと想到される（例えば、洗浄液１Ｌ当たり約０．０５〜約５．０ｍｇの酵素タンパク質、又は洗浄液１Ｌ当たり０．１〜約１．０ｍｇの酵素タンパク質）。
本発明の組成物及び方法は以降の詳細を参照して記載されているものの、多様な変更をなすことができることは理解されたい。
７．６．洗剤組成物中のアミラーゼ活性を評価する方法
見本及び微小見本によるアッセイなど、数多くのグルコアミラーゼ洗浄アッセイが当該技術分野において既知である。添付の実施例は、このようなアッセイをほんの僅かに記載する。
８．醸造組成物
ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体は、醸造物などの発酵飲料を提供するプロセスにおいて使用される醸造組成物の成分であってもよい。非発酵性炭水化物は、最終的なビール中に溶解している固体の大部分を占めると考えられる。この残留物は、デンプンのα−１，６−結合を加水分解する麦芽アミラーゼが作用しないために残留する。非発酵性炭水化物は、約３４０グラム（１２オンス）のビール当たり約５０カロリーをもたらす。通常、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を、グルコアミラーゼ、並びに任意選択でプルラナーゼ、及び／又はイソアミラーゼと組み合わせることで、デンプンのデキストリン及び発酵性の糖への変換が補助され、最終的なビール中の残存非発酵性炭水化物が減少する。
これらの飲料の製造に使用される主要な原材料は、水、ホップ、及び麦芽である。加えて、限定するものではないが、一般的なコーングリッツ、精製コーングリッツ、醸造者により粉砕された酵母、米、ソルガム、精製コーンデンプン、大麦、大麦デンプン、脱穀された大麦、小麦、小麦デンプン、炒って加熱処理された穀草、穀草フレーク、ライ麦、オーツ麦、ジャガイモ、タピオカ、及びシロップ、例えばトウモロコシシロップ、サトウキビシロップ、反転型糖シロップ、大麦及び／又は小麦シロップ、並びに同様物などの補助剤をデンプン源として使用することもできる。
数多くの理由により、選別された大麦品種から主として生産される麦芽は、ビールの全般的な特徴及び品質に重要な影響を与える。第１に、麦芽はビールにおける主要な風味剤である。第２に、麦芽は発酵性糖の大部分を提供する。第３に、麦芽はビールのボディ及び泡の特徴に寄与するタンパク質を提供する。第４に、麦芽はマッシュ中に必要な酵素活性を提供する。ホップも、風味を含むビールの品質に大きく寄与する。具体的には、ホップ（又はホップ構成成分）は、好ましい苦味物質をビールに加える。加えて、ホップはタンパク質沈殿剤として作用し、防腐剤となり、泡の形成及び安定化を補助し得る。
工業醸造のため、及び家庭内醸造のための両方の醸造に関し、大麦、オーツ麦、小麦などの穀草（穀物）だけでなく、多くの場合、トウモロコシ及び米もまた使用され、ホップなどのその他の植物成分が加えられることも多い。醸造に使用される成分は、麦芽生成されていなくてもよく、あるいは麦芽生成されていてよく、即ち、部分的に発芽させ、結果として、αアミラーゼを含む酵素濃度を上昇させることもできる。首尾よく醸造するため、発酵に適切な濃度の糖を保証するため、αアミラーゼ酵素の活性レベルは適切である必要がある。ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体はまた、醸造に使用される成分に添加され得る。
本明細書において用いられている用語「ストック」とは、圧搾又は破壊された穀物及び植物成分を意味する。例えば、ビールの生産に使用される大麦は、発酵用マッシュの生産に適切な稠度を得るため、粗く磨砕し又は破砕した穀粒である。本明細書において用いられている用語「ストック」は、破砕又は粗く磨砕された形態の、前述の種類の植物又は穀物のいずれかを含む。本明細書に記載の方法を使用して、製粉穀物及びストックの両方におけるαアミラーゼ活性のレベルを判定することもできる。
ビールの製造プロセスは当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｋｕｎｚｅ（２００４）「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｒｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｌｔｉｎｇ」，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．を参照されたい。簡潔に述べると、プロセスは、（ａ）マッシュを調製すること、（ｂ）マッシュを濾過して糖化液を調製すること、及び（ｃ）糖化液を発酵させて、ビールなどの発酵飲料を得ること、を包含する。典型的には、粉砕若しくは破砕麦芽、麦芽及び補助剤、又は補助剤を水と混合し、調節温度下で一定時間保持して、麦芽中に存在する酵素及び／又は補助剤に、麦芽中に存在するデンプンを発酵性糖類に変換させる。次にマッシュをマッシュフィルタに移し、穀物残渣から液体を分離する。この甘い液体は「糖化液」と呼ばれ、残りの穀粒残基は「消費済み穀粒」と呼ばれる。典型的には、マッシュに水を加えて消費済み穀粒から残留可溶抽出物を回収することを含む、マッシュの抽出を行う。次に糖化液を激しく沸騰させて糖化液を滅菌し、色、風味及び匂いの展開を補助する。沸騰中のどこかの時点でホップを加える。糖化液を冷却し、発酵層に移す。
次に、発酵槽内で糖化液を酵母と接触させる。発酵槽を冷却し、発酵を停止させてもよい。凝集し得る酵母は除去する。最後に、ビールを冷却して一定時間貯蔵する。貯蔵中に、ビールが澄明になり、ビールの風味が生じ、ビールの見た目、風味及び貯蔵寿命を損なう可能性のある任意の物質が沈降する。ビールは、通常、約２％〜約１０％ ｖ／ｖのアルコールを含有するものの、高アルコール含量（例えば、１８％ ｖ／ｖ）のビールを得ることもできる。充填前、ビールには炭酸を加え、所望により、濾過及び低温殺菌する。
αアミラーゼを、グルコアミラーゼ（類）（例えば、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体）、プルラナー（類）及び／又はイソアミラーゼ（類）、並びにそれらの任意の組み合わせなどの１種以上の外因性酵素と併せて含む場合が多い（必ずしもそうでなくともよい）醸造組成物は、上記工程（ａ）のマッシュに、即ち、マッシュの調製中に添加されてもよい。代わりに又は加えて、醸造組成物を、マッシュの濾過中などに、上記工程（ｂ）のマッシュに加えることもできる。あるいは、又は加えて、醸造組成物を、糖化液の発酵中などに、上記工程（ｃ）の糖化液に加えることもできる。
個々の実施形態は、上記の使用、方法、又は発酵飲料のいずれかに関し、上記発酵飲料は、フルモルトビール、「ビール純粋令」に従って醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第二のビール）、第三のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽酒、ノンアルコールビール、及びノンアルコール麦芽酒などのビールだけでなく、別の穀草及び麦芽飲料、例えば、果実風味の麦芽飲料（例えば、レモン、オレンジ、ライムなどのシトラス風味、若しくはベリー風味の麦芽飲料）、蒸留酒風味の麦芽飲料（例えば、ウォッカ、ラム、又はテキーラ風味の麦芽酒）、又はコーヒー風味の麦芽飲料（カフェイン風味の麦芽酒など）、及びこれらに類するものである。
９．ヨウ素陽性デンプンの減少
ＡｆＧＡＴＲ及びその変異体は、液化及び／又は糖化方法において使用された場合、ヨウ素陽性デンプン（ＩＰＳ）を減少させ得る。ＩＰＳの供給源の１つは、加水分解を逃れたアミロースに由来し、及び／又はデンプンポリマーの老化に由来する。デンプン分子には、別の分子に結合し、結晶化度を増加させる傾向があるため、時間経過とともに、デンプンの老化はデンプンペースト、又はジェルに自然に生じる。低濃度の溶液は、デンプン分子が積極的により大きな物体へと会合するため、濁度が増加する。沈殿が自然発生した場合、沈殿したデンプンは、その元来の冷水不溶性の状態を取り戻しているように思われる。高濃度のペーストは、冷却によりジェルに変化し、時間経過とともに、デンプン分子の会合が増加することにより着実に堅固さを増す。これは、近接するデンプン分子上のヒドロキシ基間に水素結合が形成される傾向が強くあることから生じる。Ｊ．Ａ．Ｒａｄｌｅｙ，ｅｄ．，ＳＴＡＲＣＨ ＡＮＤ ＩＴＳ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ １９４〜２０１（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９６８））を参照のこと。
糖液中にＩＰＳが存在すると、最終生成物の品質に悪影響が生じ、下流の加工で重要な問題となる。ＩＰＳは濾過系に詰まり又は減速させ、精製に使用される炭素カラムを塞ぐ。ＩＰＳが十分な高濃度に達すると、ＩＰＳは炭素カラムを通過して漏れだし、生産効率を低下させる。加えて貯蔵時に、最終生成物に、最終生成物の品質に望ましくない濁りを生じさせる恐れがある。ＩＰＳの量は、糖化槽を隔離し、内容物を戻し混合することにより減少させることができる。それでも尚、ＩＰＳは、とりわけ炭素カラム及び濾過系に蓄積する。したがって、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の使用は、ＩＰＳの量を減少させることにより全体としてのプロセスの性能を向上させるものと見込まれる。
組成物及び方法、並びにそれらの利点を更に例示するために、後述の具体的な実施例が、これらの実施例が限定的なものではなく例示的なものであるとの理解の下に提供される。
実施例１：ＡｆＧＡ１のクローニング
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａｆ２９３のゲノムＤＮＡは、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ（ＦＧＳＣ Ａ１１００）から購入された。アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）のゲノムを配列決定した。ＮＣＢＩデーターベースで、ＡｆＧＡ１遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００７１９５において開示されているゲノム内）の核酸配列、及びＡｆＧＡ１遺伝子でコードされた予測済みグルカン１，４−α−グルコシダーゼ（ＮＣＢＩ受託番号：ＸＰ＿７４９２０６）のアミノ酸配列を取得した。ＡｆＧＡ１は、ＢＬＡＳＴ検索から決定された他の真菌グルコアミラーゼに対して相同であった。図１を参照されたい。３個のイントロンを含むＡｆＧＡ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号８に示される。
次のプライマー、即ち、プライマー１：ＡｆＧＡ１−Ｆｗ ５’−ＧＣＧ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＡＣＣ ａｔｇｃｃｔｃｇｃｃｔｔｔｃｃｔａｃｇｃ−３’（配列番号９）、及びプライマー２：ＡｆＧＡ１−Ｒｖ ５’−ｃｃ ｇｇｃｇｃｇｃｃｃ ＴＴＡ ｔｃａｃｔｇｃｃａａｇｔａｔｃａｔｔｃｔｃｇ−３’（配列番号１０）を使用して、ＡｆＧＡ１遺伝子をアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）ゲノムＤＮＡから増幅させた。順方向プライマーはＮｏｔＩ制限部位を含み、逆方向プライマーはＡｓｃＩ制限部位を含む。ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩを用いた分解後、ＰＣＲ産物は、同じ制限酵素によって分解される、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７（Ａ１）号に記載されている）にクローニングされ、結果として得られたプラスミドは、ｐＪＧ２２２と標識された。ｐＪＧ２２２のプラスミドマップは、図２に与えられている。ＡｆＧＡ１遺伝子の配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
実施例２：ＡｆＧＡ１ＴＲの発現及び精製
遺伝子銃法（Ｔｅ’ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：３９３〜９９，２００２）を使用して、プラスミドｐＪＧ２２２（Ｔｒｅｘ３ｇＭ−ＡｆＧＡ１）を、４つの遺伝子を欠失させたトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）株（国際公開第０５／００１０３６号に記載）に形質転換させた。形質転換されたコロニー（約５０）は約１週間で出現した。アセトアミドプレートを５日間生育させた後、タンパク質発現のための３０ｍｌのグルコース／セファロース規定培地を含む２５０ｍｌの振盪フラスコに、コロニーを接種した。タンパク質、ＡｆＧＡ１ＴＲを、細胞外培地に分泌させ、酵素の発現を確認するために、濾過した培養培地を使用して、ＤＰ７に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びグルコアミラーゼ活性のアッセイを行った。
その後、安定した株を７Ｌの発酵槽内の規定培地で生育させた。発酵ブロスを遠心分離により収穫した。遠心分離、濾過及び濃縮に続いて、４５０ｍＬの濃縮試料が得られた。試料中の総タンパク質の濃度は、ＢＣＡ方法（タンパク質定量キット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＯ．，Ｌｔｄ））を用いて、８３．７０ｇ／Ｌと値付けされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、総タンパク質の８０％が標的タンパク質であることが示唆された。よって、濃縮試料中の標的タンパク質の濃度は、６６．９６ｇ／Ｌであると推定された。
ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＡｆＧＡ１ＴＲを親和性クロマトグラフィで精製した。βシクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，８５６０８８）をエポキシ活性セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０４８０−０１）にカップリングし、精製に用いた。７Ｌ発酵槽からの濃縮済み発酵ブロス４０ｍＬのｐＨを４．３になるように調整し、２５ｎＭ（ｐＨ ４．３）の酢酸ナトリウム（バッファＡ）で予め平衡化した溶液を、３０ｍＬのβ−ＣＤ−セファロースカラムに充填した。カラムを２カラム体積のバッファＡで洗浄した。標的タンパク質を、バッファＡ及び１０ｍＭのαシクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ４６４２）含有の３カラム体積のバッファＢで溶出させた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより解析し、グルコアミラーゼ活性についてアッセイした。標的タンパク質を含有する画分をプールし、Ｈｉｐｒｅｐ ２６×１０脱塩カラムに流して、βシクロデキストリンを除去した。得られた試料は純度９５％超のものであった。その溶液を濃縮し、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５デバイスを用いて、４０％グリセロール中で−８０℃にて保管した。
実施例３：ＡｆＧＡ１ＴＲ基質特異性の値付け
マルトース、イソマルトース、マルトヘプタオース（ＤＰ７）、マルトデキストリン（ＤＥ４〜ＤＥ１０）、ジャガイモアミロペクチン、及び可溶性デンプンを含む様々な基質に由来するグルコアミラーゼ、ＡｆＧＡ１ＴＲ、ＡｎＧＡ又は野生型ＡｆＧＡを介したグルコースの放出に基づいて、グルコアミラーゼ活性をアッセイした。カップリング済みグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＸ／ＨＲ）法を用い、グルコースの放出速度を測定した（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５（１９８０），３８９〜３９７）。グルコースと反応するカップリング済みＧＯＸ／ＨＲＰ酵素から生成された過酸化物を介した、２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）の酸化の速度として、グルコースを定量した。
１５ｍＬのコニカルチューブで、９ｍＬの各基質（１％水溶液、ｗ／ｗ）、及び１ｍＬ（０．５Ｍ、ｐＨ ５．０）の酢酸ナトリウム緩衝液を混合して、基質溶液を調製した。ＧＯＸ／ＨＲＰを５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）中に溶解し、最終濃度２．７４ｍｇ／ｍＬ ＡＢＴＳ、０．１Ｕ／ｍＬ ＨＲＰ、及び１Ｕ／ｍＬ ＧＯＸにて、ＡＢＴＳを含むカップリング済み酵素（ＧＯＸ／ＨＲＰ）溶液を調製した。
連続希釈のグルコアミラーゼサンプル、ベンチマークＡｎＧＡ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ製、Ｏｐｔｉｄｅｘ Ｌ−４００）、野生型ＡｆＧＡ、及びグルコース標準液もまた、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）で調製した。５０℃で５分間６００ｒｐｍにて事前にインキュベートした９０μＬの基質溶液を含有する新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）に、各グルコアミラーゼサンプル（１０μＬ）を移した。サーモミキサー（Eppendorf）で振盪させながら（６００ｒｐｍ）５０℃で１０分間反応を実施し、１０μＬの反応混合物及び１０μＬの連続希釈のグルコース標準液を新しいマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ９０１７）に、それぞれ速やかに移し、続いて、１００μＬのＡＢＴＳ／ＧＯＸ／ＨＲＰ溶液を加えた。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏプレートリーダー（Molecular Device）で、４０５ｎｍで１１秒間隔にて５分間、反応混合物を含有するマイクロタイタープレートを直ちに測定した。出力を各酵素濃度に対する反応速度Ｖｏとした。直線回帰を用い、酵素用量に対するプロット（Ｖｏ）の勾配を値付けした。下記の式１を用い、グルコース標準曲線に基づいてグルコアミラーゼ活性の比活性を計算した。
比活性（単位／ｍｇ）＝スロープ（酵素）／スロープ（ｓｔｄ）×１００ （１）、
式中、１単位＝１μｍｏｌグルコース／ｍｉｎである。
ＡｆＧＡ１ＴＲ、並びにベンチマークグルコアミラーゼであるＡｎＧＡ及び野生型ＡｆＧＡの、典型的な比活性を、表１に示す。
Figure 2016500267
実施例４：ｐＨがＡｆＧＡ１ＴＲグルコアミラーゼ活性に及ぼす影響
実施例３に記載されているＡＢＴＳアッセイのプロトコールを用いて、ｐＨ（３．０〜１０．０）がＡｆＧＡ１ＴＲ活性に及ぼす影響をモニターした。バッファ使用溶液（Buffer working solutions）は、グリシン／酢酸ナトリウム／ＨＥＰＥＳ（２５０ｎＭ）の混合物からなるもの（ｐＨの変動：３．０〜１０．０）であった。可溶性デンプン（１％水溶液、ｗ／ｗ）を２５０ｍＭバッファ溶液と９：１の比で混合して、基質溶液を調製した。酵素使用溶液を水に一定の用量で溶かして調製した（線形範囲内のシグナルは、用量反応曲線に準ずることを示す）。実施例３においてグルコアミラーゼ活性アッセイに関して記述したように、同じプロトコールに従って、全てのインキュベーションを５０ｏＣにて１０分間行った。各ｐＨにおける酵素活性を、最適なｐＨにおける酵素活性と比較した相対活量としてレポートした。ＡｆＧＡ１ＴＲのｐＨプロファイルを表２及び図３に示す。ＡｆＧＡ１ＴＲは、約５．０にて最適なｐＨを有し、かつｐＨ ３．５〜７．５にて７０％超の最大活性を保持することが見出された。
Figure 2016500267
実施例５：温度がＡｆＧＡ１ＴＲグルコアミラーゼ活性に及ぼす影響
実施例３に記載されているＡＢＴＳアッセイのプロトコールを用いて、温度（４０℃〜８４℃）がＡｆＧＡ１ＴＲ活性に及ぼす影響をモニターした。３．６ｍＬの可溶性デンプン（１％水溶液、ｗ／ｗ）及び０．４ｍＬの０．５Ｍ緩衝液（ｐＨ ５．０の酢酸ナトリウム）を混合して１５ｍＬのコニカルチューブに入れ、基質溶液を調製した。酵素使用溶液を水に一定の用量で溶かして調製した（線形範囲内のシグナルは、用量反応曲線に準ずることを示す）。実施例３のグルコアミラーゼ活性アッセイに関して記述されているのと同じプロトコールに従って、４０℃〜８４℃の温度にてそれぞれ１０分間インキュベーションを行った。各温度における酵素活性を、至適温度における酵素活性と比較した相対活量としてレポートした。ＡｆＧＡ１ＴＲの温度プロファイルを表３及び図４に示す。ＡｆＧＡ１ＴＲは、６８℃の至適温度を有し、５６℃〜７４℃の間で７０％超の最大活性を保持することが見出された。
Figure 2016500267
実施例６：ＡｆＧＡ１ＴＲ生成物プロファイル解析
多糖類の真菌グルコアミラーゼ触媒作用の産物をアッセイするため、グルコアミラーゼ、ＡｎＧＡ（０．１１８ｍｇ／ｇｄｓのデンプン）及びＡｆＧＡ１ＴＲ（０．１１８ｍｇ／ｇｄｓ又は０．０５９ｍｇ／ｇｄｓ）を６０℃、ｐＨ ４．２〜４．５にて３４％ ＤＳのＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（登録商標）Ｓｕｐｒａ液化デンプン（ＣＰＩ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，ＣＡ）で２日間インキュベートした。プルラナーゼ（ＰＵ）、及びアスペルギルス・カワチイ（Aspergillus kawachii）、ＧＣ６２６（登録商標）（ＡｋＡＡ）由来の酸安定性αアミラーゼ（それぞれ０．２５６ＡＳＰＵ／ｇｄｓ、及び０．３５ＳＳＵ／ｇｄｓ）を、精製ＡｆＧＡ１ＴＲと共に投与した。試料をそれぞれ異なる時間間隔で採取し、ＨＰＬＣで糖組成物の解析を行った。
表４は、１００％及び５０％濃度のＡｎＧＡにてＡｎＧＡ／ＰＵ／ＡｋＡＡ及びＡｆＧＡ１ＴＲ／ＰＵ／ＡｋＡＡにより糖化されたオリゴ糖のプロファイルを示す。（図６は、１００％、５０％及び４０％濃度のＡｎＧＡ、ＰＵ及びＡｋＡＡ有り又は無しでＡｎＧＡ及びＡｆＧＡ１ＴＲにより糖化されたオリゴ糖のプロファイルを示す。）ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３及びＨＳを含むオリゴ糖のみを示してある。表４中の数字には、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３、及びＨＳの総量の分率としての各ＤＰｎの重量パーセントが反映されている。
Figure 2016500267
表４は、等しいタンパク質用量において、ＡｆＧＡ１ＴＲは２４時間でＤＰ１が９５．５％を超過したのに対して、ＡｎＧＡは４８．５時間を要したことを、比較対照して示している。表４中のデーターから判るように、タンパク質を基準とした５０％の用量等量にて（補助酵素用量が同一であるという条件下で）ＡｆＧＡ１ＴＲによる性能改善がＡｎＧＡを凌いだことが実証された。
実施例７：ＤＰ２レベルの比較
ＡｆＧＡ１ＴＲで処理された液化デンプンのＤＰ２レベルを、同じＤＰ１レベル（９６％）を基準に、ＧＡで処理された液化デンプンのＤＰ２レベルと比較した。比較により、同等なＤＰ１レベルにておよそ０．２％だけ、ＤＰ２レベルが統計的に有意に低減したことが判った。この理由としては、グルコアミラーゼ用量の低減が考えられる。イオンクロマトグラフィによりイソマルトース／マルトース比を計算して、（トリプルブレンドとしての）ＡｎＧＡ及びＡｆＧＡ１ＴＲによる転換反応を測定した。
Figure 2016500267
表５は、イソマルトース：マルトース比の増大につれて、両方のグルコアミラーゼについてイソマルトースが経時的に累積したことを示す。一方、ＡｆＧＡ１ＴＲ有りの場合に、４８時間〜７０時間の間でＡｎＧＡ及びＡｆＧＡ１ＴＲの比の差が増大したため、イソマルトースの形成が僅かに抑制されるように思われた。このことは、ＡｆＧＡ１ＴＲによる転換反応の抑制の裏付けとなり得る。
実施例８：ＡｋＡＡの滴定
可変用量の付属αアミラーゼを用いて多糖類の真菌グルコアミラーゼ触媒作用の製品をアッセイするため、ＡｆＧＡ１ＴＲ（０．０５９ｍｇ／ｇｄｓ）及びプルラナーゼ（ＰＵ、ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）Ｌ−１０００）（０．２５６ＡＳＰＵ／ｇｄｓ）を様々な濃度の酸安定性αアミラーゼ、アスペルギルス・カワチイ（Aspergillus kawachii）由来のＧＣ６２６（登録商標）（ＡｋＡＡ）でインキュベートした。６０℃でｐＨ ４．５にてＡｋＡＡを（０〜０．３ＳＳＵ／ｄｓ、増分；０．１ＳＳＵ、３４％ ＤＳのＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（登録商標）Ｓｕｐｒａ液化デンプン（ＣＰＩ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ，ＣＡ））２日間加えた。プルラナーゼ（ＰＵ）及びＧＣ６２６（登録商標）（ＡｋＡＡ）をそれぞれ０．２５６ＡＳＰＵ／ｇｄｓ及び０．３５ＳＳＵ／ｇｄｓにて、精製ＡｆＧＡ１ＴＲと共に投与した。試料をそれぞれ異なる時間間隔で採取し、ＨＰＬＣで糖組成物の解析を行った。
表６及び図７は、ＡｆＧＡ１ＴＲ、ＰＵ及び可変用量のＡｋＡＡにより糖化されたオリゴ糖のプロファイルを開示している。ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３及びＨＳを含むオリゴ糖のみを示してある。表６中の数字には、ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３、及びＨＳの総量の分率としての各ＤＰｎの重量パーセントが反映されている。
Figure 2016500267
表６は、ＡｆＧＡ１ＴＲが少なくとも０．１ＳＳＵ／ｇｄｓの存在下にて４５時間で９６％超のＤＰ１に達し得るのに対して、ＡｋＡＡが欠如した場合は結果として統計的に有意に糖化速度が低減することを示す。結果は、ＡｆＧＡ１ＴＲによる酵素液化デンプンの糖化中にＡｋＡＡを添加したことにより、最終的なグルコース収率の有意な増加が達成されたことを示す。
実施例９：αアミラーゼ、ＡｆＧＡ１ＴＲ及びプルラナーゼ含有の酵素ブレンドによる、粒状デンプンの可溶化及び加水分解
乾燥固形分３５％のデンプンを蒸留水に溶かした粒状コーンのデンプンスラリーを調製し、ＮａＯＨを用い、ｐＨをｐＨ ５．０になるように調整した。１０ＡＡＵ／ｇｄｓのαアミラーゼ（ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡ）及びＡｆＧＡ１ＴＲの精製タンパク質を０．０４７ｍｇ／ｇｄｓにて０．１５ＡＳＰＵ／ｇｄｓのプルラナーゼ（ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）Ｌ−１０００）と共にデンプンスラリーに添加した。次いで、デンプンスラリーを６０℃に維持した水浴中に保持し、絶えず撹拌した。アリコートをそれぞれ別の時間間隔で回収して遠心分離させた。清澄な上清を屈折率（ＲＩ）に用いて可溶化率を計算し、ＨＰＬＣで糖組成物の解析を行った。
Figure 2016500267
表７は、αアミラーゼ及びＰＵの存在下にて粒状デンプンを用いることにより、ＡｆＧＡ１ＴＲが６８時間で９５．５％超のＤＰ１に達し得たこと、かつ粒状デンプンの可溶化率が８６％超であったことを示している。
実施例１０：残存αアミラーゼ活性がＤＰ３レベルに及ぼす影響
０．０６６ＫＧ／ＭＴｄｓのＬＩＱＵＯＺＹＭＥ（登録商標）Ｓｕｐｒａ（ＮＺ）をα殺菌済みデンプン液化物に添加し直してＡｆＧＡ１ＴＲを用いた場合の、ｐＨ（５．５）のみの影響、並びにｐＨ ４．５において残存αアミラーゼ活性がＤＰ１及びＤＰ３の両方に及ぼす影響を解析した。０．０６６ｍｇ／ｇｄｓのＡｆＧＡ１ＴＲを、０．２５ＡＳＰＵ／ｇｄｓのＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）Ｌ−１０００（プルラナーゼ）及び０．１ＳＳ Ｕ／ｇｄｓのＡｋＡＡと混ぜ合わせた。表８及び図５は、ＡｆＧＡ１ＴＲ及びＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）４０６０ＶＨＰ（ＡｎＧＡ／プルラナーゼブレンド）により糖化されたオリゴ糖のプロファイルを開示したものである。
Figure 2016500267
ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）Ｌ−１０００に対して、ＡｆＧＡ１ＴＲトリプルブレンドは、ｐＨがおそらく不利であったため、ｐＨ ４．５の場合と比べてｐＨ ５．５にて糖化速度の有意な減失を示した一方、４８時間で９５．５％超のＤＰ１を得ることができた。ＡｆＧＡ１ＴＲ及びＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）４０６０ＶＨＰの両方は残存αアミラーゼ活性によるマイナスの影響をやや受けたが、ＤＰ３が増加したため、予期されたようにグルコース収率が最大限に高まった。αアミラーゼ殺菌液化物の事例において、ＡｆＧＡ１ＴＲは、ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）４０６０ＶＨＰよりもＤＰ３を０，１％だけ有意に低減させた。αアミラーゼ活性液化物を含むＡｆＧＡ１ＴＲのレベルは、「α殺菌済み」液化物を含むＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）４０６０ＶＨＰの１つと同レベルに低かった。
実施例１１：ＡｆＧＡ１ＴＲと野生型アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）のグルコアミラーゼとの比較
デンプン液化物を水で希釈し、乾燥固形分３４％になるように調製して、２種類のグルコアミラーゼ、即ち、１）ＡｆＧＡ１ＴＲ（０．０６７ｍｇ／ｇｄｓのデンプン）、及び２）（アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）において発現された）野生型ＡｆＧＡの精製タンパク質ＧＬＵＣＯＴＥＡＭ ＤＢ（Ｎａｇａｓｅ Ｃｏ．＆ Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ製）０．０６５ｍｇ／ｇｄｓを用い、ｐＨ ４．４かつ６０℃にて糖化を行った。加えて、プルラナーゼ（ＰＵ）、及び酸安定性αアミラーゼであるＧＣ６２６（登録商標）（ＡｋＡＡ）をそれぞれ、各グルコアミラーゼと共に０．１４ＡＳＰＵ／ｇｄｓ及び０．９ＳＳＵ／ｇｄｓにて投与した。試料をそれぞれ異なる時間間隔で採取し、ＨＰＬＣで糖組成物の解析を行った。
表９は、ＡｆＧＡ１ＴＲによりＤＰ１が４８時間で９５．５％を超過したのに対して、商用アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）による糖化所要時間が長くなったことを示している。両方のグルコアミラーゼにより、ＤＰ１を９６％超にし、ＤＰ２を３％未満に到達させることができた。
Figure 2016500267
実施例１２：αアミラーゼ、プルラナーゼ及びアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）ＧＡ含有の酵素配合物による、粒状デンプンの可溶化及び加水分解
典型的な実施例において、乾燥固形分３５％のデンプンを蒸留水に溶かした粒状コーンのデンプンスラリーを調製し、水酸化ナトリウムを用い、ｐＨをｐＨ ５．０になるように調整した。１０ＡＡＵ／ｇｄｓのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡ、及びＡｆＧＡ１ＴＲ又は野生型アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）ＧＡ（ＡｆＧＡ）の精製タンパク質ＧＬＵＣＯＴＥＡＭ ＤＢ（Ｎａｇａｓｅ Ｃｏ．＆ Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ製）を、０．１５ＡＳＰＵ／ｇｄｓのＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）Ｌ−１０００と共にデンプンスラリーに添加した。次いで、デンプンスラリーを６０℃に維持した水浴中に保持し、絶えず撹拌した。アリコートをそれぞれ別の時間間隔で回収して遠心分離させた。清澄な上清を屈折率（ＲＩ）に用いて可溶化率を計算し、ＨＰＬＣで糖組成物の解析を行った。表１０は、αアミラーゼ及びＰＵの存在下にて粒状デンプンを用いた場合に、両方のアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）のグルコアミラーゼが６８時間でＤＰ１を９５．５％超に到達させ得、かつ粒状デンプンの可溶化率が８６％超であったことを示している。
Figure 2016500267
実施例１３：ＡｆＧＡ２ＴＲの発現及び精製
ＡｆＧＡ２遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列ＤＳ４９９５９５の１４５３８２〜１４７４４１）用の核酸配列をアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３から採取し、ＡｆＧＡ２遺伝子でコードされた仮定タンパク質のアミノ酸配列をＮＣＢＩデーターベース（ＮＣＢＩ受託番号：ＥＤＰ５３７３４）で検索した。アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）Ａ１１６３由来のＡｆＧＡ２遺伝子のヌクレオチド配列を最適化して、Ｇｅｎｅｒａｙにより合成した（Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）。
ＡｆＧＡ２のＤＮＡ配列をトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）における発現のために最適化し、次いで、Ｇｅｎｅｒａｙにより合成し、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクターに挿入して（米国特許出願第２０１１／０１３６１９７ Ａ１号に記載されている）（Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）、結果としてｐＪＧ３１３を得た（図９）。
遺伝子銃法（Ｔｅ’ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５１：３９３〜９９，２００２）を使用して、プラスミドｐＪＧ３１３を、４つの遺伝子を欠失させたトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）株（国際公開第０５／００１０３６号に記載）に形質転換させた。形質転換体を、アセトアミドを唯一の窒素源として含む培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ ４．２５）上で選択した。形質転換されたコロニー（約５０〜１００）は約１週間で出現した。アセトアミドプレート上で生育した後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレート上での生育の５日後、安定したモルホロジーを呈する形質転換体を９６ウェルのマイクロタイタープレートで２００μＬグルコース／ソホロース規定培地中に接種した。マイクロタイタープレートを酸素グロースチャンバ内で２８℃にて５日間インキュベートした。これらの培養の上清を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析でタンパク質の発現を確認して、酵素活性のアッセイを行った。その後、６０％グルコース−ソホロースフィードを含有する７Ｌ発酵槽の規定培地内で、安定した株を生育させた。（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ、ＰＩＰＰＳバッファ３３ｇ、カザミノ酸９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４．５ｇ、ＣａＣｌ２（無水）１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇからなるグルコース／ソホロース規定培地（１リットル当たり）を、５０％ ＮａＯＨとＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏで９６６．５ｍＬにし、ｐＨを５．５になるように調整した。消毒後に添加した内容は以下の通りである：２６ｍＬの６０％グルコース／セファロース、及び４００×Ｔ．レーシ（T. reesei）微量金属２．５ｍＬ。
タンパク質ＡｆＧＡ２ＴＲを２つのクロマトグラフィ工程で精製した。硫酸アンモニウムの最終濃度が１Ｍに達するまで、硫酸アンモニウムを６００ｍＬの発酵ブロスに加えた。１Ｍ硫酸アンモニウム（バッファＡ）含有の２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）で予め平衡化した５０ｍＬの疎水性相互作用クロマトグラフィフェニルＨＰカラムに試料を充填した。カラムを１〜０Ｍ硫酸アンモニウムからの直線的塩濃度勾配を用いて洗浄した。活性溜分をプールして、親和性クロマトグラフィに適用した。疎水性相互作用クロマトグラフィ後の試料を、２５ｍＭ ｐＨ ４．３酢酸ナトリウム緩衝液（バッファＢ）に交換し、バッファＢで予め平衡化させておいたβシクロデキストリンカップリング済みセファロース６Ｂカラムに充填した。標的タンパク質を、２５ｍＭ（ｐＨ ４．３）の酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのαシクロデキストリン（バッファＣ）で溶出させた。その溶出物を、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５デバイスを用いて濃縮させた。最終生成物は９８％を超える純度であり、更なる研究のため、−８０℃の４０％グリセロール中に保管した。
実施例１４：ＡｆＧＡ２ＴＲのグルコアミラーゼ活性
ＡｆＧＡ２ＴＲは、グリコシル加水分解酵素１５ファミリー（ＧＨ１５．ＣＡＺｙ番号）に属する。１％ ｗ／ｗの可溶性デンプン（Ｓｉｇｍａ Ｓ９７６５）を基質として用い、ＡｆＧＡ２ＴＲのグルコアミラーゼ活性を測定した。５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ５．０）で５０℃にて１０分間アッセイを行った。実施例３に開示されているグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＸ／ＨＲＰ）テクニックを用いて、グルコースの放出速度を測定した。過剰なカップリング済みＧＯＸ／ＨＲＰ酵素を介して、グルコースを２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）の酸化速度として定量した。グルコース標準曲線に基づいて酵素活性を計算した。このアッセイにおいて、１グルコアミラーゼ単位は、アッセイの条件下にて１分につき１μｍｏｌのグルコースを生成するのに必要とされる酵素の量として定義される。上記の方法を用いて、精製ＡｆＧＡ２ＴＲの可溶性デンプンに対する比活性を２１４単位／ｍｇとして値付けした。
実施例１５：ＡｆＧＡ２ＴＲのｐＨプロファイル
実施例３に記載されているＡＢＴＳアッセイのプロトコールに従って、ｐＨ（３．０〜１０．０）がＡｆＧＡ２ＴＲ活性に及ぼす影響をモニターした。バッファ使用溶液は、グリシン／酢酸ナトリウム／ＨＥＰＥＳ（２５０ｎＭ）の混合物からなるもの（ｐＨの変動：３．０〜１０．０）であった。可溶性デンプン（１％水溶液、ｗ／ｗ）を２５０ｍＭバッファ溶液と９：１の比で混合して、基質溶液を調製した。酵素使用溶液を水に一定の用量で溶かして調製した（線形範囲内のシグナルは、用量反応曲線に準ずることを示す）。実施例３においてグルコアミラーゼ活性アッセイに関して記述したように、同じプロトコールを用い、全てのインキュベーションを５０℃にて１０分間行った。各ｐＨにおける酵素活性を、最適なｐＨにおける酵素活性に対する相対活量としてレポートした。ＡｆＧＡ２ＴＲのｐＨプロファイルは、図１０に示してある。ＡｆＧＡ２ＴＲは、約５．３にて最適なｐＨを有し、３．３〜７．３で７０％超という最大活性を保持することが見出された。
実施例１６：ｆＡｆＧＡ２ＴＲの温度プロファイル
実施例３に記載されているＡＢＴＳアッセイのプロトコールに従って、温度（４０℃〜８４℃）がＡｆＧＡ２ＴＲ活性に及ぼす影響をモニターした。９ｍＬの可溶性デンプン（１％水溶液、ｗ／ｗ）及び１ｍＬの０．５Ｍ緩衝液（ｐＨ ５．０の酢酸ナトリウム）を混合して１５ｍＬのコニカルチューブに入れ、基質溶液を調製した。酵素使用溶液を水に一定の用量で溶かして調製した（線形範囲内のシグナルは、用量反応曲線に準ずることを示す）。インキュベーションを温度４０℃〜８４℃にてそれぞれ１０分間行った。インキュベーション後に、実施例３にグルコアミラーゼ活性アッセイに関して記述されているのと同じプロトコールに従って、活性を値付けした。活性を至適温度での酵素活性に対する相対活量としてレポートした。ＡｆＧＡ２ＴＲの温度プロファイルは、図１１に示してある。ＡｆＧＡ２ＴＲは、６９℃の至適温度を有し、６１℃〜７４℃の間で７０％超の最大活性を保持することが見出された。
実施例１７：ＡｆＧＡ２ＴＲの熱安定性
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ５．０）中のＡｆＧＡ２ＴＲの熱安定性を値付けした。酵素を基質への添加に先立って所望される温度にてＰＣＲマシンで２時間インキュベートした。実施例３に記載されているようにして、試料の残存活性を測定した。氷上に保持された試料の活性を１００％の活性として定義した。図１２に示すように、２時間のインキュベーション期間中にＡｆＧＡ２ＴＲは６３℃未満の温度にて５０％を超える活性を保持した。
実施例１８：ＡｆＧＡ１ＴＲとＡｆＧＡ２ＴＲとの比較
デンプン液化物を水で希釈して、乾燥固形分３４％になるように調製し、２種類のグルコアミラーゼ；１）ＡｆＧＡ１ＴＲ（０．０６ｍｇ／ｇｄｓ）のデンプン、及び２）ｐＨ ４．４かつ６０℃にてＡｆＧＡ２ＴＲ（０．０６ｍｇ／ｇｄｓ）の精製タンパク質を使用して糖化を行った。加えて、グルコースの生成を増強するため、プルラナーゼ（ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）Ｌ−１０００）及び酸安定性αアミラーゼ、ＧＣ６２６（登録商標）（ＡｓＡＡ）０．１４ＡＳＰＵ／ｇｄｓ及び０．９ＳＳＵ／ｇｄｓをそれぞれ、各グルコアミラーゼと共に投与した。試料をそれぞれ異なる時間間隔で採取し、ＨＰＬＣで糖組成物の解析を行った。
Figure 2016500267
表１１は、両方のグルコアミラーゼにより、４８時間でＤＰ１が９５．５％超になり、ＡｆＧＡ２ＴＲを用いて糖化速度が僅かに上昇したことを示す。
組成物、製造方法及び使用方法を、上記の例を参照しながら詳述してきたが、理解されるように、本趣旨から逸脱することなしにこれらの組成物及び方法に対し修正を施すことが可能であり、このことは当業者に容易に把握されるであろう。
本出願に関して引用されている全ての特許及び公報は、全ての目的に合わせて、その全体が本明細書において参照より援用されている。
配列表
配列番号１−ＡｆＧＡ１前駆体
Figure 2016500267
配列番号２−ＡｆＧＡ２前駆体
Figure 2016500267
配列番号３−Ｎｆ＿ＮＲＲＬ＿１８１＿ＧＡ
Figure 2016500267
配列番号４−Ｔｓ＿ＡＴＣＣ０＿１０５００＿ＧＡ
Figure 2016500267
配列番号５−Ｐｍ＿ＡＴＣＣ＿１８２２４＿ＧＡ
Figure 2016500267
配列番号６−Ａｎ＿ＦＧＳＣ＿Ａ４＿ＧＡ
Figure 2016500267
配列番号７−ＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２ ＣＢＭ
Figure 2016500267
配列番号８−ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｆＧＡ１のＡｆＧＡ１遺伝子
Figure 2016500267
配列番号９−ＡｆＧＡ１
Figure 2016500267
配列番号１０−ＡｆＧＡ１
Figure 2016500267
配列番号１１−ＡｆＧＡ１及びＡｆＧＡ２シグナルペプチド
Figure 2016500267
配列番号１２−ＡｆＧＡ１成熟形態
Figure 2016500267
配列番号１３−ＡｆＧＡ２成熟形態
Figure 2016500267
配列番号１４−ｐＴｒｅｘ３ｇＭ−ＡｆＧＡ２のＡｆＧＡ２遺伝子
Figure 2016500267

Claims (74)

  1. 配列番号１２又は１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞であって、前記トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞が、同一の条件下で前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と同じアミノ酸配列を有するＡｆＧＡ又はその変異体を発現するアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）宿主細胞と同等のレベルにて、前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する、組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞。
  2. 配列番号１２又は１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現する組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞であって、前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と同じアミノ酸配列を有するＡｆＧＡ又はその変異体よりも熱安定性に優れ、かつ前記ＡｆＧＡ又はその変異体がＡ．フミガタス（A. fumigatus）宿主細胞において発現される、組み換えトリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞。
  3. （ａ）配列番号１２又は１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を発現するＴ．レーシ（T. reesei）宿主細胞を提供する工程と、
    （ｂ）前記組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の生成を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する工程と、
    を含む、組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を生成するための方法であって、前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と同じアミノ酸配列を有するＡｆＧＡ又はその変異体よりも熱安定性に優れ、かつ前記ＡｆＧＡ又はその変異体がＡ．フミガタス（A. fumigatus）宿主細胞において発現される、組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の生成方法。
  4. 請求項１若しくは請求項２に記載の宿主細胞、又は請求項３に記載の方法により生成される組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  5. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が７４℃でｐＨ ５．０にて１０分間にわたって少なくとも７０％の活性を有する、請求項４に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  6. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体がＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体である、請求項５に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  7. 前記ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体が、５５℃〜７４℃の温度範囲でｐＨ ５．０にて１０分間にわたって少なくとも７０％の活性を有する、請求項６に記載の組み換えＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体。
  8. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の至適温度が約６８℃である、請求項７に記載の組み換えＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体。
  9. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体がＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体である、請求項５に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  10. 前記ＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体が、６１℃〜７４℃の温度範囲でｐＨ ５．０にて１０分間にわたって少なくとも７０％の活性を有する、請求項９に記載の組み換えＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体。
  11. 前記ＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体の至適温度が約６９℃である、請求項１０に記載の組み換えＡｆＧＡ２ＴＲ又はその変異体。
  12. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、配列番号１２に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  13. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が配列番号１２を含む、請求項１２に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  14. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、配列番号１２に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  15. 前記ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体が配列番号１２からなる、請求項１４に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  16. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、配列番号１３に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４〜５及び９〜１１のいずれか一項に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  17. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が配列番号１３を含む、請求項１６に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  18. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、配列番号１３に対して少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項４〜５及び９〜１１のいずれか一項に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  19. 前記ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体が配列番号１３からなる、請求項１８に記載の組み換えＡｆＧＡＴＲ又はその変異体。
  20. デンプンを含む組成物を糖化して、グルコースを含む組成物を生成する方法であって、前記方法が、
    （ｉ）請求項４〜１９のいずれか一項に記載の単離されたＡｆＧＡＴＲ又はその変異体をデンプン組成物と接触させる工程と、
    （ｉｉ）前記デンプン組成物を糖化して前記グルコース組成物を生成する工程と、を含み、前記ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体が、デンプンを含む組成物からグルコースを含む組成物への糖化を触媒する、方法。
  21. グルコースを含む前記組成物が、同一の条件下で２４時間の糖化後にＡｎＧＡにより生成されたＤＰ１を含む第２の組成物と比較してＤＰ１が富化される、請求項２０に記載の方法。
  22. グルコースを含む前記組成物が、同一の条件下で野生型ＡｆＧＡにより生成されたＤＰ１を含む第２の組成物と比較してＤＰ１が富化される、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体がＡｆＧＡＴＲ２であり、グルコースを含む前記組成物が、同一の条件下でＡｆＧＡ１ＴＲにより生成されたＤＰ１を含む第２の組成物と比較してＤＰ１が富化され得る、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記ＡｆＧＡ１ＴＲ又はその変異体が、同一の条件下でＡｎＧＡの約４０％〜５０％の用量にて糖化の２４時間後に同じＤＰ１生産量を生ずる、請求項２０に記載の方法。
  25. デンプンを含む前記組成物が、液化デンプン、糊化デンプン、又は粒状デンプンを含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 約３０℃〜約６５℃の温度範囲で糖化が行われる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記温度範囲が４７℃〜６０℃である、請求項２６に記載の方法。
  28. ｐＨ ２．０〜ｐＨ ６．０のｐＨ範囲で糖化が行われる、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ｐＨ範囲がｐＨ ３．５〜ｐＨ ５．５である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ｐＨ範囲がｐＨ ４．０〜ｐＨ ５．０である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記方法がデンプン組成物をαアミラーゼに接触させる工程を更に含む、請求項２０〜３０いずれか一項に記載の方法。
  32. 前記αアミラーゼがＡｋＡＡである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記方法がデンプン組成物をプルラナーゼに接触させる工程を更に含む、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記グルコース組成物を発酵させて発酵最終（ＥＯＦ）産物を生成することを更に含む、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記発酵が同時糖化発酵（ＳＳＦ）反応である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記発酵が、ｐＨ ２〜８、２５℃〜７０℃の温度範囲で２４〜７０時間実施される、請求項３４又は３５に記載の方法。
  37. 前記ＥＯＦ産物がエタノールを含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ＥＯＦ産物が８％〜１８％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記方法が、マッシュ及び／又は糖化液を、プルラナーゼ、αアミラーゼ及び前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と接触させることを更に含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記方法が、
    （ａ）マッシュを調製する工程と、
    （ｂ）前記マッシュを濾過して糖化液を得る工程と、
    （ｃ）前記糖化液を発酵させて発酵飲料を得る工程と、
    を更に含み、前記プルラナーゼ、前記αアミラーゼ及び前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が
    （ｉ）工程（ａ）の前記マッシュ及び／又は
    （ｉｉ）工程（ｂ）の前記糖化液及び／又は
    （ｉｉｉ）工程（ｃ）の前記糖化液
    に添加される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＥＯＦ産物が代謝産物を含む、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記代謝産物が、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコδ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、ω ３脂肪酸、ブタノール、アミノ酸、リジン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、又はイソプレンである、請求項４１に記載の方法。
  43. 付加的なグルコアミラーゼ、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、βアミラーゼ、付加的なαアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、酸化還元酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、αグルコシダーゼ、βグルコシダーゼ、リアーゼ、加水分解酵素、又はこれらの組み合わせを前記デンプン組成物に添加することを更に含む、請求項２０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を０，１〜２グルコアミラーゼ単位（ＧＡＵ）／ｇｄｓの用量にて添加する工程を含む、請求項２０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が約４９．５μｇタンパク質／ｇ固形分の用量にて添加される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記単離されたＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、前記トリコデルマ・レーシ（Trichoderma reesei）宿主細胞により分泌される、請求項２０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記宿主細胞がαアミラーゼを更に発現し、かつ分泌する、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記宿主細胞がプルラナーゼを更に発現し、かつ分泌する、請求項４７に記載の方法。
  49. デンプンを含む前記組成物を前記宿主細胞と接触させる、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 請求項２０〜４９のいずれか一項に記載の方法により生成されたグルコースを含む、組成物。
  51. 請求項３４〜４９のいずれか一項に記載の方法により生成される、液化デンプン。
  52. 請求項２０〜４９のいずれか一項に記載の方法により生産される、発酵飲料。
  53. 請求項４〜１９のいずれか一項に記載の単離されたＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含有してなる、デンプンを含む組成物の糖化に用いるための組成物。
  54. 前記組成物が培養細胞物質である、請求項５３に記載の組成物。
  55. 前記組成物がαアミラーゼを更に含む、請求項５３又は５４に記載の組成物。
  56. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が精製される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が、前記宿主細胞によって分泌される、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. グルコースを含む組成物の生成における、請求項４〜１９のいずれか一項に記載の、前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の使用。
  59. 前記液化デンプンの生成における、請求項４〜１９のいずれか一項に記載の、前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の使用。
  60. 前記発酵飲料の生成における、請求項４〜１９のいずれか一項に記載の、前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の使用。
  61. 発酵飲料又は発酵最終産物が、
    ｉ）フルモルトビール、「ビール純粋令」に従って醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第二のビール）、第三のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽酒、ノンアルコールビール、及びノンアルコール麦芽酒からなる群から選択されるビールと、
    ｉｉ）果物風味の麦芽飲料、酒風味の麦芽飲料、及びコーヒー風味の麦芽飲料からなる群から選択されるシリアル飲料又は麦芽飲料と、
    からなる群から選択される、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法、請求項５２に記載の発酵飲料、又は請求項６０に記載の使用。
  62. （ｉ）１種以上の食品原料と、
    （ｉｉ）請求項４〜１９に記載の単離されたＡｆＧＡＴＲ又はその変異体と、
    を混合する工程を含み、前記食品原料中に存在するデンプン成分の前記加水分解を前記プルラナーゼ及び前記単離されたＡｆＧＡＴＲ又はその変異体が触媒してグルコースを生成する、食品組成物の生産方法。
  63. 前記食品組成物が、食品製品、焼成用組成物、食品添加物、動物性食品製品、飼料製品、飼料添加物、油、肉、及びラードからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記１種以上の食品原料が焼成原料又は添加剤を含む、請求項６２又は６３に記載の方法。
  65. 前記１種以上の食品原料が、穀粉、老化防止アミラーゼ、ホスホリパーゼ、リン脂質、マルトース生成αアミラーゼ、又はマルトース生成αアミラーゼ活性を有するその変異体、相同体、若しくは突然変異体、ベーカリー用キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、及びリパーゼからなる群から選択される、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記１種以上の食品原料が、
    （ｉ）バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のマルトース生成αアミラーゼ、
    （ｉｉ）バチルス（Bacillus）、アスペルギルス（Aspergillus）、サーモミセス（Thermomyces）、又はトリコデルマ（Trichoderma）由来のパン用キシラナーゼ、
    （ｉｉｉ）フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）由来のグリコリパーゼ、
    からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記食品組成物が、練り粉又は練り粉製品、好ましくは加工された練り粉製品を含む、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記食品組成物を焼成して焼成食品を生産する工程を含む、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記方法が
    （ｉ）デンプン基質を提供する工程と、
    （ｉｉ）前記デンプン基質に前記プルラナーゼ及び前記ＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を加える工程と、
    （ｉｉｉ）焼成食品の生産工程（ｂ）の間に又はその後に前記デンプン基質に熱を加える工程と、
    を更に含む、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  70. 請求項４〜１９のいずれか一項に記載のＡｆＧＡＴＲ又はその変異体を含む、食品組成物の生成に使用する組成物。
  71. 食品組成物の調製における、請求項４〜１９のいずれか一項に記載のＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の使用。
  72. 前記食品組成物が、練り粉又は練り粉製品、好ましくは加工された練り粉製品を含む、請求項７１に記載の使用。
  73. 前記食品組成物がベーカリー組成物である、請求項７１又は７２に記載の使用。
  74. 前記練り粉製品の劣化、好ましくは有害な老化を遅延又は軽減するための、練り粉製品における請求項４〜１９のいずれか一項に記載のＡｆＧＡＴＲ又はその変異体の使用。
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