CN104870631A - 表达来自烟曲霉的葡糖淀粉酶的里氏木霉宿主细胞和其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了在里氏木霉宿主细胞中表达的来自烟曲霉的真菌葡糖淀粉酶(AfGATR)。里氏木霉宿主细胞相比于天然表达的AfGA烟曲霉以更高或至少相当的水平表达AfGATR。AfGATR(包括AfGA1TR和AfGA2TR)在高温和低pH下表现出高活性，所以AfGATR在存在α-淀粉酶如白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶(AkAA)的情况下可有效地应用于糖化工艺中。与在烟曲霉中表达的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶(AnGA)或天然AfGA催化的糖化产物相比，AfGATR有利地催化淀粉糖化为显著富集DP1(即，葡萄糖)的低聚糖组合物。AfGATR如AfGA1TR、AfGA2TR或其变体能够以比AnGA和天然表达的AfGA低的剂量使用，以生成相当水平的葡萄糖。

Description

表达来自烟曲霉的葡糖淀粉酶的里氏木霉宿主细胞和其使用方法

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求2012年12月11日提交的国际专利申请no.PCT/CN2012/086349的优先权，并且其以引用方式整体并入本文。

附件是包括SEQ ID NO:1-14的序列表，其以引用方式整体并入本文。

技术领域

本发明提供表达来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的葡糖淀粉酶(AfGATR)或其变体的里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主细胞，和其使用方法。

背景技术

淀粉由直链淀粉(15-30％重量/重量)和支链淀粉(70-85％重量/重量)的混合物组成。直链淀粉由α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量(MW)为约60,000至约800,000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α-1,6分支点的支链聚合物；其MW可能高达100,000,000。

得自淀粉的、以浓缩右旋糖浆形式存在的糖目前通过酶催化法制备，所述方法涉及：(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化(或降低粘度)成平均聚合度为约7-10的糊精，以及(2)用葡糖淀粉酶(也称为淀粉葡糖苷酶或GA)将所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖浆也可用微生物(如酵母)发酵以产生商品，包括例如乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一钠、葡糖酸盐、赖氨酸、其他有机酸、其他氨基酸和其他生化物质。可同时进行发酵和糖化(即SSF工艺)来实现更大的经济性和效率。

葡糖淀粉酶(葡聚糖1,4-α-葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是水解淀粉的外切碳水化合物分解酶，其催化从淀粉或者相关低聚糖和多糖分子的非还原端去除连续的葡萄糖单元。葡糖淀粉酶可以水解淀粉(例如，直链淀粉和支链淀粉)的直链和支链糖苷键。另一方面，α-淀粉酶通过随机裂解内部的α-1,4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关的多糖。葡糖淀粉酶已被用于各种不同的目的，包括淀粉糖化、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵工艺的原料的生产以及用于动物饲料中来增加可消化率。

葡糖淀粉酶由细菌、真菌和植物的许多菌株产生。例如，葡糖淀粉酶由烟曲霉菌株产生。Luo等人，(2008)，“Production of acid proof rawstarch-digesting glucoamylase from a newly isolated strain of Aspergillusfumigatus MS-09”(“从烟曲霉MS-09的新分离菌株产生耐酸生淀粉消化的葡糖淀粉酶”)，Sci.Tech.Food Indus.(《食品工业科技》)，29(5):151-154；Sellars等人，(1976)，“Degradation of barley by Aspergillusfumigatus Fres”(“利用烟曲霉Fres使大麦降解”)，Proc.Int.Biodegradation Symp.(《国际生物降解研讨会会刊》)，第3版，S.J.Miles等人编辑，Appl.Sci.(《应用科学》)，Barking,UK(英国巴金)，第635-43页；Domingues等人，(1993)，“Production of amylase by soilfungi and partial biochemical characterization of amylase of a selected strain(Aspergillus fumigatus Fresenius)”(“通过所选菌株(烟曲霉)的淀粉酶的土壤真菌和部分生物化学表征来产生淀粉酶”)，Can.J.Microbiol.(《加拿大微生物学杂志》)，39(7):681-85；Cherry等人，(2004)，“Extracellular glucoamylase from the isolate Aspergillus fumigatus”(“来自分离烟曲霉的细胞外葡糖淀粉酶”)，Pakistan J.Biol.Sci.(《巴基斯坦生物科学杂志》)，7(11):1988-92。然而，烟曲霉对于人类和植物具高度过敏性和致病性。因此，对于在制造人类消费产品的工业方法中使用的葡糖淀粉酶而言，烟曲霉并非可行的生产宿主。有必要从合适的宿主产生烟曲霉葡糖淀粉酶。

发明内容

在里氏木霉中表达的来自烟曲霉的葡糖淀粉酶(AfGATR)在高温和酸性pH下以较长的时间催化糖化。提供了来自烟曲霉的已知葡糖淀粉酶(SEQID NO:1和2)、编码核酸以及表达所述多核苷酸的里氏木霉宿主细胞的例子。里氏木霉宿主细胞相比于天然表达的AfGA烟曲霉以更高或至少相当的水平表达AfGATR。AfGATR(包括AfGA1TR和AfGA2TR)在高温和低pH下表现出高活性，所以AfGATR在存在α-淀粉酶如白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶(AkAA)的情况下可有效地应用于糖化工艺中。与在烟曲霉中表达的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶(AnGA)或天然AfGA催化的糖化产物相比，AfGATR有利地催化淀粉糖化为显著富集DP1(即，葡萄糖)的低聚糖组合物。AfGATR如AfGA1TR、AfGA2TR或其变体能够以比AnGA和天然表达的AfGA低的剂量使用，以生成相当水平的葡萄糖。AfGATR或其变体可以与源自植物(例如，谷物和谷粒)的酶结合使用。AfGATR或其变体还可以与宿主细胞分泌或宿主细胞内源的酶结合使用。例如，AfGATR或其变体可被添加到糖化反应或SSF工艺，在所述工艺期间一种或多种淀粉酶、其他的葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶或其他酶由生产宿主分泌。AfGATR或其变体也可以与内源性非分泌型生产宿主酶组合在一起工作。在另一个例子中，AfGATR或其变体可在糖化或SSF期间由生产宿主细胞与其他酶一起分泌。AfGATR葡糖淀粉酶或其变体可用于如下工艺中，所述工艺涉及将淀粉直接水解为糖浆和/或生化物质(例如，醇类、有机酸、氨基酸、其他生化物质和生物材料)，其中反应温度低于底物的糊化温度。AfGATR或其变体可在糖化或SSF期间由里氏木霉宿主细胞与其他酶一起分泌。

因此，提供了一种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO:12或13具有至少80％序列同一性，其中所述里氏木霉宿主细胞相比于烟曲霉宿主细胞以相当水平表达AfGATR或其变体，所述烟曲霉宿主细胞在相同条件下表达与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体。

还提供了一种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO:12或13具有至少80％序列同一性，其中AfGATR或其变体相比于与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体是更加热稳定的，并且其中所述AfGA或其变体在烟曲霉宿主细胞中表达。

还提供了一种用于生产重组AfGATR或其变体的方法，其包括：(a)提供表达重组AfGATR或其变体的里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO:12或13具有至少80％序列同一性；(b)在允许产生所述重组AfGATR或其变体的条件下培养所述宿主细胞；和(c)分离所述重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体相比于与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体是更加热稳定的，并且其中所述AfGA或其变体在烟曲霉宿主细胞中表达。

还提供了一种由所公开的宿主细胞产生的重组AfGATR或其变体。所述重组AfGATR或其变体在74℃下在pH 5.0下10分钟内可具有至少70％活性。所述重组AfGATR或其变体可为AfGA1TR。所述AfGA1TR在55℃-74℃的温度范围内在pH 5.0下10分钟内可具有至少70％活性。所述AfGA1TR可具有约68℃的最佳温度。所述重组AfGATR或其变体也可为AfGA2TR。所述AfGA2TR在61℃-74℃的温度范围内在pH 5.0下10分钟内可具有至少70％活性。所述AfGA2TR可具有约69℃的最佳温度。所述重组AfGATR或其变体可包含与SEQ ID NO:12具有至少90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述重组AfGATR或其变体可包含SEQ ID NO:12。所述重组AfGATR或其变体还可由与SEQ ID NO:13具有至少90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。所述重组AfGATR或其变体可由SEQ ID NO:12组成。所述重组AfGATR或其变体还可包含与SEQ ID NO:13具有至少90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。所述重组AfGATR或其变体可包含SEQ ID NO:13。所述重组AfGATR或其变体还可由与SEQ ID NO:13具有至少90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。所述重组AfGATR或其变体可由SEQ IDNO:13组成。

还提供了一种糖化包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物的方法，其中所述方法包括：(i)使淀粉组合物与根据权利要求4-15中任一项所述的分离的AfGATR或其变体接触；和(ii)糖化所述淀粉组合物以产生所述葡萄糖组合物；其中所述AfGA1TR或其变体催化所述包含淀粉的组合物向包含葡萄糖的组合物的糖化。与由AnGA在相同条件下制备的包含DP1的第二组合物相比，所述包含葡萄糖的组合物可富含DP1。与由野生型AfGA在相同条件下制备的包含DP1的第二组合物相比，所述包含葡萄糖的组合物还可富含DP1。所述AfGATR或其变体可为AfGATR2，并且所述包含葡萄糖的组合物与由AfGA1TR在相同条件下制备的包含DP1的第二组合物相比可富含DP1。所述AfGA1TR或其变体的剂量可为AnGA剂量的约40％-50％，以在相同条件下产生相同的DP1产率。

此外提供，所述包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒淀粉。糖化可在约30℃至约65℃的温度范围内进行。所述温度范围可为47℃-60℃。糖化可在pH 2.0-pH 6.0的pH范围内进行。所述pH范围可为pH3.5-pH 5.5。所述pH范围还可为pH 4.0-pH 5.0。

此外提供，糖化方法还可包括使淀粉组合物与α-淀粉酶接触。所述α-淀粉酶可为AkAA。所述糖化方法还可包括使淀粉组合物与支链淀粉酶接触。

此外提供，所述糖化方法还可包括使所述葡萄糖组合物发酵以产生发酵最终(EOF)产物。该发酵还可以是同时糖化和发酵(SSF)反应。该发酵可在pH 2-8下并且在25℃-70℃的温度范围内进行24-70小时。EOF产物可包含乙醇。该EOF产物可包含8％-18％(v/v)的乙醇。所述方法还可包括使麦芽浆和/或麦芽汁与支链淀粉酶、α-淀粉酶和AfGA1TR或其变体接触。所述方法还可包括：(a)制备麦芽浆；(b)过滤所述麦芽浆以获得麦芽汁，和(c)使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料，其中支链淀粉酶、α-淀粉酶和AfGA1TR或其变体被添加至：(i)步骤(a)的麦芽浆和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁和/或(iii)步骤(c)的发酵麦芽汁。该EOF产物可包含代谢物。该代谢物可以是柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、Ω3脂肪酸、丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇或异戊二烯。

此外提供，所述糖化方法还可包括向所述淀粉组合物添加其他的葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、其他的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、裂解酶、水解酶或者它们的组合。该AfGATR或其变体可以0.1至2葡糖淀粉酶单位(GAU)/g干固形物的剂量添加。该AfGATR或其变体可以约49.5μg蛋白质/g固形物的剂量添加。还可加入支链淀粉酶。该分离的AfGATR或其变体可由所述里氏木霉宿主细胞分泌。所述宿主细胞还可表达和分泌α-淀粉酶。所述宿主细胞还可表达和分泌支链淀粉酶。

此外提供，所述糖化方法还可使所述包含淀粉的组合物与所述宿主细胞接触。所述宿主细胞能够使所述葡萄糖组合物发酵。

还涵盖了一种包含由所公开的糖化方法生产的包含葡萄糖的组合物。还涵盖了一种由所公开的糖化方法生产的液化淀粉。还涵盖了一种由所公开的糖化方法生产的发酵饮料。

还涵盖了将包含淀粉的组合物糖化的用途，所述组合物包含分离的AfGA1TR或其变体。所述组合物可以是培养的细胞材料。所述组合物还可包含葡糖淀粉酶。该AfGA1TR或其变体可以是经纯化的。该AfGA1TR或其变体可由宿主细胞分泌。

还涵盖了AfGA1TR或其变体在制备包含葡萄糖的组合物中的用途。还涵盖了AfGA1TR或其变体在制备液化淀粉中的用途。还涵盖了AfGA1TR或其变体在制备发酵饮料中的用途。还涵盖了所公开的发酵饮料的糖化方法，或发酵最终产物的所公开用途，其中所述发酵饮料或发酵最终产物选自：i)啤酒，所述啤酒选自全麦芽啤酒、根据“纯净法(Reinheitsgebot)”酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒(IPA)、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(Happoshu)(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒(stout)、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽酒；和ii)谷物或麦芽饮料，所述谷物或麦芽饮料选自水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮料。

还涵盖了一种制备食品组合物的方法，其包括将以下物质组合：(i)一种或多种食品成分，和(ii)根据权利要求4-15所述的分离的AfGA1TR或其变体，其中所述支链淀粉酶和所述分离的AfGA1TR或其变体催化所述食品成分中存在的淀粉组分的水解以产生葡萄糖。所述食品组合物可选自食品、烘焙组合物、食品添加剂、动物食品、饲料产品、饲料添加剂、油、肉和猪油。所述食品成分可包括烘焙成分或添加剂。所述一种或多种食品成分可选自：面粉；抗变陈淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麦芽α-淀粉酶或其具有生麦芽α-淀粉酶活性的变体、同源物或突变体；烘焙食品用木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；和脂肪酶。所述一种或多种食品成分可选自：(i)来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的生麦芽糖α-淀粉酶；(ii)来自芽孢杆菌属(Bacillus)、曲霉属(Aspergillus)、嗜热真菌属(Thermomyces)或木霉属(Trichoderma)的烘焙食品用木聚糖酶；(iii)来自异孢镰孢菌(Fusariumheterosporum)的糖脂酶。所述食品组合物可包括面团或面团产品，优选地经加工的面团产品。所述方法可包括烘焙所述食品组合物以产生烘焙产品。所述方法还可包括：(i)提供淀粉介质；(ii)向所述淀粉介质中添加支链淀粉酶和AfGA1TR或其变体；和(iii)在步骤(b)期间或之后向所述淀粉介质加热以产生烘焙产品。

还涵盖了一种用于制备食品组合物的组合物，其包含AfGA1TR或其变体。还涵盖了AfGA1TR或其变体在制备食品组合物中的用途。所述食品组合物可包括面团或面团产品，优选地经加工的面团产品。所述食品组合物可以是烘焙组合物。还涵盖了AfGA1TR或其变体在面团产品中延缓或减轻面团产品变陈，优选地延缓或减轻面团产品的有害回生的用途。

附图说明

附图并入本说明书中并构成本说明书的一部分，并且例示了本文所公开的各种方法和组合物。在附图中：

图1A至图1B示出了AfGA1催化核心和碳水化合物结合域(分别为SEQ ID NO:1的第27至476位残基和第524-631位残基)或全长与来自以下的葡糖淀粉酶的相应残基的ClustalW比对：烟曲霉A1163(AfGA2)(分别为SEQ ID NO:2的第27-476位残基和第524-631位残基)；费希新萨托菌(Neosartorya fisheri)NRRL 181(分别为SEQ ID NO:3的第28-476位残基和第520-627位残基)；柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)ATCC 10500(分别为SEQ ID NO:4的第28-478位残基和第530-637位残基)；马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)ATCC 18224(分别为SEQ ID NO:5的第31-481位残基和第534-641位残基)；和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)FGSC A4(分别为SEQ ID NO:6的第55-493位残基和第544-661位残基)。由图1中的星号标示的残基是对应于SEQ ID NO:1-6中的保守残基的AfGA1残基。

图2示出了包含编码AfGA1多肽的多核苷酸的pJG222表达载体pJG222(Trex3gM-AfGA1)的图谱。

图3示出了葡糖淀粉酶活性(相对单位)对pH的依赖性。所述葡糖淀粉酶包括(1)在烟曲霉中表达的野生型AfGA，(2)在里氏木霉中表达的AfGA1TR，和(2)在黑曲霉中表达的AnGA。通过在50℃下从可溶性淀粉释放葡萄糖来测定葡糖淀粉酶活性。

图4示出了葡糖淀粉酶活性(相对单位)对温度的依赖性。所述葡糖淀粉酶包括(1)在烟曲霉中表达的野生型AfGA，(2)在里氏木霉中表达的AfGA1TR，和(3)AnGA。通过在pH 5.0下从可溶性淀粉释放葡萄糖来测定葡糖淀粉酶活性。

图5A-B示出了通过在pH 4.5和5.0下从35％干固形物淀粉释放葡萄糖所测定的AfGA1TR和AnGA葡糖淀粉酶活性。

图6A-B示出了通过含有AfGATR1、支链淀粉酶和AkAA的组合物使35％干固形物淀粉水解成DP1以及DP1反转为DP2。

图7A-B示出了通过含有AfGATR1、支链淀粉酶和可变剂量的AkAA的组合物使35％干固形物淀粉水解成DP1以及DP1反转为DP2。

图8示出了在通过含有AfGA1TR或AnGA并且此外含有α-淀粉酶(OPTIMAX L-100)和PU(GC636)的组合物从35％干固形物淀粉释放还原糖之后，在含有96％DP1的高葡萄糖组合物中所存在的DP2量。

图9示出了包含编码AfGA2多肽的多核苷酸的pJG313表达载体pJG313(Trex3gM-AfGA2)的图谱。

图10示出了在里氏木霉中表达的AfGA2TR的葡糖淀粉酶(相对单位)对pH的依赖性。通过在50℃下从可溶性淀粉底物释放葡萄糖来测定葡糖淀粉酶活性。

图11示出了在里氏木霉中表达的AfGA2TR的葡糖淀粉酶(相对单位)对温度的依赖性。通过在pH 5.0下从可溶性淀粉底物释放葡萄糖来测定葡糖淀粉酶活性。

图12示出了AfGA2TR在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中的热稳定性。将酶在热循环器中在适宜温度下温育2小时，随后加入到可溶性淀粉底物中。

图13示出了在里氏木霉中表达的AfGA1TR的SDS凝胶。柱M含有蛋白质分子量(MW)阶梯，以kDa计。柱1-4分别代表在40.5小时、64.5小时、88.3小时和112小时的流逝发酵时间内来自里氏木霉发酵产生的AfGATR的样品。用箭头标记的75kDa谱带为AfGA1TR。

具体实施方式

提供了来自烟曲霉的真菌葡糖淀粉酶(AfGA1TR或AfGA2TR)及其变体。AfGA1TR或其变体具有为pH 5.0的最佳pH值，并且在pH 3.5至pH7.5的范围内具有至少70％的活性。当在pH 5.0下测试时，所述酶具有68℃的最佳温度，并且在55℃-74℃的温度范围内具有至少70％的活性。AfGA2TR或其变体具有为pH 5.3的最佳pH值，并且在pH 3.3至pH 7.3的范围内具有至少70％的活性。当在pH 5.0下测试时，所述酶具有69℃的最佳温度，并且在61℃-74℃的温度范围内具有至少70％的活性。这些特性允许这些酶在相同的反应条件下与α淀粉酶结合使用。这消除了以分批过程实施糖化反应的必要性，在所述分批过程中需要对pH和温度加以调整，以便最佳地使用α淀粉酶或葡糖淀粉酶。

葡糖淀粉酶如AfGATR(包括AfGA1TR和AfGA2TR)或其变体的示例性应用可用于淀粉糖化工艺如SSF；食品组合物的制备；清洁组合物的制备，所述清洁组合物例如用于清洁衣物、餐具和其他表面的洗涤剂组合物；纺织物处理(例如退浆)。与黑曲霉葡糖淀粉酶(AnGA)催化的糖化产物相比，AfGATR有利地催化淀粉糖化为显著富集DP1(即，葡萄糖)的低聚糖组合物。AfGATR可在发酵或SSF期间由宿主细胞与其他酶一起分泌。例如，AfGATR显示比AnGA更大的糖化速率，从而在24小时内产生多于96％的葡萄糖。AfGATR还能够以比AnGA低的剂量使用，以生成相当水平的DP1。可预期节省至少50％的剂量。在糖化期间，AfGATR相比于AnGA还在统计学上是显著地更加热稳定的。AfGATR可以与源自植物(例如，谷物和谷粒)的酶结合使用。AfGATR还可以与宿主细胞如里氏木霉分泌或宿主细胞如里氏木霉内源的酶结合使用。例如，AfGATR可被添加到糖化、发酵或SSF工艺，在所述工艺期间一种或多种淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶或其他酶由生产宿主分泌。AfGATR可与辅助性α-淀粉酶结合以进一步改进糖化速率。例如，添加0.1SSU/g干固形物的AkAA可改进糖化速率。当与AkAA和支链淀粉酶结合时，发现在单一pH工艺中在相同葡萄糖产率下AfGATR相比于AnGA将DP3降低0.1％。AfGATR也可以与内源性非分泌型生产宿主酶组合在一起工作。在另一个例子中，AfGATR可在发酵或SSF期间由生产宿主细胞与其他酶一起分泌。AfGATR淀粉酶还可以有效地将淀粉直接水解为糖浆和/或生化物质(例如，醇类、有机酸、氨基酸、其他生化物质和生物材料)，其中反应温度低于底物的糊化温度。

1.定义和缩写

根据此具体实施方式，适用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“酶”包括多个此种酶，而提及“剂量”，包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。下面提供如下的术语。

1.1.缩写和首字母缩略词

除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

ABTS         2,2-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸

AcAmyl       棒曲霉(Aspergillus clavatus)α淀粉酶

AE           醇乙氧基化物

AEO          醇乙氧基化物

AEOS         醇乙氧基硫酸盐

AES          醇乙氧基硫酸盐

AfGA         烟曲霉(Aspergillus fumigatus)葡糖淀粉酶

AfGA1        烟曲霉葡糖淀粉酶1

AfGA2        烟曲霉葡糖淀粉酶2

AfGATR       在里氏木霉中表达的烟曲霉葡糖淀粉酶

AfGA1TR      在里氏木霉中表达的烟曲霉葡糖淀粉酶1

AfGA2TR      在里氏木霉中表达的烟曲霉葡糖淀粉酶2

AkAA         白曲霉α-淀粉酶

AnGA         黑曲霉葡糖淀粉酶

AOS          α-烯烃磺酸盐

AS           烷基硫酸盐

cDNA         互补DNA

CMC          羧甲基纤维素

DE           右旋糖当量

DNA          脱氧核糖核酸

DPn          具有n个亚单元的多糖聚合度

ds或DS       干固形物

DTMPA        二亚乙基三胺五乙酸

EC           酶学委员会

EDTA         乙二胺四乙酸

EO           环氧乙烷(聚合物片段)

EOF          发酵最终

FGSC          美国真菌遗传学资源中心

GA            葡糖淀粉酶

GAU/g ds      葡糖淀粉酶活性单位/克干固形物

HFCS          高果糖玉米糖浆

HgGA          灰腐质霉(Humicola  grisea)葡糖淀粉酶

HS            高级糖

IPTG          异丙基β-D-硫代半乳糖苷

IRS           不溶性残余淀粉

kDa           千道尔顿

LAS           直链烷基苯磺酸盐

MW            分子量

MWU           改进Wohlgemuth单位；1.6x10^-5mg/MWU  ＝活性单位

NCBI          美国国家生物技术信息中心

NOBS          壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA           次氮基乙酸

OxAm          Purastar  HPAM  5000L(美国丹尼斯科公司(Danisco  US

              Inc.))

PAHBAH        对羟基苯甲酰肼

PEG           聚乙二醇

pI            等电点

ppm           百万分率

PVA           聚(乙烯醇)

PVP           聚(乙烯吡咯烷酮)

RNA           核糖核酸

SAS           链烷磺酸盐

SDS-PAGE      十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

SSF           同时糖化和发酵

SSU/g固形物   可溶性淀粉单位/克干固形物

sp.           物种

TAED          四乙酰基乙二胺

TrGA          里氏木霉葡糖淀粉酶

w/v           重量/体积

w/w           重量/重量

v/v           体积/体积

wt％          重量％

℃            摄氏度

H₂O           水

dH₂O或DI      去离子水

dIH₂O         Milli-Q过滤的去离子水

g或gm         克

μg           微克

mg            毫克

kg            千克

μL和μl      微升

mL和ml       毫升

mm           毫米

μm          微米

M            摩尔

mM           毫摩尔

μM          微摩尔

U            单位

sec          秒

min          分钟

hr           小时

DO           溶解氧

Ncm          牛顿厘米

ETOH         乙醇

eq.          当量

N            当量浓度

1.2.定义

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指除了别的方面外还能够催化淀粉降解的酶。α-淀粉酶是裂解淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。一般而言，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)描述为以随机方式裂解淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键从而生成含有三个或更多个(1-4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖的内切作用酶。与之相对地，外切淀粉分解酶如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原端裂解多糖分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶如麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.60)和麦芽六糖苷酶(EC 3.2.1.98)可产生特定长度的麦芽低聚糖或特定麦芽低聚糖的富集糖浆。

如本文所用，术语“葡糖淀粉酶”(EC 3.2.1.3)(也称为葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶；葡糖淀粉酶；淀粉葡糖苷酶；γ-淀粉酶；溶酶体α-葡糖苷酶；酸性麦芽糖酶；外切-1,4-α-葡糖苷酶；葡萄糖淀粉酶；γ-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶；酸性麦芽糖酶；1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶；或4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)是指一类催化从淀粉和相关低聚糖和多糖的非还原端释放D-葡萄糖的酶。这些酶是外切作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基残基。该酶还水解α-1,6和α-1,3-键，但速率比水解α-1,4-键慢得多。术语“淀粉的水解”是指加入水分子切割糖苷键。

术语“支链淀粉酶”(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖水解酶)是指一类能水解支链淀粉分子中的α1-6葡糖苷键的酶。

本文的“酶单位”是指在规定的测定条件下每时间段所形成的产物的量。例如，“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)定义为在60℃、pH 4.2下每小时从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1g葡萄糖的酶量。“可溶性淀粉单位”(SSU)是在pH 4.5、50℃下每分钟从可溶性淀粉底物(4％DS)产生1mg葡萄糖的酶量。DS是指“干固形物”。

本文所用的“干固形物”含量是指以干重百分比计的浆液总固形物。术语“浆液”是指含有不溶性固体的含水混合物。术语“高ds”是指含有高于38％的干固形物的水性淀粉浆液。

术语“百利糖度”是指众所周知的用于测量给定温度下溶液的糖含量的比重计标度。百利糖度标度测量每100克糖水溶液中存在的蔗糖克数(总溶解固体含量)。百利糖度测量常常使用比重计或折射计进行。

术语“聚合度”(DP)是指给定的糖类中无水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的例子是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，如麦芽糖和蔗糖。HS或DP4+(>DP3)表示聚合度大于3的聚合物。术语“DE”或“右旋糖当量”定义为还原糖即D-葡萄糖作为糖浆中总碳水化合物的分数的百分比。它是总还原糖的浓度的行业标准，并且以按干重计的D-葡萄糖％表示。非水解的颗粒淀粉的DE几乎为0，而D-葡萄糖的DE为100。

如本文所用，术语“淀粉”是指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式(C₆H₁₀O₅)_x(其中X可以是任何数字)的直链淀粉和支链淀粉构成。所述术语包括植物基材料，如谷粒、草、块茎和根，并且更具体地讲是从小麦、大麦、玉米、裸麦、水稻、高梁、糠、木薯(cassava)、小米、马铃薯、甘薯和木薯(tapioca)获得的材料。术语“淀粉”包括颗粒淀粉。术语“颗粒淀粉”是指生的即未蒸煮过的淀粉，例如尚未经受糊化的淀粉。

术语“葡萄糖糖浆”是指含有葡萄糖固形物的含水组合物。葡萄糖糖浆将具有至少20的DE。在一些实施例中，葡萄糖糖浆将包含不超过21％的水和以右旋糖计算不少于25％的还原糖。葡萄糖糖浆将包括至少90％的D-葡萄糖，或者至少95％的D-葡萄糖。在一些实施例中，术语葡萄糖和葡萄糖糖浆可互换使用。

术语“总糖含量”是指淀粉组合物中存在的总糖含量。

术语“折射率干物质”(RIDS)定义为在已知DE下在控制温度下测定淀粉溶液的折射率，然后使用适当的关系，例如玉米提炼协会关键数据表(Critical Data Tables of the Corn Refiners Association)，将RI换算为干物质。

术语“接触”是指将相应的酶设置成与相应的底物充分靠近，使得该酶能够将该底物转化为最终产品。本领域技术人员将认识到将酶溶液与相应底物混合可实现接触。

关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指天然存在的多肽，其在一个或多个氨基酸位置处不包括人为制造的置换、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖任何编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸。此外，如本文所用并且从上下文将显而易见，应理解，提及特定序列为“野生型”不意味着实例中未附加前缀“野生型”的其他序列不是野生型。

如本文所用，除非上下文另外明确说明，否则关于表达水平的术语“相当的”是指所关注样品之间的变化不超过20％。

对野生型蛋白质的提及应理解为包括所述蛋白质的成熟形式。“成熟”多肽意指缺少信号序列的多肽或其变体。例如，信号序列可在多肽的表达期间被切除。成熟AfGA1或AfGA2的长度为612个氨基酸，所述长度分别覆盖SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的第1至612位残基，其中所述位置从N端计数。野生型AfGA1或AfGA2的信号序列的长度为19个氨基酸，并具有SEQ ID NO:11中所示的序列。成熟AfGA1、AfGA2或其变体可包含取自不同蛋白质的信号序列。成熟蛋白质可以是成熟多肽和信号序列多肽之间的融合蛋白。

AfGA1、AfGA2或其变体的推定“催化核心”跨越SEQ ID NO:1的第41至453位残基。第534-630位氨基酸残基构成AfGA1、AfGA2或其变体的推定“碳水化合物结合域”。AfGA1、AfGA2或其变体的“连接子”或“连接子区域”跨越“催化核心”与“碳水化合物结合域”之间的区域。

关于多肽的术语“变体”是指因其包括一个或多个天然存在的或人为制造的氨基酸置换、插入或缺失而不同于指定的野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份从上下文来看将是显而易见的。

就本发明的酶如葡糖淀粉酶而言，“活性”是指酶活性，其可如本文所述进行测量。

当用于对象细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”指该对象已从其天然状态经过修饰。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)形式的细胞中存在的基因，或者以不同于自然界中存在的水平或条件表达天然基因。重组核酸与天然序列相差一个或多个核苷酸和/或可操作地连接至异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白可与天然序列相差一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码AfGA1、AfGA2或其变体的核酸的载体是重组载体。

术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指这样的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其他指定的物质或组分，其从如在自然界中存在的那样与其天然相关的至少一种其他物质或组分中移除，例如从重组宿主细胞中分离的AfGATR。“分离的”AfGATR或其变体包括但不限于：包含在异源宿主细胞(即，非烟曲霉的宿主细胞)中表达的分泌AfGATR的培养发酵液。

如本文所用，术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的物质(例如，分离的多肽或多核苷酸)，所述相对纯的状态如纯度至少约90％、纯度至少约95％、纯度至少约98％或纯度甚至至少约99％。

关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于高温后保持活性的能力。酶(例如淀粉酶)的热稳定性可通过其T_m测量，在此期间酶活性在限定的条件下损失一半。T_m可通过测量暴露于(即，经受)高温后残余的葡糖淀粉酶活性来计算。

关于酶的“pH范围”是指酶显示出催化活性的pH值范围。

如本文所用，关于酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及在预定的时间段(如，15分钟、30分钟和1小时)内、酶在宽泛的pH值范围内保持活性的能力。

如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。当这些氨基酸序列展现活性时，其可称为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，其中氨基酸序列是以标准的氨基至羧基末端取向(即N→C)给出。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列以5'至3'取向给出。

如本文所用，“杂交”是指在印迹杂交技术和PCR技术期间核酸的一条链与互补链形成双链体、即与互补链发生碱基配对的过程。严格杂交条件由在如下条件下的杂交所例示：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。杂交的双链核酸通过解链温度(T_m)表征，在解链温度下一半杂交的核酸不与互补链配对。双链体内的错配核苷酸降低T_m。编码变体葡糖淀粉酶的核酸较SEQ ID NO:8与其相同互补链的核苷酸之间形成的双链，可具有降低1℃-3℃或更多的T_m。

如本文所用，“合成的”分子通过体外化学合成或酶促合成而生成、而非由生物体生成。

如本文所用，关于细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指含有整合进其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然(例如，异源)核酸序列的细胞。

在将核酸序列插入细胞的语境中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”为已将表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体(包括编码所关注的多肽(如，AfGATR或其变体)的多核苷酸)引入其中的生物体。示例性的宿主菌株是能够表达所关注的多肽和/或使糖发酵的微生物细胞(例如细菌、丝状真菌和酵母，如里氏木霉)。术语“宿主细胞”包括由细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文所用，术语“表达”是指基于核酸序列生成多肽的过程。所述过程包括转录和翻译二者。

“选择性标记”或“可选标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于对携带该基因的宿主细胞的选择。可选标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。

“载体”是指设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等等。

“表达载体”是指包含编码所关注多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列可操作地连接至能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括影响转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子，和控制转录和翻译终止的序列。

术语“可操作地连接”意指特定组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，调控序列可操作地连接至编码序列，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是连接至蛋白质的N端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质在细胞外的分泌。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。

如本文所用，“生物活性的”是指具有特定生物活性(例如酶活性)的序列。

如本文所用，“样片”是其上施有污渍的一块材料，例如织物。所述材料可以是例如由棉、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制成的织物。所述样片还可以是纸，例如滤纸或硝化纤维素，或者是一块硬质材料，如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶，污渍是基于淀粉的，但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、颜料、油或这些化合物的混合物。

如本文所用，“小样片”是自样片上用单孔打孔装置切下的部分，或者用定制的96孔打孔装置(其中该多孔打孔模式与标准96孔微量滴定板匹配)切下的部分，或者是以其他方式自样片上取下的部分。样片可以是纺织物、纸、金属或其他合适的材料。小样片可以在其被放入24孔、48孔或96孔微量滴定板孔之前或之后具有固着的污渍。“小样片”也可以通过向小块材料施加污渍而制成。例如，小样片可以是直径为5/8英寸或0.25英寸的一块施有污渍的织物。定制的打孔器被设计成同时将96个样片递送至96孔板的所有孔中。所述装置可以通过简单地向同一96孔板多次上样，而允许向每孔递送不止一个样片。可以设想将多孔打孔装置用于向任何格式的板(包括但不限于24孔、48孔和96孔板)同时递送多个样片。在另一个可设想的方法中，脏的测试平台可以是由金属、塑料、玻璃、陶瓷或另一合适材料制成的、被污渍包覆的珠粒。然后将一个或多个包覆的珠粒置于含有合适缓冲液和酶的96孔、48孔或24孔板或更大版式的板的孔中。

如本文所用，“包含AfGATR或其变体的培养的细胞材料”或者类似的用语是指包含AfGATR或其变体作为组分的细胞裂解液或上清液(包括培养基)。细胞材料可以来自出于制备AfGATR或其变体的目的而在培养物中生长的异源宿主。

“序列同一性百分比”意指以默认参数用CLUSTAL W算法比对时，变体具有至少一定百分比的氨基酸残基与野生型AfGA1或AfGA2相同。参见Thompson等人，(1994)Nucleic Acids Res.(《核酸研究》)，22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数为：

与参考序列相比，缺失算作非相同残基。任一末端出现的缺失被包括在内。例如，在SEQ ID NO:12的成熟AfGA1多肽的C端具有六个氨基酸缺失的变体将相对于所述成熟多肽具有99％的百分比序列同一性(606/612个相同的残基×100，四舍五入为最接近的整数)。这种变体将被与成熟AfGA1多肽具有“至少99％序列同一性”的变体涵盖。

“融合的”多肽序列经由两个多肽序列之间的肽键连接，即可操作地连接。

术语“丝状真菌”是指真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状形式。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生化物质生产中的一种工艺，其中在同一工序步骤期间存在微生物有机体如产乙醇微生物和至少一种酶如AfGA或其变体。SSF包括在相同反应器容器中同时进行将淀粉底物(颗粒淀粉、液化淀粉或增溶淀粉)水解成糖(包括葡萄糖)和使糖发酵成醇或其他生化物质或生物材料。

如本文所用，“产乙醇微生物”是指能够将糖或低聚糖转化为乙醇的微生物。

术语“发酵饮料”是指通过包括发酵过程如微生物发酵，例如细菌和/或酵母发酵的方法制备的任何饮料。

“啤酒”是这种发酵饮料的例子，并且术语“啤酒”意在包含通过含淀粉植物材料的发酵/酿造产生的任何发酵麦芽汁。通常，啤酒专门由麦芽或辅助材料或麦芽和辅助材料的任何组合制备。啤酒的例子包括：全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒(IPA)、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但是还有替代形式的谷物和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒，等等。

术语“麦芽”是指任何经制麦(malted)的谷粒，如经制麦的大麦或小麦。

术语“辅助材料”是指不是麦芽如大麦或小麦麦芽的任何含淀粉和/或糖的植物材料。辅助材料的例子包括粗磨玉米粉、精制粗磨玉米粉、酿酒用碾磨酵母、水稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷物、谷物薄片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯粉、木薯以及糖浆，如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等。

术语“麦芽浆”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如制粉用谷物(grist)(例如包括压碎的大麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅助材料或它们的组合的含水浆液，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。

术语“麦芽汁”是指在制浆过程中提取制粉用谷物后的未发酵液体流出物。

“碘阳性淀粉”或“IPS”是指(1)在液化和糖化后未水解的直链淀粉或(2)回生淀粉聚合物。当用碘对糖化的淀粉或糖液进行测试时，高DPn直链淀粉或回生淀粉聚合物会结合碘并产生特征性蓝色。因而所述糖液称为“碘阳性糖”、“蓝色糖”或“蓝糖”。

术语“回生淀粉”或“淀粉回生”是指淀粉糊或凝胶在变陈时自发出现的变化。

术语“约”是指参考值±15％。

2.烟曲霉葡糖淀粉酶(AfGA1和AfGA2)

提供了来自烟曲霉物种的分离和/或纯化的AfGA1或其变体，其具有葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶由三个不同结构域构成，其包括催化结构域，接着是连接子区域，其又连接至淀粉结合域。AfGA1多肽可以是SEQID NO:12中所示的成熟AfGA1多肽。所述多肽可在N端和/或C端处融合到另外的氨基酸序列。另外的N端序列可以是信号肽，其可具有例如SEQID NO:11中所示的序列。在任一端处融合的其他氨基酸序列包括可用于标记或纯化蛋白质的融合伴侣多肽。

例如，AfGA1前体包括以下序列(SEQ ID NO:1)：

MPRLSYALCALSLGHAAIAAPQLSARATGSLDSWLGTETTVALNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSEPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSNPSGGLASGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGAAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASSTSTFTDIINAVKTYADGYVSIVQAHAMNNGSLSEQFDKSSGLSLSARDLTWSYAAFLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPGSTTTVGTTTSTTSGTAAETACATPTAVAVTFNEIATTTYGENVYIVGSISELGNWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVSVTLPAGTTFEYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPAACGVSTATENDTWQ

提供了来自烟曲霉物种的分离和/或纯化的AfGA2或其变体，其具有葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶由三个不同结构域构成，其包括催化结构域，接着是连接子区域，其又连接至淀粉结合域。AfGA2多肽可以是SEQID NO:13中所示的成熟AfGA2多肽。所述多肽可在N端和/或C端处融合到另外的氨基酸序列。另外的N端序列可以是信号肽，其可具有例如SEQID NO:11中示出的序列。在任一端处融合的其他氨基酸序列包括可用于标记或纯化蛋白质的融合蛋白多肽。

例如，AfGA2前体包括以下序列(SEQ ID NO:2)：

MPRLSYALCALSLGHAAIAAPQLSARATGSLDSWLGTETTVALNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSEPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSNPSGGLASGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGAAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASSTSTFTDIINAVKTYADGYVSIVQAHAMNNGSLSEQFDKSSGLSLSARDLTWSYAAFLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPGSTTTVGTTTSTTSGTATETACATPTAVAVTFNEIATTTYGENVYIVGSISELGNWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVSVTLPAGTTFEYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPAACGVSTATENDTWR

对于AfGA1和AfGA2，上述以粗体表示的氨基酸构成C端碳水化合物结合(CBM)结构域(SEQ ID NO:7)。糖基化连接子区域连接N端催化核心与CBM结构域。AfGA1和AfGA2中的CBM结构域是保守的，其中CBM20结构域存在于大量淀粉降解酶中，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和环糊精葡聚糖转移酶。CBM20折叠为具有两个淀粉结合位点1和2的逆平行β-桶状结构。这两个位点被认为在功能上不同：位点1可充当初始淀粉识别位点，而位点2可能涉及对淀粉适当区域的特异性识别。参见Sorimachi等人，(1997)，“Solution structure of the granular starch bindingdomain of Aspergillus niger glucoamylase bound to beta-cyclodextrin”(“与β环糊精结合的黑曲霉葡糖淀粉酶的颗粒淀粉结合域的溶液结构”)，Structure(《结构》)，5(5):647-61。在

AfGA1和AfGA2CBM结构域中的淀粉结合位点1和2保守的残基在以下序列中分别通过数字1和2示出：

变体AfGA1或AfGA2可包含SEQ ID NO:7的CBM结构域的一些或零个氨基酸残基。作为另一种选择，变体可包含与SEQ ID NO:7的CBM结构域具有至少80％、85％、90％、95％或98％序列同一性的CBM结构域。变体可包含异源或经工程改造的CBM20结构域。

AfGA或其变体可在真核宿主细胞，如丝状真菌细胞中表达，该真核宿主细胞允许例如连接子序列的适当糖基化。

编码AfGA1的代表性多核苷酸是SEQ ID NO:8中所示的多核苷酸序列。编码AfGA2的代表性多核苷酸是SEQ ID NO:14中所示的多核苷酸序列。(NCBI参考序列NC_007195，烟曲霉基因组。)上面在AfGA1和AfGA2前体序列中以斜体示出的多肽序列MPRLSYALCALSLGHAAIA(SEQ ID NO:11)是在蛋白质于适当的宿主细胞中表达时被切除的N端信号肽。

AfGA1的多肽序列类似于其他真菌葡糖淀粉酶，包括AfGA2。例如，AfGA1与以下真菌葡糖淀粉酶具有高度序列同一性：

与来自烟曲霉A1163的糖基水解酶(AfGA2)(SEQ ID NO:2)具有99％序列同一性；

与来自费希新萨托菌NRRL 181的糖基水解酶(SEQ ID NO:3)具有92％序列同一性；和

与来自柄篮状菌ATCC 10500的推定葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:4)具有82％序列同一性；

与来自马尔尼菲青霉菌ATCC 18224的推定葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:5)具有81％序列同一性；

与来自构巢曲霉FGSC A4的假定葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:6)具有81％序列同一性；

序列同一性通过BLAST比对确定，使用SEQ ID NO:1的AfGA1的前体形式作为查询序列。参见Altschul等人，(1990)，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215:403-410。序列同一性也可任选地基于酶的成熟形式。

提供了AfGA1多肽的变体。所述变体可由如下多肽组成或包含如下多肽，所述多肽与SEQ ID NO:1的第1-631位残基的多肽具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性，其中所述变体包含选自SEQ ID NO:2-6中的一个或多个对应氨基酸的置换、插入或缺失的一种或多种氨基酸修饰。提供了AfGA2多肽的变体。所述变体可由如下多肽组成或包含如下多肽，所述多肽与SEQ ID NO:2的第1-631位残基的多肽具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性，其中所述变体包含选自SEQ ID NO:1和/或3-6中的一个或多个对应氨基酸的置换、插入或缺失的一种或多种氨基酸修饰。例如，由与SEQ ID NO:1的第1至612位残基的多肽具有至少99％序列同一性的多肽组成的变体与SEQ ID NO:1的AfGA1相比可具有一个至六个氨基酸置换、插入或缺失。插入或缺失可以在例如多肽的任一端处发生。作为另一种选择，变体可“包含”由与SEQ ID NO:1或2的第1-631位残基的多肽具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的多肽组成的多肽。在一种变体中，另外的氨基酸残基可融合至多肽的任一端。变体可以是经糖基化的，无论所述变体是否“包含”给定的氨基酸序列或由给定的氨基酸序列“组成”。

AfGA1(SEQ ID NO:1)；AfGA2(SEQ ID NO:2)；来自费希新萨托菌NRRL 181的葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:3)；来自柄篮状菌ATCC 10500的葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:4)；来自马尔尼菲青霉菌ATCC 18224的葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:5)；来自构巢曲霉FGSC A4的葡糖淀粉酶(SEQ ID NO:6)之间的ClustalW比对示于图1中。参见Thompson等人，(1994)Nucleic AcidsRes.(《核酸研究》)，22:4673-4680。一般来讲，在相关蛋白质序列的比对中氨基酸的保守程度与氨基酸位置相对于蛋白质功能的重要性成比例。即，在所有相关序列中共有的氨基酸可能起重要的功能作用，并且不能被轻易置换。同样地，在序列之间变化的位置很可能被其他氨基酸置换或以其他方式修饰，而同时保持蛋白质的活性。

图1中所示的比对例如可以指导具有葡糖淀粉酶活性的变体AfGA多肽的构建。SEQ ID NO:1的AfGA1多肽的变体可以包括但不限于具有选自以下的氨基酸修饰的那些：选自SEQ ID NO:2(AfGA2)、3、4、5和6的多肽中的对应氨基酸的置换、插入或缺失。SEQ ID NO:1的AfGA1和SEQ IDNO:2、3、4、5和6的葡糖淀粉酶中的位置之间的对应参照图1中示出的比对确定。例如，参见图1中的比对，变体AfGA1多肽可具有D23N置换，其中Asn是SEQ ID NO:6中的对应氨基酸。变体AfGA1多肽还包括但不限于具有1、2、3或4个随机选择的氨基酸修饰的那些多肽。氨基酸修饰可使用熟知的方法，例如寡核苷酸定向诱变来进行。类似地，SEQ IDNO:2的AfGA2多肽的变体可以包括但不限于具有选自以下的氨基酸修饰的那些：选自SEQ ID NO:1(AfGA1)、3、4、5和6的多肽中的对应氨基酸的置换、插入或缺失。

还提供了编码AfGA1多肽或其变体的核酸。编码AfGA1的核酸可以是基因组DNA。或者，所述核酸可以是包含SEQ ID NO:8的cDNA。类似地，提供编码AfGA2多肽或其变体的核酸。编码AfGA2的核酸也可以是基因组DNA。或者，所述核酸可以是包含SEQ ID NO:14的cDNA。如本领域的技术人员所熟知，遗传密码具有简并性，意指在一些情况下多个密码子可编码相同的氨基酸。核酸包括编码AfGA1、AfGA2或其变体的所有基因组DNA、mRNA和cDNA序列。

AfGA1、AfGA2或其变体可以是“前体”、“未成熟的”或“全长的”，在这些情形中它们包括信号序列；或可以是“成熟的”，在该情形中它们缺少信号序列。变体葡糖淀粉酶也可在N端或C端处被截短，只要所得的多肽保留葡糖淀粉酶活性。

2.1.AfGA变体表征

变体AfGA多肽保持葡糖淀粉酶活性。它们可具有高于或低于野生型AfGA多肽的比活性。AfGA变体的另外的特征包括例如稳定性、pH范围、温度曲线、氧化稳定性和热稳定性。例如，所述变体可在pH 3至约pH 8，例如pH 3.0-7.8、例如pH 3.0-7.5、pH 3.5-7.0、pH 4.0-6.7或pH 5.0下pH稳定24-60小时。AfGA变体能够以高于野生型AfGA的水平表达，同时保持野生型AfGA的性能特性。与亲本葡糖淀粉酶相比，AfGA变体还可具有改变的氧化稳定性。例如，氧化稳定性降低在用于淀粉液化的组合物中可能是有利的。变体AfGA与野生型葡糖淀粉酶相比具有发生改变的温度曲线。此类AfGA变体有利地用于需要高温的烘焙或其他工艺中。表达水平和酶活性可使用本领域的技术人员已知的标准测定法(包括下文公开的那些)评估。

3.AfGA及其变体的制备

AfGA或其变体可从宿主细胞分离，例如通过AfGA或变体从宿主细胞分泌而分离。包含AfGA或其变体的培养的细胞材料可在AfGA或变体从宿主细胞分泌后获得。AfGA或其变体任选地在使用之前进行纯化。可根据本领域所熟知的方法克隆和表达AfGA基因。合适的宿主细胞包括细菌、植物或酵母细胞，例如丝状真菌细胞。特别有用的宿主细胞包括里氏木霉。里氏木霉宿主细胞相比于天然表达的AfGA烟曲霉以更高或至少相当的水平表达AfGATR。

在一些实施例中，AfGA以至少10克/升在宿主中异源表达。在一些实施例中，AfGA以至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100或110克/升异源表达。在一些实施例中，AfGA在里氏木霉宿主中异源表达，其中所述表达为至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100或110克/升。在一些实施例中，AfGA在曲霉宿主中异源表达，其中所述表达为至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100或110克/升。

宿主细胞还可表达编码同源或异源淀粉酶(即与宿主细胞不是同一物种的淀粉酶)或一种或多种其他酶。所述淀粉酶可为变体淀粉酶。另外，宿主可表达一种或多种辅助性酶、蛋白质、肽。这些可有益于液化、糖化、发酵、SSF等工艺。此外，宿主细胞除了产生用于消化一种或多种碳原料的酶外还可产生生化物质。这种宿主细胞可用于发酵工艺或同时糖化发酵工艺以减少或消除对添加酶的需要。

3.1.载体

可构建包含编码AfGA或其变体的核酸的DNA构建体以在宿主细胞中表达。编码AfGA1的代表性核酸包括SEQ ID NO:8。编码AfGA2的代表性核酸包括SEQ ID NO:14。由于众所周知的遗传密码的简并性，编码相同氨基酸序列的变体多核苷酸可以常规技能进行设计和制备。针对特定宿主细胞来优化密码子使用也是本领域众所周知的。可将编码AfGA或其变体的核酸整合到载体中。可用众所周知的转化技术，如下面公开的那些技术将载体转移至宿主细胞。

载体可以是任何可转化进宿主细胞中并且在宿主细胞内复制的载体。例如，作为使载体增殖和扩增的手段，可将包含编码AfGA或其变体的核酸的载体转化进细菌宿主细胞中并在细菌宿主细胞中复制。还可将载体转化进表达宿主中，使得编码核酸可表达为功能性AfGA或其变体。充当表达宿主的宿主细胞可包括例如丝状真菌。美国真菌遗传资源中心(FungalGenetics Stock Center,FGSC)菌株目录列出了适于在真菌宿主细胞中表达的载体。参见网址为www.fgsc.net的FGSC,Catalogue of Strains,University ofMissouri(密苏里大学菌株目录)(2007年1月17日进行了最后的修改)。代表性载体包括pJG222(Trex3gM-AfGA1)(图2)和pJG313(Trex3gM-AfGA2)(图10)，其各自包含pTrex3gM表达载体(已公布美国申请No.2011/0136197A1)，并且允许编码AfGA的核酸在cbh1启动子的控制下在真菌宿主中表达。可以用常规技能修饰pJG222和pJG313以包含编码AfGA变体的核酸且表达该核酸。

可将编码AfGA或其变体的核酸与合适的启动子可操作地连接，使其可以在宿主细胞中转录。该启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。对于在真菌宿主中的转录，可用的启动子的例子是源自编码如下酶的基因的那些启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉菌中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。当在细菌物种如大肠杆菌中表达编码AfGA或其变体的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)选择合适的启动子。适用于在酵母物种中表达的启动子的例子包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子，以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。图2中所示的pJG222载体例如含有可操作地连接至AfGA1的cbh1启动子。图10中所示的pJG313载体例如含有可操作地连接至AfGA2的cbh1启动子。cbh1是来自里氏木酶的内源性诱导型启动子。参见Liu等人，(2008)，“Improved heterologous gene expression in Trichodermareesei by cellobiohydrolase I gene(cbh1)promoter optimization”(“通过纤维二糖水解酶I基因(cbh1)启动子优化改进异源基因在里氏木霉中的表达”)，Acta Biochim.Biophys.Sin(《生物化学与生物物理学学报》)(上海)40(2):158-65。

可将编码序列与信号序列可操作地连接。编码信号序列的DNA可以是与待表达的AfGA基因天然相关的DNA序列。例如，该DNA可编码可操作地连接至编码AfGA或其变体的核酸的SEQ ID NO:11的AfGA1和AfGA2信号序列。该DNA编码来自非烟曲霉物种的信号序列。构成DNA构建体或载体的信号序列或启动子序列可被引入进真菌宿主细胞并且可源自相同来源。例如，该信号序列是与cbh1启动子可操作地连接的cbh1信号序列。

表达载体也可包含与编码AfGA或其变体的DNA序列可操作地连接的合适的转录终止子以及(在真核生物中)多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可适宜地源自与启动子相同的来源。

载体还可包含使得载体能在宿主细胞中复制的DNA序列。这类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可包含可选标记，例如其产物能补足分离的宿主细胞中的缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的dal基因，或者赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包含曲霉属选择标记，如amdS、argB、niaD和sC(产生潮霉素抗性的标记)，或者可通过例如本领域已知的共转化实现选择。参见例如PCT国际专利申请WO 91/17243。

细胞内表达在一些方面可能是有利的，例如当将某些细菌或真菌用作宿主细胞来产生大量用于后续纯化的AfGA或其变体时。AfGA或其变体向培养基中的细胞外分泌也可用来制备包含分离的AfGA或其变体的培养的细胞材料。

表达载体通常包含克隆载体的组分，例如，在选择的宿主生物中允许载体自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型可检测标记。表达载体通常包含控制核苷酸序列，例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或一个或多个激活基因。另外，表达载体可包含能够将AfGA或其变体靶向到宿主细胞细胞器(例如过氧化物酶体)、或靶向到特定宿主细胞区室的氨基酸序列的编码序列。这种靶向序列包括但不限于丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸(SKL)序列，其为已知的过氧化物酶体目标信号。为在控制序列的指导下表达，AfGA或其变体的核酸序列以适于表达的方式可操作地连接到控制序列。

用于分别连接编码AfGA或其变体的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的操作，和用于将它们插入含有复制所必需的信息的合适载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等人，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL(《分子克隆：实验室手册》)，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor),1989，以及第3版，2001)。

3.2.宿主细胞的转化和培养

包含DNA构建体或表达载体的里氏木霉宿主细胞有利地在重组生产AfGATR或其变体的过程中用作宿主细胞。可用编码该酶的DNA构建体，方便地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合进宿主染色体中来转化该细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更有可能在细胞中稳定地维持。可根据常规方法，例如通过同源或异源重组，将DNA构建体整合进宿主染色体中。作为另一种选择，可使用针对不同类型的宿主细胞的上述表达载体对细胞进行转化。

从表达宿主中去除基因是有利的，其中该基因缺陷可由转化的表达载体补救。可使用已知的方法来获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或者通过任何其他能使基因对其预定目的而言无功能从而防止该基因表达功能蛋白的手段，来实现基因失活。可去除来自已被克隆的木霉属物种或其他丝状真菌宿主的任何基因，例如cbh1基因、cbh2基因、egl1基因和egl2基因。可通过用本领域已知的方法将某种形式的所需的待失活基因插入进质粒中来完成基因缺失。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括以下技术：例如转化；电穿孔；细胞核显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导和DEAE-葡聚糖介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀物一起温育；用DNA包被的微粒子弹进行高速轰击；和原生质体融合。通用的转化技术是本领域已知的。参见例如Sambrook等人，(2001)，同上。异源蛋白在木霉属中的表达例如在美国专利No.6,022,725中描述。关于曲霉菌株的转化，也参考Cao等人，(2000)Science(《科学》)9:991-1001。可用载体系统构建遗传上稳定的转化株，编码AfGA或其变体的核酸由此稳定地整合进宿主细胞染色体中。然后通过已知的技术选择和纯化转化株。

制备用于转化的木霉属物种例如可涉及从真菌菌丝体制备原生质体。参见Campbell等人，(1989)Curr.Genet(《当代遗传学》)，16:53-56。菌丝体可从萌发的营养孢子获得。可用能消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而得到原生质体。通过在悬浮介质中存在渗透稳定剂来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨糖醇、甘露糖醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M至1.2M之间变动，例如可将1.2M的山梨糖醇溶液用于悬浮介质中。

宿主木霉属物种菌株对DNA的摄取取决于钙离子浓度。一般而言，摄取溶液中使用约10-50mM CaCl₂。另外的合适的化合物包括缓冲体系，如TE缓冲液(10mM Tris,pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS,pH 6.0和聚乙二醇。聚乙二醇据信可融合细胞膜，从而允许介质的内容物得以递送进木霉属物种菌株的细胞质中。所述融合经常使质粒DNA的多个拷贝整合进宿主染色体中。

通常，木霉属物种的转化通常以10⁵至10⁷/mL、特别是2×10⁶/mL的密度使用已经经历渗透处理的原生质体或细胞。可将100μL体积的在适当溶液(例如1.2M山梨糖醇和50mM CaCl₂)中的这些原生质体或细胞与所需的DNA混合。一般而言，向摄取溶液添加高浓度的PEG。可向原生质体悬浮液中添加0.1至1体积的25％PEG 4000；然而，有用的是向原生质体悬浮液中添加约0.25体积。也可向摄取溶液添加添加剂如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等以助于转化。存在可用于其他的真菌宿主细胞的类似的程序。参见例如美国专利No.6,022,725。

3.3.表达

产生AfGATR或其变体的方法可包括在有利于产生所述酶的条件下培养如上所述的里氏木霉宿主细胞并从所述细胞和/或培养基回收所述酶。里氏木霉宿主细胞相比于天然表达的AfGA烟曲霉以更高或至少相当的水平表达AfGATR。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于培养所考虑的宿主细胞和获得AfGATR或其变体的表达的常规培养基。合适的培养基和培养基组分可获自商业供应商或可根据公布的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述的配方)制备。

从宿主细胞分泌的酶可用于全发酵液制备。在本发明的方法中，使用任何本领域已知的导致葡糖淀粉酶表达的培养方法，可实现重组微生物的耗尽的全发酵液的制备。因此，可将发酵理解为包括在合适培养基中以及在允许葡糖淀粉酶表达或分离的条件下进行的在实验室中的摇瓶培养、或在工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)。术语“耗尽的全发酵液”在本文中被定义为发酵材料的未分级分离的内容物，包括培养基、细胞外蛋白(例如酶)和细胞生物质。应当理解，术语“耗尽的全发酵液”还涵盖了已使用本领域熟知的方法裂解的或经透化处理的细胞生物质。

可通过公知的方法从培养基中方便地回收分泌自宿主细胞的酶，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，以及借助于诸如硫酸铵之类的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换色谱、亲和色谱等之类的色谱方法。

载体中编码AfGA或其变体的多核苷酸可与能够使宿主细胞表达所述编码序列的控制序列可操作地连接，即所述载体是表达载体。控制序列可例如通过添加其他转录调控元件进行修饰，从而使控制序列所指导的转录水平对转录调节因子的响应更灵敏。控制序列尤其可包含启动子。

宿主细胞可在允许AfGATR或其变体表达的合适条件下培养。酶的表达可以是组成型的，使得它们可以连续生产；或可以是诱导型的，从而需要刺激物来引发表达。就诱导型表达而言，蛋白质的产生可在需要时通过例如向培养基添加诱导物质(例如地塞米松或IPTG或Sepharose)来引发。多肽也可以在体外无细胞体系(如TNT^TM(普洛麦格公司(Promega))兔网织红细胞体系)中重组产生。

表达宿主也可在适合该宿主的培养基中、在有氧条件下进行培养。可以提供振荡或者搅拌和通风的组合，在适合所述宿主的温度例如约25℃至约78℃(例如30℃至45℃)下进行生产，这取决于宿主的需要以及制备所需AfGATR或其变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任何小时值，如24至72小时)。通常，培养发酵液的pH为约4.0至约8.0，这也取决于与AfGATR或其变体的制备相关的宿主所需的培养条件。

3.4.AfGATR活性的鉴定

为了评价AfGATR或其变体在宿主细胞中的表达，可用测定法测量所表达的蛋白质、相应的mRNA或葡糖淀粉酶活性。例如，合适的测定法包括使用经适当标记的杂交探针进行的Northern印迹、逆转录酶聚合酶链反应和原位杂交。合适的测定法还包括测量样品中的AfGATR活性，例如通过直接测量培养基中的还原糖如葡萄糖的测定法来进行。例如，葡萄糖浓度可用葡萄糖试剂盒No.15-UV(西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.))或仪器如Technicon自动分析仪测定。葡糖淀粉酶活性还可通过任何已知的方法如下文描述的PAHBAH测定法或ABTS测定法来测量。

3.5.纯化AfGATR及其变体的方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法来制备浓缩的含AfGATR或变体葡糖淀粉酶多肽的溶液。

发酵后，获得发酵液，并通过常规分离技术除去微生物细胞和各种悬浮的固形物(包括残余的发酵原料)以获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、转鼓真空过滤、超滤、离心并随后进行超滤、提取或色谱法等。

可取的是浓缩含AfGATR或变体葡糖淀粉酶多肽的溶液以优化回收率。使用未浓缩的溶液可能需要增加温育时间以便收集纯化的酶沉淀物。

使用常规的浓缩技术浓缩含酶溶液直到获得所需的酶含量。可通过任何本文论述的技术实现含酶溶液的浓缩。纯化的示例性方法包括但不限于旋转式真空过滤和/或超滤。

将酶溶液浓缩成浓缩酶溶液直至所述浓缩的含AfGATR或变体葡糖淀粉酶多肽的溶液的酶活性处于所需的水平。

可使用例如沉淀剂(例如金属卤化物沉淀剂)进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。示例性的金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾，和这些金属卤化物中两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。

金属卤化物沉淀剂以能有效地使AfGATR或其变体沉淀的量使用。在常规测试后选择能有效引起酶沉淀的金属卤化物的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件(包括温育时间、pH、温度和酶浓度)，对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。

一般而言，向浓缩的酶溶液添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，通常是至少8％w/v。一般而言，向浓缩的酶溶液添加不超过约25％w/v的金属卤化物，通常是不超过约20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最佳浓度将取决于尤其是具体AfGATR或变体葡糖淀粉酶多肽的性质以及其在浓缩的酶溶液中的浓度。

使该酶沉淀的另一备选途径是使用有机化合物。示例性的有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯，以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。所述有机化合物沉淀剂的添加可以在添加金属卤化物沉淀剂之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加可相继进行或同时进行。

通常，有机沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(如钠或钾盐)，和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基含有1至12个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂可以是(例如)4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯(其中烷基含有1至10个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。示例性的有机化合物为4-羟基苯甲酸的直链烷基酯(其中烷基含有1至6个碳原子)以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲酯、4-羟基苯甲酸的丙酯、4-羟基苯甲酸的丁酯、4-羟基苯甲酸的乙酯以及这些有机化合物中两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(名为对羟基苯甲酸甲酯)和4-羟基苯甲酸丙酯(名为对羟基苯甲酸丙酯)，它们也都是淀粉酶防腐剂。有关进一步的描述，参见例如美国专利No.5,281,526。

就pH、温度、AfGATR或变体葡糖淀粉酶多肽浓度、沉淀剂浓度和温育时间而言，添加有机化合物沉淀剂提供了沉淀条件高度灵活的优势。

有机化合物沉淀剂以能通过金属卤化物沉淀剂有效地改善酶沉淀的量使用。按照本公开，在常规测试后选择有机化合物沉淀剂的至少有效量和最适量，以及最大回收率的沉淀条件(包括温育时间、pH、温度和酶浓度)，对于本领域中的普通技术人员来说将是显而易见的。

一般而言，向浓缩酶溶液添加至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，通常是至少约0.02％w/v。一般而言，向浓缩酶溶液添加不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，通常是不超过约0.2％w/v。

可以调节含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩多肽溶液的pH，该pH将必然取决于待纯化的酶。通常，将pH调节至葡糖淀粉酶等电点附近的水平。可将pH调节在低于等电点(pI)约2.5pH单位至高于等电点约2.5pH单位的pH范围内的某个pH。

获得纯化的酶沉淀物所需的温育时间取决于具体酶的性质、酶浓度以及具体的一种或多种沉淀剂及其浓度。通常，有效沉淀酶的时间介于约1至约30小时之间；通常不超过约25小时。在存在有机化合物沉淀剂的情况下，温育时间还可以减至低于约10小时，在大多数情况下甚至是约6小时。

通常，温育期间的温度介于约4℃至约50℃之间。通常，在约10℃至约45℃之间(例如约20℃至约40℃之间)的温度下进行所述方法。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和该酶或所用的一种或多种沉淀剂而变化。

通过搅拌包含该酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液来改善纯化的酶沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的温育期过程中进行搅拌步骤。合适的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强力通风或任何类似的技术。

在温育期后，接着可将已纯化的酶与解离的颜料和其他杂质分离，并通过常规分离技术(诸如过滤、离心、微滤、旋转式真空过滤、超滤、压滤、跨膜微滤、错流膜微滤等)进行收集。可以通过用水洗涤沉淀物获得对纯化的酶沉淀物的进一步纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水、或者用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶沉淀物。

在发酵过程中，AfGATR或变体葡糖淀粉酶多肽积聚在培养发酵液中。为了分离和纯化所需的AfGATR或变体葡糖淀粉酶，将培养发酵液离心或过滤以除去细胞，并将所得的无细胞液用于酶纯化。在一个实施例中，使用约70％饱和度的硫酸铵对该无细胞培养液进行盐析；然后将该70％饱和度沉淀级分溶解于缓冲液中并施加至诸如Sephadex G-100柱的柱上，并洗脱以回收酶活性级分。为了进一步的纯化，可使用诸如离子交换色谱的常规方法。

纯化后的酶可用于衣物洗涤和清洁应用。例如，它们可以用于衣物洗涤剂和去渍剂中。可以将它们制成液体(溶液、浆液)或固体(颗粒、粉末)形式的终产品。

纯化的更具体的例子在Sumitani等人，(2000)“New type of starch-binding domain:the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp.195glucoamylase contributes to starch binding and raw starch degrading”(“新型淀粉结合域：芽孢杆菌属物种195葡糖淀粉酶的C端区域中的直接重复基序有助于淀粉结合和生淀粉降解”)，Biochem.J.(《生物化学杂志》)350:477-484中有所描述并在这里进行简要概括。用80％饱和度的(NH₄)₂SO₄处理从4升变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24培养上清液获得的酶。通过在10,000×g(20分钟和4℃)离心而回收沉淀物，并且将其重新溶解于含有5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)中。然后用相同的缓冲液对溶解的沉淀进行透析。然后将透析过的样品施加到先前已用含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡的Sephacryl S-200柱上，然后用相同缓冲液以7mL/h的线性流速洗脱。收集来自该柱的级分，然后评估其按酶测定法和SDS-PAGE判断的活性。按如下方式进一步纯化蛋白质。Toyopearl HW55柱(美国宾夕法尼亚州蒙哥马利市东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience,Montgomeryville,PA)；目录No.19812)用含5mMCaCl₂和1.5M(NH₄)₂SO₄的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡。用在含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCL缓冲液(pH 7.0)中线性梯度为1.5至0M(NH₄)₂SO₄洗脱酶。收集活性级分，并且用80％饱和度的(NH₄)₂SO₄使酶沉淀。如上所述对沉淀物进行回收、重新溶解和透析。然后将透析后的样品施加到Mono Q HR5/5柱(安发玛西亚生物技术公司(AmershamPharmacia)；目录No.17-5167-01)，所述柱先前已用含5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)以60mL/h的流速进行了平衡。收集活性级分，并将其添加到1.5M(NH₄)₂SO₄溶液中。使活性酶级分如前所述在Toyopearl HW55柱上重新层析，得到如通过SDS-PAGE确定的均质酶。参见Sumitani等人，(2000)Biochem.J.(《生物化学杂志》)350:477-484，以了解其方法和变化的一般性讨论。

对于生产规模的回收，可如上一般性地描述，通过用聚合物絮凝除去细胞而对AfGATR或变体葡糖淀粉酶多肽进行部分纯化。作为另一种选择，可使用可用的膜和设备通过微滤、接下来通过超滤浓缩而对该酶进行纯化。然而，对于某些应用，无需对酶进行纯化，并且无需进一步处理即可对全发酵液培养物进行溶解和使用。然后可将酶加工成(例如)颗粒。

4.AfGATR及其变体的组合物和用途

AfGATR及其变体可用于多种工业应用。例如，AfGATR及其变体可用于淀粉转化工艺，尤其是用于已经过液化的淀粉的糖化工艺。所需的终产物可以是任何可通过淀粉底物的酶促转化产生的产物。例如，所需的产品可以是富含葡萄糖的糖浆，其可以用于其他过程中，例如HFCS的制备，或者其可以转化成多种其他有用的产品，例如抗坏血酸中间体(例如，葡糖酸盐；2-酮基-L-古洛糖酸；5-酮基-葡糖酸盐；和2,5-二酮基葡糖酸盐)；1,3-丙二醇；芳族氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如，乳酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、异柠檬酸盐和草酰基乙酸盐)；氨基酸(例如，丝氨酸和甘氨酸)；抗生素；抗微生物剂；酶；微生物；和激素。

淀粉转化工艺可以是设计用于制备燃料用酒精或饮用酒精(即适于饮用的酒精)的发酵工艺的先导步骤或与发酵加工同时进行。本领域技术人员知悉可用于制备这些终产物的各种发酵条件。AfGATR及其变体也可用于食品制备的组合物和方法中。AfGATR及其变体的这些各种用途在下文更详细地描述。

4.1.淀粉底物的制备

本领域普通技术人员熟知可用于制备在本文公开的工艺中使用的淀粉底物的可用方法。例如，可用的淀粉底物可获自块茎、根、茎、豆类、谷物或全谷粒。更具体而言，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、蜀黍、西米、小米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。玉米含有约60-68％淀粉；大麦含有约55-65％淀粉；小米含有约75-80％淀粉；小麦含有约60-65％淀粉；并且精米含有70-72％淀粉。具体涵盖的淀粉底物有玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是磨碎的或者是完整的，包括玉米固形物，如玉米籽粒、麩皮和/或穗轴。淀粉可以是来自淀粉精制过程的高度精制的生淀粉或原料。各种淀粉也可市售获得。例如，玉米淀粉可获自赛力事达(Cerestar)、西格玛(Sigma)和日本片山化学工业株式会社(Katayama Chemical Industry Co.(Japan))；小麦淀粉可获自西格玛；甘薯淀粉可获自日本和光纯药工业株式会社(WakoPure Chemical Industry Co.(Japan))；并且马铃薯淀粉可获自NakaariChemical Pharmaceutical Co.(日本)。

淀粉底物可以是来自经碾磨的全谷粒的粗淀粉，其含有非淀粉级分例如胚残余物和纤维。碾磨包括湿磨或干磨或研磨。在湿磨中，可将全谷粒浸泡在水或稀酸中以将谷粒分离为其组分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、籽粒纤维。湿磨能有效地分离胚芽和粗粉(即淀粉颗粒和蛋白质)，并可尤其适合于制备糖浆。在干磨或研磨中，将完整籽粒研磨成细粉并通常在不将谷粒分级为其组成部分的情况下进行加工。在一些情况下，回收来自籽粒的油。干磨谷粒除了包含淀粉外通常还将包含大量的非淀粉碳水化合物。干磨淀粉底物可用于生产乙醇和其他生化物质。待加工的淀粉可以为高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％的纯度。

4.2.淀粉的糊化和液化

如本文所用，术语“液化”意指将淀粉转化为粘性较小且链长较短的糊精的过程。一般而言，该过程涉及淀粉的糊化，同时添加α-淀粉酶或在糊化后添加α-淀粉酶，但任选可添加另外的诱导液化的酶。在一些实施例中，将如上所述制备的淀粉底物用水调成浆液。该淀粉浆液可含有干固形物重量百分比为约10-55％、约20-45％、约30-45％、约30-40％或约30-35％的淀粉。可用例如计量泵将α淀粉酶(EC 3.2.1.1)添加至该浆液。通常用于该应用的α淀粉酶是热稳定性的细菌α淀粉酶，如嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶。α-淀粉酶通常以例如约1500单位/kg淀粉干物质供应。为了优化α淀粉酶的稳定性和活性，通常将浆液的pH调节至约pH 5.5-6.5，并且通常添加约1mM的钙(约40ppm的游离钙离子)。嗜热脂肪土芽孢杆菌变体或其他α-淀粉酶可能需要不同的条件。可通过多种方法，包括降低后续反应步骤中的pH或在酶依赖于钙的情形中通过移除钙来使液化后保留在浆液中的细菌α-淀粉酶灭活。

淀粉加α-淀粉酶的浆液可连续泵送通过被蒸汽加热至105℃的喷射蒸煮器。在这些条件下快速地发生糊化，并且酶促活性结合剪切力开始淀粉底物的水解。在喷射蒸煮器中的停留时间是短暂的。可使部分糊化的淀粉通过维持在105-110℃下的一系列保持管并保持5-8分钟以完成糊化过程(“初次液化”)。在85-95℃或更高温度下的保持罐中约1至2小时完成水解至所需的DE(“二次液化”)。这些罐可具有挡板以阻止返混。如本文所用，术语“二次液化的分钟数”是指自二次液化开始时起至测量右旋糖当量(DE)时所耗费的时间。然后让浆液冷却至室温。所述冷却步骤可为30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。

由上述工艺获得的液化淀粉通常包含约98％的低聚糖和约2％的麦芽糖和0.3％的D-葡萄糖。液化的淀粉通常是浆液的形式，该浆液具有的干固形物含量(w/w)为约10-50％、约10-45％、约15-40％、约20-40％、约25-40％或约25-35％。

AkAA、AtAmy1、AfAmy1和AcAmy1及其变体可在液化工艺中代替细菌α淀粉酶使用。用这些α-淀粉酶及其变体液化有利地可在低pH下进行，从而消除了对将pH调节至约pH 5.5-6.5的需要。这些α-淀粉酶及其变体可用于pH范围为2至7，例如pH 3.0-7.5、pH 4.0-6.0或pH 4.5-5.8下的液化。它们可在约85℃-95℃、例如85℃、90℃或95℃的温度范围下维持液化活性。例如，可利用800μg AcAmy1或其变体在25％DS玉米淀粉溶液中，例如在pH 5.8和85℃或者pH 4.5和95℃下进行液化10分钟。液化活性可用多种本领域已知的粘度测定法中的任一种测定。

4.3.糖化

可使用AfGATR及其变体，任选地在另外的酶的存在下将液化淀粉糖化成富含较低DP、尤其是DP1糖的糖浆。糖化产物的确切组成取决于所用酶的组合以及所处理的颗粒淀粉的类型。有利的是，可使用所提供的AfGATR及其变体获得的糖浆，其可含有的DP1占糖化淀粉中的总低聚糖的重量百分比超过约65％，例如70％、80％、85％、90％、95％或96％。

尽管液化通常以连续工艺运行，但糖化通常以分批工艺进行。糖化通常在约55-75℃的温度和约4.0-6.7的pH，例如pH 5.0下最有效，必须冷却和调节经液化的淀粉的pH。糖化可例如在约40℃、约55℃或约65℃至约约70℃、约75℃或约80℃之间的温度下进行。糖化通常在搅拌槽中进行，所述搅拌槽可能花费数小时来装填或排空。酶通常在装填罐时以与干固形物的固定比率添加，或者在装填阶段开始时以单次计量添加。用以制备糖浆的糖化反应通常运行约24-72小时，例如24-48小时。当已经获得最大DE或所需DE时，通过例如加热至85℃持续5分钟来终止反应。进一步温育将导致更低的DE，最终至约90DE，这是因为积聚的葡萄糖经由酶促逆转反应和/或利用热力学平衡方法而重新聚合为异麦芽糖和/或其他逆转产物。当使用AfGATR多肽或其变体时，最佳地在约40℃至约80℃的温度范围、例如约55℃至约75℃或者约65℃至约70℃下进行糖化。可在约pH3.0至约pH 7.5的pH范围内、例如pH 3.5-pH 7.0、pH 4.0-pH 6.7、或pH5.0下进行糖化。

AfGATR或其变体可添加至组合物形式的浆液中。AfGATR或其变体能够以约0.6-10ppm干固形物、例如2ppm干固形物的量添加至颗粒淀粉底物的浆液。AfGATR或其变体可以作为全发酵液，澄清的酶、部分纯化的酶或纯化的酶添加。纯化的AfGATR或其变体的比活性可以为约187.7U/mg，例如用ABTS测定法测得。纯化的AfGA2TR或其变体的比活性可以为约213.7U/mg，例如用ABTS测定法测得。AfGATR或其变体还可以作为全发酵液产物添加。

AfGATR或其变体可以作为分离的酶溶液添加至浆液。例如，AfGATR或其变体能够以由表达AfGATR或其变体的宿主细胞产生的培养细胞材料的形式添加。AfGATR或其变体还可以在发酵或SSF工艺过程中由宿主细胞分泌进反应介质中，使得酶被连续提供进反应物中。产生和分泌AfGATR或其变体的宿主细胞也可以表达另外的酶，例如葡糖淀粉酶。例如，美国专利No.5,422,267公开了酵母中的葡糖淀粉酶在制备酒精饮料中的用途。例如，在糖化期间，宿主细胞如里氏木霉可经过工程改造以共表达AfGATR或其变体和α-淀粉酶，包括但不限于AkAA、AcAmy1、天然里氏木霉α-淀粉酶或其变体。宿主细胞可经遗传修饰从而不表达其内源葡萄糖淀粉酶和/或其他酶、蛋白质或其他物质。可对宿主细胞进行工程改造以表达多种不同的糖解酶。例如，重组酵母宿主细胞可包含编码葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、利用戊糖的酶、α淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶和/或异支链淀粉酶的核酸。参见例如WO 2011/153516 A2。

4.4.异构化

通过用AfGATR或其变体处理而产生的可溶性淀粉水解产物可转化为高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，如高果糖玉米糖浆(HFCS)。这种转化可以使用葡萄糖异构酶实现，特别是固定在固相载体上的葡萄糖异构酶。将pH增加至约6.0至约8.0，例如pH 7.5，并通过离子交换移除Ca²⁺。合适的异构酶包括IT(诺维信公司(Novozymes A/S))；IMGI，和G993、G993、G993液体和IGI。异构化后，混合物通常含有约40-45％果糖，例如42％果糖。

4.5.发酵

可溶性淀粉水解产物，尤其是富含葡萄糖的糖浆可通过使淀粉水解产物与发酵生物体，通常在约32℃(例如30℃至35℃)的温度下接触来发酵。EOF产物包括代谢物，例如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸-δ-内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其他氨基酸、ω3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇和生物材料。

产乙醇微生物包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母如酿酒酵母和细菌例如运动发酵单胞菌(Zymomonas moblis)。产乙醇微生物可表达可将木糖转化为木酮糖的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶。产乙醇微生物的改良菌株(例如，可经受较高的温度)是本领域已知的并且可以使用。参见Liu等人，(2011)《生物工程学报》(Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao)27(7):1049-56。酵母的商业来源包括ETHANOL(LeSaffre)；(Lallemand)；RED(Red Star)；(DSM Specialties)；和(Alltech)。通过发酵产生其他代谢物如柠檬酸和乳酸的微生物也是本领域已知的。参见例如Papagianni(2007)“Advances in citric acidfermentation by Aspergillus niger:biochemical aspects,membrane transport andmodeling”(“利用黑曲霉在柠檬酸发酵中的进展：生物化学方面、膜传输和建模”)，Biotechnol.Adv.(《生物技术进展》)，25(3):244-63；John等人，(2009)“Direct lactic acid fermentation:focus on simultaneoussaccharification and lactic acid production”(“直接乳酸发酵：聚焦于同时糖化和乳酸产生”)，Biotechnol.Adv.(《生物技术进展》)，27(2):145-52。

糖化和发酵过程可作为SSF工艺进行。发酵可包括例如后续的乙醇纯化和回收。在发酵过程中，发酵液或“啤酒”的乙醇含量可以达到约8-18％v/v，例如14-15％v/v。可蒸馏发酵液以生产富集的(例如96％纯度的)乙醇溶液。另外，发酵产生的CO₂可用CO₂洗气器收集、压缩并销售以供其他用途，例如使饮料碳酸化或制备干冰。来自发酵过程的固体废物可用作富含蛋白质的产品，例如家畜饲料。

如上面所提及的，可用在整个SSF期间连续表达和分泌AfGATR或其变体的真菌细胞、例如里氏木霉进行SSF工艺。表达AfGATR或其变体的真菌细胞也可以是发酵微生物，例如产乙醇微生物。因而可用表达足够AfGATR或其变体的真菌细胞进行乙醇生产，使得需要从外面添加较少的酶或不需要从外面添加酶。真菌宿主细胞可来自经适当工程改造的真菌菌株。还可以使用表达和分泌除AfGATR或其变体之外的其他酶的真菌宿主细胞。这类细胞可表达α-淀粉酶和/或支链淀粉酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、除AfGATR之外的葡糖淀粉酶或其他酶。

所述工艺的一种变型是“补料分批发酵”系统，其中随着发酵进行递增地添加底物。当降解物阻遏可能会抑制细胞的代谢时和在希望在培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。补料分批系统中实际底物浓度通过诸如pH、溶解氧、和废气(如CO₂)分压的可测量因素的变化估计。分批发酵和补料分批发酵是本领域普通且公知的。

连续发酵是开放系统，其中限定的发酵培养基被连续地添加到生物反应器，并同时移取等量的经调理的培养基用于加工。连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵使得能调节细胞生长和/或产物浓度。例如，以固定的速率维持限制性营养物如碳源或氮源，并允许所有其他参数调节。因为生长保持处于稳态，由于培养基抽取引起的细胞损失应该相对于发酵中的细胞生长速率保持平衡。优化连续发酵工艺以及使产物形成速率最大化的方法是工业微生物学领域所熟知的。

4.6.包含AfGATR或其变体的组合物

AfGATR或其变体可与α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)组合。在一些实施例中，所述α-淀粉酶是酸稳定性α淀粉酶，其当以有效量添加时在3.0至7.0并且优选3.5至6.5的pH范围内具有活性。α淀粉酶可为真菌α-淀粉酶或细菌α-淀粉酶。此外，α-淀粉酶可为野生型α-淀粉酶或其变体。

真菌α淀粉酶的优选例子包括获自丝状真菌菌株的那些，所述菌株包括但不限于如下菌株：曲霉属(例如，黑曲霉、白曲霉和米曲霉)；木霉属物种、根霉属物种、毛霉属物种和青霉属物种、乳酸杆菌属物种和链霉菌属物种。酸稳定性α-淀粉酶可源自细菌菌株。优选的细菌菌株包括芽孢杆菌属物种，例如地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)和凝结芽孢杆菌(B.coagulans)。特别优选的是地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在本发明的组合物和方法中使用的细菌α淀粉酶之一可包括以下文献中描述的α-淀粉酶之一：美国专利No.5,093,257、5,763,385、5,824,532、5,958,739、6,008,026、6,093,563、6,187,576、6,361,809、6,867,031；美国公开No.2006/0014265；和国际PCT No.WO 96/23874、WO 96/39528、WO 97/141213、WO 99/19467和WO 05/001064。

示例性的α-淀粉酶包括AkAA或AcAmy1及其变体，其具有优异的比活性和热稳定性。AkAA的合适变体包括具有α-淀粉酶活性且与野生型AkAA具有至少80％、90％、95％、98％或至少99％序列同一性的那些。AcAmy1的合适变体包括具有α-淀粉酶活性且与野生型AcAmy1具有至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的那些。AfGATR及其变体有利地提高由AnGA或Tr-GA催化的糖化过程中产生的葡萄糖的收率。

预期用于所述组合物和方法中的市售的α淀粉酶包括：SPEZYME^TMAA；SPEZYME^TM FRED；SPEZYME^TM XTRA；GZYME^TM 997；和CLARASE^TM L(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))；TERMAMYL^TM 120-L、LC和SC和SUPRA(诺维信生物技术公司(Novozymes Biotech))；LIQUOZYME^TM X和SAN ^TMSUPER(诺维信公司(Novozymes A/S))和Fuelzyme ^TM LF(狄瓦沙公司(Diversa))。在一些实施例中，α淀粉酶将包括源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶，例如SPEZYME^TMAA、SPEZYME^TM FRED或SPEZYME^TM XTRA。在一些实施例中，酶组合物将包括BP-WT、SPEZYME^TM XTRA和任选地SPEZYME^TM FRED。在其他实施例中，所述组合物将包括BP-17、SPEZYME^TM XTRA和任选地SPEZYME^TM FRED。

可与AfGATR或其变体一起使用的其他合适的酶包括非AfGATR的葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、异淀粉酶、α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、氧化还原酶或它们的组合。

例如，脱支酶如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)，例如可以以本领域技术人员熟知的有效量添加。支链淀粉酶通常以100U/kg干固形物添加。支链淀粉酶通常由芽孢杆菌物种分泌。描述了脱支芽孢杆菌(Bacillusderamificans)(美国专利#5,817,498；1998)、嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)(欧洲专利#0 063 909)和长野芽孢杆菌(Bacillusnaganoensis)(美国专利#5,055,403)的示例性支链淀粉酶。商用的具有支链淀粉酶活性的酶产生自例如芽孢杆菌物种(商品名OPTIMAX ^TM L-1000，来自丹尼斯科·杰能科；和Promozyme^TM，来自诺维信)。

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)淀粉酶/转移酶(BMA)：巨大芽孢杆菌能够将脱支糖转化为容易被葡糖淀粉酶水解的形式。(Habeda R.E.,Styrlund C.R和Teague,W.M.；1988Starch/Starke(《淀粉酶》)，40,33-36)。所述酶在pH 5.5下和75℃的温度下表现出最大活性(David,M.H.,Gunther H和Vilvoorde,H.R.；1987,Starch/Starke(《淀粉酶》)，39436-440)。所述酶已经克隆，表达于基因工程改造的枯草芽孢杆菌中并以商业规模生产(Brumm,P.J.,Habeda R.E和Teague W.M.,1991Starch/Starke(《淀粉酶》)，43 315-329)。该酶以MEGADEX^TM为商品名销售，用于增强使用黑曲霉葡糖淀粉酶对酶液化淀粉进行糖化期间的葡萄糖产率。

异淀粉酶(EC 3.2.1.68)还可以本领域技术人员公知的有效量添加。支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)，例如也是合适的。支链淀粉酶通常以100U/kg干固形物添加。另外合适的酶包括蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括获自曲霉属如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉；毛霉属(例如米黑毛霉(M.miehei))；根霉属；和木霉属的那些蛋白酶。

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切作用生麦芽糖淀粉酶，其催化1,4-α-糖苷键水解成支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，从而释放麦芽糖。已从多种植物和微生物分离了β-淀粉酶。参见Fogarty等人，(1979),PROGRESS ININDUSTRIAL MICROBIOLOGY(《工业微生物学进展》)，第15卷，第112-115页。这些β-淀粉酶具有在40℃至65℃范围内的最佳温度和在约4.5至约7.0范围内的最佳pH。所涵盖的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的β淀粉酶BBA 1500、DBA、Optimalt^TM ME、Optimalt^TMBBA(美国丹尼斯科公司)；和Novozym^TM WBA(诺维信公司)。

5.用于烘焙和食品制备的组合物和方法

本发明还涉及包含AfGATR或其变体的“食品组合物”，包括但不限于食品、动物饲料和/或食品/饲料添加剂，和制备这种食品组合物的方法，包括将AfGATR或其变体与一种或多种食品成分混合，以及所述食品组合物和方法的用途。

所述AfGATR或其变体可用于制备食品组合物，其中该食品组合物在添加了多肽后进行烘焙。本文所用的术语“烘焙组合物”意指任何在提供烘焙食品的工艺中制备的组合物和/或添加剂，包括但不限于烘焙用面粉、面团、烘焙添加剂和/或烘焙产品。食品组合物或者添加剂可以是液体或者固体。

本文所用的术语“面粉”意指磨碎的或者研磨的谷粒。术语“面粉”还可意指已经过研磨或捣碎的西米或者块茎产品。在一些实施例中，面粉除了磨碎的或者捣碎的谷物或者植物物质外，还可以含有多种组分。另外的组分的一个(非限制性的)例子是膨松剂。谷粒包括小麦、燕麦、黑麦和大麦。块茎产品包括木薯(tapioca)面粉、木薯(cassava)面粉和蛋糊(custard)粉。术语“面粉”还包括研磨的玉米面粉、玉蜀黍粗粉、大米面粉、全粗粉(whole-meal flour)、自起发面粉、木薯面粉、木薯面粉、研磨的大米、富集的花和蛋糊粉。

对于面粉用于烘焙和食品生产的商业使用和家庭用途而言，重要的是在面粉中维持适当水平的葡糖淀粉酶活性。活性水平过高可能会导致产品粘乎乎和/或粘成团，从而不能上市。葡糖淀粉酶活性不足的面粉可能不含有足够的糖分来使酵母发挥适当功能，从而导致干燥脆性的面包或者烘焙产品。因此，可将AfGATR或其变体本身或者与一种或多种α淀粉酶组合在一起添加到面粉中，以增大面粉中的内源葡糖淀粉酶活性的水平。

淀粉酶可单独地或者与其他淀粉酶组合在一起添加，以防止或者延缓烘焙产品变陈，即团粒硬化(crumb firming)。抗变陈淀粉酶的量通常将在0.01-10mg酶蛋白/千克面粉的范围内，例如0.5mg/kg干固形物。可与AfGATR或其变体组合使用的另外的抗变陈淀粉酶包括内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。另外的淀粉酶可以是另一产麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如来自芽孢杆菌属。是一种来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的示例性生麦芽糖α-淀粉酶，并且例如在Christophersen等人，(1997)，Starch(《淀粉》)，50:39-45中有描述。抗变陈内切淀粉酶的其他例子包括源自芽孢杆菌属如地衣芽孢杆菌或者解淀粉芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶。抗变陈淀粉酶可以是外切淀粉酶，如β-淀粉酶，例如来自植物来源如大豆，或者来自微生物来源如芽孢杆菌。

包含AfGATR或其变体的烘焙组合物还可包含磷脂酶或具有磷脂酶活性的酶。具有磷脂酶活性的酶的活性可用脂肪酶单位(LU)测量。磷脂酶可具有A₁或A₂活性以从磷脂移除脂肪酸，从而形成溶血磷脂。它可具有或者可不具有脂肪酶活性，即对甘油三酯底物的活性。磷脂酶通常具有在30-90℃范围内、例如30-70℃的最佳温度。所添加的磷脂酶可以是动物来源，例如来自胰腺如牛或猪胰腺、蛇毒或蜂毒。作为另一种选择，磷脂酶可为微生物来源，例如来自丝状真菌、酵母或者细菌。

磷脂酶以能改进面包在烘焙后的最初时期特别是前24小时的松软性的量添加。磷脂酶的量通常将在0.01-10mg酶蛋白/千克面粉的范围内，例如0.1-5mg/kg。也就是说，磷脂酶活性通常将在20-1000LU/kg面粉的范围内，其中脂肪酶单位定义为以阿拉伯树胶作为乳化剂和甘油三丁酸酯作为底物，在30℃，pH 7.0下每分钟释放1微摩尔丁酸所需的酶量。

面团组合物通常包含小麦粗粉或者小麦面粉和/或其他类型的粗粉、面粉或者淀粉，如玉米面粉、玉米淀粉、黑麦粗粉、黑麦面粉、燕麦面粉、燕麦粗粉、大豆面粉、高粱粗粉、高粱面粉、马铃薯粗粉、马铃薯面粉或者马铃薯淀粉。面团可以是新鲜的、冷冻的或者预烘焙的。面团可以是经膨松的面团或者是待膨松的面团。面团可以以各种方式进行膨松，如通过添加化学膨松剂例如碳酸氢钠，或者通过添加发酵剂，即发酵面团。面团还可通过添加合适的酵母培养物进行膨松，如酿酒酵母(面包酵母)的培养物，例如可商购获得的酿酒酵母菌株。

面团还可包含其他常规面团成分，例如蛋白质，如乳粉、面筋和大豆；蛋(例如全蛋、蛋黄或蛋清)；抗氧化剂，如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(ADA)或过硫酸铵；氨基酸，如L-半胱氨酸；糖；或盐，如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。面团还可包含脂肪，例如甘油三酯，如颗粒化脂肪或者起酥油。面团还可包含乳化剂，如甘油单酯或者甘油二酯、甘油单酯或者甘油二酯的二酰基酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、单甘油酯的乳酸酯、单甘油酯的乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯或者溶血卵磷脂。例如，可不添加乳化剂而制备面团。

面团产品可以是任何经加工的面团产品，包括油炸的、深度油炸的、烘烤的、烘焙的、蒸煮的或者煮沸的面团，如蒸煮的面包和米饼。在一个实施例中，食品是烘焙产品。典型的焙烤(经烘焙的)产品包括面包，如枕形面包、小白面包、奶油小圆甜面包、百吉圈、比萨饼基料等、发面点心、椒盐卷饼、未经发酵的玉米饼、蛋糕、小甜饼、脆饼干、薄脆饼干等。

任选地，可将另外的酶与抗变陈淀粉酶和磷脂酶一起使用。另外的酶可以是第二淀粉酶如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶，或者另外的酶可以是肽酶尤其是外肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶例如WO 95/00636中公开的蛋白质二硫键异构酶、例如糖基转移酶、分支酶(1,4-α-葡聚糖分支酶)、4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或者氧化还原酶、例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂肪加氧酶、L-氨基酸氧化酶或者碳水化合物氧化酶。另外的酶可来自任何来源，包括哺乳动物和植物，特别是微生物(细菌、酵母或者真菌)来源，并且可通过本领域常规使用的技术获得。

木聚糖酶通常来自微生物来源，例如源自细菌或者真菌，如曲霉属的菌株。木聚糖酶包括例如和Novozym它们是从里氏木霉生产的市售木聚糖酶制剂。淀粉葡糖苷酶可以为黑曲霉淀粉葡糖苷酶(如)。其他可用的淀粉酶产品包括A 1000或者A 5000(丹麦Grindsted Products)和H或者P(DSM)。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(如)。示例性的蛋白酶是

所述工艺可用于任何种类的从面团制备的烘焙产品，无论是软性的还是脆性的，无论是白的、浅色的还是深色的。例如有面包，特别是白色的、全粗粉或者黑麦面包，通常为枕形面包或者小白面包的形式，如但不限于法国棍子面包类型的面包、皮塔面包、未经发酵的玉米饼、蛋糕、薄烤饼、脆饼干、小甜饼、大馅饼皮、脆面包、蒸面包、披萨等。

AfGATR或其变体可用于预混合料中，所述预混合料包含粉以及抗变陈淀粉酶、磷脂酶和/或磷脂。预混合料可含有其他的改进面团的和/或改进面包的添加剂，例如任何添加剂，包括上述的酶在内。AfGATR或其变体可以是包含抗变陈淀粉酶和磷脂酶、供用作烘焙添加剂的酶制剂的一种组分。

该酶制剂任选为颗粒或者附聚粉末的形式。该制剂可具有窄的粒度分布，超过95％(重量)的粒子在25-500μm的范围内。颗粒和附聚粉末可通过常规方法，如通过将AfGATR或其变体喷洒到流化床制粒机中的载体上来制备。该载体可由具有合适的粒度的颗粒状芯组成。该载体可以是可溶性的或者不溶性的，例如盐(如NaCl或硫酸钠)、糖(如蔗糖或乳糖)、糖醇(如山梨糖醇)、淀粉、大米、玉米渣或者大豆。

包封的粒子，即葡糖淀粉酶粒子可包含AfGATR或其变体。为制备包封的葡糖淀粉酶粒子，可使该酶与食品级脂质接触，该脂质的量足以悬浮全部葡糖淀粉酶粒子。本文所用的食品级脂质可以是任何不溶于水但可溶于非极性有机溶剂(如烃或二乙醚)的天然有机化合物。合适的食品级脂质包括但不限于饱和或者不饱和的、以脂肪或者油形式存在的甘油三酯。构成饱和甘油三酯的各种脂肪酸及其组合的例子包括但不限于丁酸(衍生自乳脂肪)、棕榈酸(衍生自动物和植物脂肪)和/或硬脂酸(衍生自动物和植物脂肪)。构成不饱和甘油三酯的脂肪酸及其组合的例子包括但不限于棕榈油酸(衍生自动物和植物脂肪)、油酸(衍生自动物和植物脂肪)、亚油酸(衍生自植物脂肪)和/或亚麻酸(衍生自亚麻籽油)。其他合适的食品级脂质包括但不限于衍生自以上所讨论的甘油三酯的甘油单酯和甘油二酯，还有磷脂及糖脂。

将食品级脂质尤其是液体形式的食品级脂质与粉末形式的葡糖淀粉酶粒子接触，使得脂质材料覆盖至少大多数、例如100％的葡糖淀粉酶粒子的表面的至少一部分。因此，每个葡糖淀粉酶粒子单独地被包封在脂质中。例如，全部的或者基本上全部的葡糖淀粉酶粒子以有薄的、连续的脂质包封膜的形式提供。这可通过如下来实现：首先将一定量的脂质倒入容器中，然后将葡糖淀粉酶粒子进行调浆，使得脂质彻底湿润葡糖淀粉酶粒子的表面。短暂搅拌后，回收在其表面上携带有大量脂质的包封葡糖淀粉酶粒子。如此施加到葡糖淀粉酶粒子的涂层的厚度，可通过选择所用的脂质类型和当需要时通过重复所述操作以形成较厚的膜来进行控制。

可借助于包装混合料来完成所述加载的递送介质的保存、处理和掺合。包装混合料可包含包封的葡糖淀粉酶。但是，包装混合料还可含有制造商或者面包师所需的另外成分。在包封的葡糖淀粉酶掺合到面团中后，面包师继续进行该产品的正常生产过程。

包封的葡糖淀粉酶颗粒的优点是双重的。首先，对于那些热不稳定的酶，食品级脂质能保护酶免于在烘焙过程中发生热变性。因此，虽然葡糖淀粉酶在醒发和烘焙阶段中得到稳定化和保护，但是它在最终烘焙产品中从保护涂层中被释放出来，在所述产品中水解多葡聚糖中的糖苷键。加载的递送介质还提供活性酶向烘焙产品中的持续释放。也就是说，在烘焙过程之后，活性葡糖淀粉酶继续以能阻碍变陈机制从而降低变陈机制的速率从保护涂层释放出来。

一般而言，施加到葡糖淀粉酶粒子的脂质的量可在葡糖淀粉酶总重量的百分之几到该重量的许多倍之间变动，其取决于脂质的性质、脂质被施加到葡糖淀粉酶粒子的方式、待处理的面团混合物的组成以及所涉及的面团混合操作的激烈程度。

加载的递送介质即脂质包封的酶以能有效延长烘焙产品的货架期的量添加到用来制备烘焙产品的各成分。面包师会计算为实现期望的抗变陈作用而需要的如上所述制备的包封α-淀粉酶的量。所需要的包封葡糖淀粉酶的量是基于包封的酶的浓度和基于所指定的葡糖淀粉酶与面粉的比例来计算。已发现很宽的浓度范围都有效，不过如所讨论，可观察的抗变陈作用的改进与葡糖淀粉酶浓度没有线性对应关系，而在某些最低水平之上，葡糖淀粉酶浓度的大量增加只带来极少的额外改进。在特定烘焙生产中实际使用的葡糖淀粉酶浓度可能比必要的最低量高得多，以给面包师提供一定的保险，防止面包师无意的低测量值误差。酶浓度的下限由面包师希望达到的最低抗变陈作用决定。

一种制备烘焙产品的方法可包括：a)制备脂质包封的葡糖淀粉酶粒子，其中基本上所有的葡糖淀粉酶粒子被包封；b)混合含有面粉的面团；c)在混合完成之前向所述面团添加脂质包封的葡糖淀粉酶并且在从α-淀粉酶除去脂质包膜之前终止混合；d)醒发所述面团；和e)烘焙所述面团以提供烘焙产品，其中所述葡糖淀粉酶在混合、醒发和烘焙阶段是非活性的并且在烘焙产品中是活性的。

包封的葡糖淀粉酶可在混合循环过程中添加到面团，例如在接近混合循环结束时。在混合阶段中的特定时刻添加包封的葡糖淀粉酶，从而允许包封的葡糖淀粉酶充分分布在整个面团中；然而，在保护性涂层从葡糖淀粉酶粒子剥离之前终止所述混合阶段。取决于面团的类型和体积以及混合器作用和速度，可能需要从一分钟到六分钟或者更长时间的任一时间来将包封的葡糖淀粉酶混合到面团中，但平均为两分钟到四分钟。因此，若干变量可能决定着精确的程序。首先，包封的葡糖淀粉酶的量应具有这样的总体积，该总体积足以让包封的葡糖淀粉酶遍布在整个面团混合料中。如果包封的葡糖淀粉酶的制品是高度浓缩的，则可能需要在将包封的葡糖淀粉酶添加到面团之前添加额外的油到预混合料。配方和生产方法可能需要特定修改；但是，在如下情况下通常可获得良好的结果：将面包面团配方中指明的油的25％留在面团之外，用作在接近混合循环结束时添加的浓缩包封葡糖淀粉酶的载体。在面包或者其他烘焙产品中，特别是那些具有低脂肪含量的产品如法式面包中，占干面粉重量大约1％的包封葡糖淀粉酶混合物就足以使包封葡糖淀粉酶与面团适当混合。合适的百分比范围很宽，并取决于配方、最终产品和每个面包师的生产方法要求。其次，包封的葡糖淀粉酶悬浮物应添加到混合料达足够的时间以便完全混合到面团中，但此时间也不要造成过度的机械作用使保护脂质涂层从包封的葡糖淀粉酶颗粒剥离下来。

涵盖了一种食品组合物，其中所述食品是包含AfGATR或其变体的油、肉、猪油组合物。在此语境中，术语“[油/肉/猪油]组合物”意指任何分别地基于油、肉或者猪油，从油、肉或者猪油制备和/或含有油、肉或者猪油的组合物。涵盖了一种制备包含AfGATR或其变体的油或肉或猪油组合物和/或添加剂的方法，所述方法包括将本发明的多肽与油/肉/猪油组合物和/或添加剂成分混合。

所述食品组合物可为包含AfGATR及其变体的动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品。涵盖了一种制备这种动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将AfGATR及其变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分混合。AfGATR及其变体可用于制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品。

术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在一个具体的实施例中，动物是非反刍动物，如马和单胃动物。单胃动物的例子包括但不限于猪(pig/swine)，如仔猪、生长猪、母猪；家禽如火鸡、鸭、鸡、肉鸡、蛋鸡；鱼类如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；和甲壳类如河虾和对虾。在另一个实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛。

在本发明的背景下，术语“宠物食品”意在理解为意指以下动物的食品：家养动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行类宠物，例如乌龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。

术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“草料”可互换使用并可包含一种或多种选自以下的饲料材料：a)谷物，如小谷粒(例如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大谷粒(如玉蜀黍或高粱)；b)谷物副产品，如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)(尤其是玉米干酒糟及可溶物(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)得自诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉粉及骨粉、马铃薯蛋白、乳清、椰子核、芝麻之类的来源的蛋白质；d)得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

6.纺织物退浆组合物及用途

还涵盖了使用AfGATR处理织物(例如对纺织品进行退浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域公知的(参见例如美国专利No.6,077,316)。例如，可通过包括使织物与AfGATR在溶液中接触的方法来改善所述织物的触感和外观。织物可在压力下用该溶液处理。

可以在纺织品纺织期间或之后，或在退浆阶段或者一个或多个额外的织物处理步骤的过程中施加AfGATR。在纺织物纺织期间，纺线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂以上浆淀粉或淀粉衍生物以增加其抗张强度以及防止断裂。AfGATR可在纺织期间或者之后施加以去除这些上浆淀粉或淀粉衍生物。纺织后，在进一步加工织物之前，可使用AfGATR来去除浆液涂层，以确保均匀且耐洗的结果。

AfGATR可以单独或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起用作洗涤添加剂(例如在水性组合物中)以使织物(包括含棉织物)退浆。AfGATR也可在用于在靛蓝染色的粗料棉布织物(denim fabric)和衣物上产生石洗外观的组合物和方法中使用。为生产衣服，可将织物进行剪裁并缝制成衣服或衣物，之后进行整理。特别是，为生产粗料棉布牛仔服，已开发了不同的酶促整理方法。粗料棉布衣物的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服以使织物柔软并使所述棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。AfGATR可在用于整理粗斜棉布衣物(例如“生物打磨法”)、酶促退浆及赋予织物柔软性和/或整理工艺的方法中使用。

7.清洁组合物

本发明组合物和方法的一个方面为包含AfGATR或其变体作为组分的清洁组合物。淀粉酶多肽可用作用于洗手、衣物洗涤、餐具洗涤和其他硬质表面清洁的洗涤剂组合物中的组分。

7.1.综述

优选地，AfGATR或其变体以等于或接近惯常用于洗涤剂中的淀粉酶的浓度掺入到洗涤剂中。例如，葡糖淀粉酶多肽可以对应于每升洗涤液/餐具洗涤液0.00001-1mg(按纯酶蛋白质计算)淀粉酶的量添加。本文提供示例性制剂，如下所示出：

葡糖淀粉酶多肽可作为唯一的酶或者与其他酶(包括其他淀粉分解酶)一起成为洗涤剂组合物的组分。照此，其可以以无粉尘颗粒、稳定化液体或受保护的酶的形式被包含在洗涤剂组合物中。可以例如如美国专利No.4,106,991和4,661,452中所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如，GB 1483591给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的例子。可例如通过添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制剂。其他的酶稳定剂是本领域已知的。可根据例如EP 238 216中公开的方法来制备受保护的酶。长期以来多元醇被公认为蛋白质的稳定剂，以及用于改善蛋白质的溶解性。

洗涤剂组合物可为任何可用形式，例如作为粉末、颗粒剂、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，以及0％至约30％的有机溶剂。它也可为含有约30％水的紧致凝胶类型的形式。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其中每种都可以是阴离子型、非离子型、阳离子型或两性离子型。洗涤剂将通常含有0％至约50％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。所述组合物也可含有0％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化的醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如例如在WO 92/06154中所述)。

洗涤剂组合物可另外包含一种或多种其他的酶，如蛋白酶、另一淀粉分解酶、角质酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酸裂解酶、过水解酶、木聚糖酶、过氧化物酶和/或漆酶，它们可进行任何组合。

洗涤剂可含有约1％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。可以在与酶的稳定性相容的任何组合物中使用酶。通常可以用已知的包封形式(例如通过造粒或分离在水凝胶中)来保护酶免于遭遇有害的组分影响。酶、具体地讲淀粉酶(具有或不具有淀粉结合域)可在包括衣物洗涤和餐具洗涤应用、表面清洁剂的多种组合物中使用，以及在用于从淀粉或生物质生成乙醇的组合物中使用。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可含有漂白系统，其可包含可与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸盐(NOBS)联用的H₂O₂来源(如过硼酸盐或过碳酸盐)。作为另一种选择，漂白系统可包含过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸)。漂白系统也可为酶漂白系统，例如过水解酶，如在PCT国际专利申请WO 2005/056783中所描述的。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，所述稳定剂为例如多元醇，如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，如硼酸芳族酯；并且可按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。

洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土、增泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、悬污剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、晦暗抑制剂、光学增白剂或香料。

pH(在使用浓度下于水溶液中测量)通常是中性或碱性，例如pH约7.0至约11.0。

以下描述用于包含本发明葡糖淀粉酶的洗涤剂组合物的具体形式。

7.2.重垢型液体(HDL)衣物洗涤剂组合物

示例性HDL衣物洗涤剂组合物包括去污表面活性剂(10％-40％重量/重量)，其包括阴离子去污表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或非取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)，和任选非离子型表面活性剂(选自直链的或支链的或无规链的、取代的或非取代的烷基烷氧基化醇，例如C₈-C₁₈烷基乙氧基化醇和/或C₆-C₁₂烷基酚烷氧基化物)，其中阴离子去污表面活性剂(亲水指数(HIc)为6.0-9)与非离子型去污表面活性剂的重量比大于1:1。合适的去污表面活性剂也包括阳离子型去污表面活性剂(选自烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三级锍化合物和/或它们的混合物的群组)；两性离子和/或两性去污表面活性剂(选自烷醇胺磺基甜菜碱的群组)；两性表面活性剂；半极性非离子型表面活性剂和它们的混合物。

组合物可任选包括表面活性增强聚合物，所述聚合物由两亲型烷氧基化脂清洁聚合物(选自具有支链亲水和疏水性质的烷氧基化聚合物，如烷氧基化聚亚烷亚胺，在0.05重量％-10重量％范围内)和/或无规接枝聚合物(通常由亲水主链和疏水侧链构成，所述亲水主链包含选自以下的单体：不饱和C₁-C₆羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和多元醇如甘油，和它们的混合物；所述疏水侧链选自：C₄-C₂₅烷基、聚丙烯、聚丁烯、饱和C₁-C₆单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或者甲基丙烯酸的C₁-C₆烷基酯以及它们的混合物)。

组合物可包括另外的聚合物，如污垢释放聚合物(包括阴离子型封端的聚酯，例如SRP1，包含至少一个选自糖类、二羧酸、多元醇和它们的组合的单体单元的聚合物，以无规或者嵌段构型，基于对苯二甲酸乙烯酯的聚合物以及它们的共聚物，以无规或者嵌段构型，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6，Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，Marloquest SL)、抗再沉积聚合物(0.1重量％-10重量％，包括羧酸聚合物，如包含至少一个选自丙烯酸、马来酸(或者马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸以及它们的任何混合物的单体的聚合物，乙烯吡咯烷酮均聚物和/或聚乙二醇，分子量在500至100,000道尔顿的范围内)；纤维素聚合物(包括选自以下的那些：烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素，其例子包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素以及它们的混合物)和聚合羧酸酯(例如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。

组合物还可包括饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和C₁₂-C₂₄脂肪酸(0重量％至10重量％)；沉积助剂，其例子包括多糖，优选纤维素聚合物，聚二烯丙基二甲基卤化铵(DADMAC)以及DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉鎓卤化物以及它们的混合物所成的共聚物，以无规或者嵌段构型，阳离子型瓜尔豆胶、阳离子型纤维素如阳离子型羟乙基纤维素、阳离子型淀粉、阳离子型聚丙烯酰胺以及它们的混合物。

组合物还可包括染料转移抑制剂，其例子包括酞菁锰、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑、聚乙烯基噁唑二酮和聚乙烯基咪唑的共聚物和/或它们的混合物；螯合剂，其例子包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或者甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基-间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、N-羟乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)以及它们的衍生物。

组合物优选包括选自以下的酶(通常约0.01重量％活性酶至0.03重量％活性酶)：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。组合物可包括酶稳定剂(其例子包括多元醇如丙二醇或者甘油、糖或者糖醇、乳酸、可逆蛋白酶抑制剂、硼酸或者硼酸衍生物，例如芳族硼酸酯、或者苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸)。

组合物任选地包括基于硅酮或脂肪酸的泡沫抑制剂；色相染料(heuingdye)、钙和镁阳离子、视觉信号成分、抑泡剂(0.001重量％至约4.0重量％)和/或结构剂(structurant)/增稠剂(0.01重量％至5重量％，选自甘油二酯和甘油三酯、乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、纤维素基材料、微纤维纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶以及它们的混合物)。

组合物可以是任何液体形式，例如液体或者凝胶形式，或者它们的任何组合。组合物可以是任何单位剂量形式，例如袋剂(pouch)。

7.3.重垢型干/固体(HDD)衣物洗涤剂组合物

示例性HDD衣物洗涤剂组合物包括去污表面活性剂，包括阴离子型污物表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、被取代或未被取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或它们的混合物)、非离子型去污表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、被取代或未被取代的C₈-C₁₈烷基乙氧基化物和/或C₆-C₁₂烷基酚烷氧基化物)、阳离子型去污表面活性剂(例如，烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三级锍化合物以及它们的混合物)、两性离子和/或两性去污表面活性剂(例如，烷醇胺磺基甜菜碱)、两性表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂，以及它们的混合物；助洗剂，包括不含磷酸盐的助洗剂(例如沸石助洗剂，其例子包括沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP，范围为0重量％至小于10重量％)、磷酸盐助洗剂(例如三聚磷酸钠，范围为0重量％至小于10重量％)、柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸、硅酸盐(例如，硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，范围为0重量％至小于10重量％，或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(例如，碳酸钠和/或碳酸氢钠，范围为0重量％至小于80重量％)；和漂白剂，包括光漂白剂(例如，磺化酞菁锌、磺化酞菁铝、呫吨染料以及它们的混合物)、疏水性或亲水性漂白活化剂(例如，十二烷酰基羟基苯磺酸盐、癸酰基羟基苯磺酸盐、癸酰基羟基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基羟基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、壬酰氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵化合物，以及它们的混合物)、过氧化氢源(例如，无机过水合物盐，其例子包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单水合或四水合钠盐)、预形成的亲水性和/或疏水性过酸(例如，过羧酸及其盐、过碳酸及其盐、过亚胺酸及其盐、过一硫酸及其盐，以及它们的混合物)，和/或漂白催化剂(例如，亚胺漂白增效剂(其例子包括亚胺阳离子和聚离子)、亚胺两性离子、改性胺、改性胺氧化物、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮，以及它们的混合物，和含金属的漂白催化剂(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子如锌或铝和螯合剂如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)，和其水溶性盐)。

组合物优选包括酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶以及它们的任何混合物。

组合物可任选包括另外的洗涤剂成分，包括香料微胶囊、淀粉包封的调和香料谐香剂(perfume accord)、调色剂(hueing agent)、另外的聚合物，包括织物完整性和阳离子型聚合物、染料锁定成分、织物软化剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉积助剂和/或环糊精。

7.4.自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物

示例性ADW洗涤剂组合物包括非离子型表面活性剂，包括乙氧基化非离子型表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧烷基化)醇或氧化胺表面活性剂，以0至10重量％的量存在；助洗剂，范围为5-60％，包括磷酸盐助洗剂(例如，单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐、其他低聚聚磷酸盐、三聚磷酸钠-STPP)和不含磷酸盐的助洗剂(例如，基于氨基酸的化合物，包括甲基-甘氨酸-二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧甲基菊粉及其盐和衍生物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐、聚羧酸及其部分或完全中和的盐、单体聚羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物，范围为0.5重量％至50重量％)；磺化/羧化聚合物，范围为约0.1重量％至约50重量％，以提供尺寸稳定性；干燥助剂，范围为约0.1重量％至约10重量％(例如，聚酯，尤其是阴离子型聚酯，任选地以及具有3至6个官能团(通常是有利于缩聚的酸、醇或酯官能团)的其他单体，聚碳酸酯-聚有机硅氧烷、聚氨酯-聚有机硅氧烷和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物，特别是反应性环状碳酸酯和脲类型)；硅酸盐，范围为约1重量％至约20重量％(包括硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶层状硅酸盐)；无机漂白剂(例如，过水合物盐如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如，有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，例如二过氧基十二烷二酸、二过氧基十四烷二酸和二过氧基十六烷二酸)；漂白活化剂(即，有机过酸前体，范围为约0.1重量％至约10重量％)；漂白催化剂(例如，三氮杂环壬烷锰和相关络合物，Co、Cu、Mn和Fe双吡啶基胺和相关络合物，和五胺乙酸钴(III)和相关络合物)；金属护理剂，范围为约0.1重量％至5重量％(例如，苯并三唑、金属盐和络合物，和/或硅酸盐)；酶，范围为以每克自动餐具洗涤剂组合物计约0.01至5.0mg活性酶(例如，蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶，以及它们的混合物)；和酶稳定剂组分(例如，低聚糖、多糖，和无机二价金属盐)。

7.5.另外的洗涤剂组合物

可添加本发明的淀粉酶的另外的示例性洗涤剂制剂在下面带编号的段落中进行了描述。

1)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约7％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如，C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)；约14％至约20％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约15％至约22％的沸石(例如，NaA1SiO₄)；0％至约6％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，泡沫抑制剂、香料、光学增白剂、光漂白剂)。

2)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约6％至约11％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如C_12-18醇1-2EO)或烷基硫酸盐(例如，C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约24％至约34％的沸石(例如，NaA1SiO₄)；约4％至约10％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(例如，C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如，泡沫抑制剂、香料)。

3)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约5％至约9％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约1％至约3％的皂如脂肪酸(例如，C_16-22脂肪酸)；约10％至约17％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约23％至约33％的沸石(如NaA1SiO₄)；0％至约4％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如，EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-5％的次要成分(例如泡沫抑制剂、香料、光学增白剂)。

4)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约8％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约25％至约35％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；0％至约10％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如泡沫抑制剂、香料)。

5)水性液体洗涤剂组合物，包含约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约13％的皂如脂肪酸(例如油酸)；0％至约13％的烯基琥珀酸(C_12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如，PVP，PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，分散剂、泡沫抑制剂、香料、光学增白剂)。

6)水性结构化液体洗涤剂组合物，包含约15％至约21％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；3-9％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约10％的皂如脂肪酸(例如，油酸)；约14％至约22％的沸石(如NaAlSiO₄)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，PEG、PVP)；0％至约3％的锚定聚合物(例如，甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物；摩尔比为25:1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，分散剂、泡沫抑制剂、香料、光学增白剂)。

7)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包括约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的皂如脂肪酸；约5％至约10％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约20％至约40％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；约2％至约8％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，光学增白剂、泡沫抑制剂、香料)。

8)配制为颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约8％至约14％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的皂如脂肪酸；约4％至约10％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)；约30％至约50％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；约3％至约11％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如，C₆H₅Na₃O₇)；约1％至约5％的聚合物(例如，PVP、马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，泡沫抑制剂、香料)。

9)配制为颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约6％至约12％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约1％至约4％的非离子型表面活性剂；约2％至约6％的皂如脂肪酸；约14％至约22％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约18％至约32％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；约5％至约20％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如，C₆H₅Na₃O₇)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约1％至约5％的漂白活化剂(例如，NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸盐或PEG)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，光学增白剂、香料)。

10)水性液体洗涤剂组合物，包含约15％至约23％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；约8％至约15％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C_{12- 15}醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；0％至约3％的皂如脂肪酸(例如，月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的助水溶物(例如，甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，聚合物、分散剂、香料、光学增白剂)。

11)水性液体洗涤剂组合物，包含约20％至约32％的直链烷基苯磺酸盐(按酸计算)；6-12％的醇乙氧基化物(例如C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氨基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，助水溶物、分散剂、香料、光学增白剂)。

12)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约25％至约40％的阴离子型表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子型表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；0％至约5％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约15％至约28％的沸石(NaA1SiO₄)；0％至约20％的过硼酸钠(例如，NaBO₃ ^.4H₂O)；约0％至约5％的漂白活化剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；0-3％的次要成分(例如，香料、光学增白剂)。

13)如上述组合物1)-12)中所述的洗涤剂组合物，其中所述直链烷基苯磺酸盐中的全部或部分被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐代替。

14)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约9％至约15％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；约10％至约20％的层状二硅酸盐(例如，来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过碳酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸盐和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-5％的次要成分(例如，光学增白剂、光漂白剂、香料、泡沫抑制剂)。

15)配制为具有至少600g/L堆密度的颗粒形式的洗涤剂组合物，包含约4％至约8％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(如Na₂CO₃)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约13％至约22％的过碳酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，聚羧酸盐和PVP)；0.0001-0.1％的酶(按纯酶蛋白质计算)；和0-3％的次要成分(例如，光学增白剂、膦酸盐、香料)。

16)如上面1)-15)中所述的洗涤剂制剂，其含有稳定化的或包封的过酸作为额外组分或作为已经述及的漂白系统的替代物。

17)如上面1)、3)、7)、9)和12)中所述的洗涤剂组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐代替。

18)如上面1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的洗涤剂组合物，还额外含有锰催化剂。例如锰催化剂是“Efficient manganesecatalysts for low-temperature bleaching”(“用于低温漂白的高效锰催化剂”，Nature(《自然》)，369:637-639(1994)中所述的化合物之一。

19)配制为非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，其包含液态非离子型表面活性剂，例如直链烷氧基化伯醇、助洗剂体系(例如磷酸盐)、酶和碱。所述洗涤剂还可包含阴离子型表面活性剂和/或漂白系统。

如上所述，可以以洗涤剂中常规采用的浓度掺入本发明的淀粉酶多肽。目前设想的是，在洗涤剂组合物中，可以对应于每升洗涤液体0.00001-1.0mg(按纯酶蛋白质计算)淀粉酶多肽的量添加酶。

洗涤剂组合物也可包含其他常规洗涤剂成分，例如抗絮凝剂材料、填充材料、消泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、螯合剂、防污垢再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

可以将洗涤剂组合物配制成手洗(人工)或机洗(自动)的衣物洗涤剂组合物，包含适于预处理玷污的织物的洗衣添加剂组合物和冲洗添加的织物软化剂组合物，或者可配制成用于一般的家居硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配制用于人工或自动的餐具洗涤操作。

任何本文描述的清洁组合物可以包括任何数目的另外的酶。通常，酶应该与所选择的洗涤剂相容(例如，就最佳pH、与其他酶成分或非酶成分的相容性等而言)，并且酶应该以有效量存在。提供如下酶作为例子。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体，以及天然制成的蛋白质。蛋白酶可为丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草杆菌蛋白酶，例如源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子为胰蛋白酶(如猪或牛来源)和镰孢菌蛋白酶(参见例如WO 89/06270和WO94/25583)。可用的蛋白酶的例子还包括但不限于WO 92/19729、WO98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体。可商购获得的蛋白酶包括但不限于：Primase^TM、Duralase^TM、Kannase^TM和BLAZE^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)；Maxacal^TM、Maxapem^TM、PurafectOxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(美国丹尼斯科公司)。其他示例性的蛋白酶包括来自解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens)的NprE和来自纤维单胞菌属物种菌株69B4的ASP。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括经化学修饰、蛋白分解改性或蛋白质工程改造的突变体。有用的脂肪酶的例子包括但不限于腐质霉属(Humicola)(同义词嗜热真菌属)的脂肪酶，例如来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(嗜热真菌(T.lanuginosus))(参见例如EP258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如WO96/13580)；假单胞菌脂肪酶(例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(参见例如EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331 376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD705(参见例如WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康辛假单胞菌(P.wisconsinensis)(参见例如WO 96/12012))；芽孢杆菌脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌(参见例如Dartois等人，Biochemica et Biophysica Acta(《生物化学与生物物理学报》)，1131:253-360(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)、或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422))。设想用于制剂中的其他脂肪酶变体包括例如在如下专利中所述的那些：WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105。一些可商购获得的脂肪酶包括和Lipolase Ultra^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)。

聚酯酶：组合物中可包括合适的聚酯酶，例如WO 01/34899、WO01/14629和US6933140中所述的那些。

淀粉酶：组合物可与淀粉酶(如非生产增强型淀粉酶)组合。这些可包括市售淀粉酶，例如但不限于 和BAN^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)；和(来自美国丹尼斯科公司)。

纤维素酶：可向组合物添加纤维素酶。合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳属、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，如，例如美国专利No.4,435,307、No.5,648,263、No.5,691,178、No.5,776,757和WO 89/09259中公开的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。设想使用的示例性纤维素酶为对于纺织物具有颜色护理益处的那些纤维素酶。此类纤维素酶的例子为例如EP 0495257、EP0531372、WO 96/11262、WO 96/29397和WO 98/08940中所述的纤维素酶。其他例子为纤维素酶变体，例如WO 94/07998、WO 98/12307、WO95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、美国专利No.5,457,046、No.5,686,593和No.5,763,254中所述的那些。市售纤维素酶包括和(诺和诺德公司和诺维信公司)；和Puradax(美国丹尼斯科公司)；和KAC-500(B)^TM(花王公司(Kao Corporation))。

过氧化物酶/氧化酶：设想用于组合物中的合适过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰或蛋白质工程改造的突变体。可用的过氧化物酶的例子包括如WO 93/24618、WO 95/10602和WO98/15257中描述的来自鬼伞属(Coprinus)、例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶及其变体。市售的过氧化物酶包括例如Guardzyme^TM(诺和诺德公司和诺维信公司)。

洗涤剂组合物还可以包含2,6-β-D-果聚糖水解酶，其可有效用于移除/清洁家庭和/或工业纺织物/衣物上存在的生物膜。

可通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而在洗涤剂组合物中包括洗涤剂酶。洗涤添加剂(即单独的添加剂或组合的添加剂)可配制为例如颗粒、液体、浆液等。示例性的洗涤添加剂制剂包括(但不限于)颗粒，尤其是无粉尘颗粒、液体尤其是稳定的液体或浆液。

可以例如如美国专利No.4,106,991和4,661,452中所公开的那样来生产无粉尘颗粒，并且可任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的例子是平均分子量为1,000至20,000的聚环氧乙烷产品(例如，聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有12至20个碳原子并且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯及甘油三酯。例如，GB 1483591给出了适于通过流化床技术施加的成膜包衣材料的例子。可例如通过添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸，根据已确立的方法来稳定液态酶制剂。可根据EP 238,216中公开的方法来制备受保护的酶。

洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如条棒状、片、粉末、颗粒、糊状物或液体。液体洗涤剂可以是水性的，通常含有高达约70％的水，和0％至约30％的有机溶剂。还涵盖了包含约30％或更少水的紧致洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可任选地包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型的。表面活性剂能够以很宽的范围(约0.1重量％至约60重量％)存在。

当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸或皂。

当包含在洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基-N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可含有0％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司的SKS-6)。

洗涤剂可包含一种或多种聚合物。示例性的聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(例如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

可使用常规的稳定剂来稳定洗涤剂组合物的酶，所述稳定剂例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(如芳族硼酸酯)或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸)。可如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制所述组合物。

设想在洗涤剂组合物中，尤其是酶变体可以对应于每升洗涤液约0.01至约100mg酶蛋白(例如每升洗涤液约0.05至约5.0mg酶蛋白或每升洗涤液0.1至约1.0mg酶蛋白)的量添加。

虽然本发明的组合物和方法结合以下详情进行了描述，但应当理解可进行各种改变。

7.6.评估洗涤剂组合物中的淀粉酶活性的方法

许多葡糖淀粉酶清洁测定法是本领域已知的，包括样本测定法和微样本测定法。所附的实例仅仅描述了几个这类测定法。

8.酿造组合物

AfGATR或其变体可以是在提供发酵饮料如酿造的工艺中使用的酿造组合物的组分。据信，非可发酵的碳水化合物构成最终啤酒中的溶解固形物的大部分。该残余物保留下来是因为麦芽淀粉酶不能够水解淀粉中的α-1,6-键。非可发酵的碳水化合物贡献约50卡路里/12盎司(约340克)啤酒。AfGATR或其变体通常与葡糖淀粉酶并任选地与普鲁兰酶和/或异淀粉酶组合，能帮助将淀粉转化为糊精和可发酵糖，降低最终啤酒中的残余非可发酵的碳水化合物。

用于制备这些饮料的主要原料是水、酒花和麦芽。另外以及专门地，诸如以下的辅料可用作淀粉源：普通粗磨玉米粉、精制粗磨玉米粉、酿酒用碾磨酵母、水稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘焙谷物、谷物薄片、黑麦、燕麦、马铃薯、木薯以及浆液，如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等。

出于多种原因，主要从选定的大麦品种生产的麦芽对啤酒的总体特性和质量具有重要的影响。首先，麦芽是啤酒中的主要风味剂。其次，麦芽提供可发酵糖的绝大部分。第三，麦芽提供蛋白质，蛋白质将有助于啤酒的酒体和泡沫特性。第四，麦芽提供制浆过程中必要的酶活性。酒花也对啤酒质量有重大贡献，包括风味。具体地讲，酒花(或者酒花成分)给啤酒添加合意的苦味物质。此外，酒花可充当蛋白质沉淀剂，建立防腐剂并帮助泡沫形成和稳定。

谷物(谷粒)如大麦、燕麦、小麦以及玉米和水稻通常用于工业酿造和家庭酿造，但通常也可加入其他植物组分如酒花。用于酿造的组分可以是未经制麦的或者可以是经制麦的，即部分发芽的，导致包括α淀粉酶在内的酶水平提高。为了成功酿造，足够水平的α淀粉酶活性对于确保发酵过程中具有适当水平的糖是必要的。还可将AfGATR或其变体添加至用于酿造的组分中。

本文所用的术语“原材料(stock)”意指被压碎或者破碎的谷粒和植物组分。例如，用于啤酒生产的大麦是经过粗研磨或者压碎以产生适于生产发酵用麦芽浆的稠度的谷物。本文所用的术语“原材料”包括任何前述类型的压碎或者粗磨形式的植物和谷物。本文描述的方法可用于测定面粉和原材料中的α-淀粉酶活性水平。

制备啤酒的工艺是本领域公知的。参见例如Wolfgang Kunze(2004)，“Technology Brewing and Malting”(《酿造和制麦技术》)，Researchand Teaching Institute of Brewing(酿造研究与教学院)，柏林(VLB)，第3版。简单地讲，所述工艺涉及：(a)制备麦芽浆，(b)过滤所述麦芽浆以制备麦芽汁，和(c)使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料如啤酒。通常，将磨碎的或者压碎的麦芽、麦芽和辅料、或辅料与水混合，并在控制的温度下保持一段时间，以让麦芽和/或辅料中存在的酶将麦芽中存在的淀粉转化为可发酵糖。然后将麦芽浆转移到麦芽浆过滤器，在其中将液体与谷物残余物分离。这种甜液体称为“麦芽汁”，剩余的谷物残余物称为“废糟”。通常将麦芽浆进行提取，其涉及向麦芽浆加水以从废糟回收残余的可溶性提取物。然后将麦芽汁剧烈煮沸，以将麦芽汁灭菌并帮助形成色度、风味和气味。在煮沸过程中的某个时间点添加酒花。将麦芽汁冷却并转移到发酵罐。

然后使麦芽汁在发酵罐中与酵母接触。可将发酵罐冷却以终止发酵。除去可能絮凝的酵母。最后，将啤酒冷却并保藏一段时间，期间啤酒澄清并形成风味，而任何可能损害啤酒的外观、风味和货架期的物质会沉淀出来。啤酒通常含有约2％至约10％v/v的酒精，不过也可以获得更高酒精含量(例如18％v/v)的啤酒。在包装前，将啤酒充入二氧化碳，并任选地进行过滤和巴氏灭菌。

可将包含α-淀粉酶、通常但未必组合一种或多种外源酶如一种或多种葡糖淀粉酶(例如AfGATR或其变体)、一种或多种支链淀粉酶和/或一种或多种异淀粉酶和其任何组合的酿造组合物添加到上述步骤(a)(即在麦芽浆制备过程中)的麦芽浆中。作为另一种选择，或者除此之外，可将酿造组合物添加到上述步骤(b)(如在麦芽浆过滤过程中)的麦芽浆中。作为另一种选择，或者除此之外，可将酿造组合物添加到上述步骤(c)(如在麦芽汁发酵过程中)的麦芽汁中。

特定实施例涉及上述用途、方法或发酵饮料的任一者，其中所述发酵饮料为啤酒，如全麦芽啤酒、在“纯净法”下酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒、无酒精麦芽酒等，但是还有备选的谷物和麦芽饮料，如水果味麦芽饮料，例如柑橘味如柠檬、甜橙、酸橙或浆果味麦芽饮料；酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰味麦芽酒；或咖啡味麦芽饮料，如咖啡因味麦芽酒，等等。

9.碘阳性淀粉的减少

当在液化和/或糖化的方法中使用时，AfGATR及其变体可减少碘阳性淀粉(IPS)。IPS的一个来源是来自于逃过水解的直链淀粉和/或来自于回生淀粉聚合物。在变陈时，淀粉糊或者凝胶中会自发出现淀粉回生，因为淀粉分子有相互结合的趋向，然后结晶度会提高。由于淀粉分子逐渐缔合成更大的粒子，低浓度的溶液变得愈加浑浊。自发沉淀发生，并且沉淀的淀粉看起来回复至其初始的冷水不溶性状态。较高浓度的糊在冷却时凝固成凝胶，其在变陈时由于淀粉分子的不断增加的缔合而稳步坚实。这是由于相邻淀粉分子上的羟基之间有强的形成氢键的趋势而引起的。参见J.A.Radley编辑，STARCH AND ITS DERIVATIVES(《淀粉及其衍生物》)，第194-201页，伦敦查普曼和霍尔出版社(Chapman and Hall,London)，(1968))。

糖液中存在IPS会不利地影响最终的产品质量，是下游加工的一个主要问题。IPS会阻塞或减缓过滤系统，并淤塞用于纯化的炭柱。当IPS达到充分高的水平时，其可能渗漏出炭柱而降低生产效率。另外，在储存时其可能会导致浑浊的终产品，这对终产品质量而言是不可接受的。IPS的量可通过隔离糖化罐并将内容物回混来减少。尽管如此，IPS将尤其地积聚在炭柱和过滤系统中。因此，预期AfGATR或其变体的使用通过减少IPS的量而改善总体工艺性能。

为了进一步说明组合物和方法以及它们的优点，给出了以下具体实例，应当理解它们是示例性的而非限制性的。

实例

实例1：AfGA1的克隆。

烟曲霉Af293的基因组DNA购自密苏里州堪萨斯城真菌遗传资源中心(Fungal Genetics Stock Center,Kansas City,MO)(FGSC A1100)。对烟曲霉的基因组进行测序。在NCBI数据库中获得AfGA1基因(在NCBI参考序列NC_007195中的所公开基因组内)的核酸序列，和由所述AfGA1基因编码的预测葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(NCBI寄存编号XP_749206)的氨基酸序列。如根据BLAST搜索所测定，AfGA1与其他真菌葡糖淀粉酶同源。参见图1。AfGA1基因的核苷酸序列包含三个内含子，该核苷酸序列示于SEQ ID NO:8。

AfGA1基因是使用如下引物从烟曲霉的基因组DNA扩增：引物1：AfGA1-Fw 5'-GCG GCGGCCGC ACC atgcctcgcctttcctacgc-3'(SEQ IDNO:9)，和引物2：AfGA1-Rv 5'-cc ggcgcgccc TTA tcactgccaagtatcattctcg-3'(SEQ ID NO:10)。正向引物含有NotI限制位点，并且反向引物含有AscI限制位点。在用NotI和AscI进行消化后，将PCR产物克隆到用相同的限制酶消化的pTrex3gM表达载体(在已公布的美国专利申请2011/0136197A1中有所描述)中，并且所得的质粒被标记为pJG222。pJG222的质粒图谱提供于图2。AfGA1基因的序列通过DNA测序确认。

实例2：AfGA1TR的表达和纯化。

使用基因枪方法将质粒pJG222(Trex3gM-AfGA1)转化到四重缺失里氏木霉菌株(在WO 05/001036中描述)中(Te’o等人，J.Microbiol.Methods(《微生物学方法杂志》)，51:393-99,2002)。约1周内出现转化菌落(约50个)。在乙酰胺板上生长5天后，将菌落接种在含30ml葡萄糖/琼脂糖限定培养基的250ml摇瓶中以进行蛋白质表达。蛋白质AfGA1TR分泌到细胞外培养基中，并且使用经过滤的培养基进行SDS-PAGE和葡糖淀粉酶对DP7的活性测定，以确认酶表达。

随后使稳定菌株在7L发酵罐中在限定培养基中生长。通过离心收集发酵液。在离心、过滤和浓缩后，获得450ml浓缩样品。通过使用BCA方法(蛋白质定量试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司(Shanghai GenerayBiotech CO.,Ltd))，样品中的总蛋白浓度经测定为83.70g/L。SDS-PAGE分析表明，总蛋白的80％是目标蛋白。因此，浓缩样品中的目标蛋白浓度据估计为66.96g/L。

使用AKTA Explorer 100FPLC系统(GE Healthcare)通过亲和色谱法纯化AfGA1TR。将β-环糊精(Sigma-Aldrich，856088)与环氧基活化的琼脂糖珠粒(GE Healthcare，17-0480-01)偶联并用于纯化。将来自7L发酵罐的40ml浓缩发酵液的pH调节至4.3并且将溶液加载至用25mM的pH 4.3乙酸钠(缓冲液A)预平衡的30mlβ-CD-琼脂糖柱上。用2个柱体积的缓冲液A洗涤该柱。用三个柱体积的缓冲液B洗脱目标蛋白，所述缓冲液B含有缓冲液A和10mMα-环糊精(Sigma-Aldrich，C4642)。通过SDS-PAGE凝胶分析级分，并测定葡糖淀粉酶活性。将含有目标蛋白的级分汇集并通过Hiprep 26×10脱盐柱以除去β-环糊精。所得样品的纯度高于95％，使用10K Amicon Ultra-15装置浓缩溶液并在-80℃下储存在40％甘油中。

实例3：测定AfGA1TR底物特异性。

基于利用葡糖淀粉酶、AfGA1TR、AnGA或野生型AfGA从不同底物释放葡萄糖来测定葡糖淀粉酶活性，所述底物包括麦芽糖、异麦芽糖、麦芽七糖(DP7)、麦芽糖糊精(DE4-DE10)、马铃薯支链淀粉和可溶性淀粉。使用偶联葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOX/HRP)方法测量葡萄糖释放速率(Anal.Biochem.(《分析生物化学》)，105(1980),389-397)。以过氧化物对2,2'-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的氧化速率来定量葡萄糖，所述过氧化物是从与葡萄糖反应的偶联GOX/HRP酶产生的。

通过将9mL每种底物(1％于水中，w/w)和1mL的0.5M pH 5.0乙酸钠缓冲液混合在15mL锥形瓶中来制备底物溶液。通过将GOX/HRP溶解在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中来制备含ABTS的偶联酶(GOX/HRP)溶液，其中最终浓度为2.74mg/mL ABTS、0.1U/mL HRP和1U/mL GOX。

还在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中制备了葡糖淀粉酶样品、基准AnGA(杰能科产品，Optidex L-400)、野生型AfGA和葡萄糖标准品的连续稀释液。将每个葡糖淀粉酶样品(10μl)转移至含有在50℃下在600rpm下预温育5分钟的90μl底物溶液的新的微量滴定板(Corning 3641)中。在50℃下在热混合器(Eppendorf)中在振荡(600rpm)下进行反应10分钟，分别将10μl反应混合物以及10μl葡萄糖标准品的连续稀释液快速转移至新的微量滴定板(Corning 9017)，接着加入100μl ABTS/GOX/HRP溶液。在SoftMaxPro板读取器(Molecular Device)上以11秒时间间隔在405nm下立即测量含有反应混合物的微量滴定板5分钟。输出为每种酶浓度的反应速率Vo。使用线性回归确定Vo相对于酶剂量的曲线图的斜率。使用以下方程1基于葡萄糖标准品曲线计算葡糖淀粉酶活性的比活性：

比活性(单位/mg)＝斜率(酶)/斜率(标准品)×100(1)，

其中1个单位＝1微摩尔葡萄糖/分钟。

AfGA1TR和基准葡糖淀粉酶AnGA和野生型AfGA的代表性比活性在表1中示出。

表1.经过纯化的葡糖淀粉酶对于各种底物的比活性。

实例4：pH对AfGA1TR葡糖淀粉酶活性的影响。

使用如实例3中所述的ABTS测定方案监测pH(3.0至10.0)对AfGA1TR活性的影响。缓冲工作溶液由甘氨酸/乙酸钠/HEPES(250mM)的组合组成，其中pH从3.0变为10.0。通过将可溶性淀粉(1％于水中，w/w)与250mM缓冲溶液以9:1的比率混合来制备底物溶液。在水中在特定剂量下制备酶工作溶液(显示在线性范围内的信号根据剂量反应的曲线)。遵循与实例3中关于葡糖淀粉酶活性测定法所述相同的方案在50℃下进行所有温育10分钟。在每种pH下的酶活性报道为相比于在最佳pH下的酶活性的相对活性。AfGA1TR的pH曲线在表2和图3中示出。据发现，AfGA1TR具有约5.0的最佳pH，并且在3.5至7.5的pH下保持最大活性的70％以上。

表2.纯化的葡糖淀粉酶的pH曲线

实例5：温度对AfGA1TR葡糖淀粉酶活性的影响。

使用如实例3中所述的ABTS测定方案监测温度(40℃至84℃)对AfGA1TR活性的影响。通过将3.6mL可溶性淀粉(1％于水中，w/w)和0.4mL的0.5M缓冲液(pH 5.0乙酸钠)混合在15mL锥形瓶中来制备底物溶液。在水中在特定剂量下制备酶工作溶液(显示在线性范围内的信号根据剂量反应的曲线)。遵循与实例3中关于葡糖淀粉酶活性测定法所述相同的方案分别在40℃至84℃的温度下进行温育10分钟。在每种温度下的酶活性报道为相比于在最佳温度下的酶活性的相对活性。AfGA1TR的温度曲线在表3和图4中示出。据发现，AfGA1TR具有68℃的最佳温度，并且在56℃至74℃下保持最大活性的70％以上。

表3.葡糖淀粉酶的温度曲线。

实例6：AfGA1TR产物分布(product profile)分析。

为了测定多糖的真菌葡糖淀粉酶催化产物，将葡糖淀粉酶、AnGA(0.118mg/g干固形物淀粉)和AfGA1TR(0.118mg/g干固形物或0.059mg/g干固形物)与34％DS超液化淀粉(CPI，加利福尼亚州斯托克顿市(Stockton,CA))在60℃、pH 4.2至4.5下一起温育2天。将支链淀粉酶(PU)和来自白曲霉的酸稳定性α-淀粉酶(AkAA)分别以0.256ASPU/g干固形物和0.35SSU/g干固形物的剂量与纯化的AfGA1TR一起提供。在不同的时间间隔下取得样品并通过HPLC分析糖组成。

表4示出在浓度为100％和50％的AnGA下由AnGA/PU/AkAA和AfGA1TR/PU/AkAA糖化的低聚糖的分布。(图6示出在浓度为100％、50％和40％的AnGA下在存在和不存在PU和AkAA的情况下由AnGA和AfGA1TR糖化的低聚糖的分布)。仅示出了在DP1、DP2、DP3和HS下的低聚糖。表4中的数字反映了每个DPn作为总DP1、DP2、DP3和HS的一部分的重量百分比。

表4.真菌葡糖淀粉酶对液化淀粉的产物分布。

表4示出AfGA1TR在24小时内产生>95.5％DP1，相比之下AnGA在相等剂量的蛋白质下花费了48.5小时。表4中的数据显示，在基于蛋白质的50％剂量当量下(在补充酶剂量的相同条件下)，AfGA1TR相比于AnGA显示改进的性能。

实例7：DP2水平的比较。

基于相同的DP1水平(96％)，将来自AfGA1TR处理的液化淀粉的DP2水平与来自AnGA处理的液化淀粉的DP2水平进行比较。比较显示，在相等的DP1水平下，DP2水平在统计学上显著降低约0.2％，这可能是由于较低的葡糖淀粉酶剂量。通过经由离子色谱法计算异麦芽糖/麦芽糖比率来测量由AnGA和AfGA1TR(呈三重共混物形式)进行的逆转反应。

表5.真菌葡糖淀粉酶对液化淀粉的产物分布。

Δ比率＝在48小时和70小时下的[AnGA比率-AfGA1TR比率]

表5示出，对于两种葡糖淀粉酶，根据异麦芽糖：麦芽糖的比率增加，异麦芽糖随时间积聚。然而，利用AfGA1TR，异麦芽糖形成似乎略微较低，因为AnGA与AfGA1TR之间的比率的差异从48小时至70小时增加，这可支持AfGA1TR的较低逆转反应。

实例8：AkAA的滴定。

为了测定使用不同剂量的辅助性α-淀粉酶进行的多糖的真菌葡糖淀粉酶催化产物，将AfGA1TR(0.059mg/g干固形物)和支链淀粉酶(PU，L-1000)(0.256ASPU/g干固形物)与不同浓度的来自白曲霉的酸稳定性α-淀粉酶(AkAA)一起温育。AkAA以0.1SSU的增量在0至0.3SSU/干固形物下添加，和34％DS超液化淀粉(CPI，加利福尼亚州斯托克顿市)，在60℃、pH 4.5下2天。将支链淀粉酶(PU)和(AkAA)分别以0.256ASPU/g干固形物和0.35SSU/g干固形物的剂量与纯化的AfGA1TR一起提供。在不同的时间间隔下取得样品并通过HPLC分析糖组成。

表6和图7公开了由AfGA1TR、PU和不同剂量的AkAA糖化的低聚糖的分布。仅示出了在DP1、DP2、DP3和HS下的低聚糖。表6中的数字反映了每个DPn作为总DP1、DP2、DP3和HS的一部分的重量百分比。

表6.在利用AfGA1TR的酶液化淀粉糖化期间AkAA的影响。

表6示出，在至少0.1SSU/g干固形物存在下，AfGA1TR能够在45小时内达到>96％DP1，而缺乏AkAA导致糖化速率在统计学上显著降低。结果表明，通过在利用AfGA1TR的酶液化淀粉糖化期间添加AkAA达到最终葡萄糖产率的显著增加。

实例9：含有α-淀粉酶、AfGA1TR和支链淀粉酶的酶共混物对颗粒淀 粉酶的增溶和水解

制备在蒸馏水中具有35％干固体淀粉的颗粒玉米淀粉浆液并且使用NaOH将pH调节至pH 5.0。将10AAU/g干固形物的α-淀粉酶(XTRA)和0.047mg/g干固形物的AfGA1TR纯化蛋白与0.15ASPU/g干固形物的支链淀粉酶(L-1000)一起添加至淀粉浆液中。然后，将淀粉浆液保持于在恒定搅拌下维持在60℃的水浴中。在不同时间间隔下提取等分试样并离心。将澄清上清液用于折射率(RI)以计算增溶百分比并通过HPLC分析糖组成。

表7：在液化期间真菌葡糖淀粉酶对淀粉的产物分布。

表7示出，在α-淀粉酶和PU存在下，使用颗粒淀粉，AfGA1TR能够在68小时内能够达到>95.5％DP1，其中86％的颗粒淀粉被溶解。

实例10：残余α-淀粉酶活性对DP3水平的影响。

分析通过添加0.066KG/MT干固形物的Supra(NZ)回至α-杀灭淀粉液化物，利用AfGA1TR，单一pH(5.5)对DP1和DP3的影响以及在pH 4.5下的残余α-淀粉酶活性对DP1和DP3的影响。将0.066mg/g干固形物的AfGA1TR与0.25ASPU/g干固形物的L-1000(支链淀粉酶)和0.1SS U/g干固形物的AkAA共混。表8和图5公开了由AfGA1TR和4060VHP(AnGA/支链淀粉酶共混物)糖化的低聚糖的分布。

表8：真菌葡糖淀粉酶对液化淀粉的产物分布。

AfGA1TR三重共混物显示在pH 5.5下相比于pH 4.5下的糖化速率显著损失，可能是由于对L-1000的不利pH，但能够在48小时内达到>95.5％DP1。由于所预期的更高DP3，AfGA1TR和4060VHP都受到残余α-淀粉酶活性的少量不利影响以最大化葡萄糖产率。在α-淀粉酶杀灭液化物的情况下，AfGA1TR相比于4060VHP导致DP3显著降低0.1％。具有α-淀粉酶活性液化物的AfGA1TR的水平与具有α-“杀灭”液化物的4060VHP同样低。

实例11：AfGA1TR与野生型烟曲霉葡糖淀粉酶的比较

通过用水稀释来制备淀粉液化物以具有34％干固形物并且在pH 4.4和60℃下使用2种不同的葡糖淀粉酶来进行糖化；1)AfGA1TR，在0.067mg/g干固形物淀粉和2)来自GLUCOTEAM DB(日本长濑产业株式会社(Nagase Co.&Ltd.,Japan))的野生型AfGA的纯化蛋白(表达于烟曲霉中)，在0.065mg/g干固形物下。另外，将分别为0.14ASPU/g干固形物和0.9SSU/g干固形物的支链淀粉酶(PU)和酸稳定性α-淀粉酶(AkAA)与每种葡糖淀粉酶一起给与。在不同的时间间隔下取得样品并通过HPLC分析糖组成。

表9示出，AfGA1TR在48小时内产生>95.5％DP1，而商业烟曲霉花费较长的糖化时间。两种葡糖淀粉酶都能够达到>96％DP1，而DP2小于3％。

表9：真菌葡糖淀粉酶共混物对液化淀粉的产物分布。

实例12：含有α-淀粉酶、支链淀粉酶和烟曲霉GA的酶共混物对颗粒 淀粉的增溶和水解

在典型的实例中，制备在蒸馏水中具有35％干固体淀粉的颗粒玉米淀粉浆液并且使用氢氧化钠将pH调节至pH 5.0。将10AAU/g干固形物的XTRA和AfGA1TR的纯化蛋白或来自GLUCOTEAM DB(日本长濑产业株式会社)的野生型烟曲霉与0.15ASPU/g干固形物的L-1000一起添加至淀粉浆液。然后，将淀粉浆液保持于在恒定搅拌下维持在60℃的水浴中。在不同时间间隔下提取等分试样并离心。将澄清上清液用于折射率(RI)以计算增溶百分比并通过HPLC分析糖组成。表10示出，在α-淀粉酶和PU存在下，使用颗粒淀粉，两种烟曲霉葡糖淀粉酶能够在68小时内能够达到>95.5％DP1，其中>86％的颗粒淀粉溶解。

表10.α-淀粉酶和支链淀粉酶对颗粒淀粉增溶的影响

实例13：AfGA2TR的表达和纯化。

AfGA2基因(NCBI参考序列DS499595，145382至147441)的核酸序列是采自烟曲霉A1163，并且由AfGA2基因编码的假定蛋白质的氨基酸序列见于NCBI数据库(NCBI寄存编号EDP53734)中。优化来自烟曲霉A1163的AfGA2基因的核苷酸序列并通过Generay(中国上海捷瑞生物工程有限公司)合成。

优化AfGA2的DNA序列用于其在里氏木霉中的表达，然后通过Generay(中国上海捷瑞生物工程有限公司)合成并插入pTrex3gM表达载体(描述于美国已公布申请2011/0136197A1)中，产生pJG313(图9)。

质粒pJG313使用基因枪方法转化进四重缺失里氏木霉菌株(在WO05/001036中描述)中(Te’o等人，J.Microbiol.Methods(《微生物学方法杂志》)，51:393-99,2002)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的培养基(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；硫酸镁七水合物0.6g/L；氯化钙二水合物0.6g/L；硫酸亚铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)上选择转化株。约1周内出现转化菌落(约50-100个)。在乙酰胺板上生长后，拾取转化株并单独地转移至乙酰胺琼脂板。在乙酰胺板上生长5天后，将显示稳定形态的转化株接种在96孔微量滴定板中的200μl葡萄糖/琼脂糖限定培养基中。将所述微量滴定板在氧生长腔室中在28℃下温育5天。使用来自这些培养物的上清液通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达并测定酶活性。随后使稳定菌株在7L发酵罐中在含有60％葡萄糖-琼脂糖进料的限定培养基中生长。葡萄糖/琼脂糖限定培养基(每升)由5g(NH₄)₂SO₄、33g PIPPS缓冲液、9g酪蛋白氨基酸、4.5g KH₂PO₄、1g CaCl₂(无水)、1g MgSO₄·7H₂O组成，用50％NaOH调节pH至5.5，用Milli-QH₂O补足至966.5mL。在灭菌后，添加以下：26mL 60％葡萄糖/琼脂糖，和400×里氏木霉痕量金属2.5mL。

经由色谱法的两个步骤来纯化蛋白质AfGA2TR。将硫酸铵添加至600mL发酵液直至硫酸铵的最终浓度达到1M。将样品加载至用含有1M硫酸铵的20mM磷酸钠pH 7.0(缓冲液A)预平衡的50mL疏水相互作用色谱Phenyl HP柱上。用1至0M硫酸铵的线性盐梯度洗涤该柱。将活性级分汇集并应用于亲和色谱法。将疏水相互作用色谱法后的样品交换于25mMpH 4.3乙酸钠缓冲液(缓冲液B)中并加载至用缓冲液B预平衡的β-环糊精偶联的Sepharose 6B柱上。利用含10mMα-环糊精的25mM pH 4.3乙酸钠(缓冲液C)洗脱目标蛋白。通过使用10K Amicon Ultra-15装置来浓缩洗脱液。最终产物纯度高于98％，并储存在-80℃下的40％甘油中以供进一步研究。

实例14：AfGA2TR的葡糖淀粉酶活性

AfGA2TR属于糖基水解酶15家族(GH15,CAZy编号)。使用1％w/w可溶性淀粉(Sigma S9765)作为底物来测量AfGA2TR的葡糖淀粉酶活性。在50℃下在50mM乙酸钠缓冲液pH 5.0中进行测定10分钟。使用实例3中公开的葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOX/HRP)技术测量葡萄糖释放速率。以经由过量的偶联GOX/HRP酶进行的2,2'-连氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的氧化速率来定量葡萄糖。基于葡萄糖标准曲线计算酶活性。在该测定法中，将一个葡糖淀粉酶单位定义为在测定法条件下每分钟生成1微摩尔葡萄糖所需的酶的量。使用上述方法，测定纯化AfGA2TR的可溶性淀粉的比活性为214单位/毫克。

实例15：AfGA2TR的pH分布

通过遵循如实例3中所述的ABTS测定方案监测pH(3.0至10.0)对AfGA2TR活性的影响。缓冲工作溶液由甘氨酸/乙酸钠/HEPES(250mM)的组合组成，其中pH从3.0变为10.0。通过将可溶性淀粉(1％于水中，w/w)与250mM缓冲溶液以9:1的比率混合来制备底物溶液。在水中在特定剂量下制备酶工作溶液(显示在线性范围内的信号根据剂量反应的曲线)。所有温育均使用与实例3中关于葡糖淀粉酶活性测定法所述相同的方案在50℃下进行10分钟。在每种pH下的酶活性报道为相对于在最佳pH下的酶活性的相对活性。AfGA2TR的pH曲线在图10中示出。据发现，AfGA2TR具有约5.3的最佳pH，并且在3.3至7.3的pH下保持最大活性的70％以上。

实例16：AfGA2TR的温度曲线

通过遵循如实例3中所述的ABTS测定方案监测温度(40℃至84℃)对AfGA2TR活性的影响。通过将9mL可溶性淀粉(1％于水中，w/w)和1mL的0.5M缓冲液(pH 5.0乙酸钠)混合在15mL锥形瓶中来制备底物溶液。在水中在特定剂量下制备酶工作溶液(显示在线性范围内的信号根据剂量反应的曲线)。分别在40℃至84℃的温度下进行温育10分钟。在温育后，遵循与实例3中关于葡糖淀粉酶活性测定法所述相同的方案测定活性。所述活性报道为相对于在最佳温度下的酶活性的相对活性。AfGA2TR的温度曲线在图11中示出。据发现，AfGA2TR具有69℃的最佳温度，并且在61℃至74℃下保持最大活性的70％以上。

实例17：AfGA2TR的热稳定性

在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中测定AfGA2TR的热稳定性。将酶在PCR机器中在所需温度下温育2小时，随后添加至底物中。如实例3中所述测量样品的剩余活性。将保持在冰上的样品的活性定义为100％活性。如图12中所示，在低于63℃的温度下，AfGA2TR在2小时温育期内保持高于50％的活性。

实例18：AfGA1TR与AfGA2TR的比较

通过用水稀释来制备淀粉液化物以具有34％干固形物并且在pH 4.4和60℃下使用2种不同的葡糖淀粉酶来进行糖化；1)AfGA1TR，在0.06mg/g干固形物淀粉和2)AfGA2TR的纯化蛋白，在0.06mg/g干固形物下。另外，将分别为0.14ASPU/g干固形物和0.9SSU/g干固形物的支链淀粉酶(L-1000)和酸稳定性α-淀粉酶(AsAA)与每种葡糖淀粉酶一起给与以增强葡萄糖的产生。在不同的时间间隔下取得样品并通过HPLC分析糖组成。

表11：AfGA1TR和AfGA2TR共混物对液化淀粉的产物分布。

表11示出，在48小时内两种淀粉酶都产生>95.5％DP1，其中使用AfGA2TR进行的糖化略微更快。

尽管已经参考上文实例详细地描述了组合物和其制造和使用方法，但是应理解，在不背离这些组合物和方法的精神的情况下可作出多种修改，并且这些修改对本领域技术人员来说是显而易见的。

在本申请中提及的所有引用专利和出版物都以引用的方式整体并入本文并用于所有目的。

Claims (74)

1.一种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO:12或13具有至少80％序列同一性，其中在相同条件下所述里氏木霉宿主细胞以与烟曲霉宿主细胞相当的水平表达所述AfGATR或变体，所述烟曲霉宿主细胞表达与所述AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体。

2.一种表达AfGATR或其变体的重组里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO:12或13具有至少80％序列同一性，其中所述AfGATR或其变体相比于与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体是更加热稳定的，并且其中所述AfGA或其变体在烟曲霉宿主细胞中表达。

3.一种用于产生重组AfGATR或其变体的方法，其包括：

(a)提供表达重组AfGATR或其变体的里氏木霉宿主细胞，所述AfGATR或其变体与SEQ ID NO:12或13具有至少80％序列同一性；

(b)在允许所述重组AfGATR或其变体产生的条件下培养所述宿主细胞；并且

其中所述AfGATR或其变体相比于与AfGATR或其变体具有相同氨基酸序列的AfGA或其变体是更加热稳定的，并且其中所述AfGA或其变体在烟曲霉宿主细胞中表达。

4.一种重组AfGATR或其变体，其由权利要求1或权利要求2所述的宿主细胞、或者根据权利要求3所述的方法产生。

5.根据权利要求4所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体在74℃下在pH 5.0下在10分钟内具有至少70％活性。

6.根据权利要求5所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体为AfGA1TR或其变体。

7.根据权利要求6所述的重组AfGA1TR或其变体，其中所述AfGA1TR或其变体在55℃至74℃的温度范围内在pH 5.0下在10分钟内具有至少70％活性。

8.根据权利要求7所述的重组AfGA1TR或其变体，其中所述AfGATR或其变体具有约68℃的最佳温度。

9.根据权利要求5所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体为AfGA2TR或其变体。

10.根据权利要求9所述的重组AfGA2TR或其变体，其中所述AfGA2TR或其变体在61℃至74℃的温度范围内在pH 5.0下在10分钟内具有至少70％活性。

11.根据权利要求10所述的重组AfGA2TR或其变体，其中所述AfGA2TR或其变体具有约69℃的最佳温度。

12.根据权利要求4-8中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体包含与SEQ ID NO:12具有至少90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

13.根据权利要求12所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体包含SEQ ID NO:12。

14.根据权利要求4-8中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体由与SEQ ID NO:12具有至少80％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。

15.根据权利要求14所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGA1TR或其变体由SEQ ID NO:12组成。

16.根据权利要求4-5和9-11中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体包含与SEQ ID NO:13具有至少90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体包含SEQ ID NO:13。

18.根据权利要求4-5和9-11中任一项所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGATR或其变体由与SEQ ID NO:13具有至少80％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成。

19.根据权利要求18所述的重组AfGATR或其变体，其中所述AfGA1TR或其变体由SEQ ID NO:13组成。

20.一种糖化包含淀粉的组合物以产生包含葡萄糖的组合物的方法，其中所述方法包括：

(i)使淀粉组合物与根据权利要求4-19中任一项所述的分离的AfGATR或其变体接触；和

(ii)糖化所述淀粉组合物以产生所述葡萄糖组合物；其中所述AfGA1TR或其变体催化所述包含淀粉的组合物向包含葡萄糖的组合物的糖化。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述包含葡萄糖的组合物与包含DP1的第二组合物相比富含DP1，所述包含DP1的第二组合物由AnGA在所述相同条件下糖化24小时后产生。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述包含葡萄糖的组合物与包含DP1的第二组合物相比富含DP1，所述包含DP1的第二组合物由野生型AfGA在所述相同条件下产生。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述AfGATR或其变体为AfGATR2及其中所述包含葡萄糖的组合物与包含DP1的第二组合物相比富含DP1，所述包含DP1的第二组合物由AfGA1TR在所述相同条件下产生。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述AfGA1TR或其变体的剂量为AnGA剂量的约40％-50％，以在相同条件下糖化24小时后产生相同的DP1产率。

25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述包含淀粉的组合物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒淀粉。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中糖化在约30℃至约65℃的温度范围内进行。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述温度范围为47℃至60℃。

28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其中糖化在pH 2.0至pH6.0的pH范围内进行。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述pH范围为pH 3.5至pH5.5。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述pH范围为pH 4.0至pH5.0。

31.根据权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使淀粉组合物与α-淀粉酶接触。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述α-淀粉酶为AkAA。

33.根据权利要求20-32中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使淀粉组合物与支链淀粉酶接触。

34.根据权利要求20-33中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述葡萄糖组合物发酵以产生发酵最终(EOF)产物。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述发酵是同时糖化和发酵(SSF)反应。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述发酵在pH 2至8下并且在25℃至70℃的温度范围内进行24至70小时。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含乙醇。

38.根据权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含8％至18％(v/v)的乙醇。

39.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使麦芽浆和/或麦芽汁与支链淀粉酶、α-淀粉酶和所述AfGATR或其变体接触。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法还包括：

(a)制备麦芽浆；

(b)过滤所述麦芽浆以获得麦芽汁；和

(c)使所述麦芽汁发酵以获得发酵饮料，

其中所述支链淀粉酶、所述α-淀粉酶和所述AfGATR或其变体被添加至：

(i)步骤(a)的麦芽浆和/或

(ii)步骤(b)的麦芽汁和/或

(iii)步骤(c)的麦芽汁。

41.根据权利要求34-40中任一项所述的方法，其中所述EOF产物包含代谢物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述代谢物是柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡糖酸钠、葡糖酸钙、葡糖酸钾、葡糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、Ω-3脂肪酸、丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇或异戊二烯。

43.根据权利要求20-42中任一项所述的方法，还包括向所述淀粉组合物添加另外的葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、另外的α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、裂解酶、水解酶或者它们的组合。

44.根据权利要求20-43中任一项所述的方法，其包括以0.1至2葡糖淀粉酶单位(GAU)/g干固形物的剂量添加所述AfGATR或其变体。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述AfGATR或其变体以约49.5μg蛋白质/g固形物的剂量添加。

46.根据权利要求20-45中任一项所述的方法，其中所述分离的AfGATR或其变体由所述里氏木霉宿主细胞分泌。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌α-淀粉酶。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述宿主细胞还表达和分泌支链淀粉酶。

49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中使所述包含淀粉的组合物与所述宿主细胞接触。

50.一种包含葡萄糖的组合物，其根据权利要求20-49中任一项所述的方法生产。

51.一种液化淀粉，其根据权利要求34-49中任一项所述的方法生产。

52.一种发酵饮料，其根据权利要求20-49中任一项所述的方法生产。

53.一种用于糖化包含淀粉的组合物的组合物，其包含根据权利要求4-19中任一项所述的分离的AfGATR或其变体。

54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述组合物是培养的细胞材料。

55.根据权利要求53或54所述的组合物，其中所述组合物包含α-淀粉酶。

56.根据权利要求53-55中任一项所述的组合物，其中所述AfGATR或其变体是经纯化的。

57.根据权利要求53-56中任一项所述的组合物，其中所述AfGATR或其变体是由宿主细胞分泌。

58.一种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途,其用于生产包含葡萄糖的组合物。

59.一种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途,其用于生产液化淀粉。

60.一种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途,其用于生产发酵饮料。

61.根据权利要求34-42中任一项所述的方法、根据权利要求52所述的发酵饮料或根据权利要求60所述的用途，其中所述发酵饮料或发酵最终产物选自：

i)啤酒，所述啤酒选自：全麦芽啤酒、根据“纯净法”酿造的啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒、拉格啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麦芽酒、无酒精啤酒和无酒精麦芽酒；和

ii)选自如下的谷物或麦芽饮料：水果味麦芽饮料、酒味麦芽饮料和咖啡味麦芽饮料。

62.一种生产食品组合物的方法，包括将以下物质组合

(i)一种或多种食品成分，和

(ii)根据权利要求4-19所述的分离的AfGATR或其变体，

其中所述支链淀粉酶和所述分离的AfGATR或其变体催化所述食品成分中存在的淀粉组分的水解而产生葡萄糖。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述食品组合物选自食品、烘焙组合物、食品添加剂、动物食品、饲料产品、饲料添加剂、油、肉和猪油。

64.根据权利要求62或63中任一项所述的方法，并且其中所述一种或多种食品成分包含烘焙成分或添加剂。

65.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述一种或多种食品成分选自：面粉；抗变陈淀粉酶；磷脂酶；磷脂；生麦芽α-淀粉酶或其具有生麦芽α-淀粉酶活性的变体、同源物或突变体；烘培食品用木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；和脂肪酶。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述一种或多种食品成分选自：

(i)来自嗜热脂肪芽孢杆菌的生麦芽糖α-淀粉酶，

(ii)来自芽孢杆菌属、曲霉属、嗜热真菌属或木霉属的烘焙食品用木聚糖酶，

(iii)来自异孢镰孢菌的糖脂酶。

67.根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中所述食品组合物包含面团或面团产品，优选经加工的面团产品。

68.根据权利要求62-67中任一项所述的方法，包括烘焙所述食品组合物以生产烘焙产品。

69.根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：

(i)提供淀粉介质；

(ii)向所述淀粉介质添加所述支链淀粉酶和所述AfGATR或其变体；和

(iii)在步骤(b)期间或之后向所述淀粉介质加热以生产烘焙产品。

70.一种用于生产食品组合物的组合物，其包含根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体。

71.一种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途，其用于制备食品组合物。

72.根据权利要求71所述的用途，其中所述食品组合物包含面团或面团产品，优选经加工的面团产品。

73.根据权利要求71或72所述的用途，其中所述食品组合物为烘焙组合物。

74.一种根据权利要求4-19中任一项所述的AfGATR或其变体的用途，其在面团产品中用于延缓或减轻所述面团产品变陈，优选地延缓或减轻其不利回生。