CN113444754B

CN113444754B - 一种水解生淀粉的方法及其应用

Info

Publication number: CN113444754B
Application number: CN202010747851.8A
Authority: CN
Inventors: 佟毅; 李义; 陶进; 刘松; 宋伟艳; 李江华; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangnan University; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Priority date: 2020-07-30
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2040-07-30
Also published as: CN113444754A

Abstract

本发明公开了一种水解生淀粉的方法及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明提供了一种降解效率高的水解生淀粉的方法，此方法为将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶与α‑淀粉酶共同添加至含有生淀粉的反应体系中；利用此方法，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶与中温α‑淀粉酶分别以0.1U/mg_生淀粉和0.1U/mg_生淀粉的加酶量协同添加至含有生淀粉的反应体系中，于温度为50℃的条件下水解24h，即可使反应体系中生淀粉的降解率高达96.93％。

Description

一种水解生淀粉的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种水解生淀粉的方法及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

淀粉是高分子碳水化合物，是由葡萄糖分子聚合而成的。其基本构成单位为α-D-吡喃葡萄糖，分子式为(C₆H₁₀O₅)n。淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。前者为无分支的螺旋结构；后者以24～30个葡萄糖残基以α-1,4-糖苷键首尾相连而成，在支链处为α-1,6-糖苷键。生活中，玉米淀粉、木薯淀粉、大米淀粉等比较常见。

淀粉降解可产生葡萄糖，葡萄糖应用广泛，例如，可作为药用辅料应用于医药领域，可进行乙醇发酵应用于化工领域，可作为甜味剂应用于食品领域等。但是，由于天然的生淀粉颗粒不能被普通的淀粉降解酶直接降解，只有通过高温糊化破坏生淀粉颗粒的结构，促使生淀粉变为熟淀粉，淀粉长链才能被淀粉降解酶有效切断，因此，传统的淀粉降解会有淀粉糊化和淀粉降解两个步骤。其中，由于淀粉糊化需要加热，并且，淀粉降解所使用的淀粉酶需要高温环境(一般为90℃及以上)，因此，传统的淀粉降解能耗较高，这无疑大大增加了葡萄糖的生产成本。

为了节省能量和成本，能够在较低温度下直接水解生淀粉一步生成葡萄糖的生淀粉酶(例如，α-淀粉酶和糖化酶等)引起了越来越多的关注。在已发现的淀粉酶中，仅有不足10％具有降解生淀粉的能力。此类酶直接作用不经糊化的生淀粉，可有效简化生淀粉的降解过程。

然而，利用这些生淀粉酶降解生淀粉一步生产葡萄糖的工业化进程仍然难以推进，这主要是因为利用这些生淀粉酶降解生淀粉的降解率过低，例如，WeiFang等人将来源于海洋细菌的α-淀粉酶按照5U/mg_底物的添加量添加到生大米淀粉中，于温度为35℃的条件下反应24h，仅可使生大米淀粉的降解率达52％(具体可参见文献：Fang W,Xue S,Deng P,et al.AmyZ1:A novelα-amylase from marine bacterium Pontibacillussp.ZY withhigh activity toward raw starches[J].Biotechnology for Biofuels,2019,12(1).)；Thanasak Lomthong等人将来源于嗜热丝状菌的生淀粉酶和商品化的葡萄糖淀粉酶分别按照660～2600U/g_底物和66～330U/g_底物的添加量协同添加到生木薯淀粉中，于温度为50℃的条件下反应12h，仅可使生木薯淀粉的降解率达66.3％(具体可参见文献：Thanasak,Lomthong,Noppon,等.Production of raw starch degrading enzyme by thethermophilic filamentous bacterium Laceyella sacchari LP175 and itsapplication for ethanol production from dried cassava chips[J].Starch Strke,2016.)。

因此，急需找到一种降解率高的利用生淀粉酶降解生淀粉的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种降解率高的利用生淀粉酶直接降解生淀粉一步生成葡萄糖的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种水解生淀粉的方法，所述方法为将糖化酶添加至生淀粉中进行水解；或者，所述方法为将糖化酶和α-淀粉酶添加至生淀粉中进行水解；所述糖化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述糖化酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶在生淀粉中的添加量为0.05～0.1U/mg_生淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶在生淀粉中的添加量为0.1U/mg_生淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶在生淀粉中的添加量为0.05～0.1U/mg_生淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶在生淀粉中的添加量为0.1U/mg_生淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶为中温α-淀粉酶。

在本发明的一种实施方式中，当α-淀粉酶为中温α-淀粉酶时，所述水解的温度为40～60℃。

在本发明的一种实施方式中，当α-淀粉酶为中温α-淀粉酶时，所述水解的温度为50℃。

在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶是由毕赤酵母工程菌分泌得到的；所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母为宿主表达编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母GS115为宿主、以pPIC9K质粒为表达载体表达编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶的基因。

本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶或上述水解生淀粉的方法在水解生淀粉中的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶在降解生淀粉中的应用；将此糖化酶以0.1U/mg_生淀粉的加酶量添加至含有生淀粉的反应体系中，于温度为50℃的条件下水解24h，即可使反应体系中生淀粉的降解率高达55％；将此糖化酶和中温α-淀粉酶分别以0.1U/mg_生淀粉和0.1U/mg_生淀粉的加酶量协同添加至含有生淀粉的反应体系中，于温度为50℃的条件下水解24h，即可使反应体系中生淀粉的降解率高达96.93％。

(2)本发明提供了一种降解效率高的水解生淀粉的方法，此方法为将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶与α-淀粉酶共同添加至含有生淀粉的反应体系中；利用此方法，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶与中温α-淀粉酶分别以0.1U/mg_生淀粉和0.1U/mg_生淀粉的加酶量协同添加至含有生淀粉的反应体系中，于温度为50℃的条件下水解24h，即可使反应体系中生淀粉的降解率高达96.93％。

附图说明

图1：重组质粒pPIC9K-GA的质粒图谱。

图2：糖化酶的SDS-PAGE分析结果；其中，M代表marker，箭头所指的条带位置为生淀粉糖化酶。

图3：温度对糖化酶酶活的影响。

图4：pH对糖化酶酶活的影响。

具体实施方式

下述实施例中涉及的生玉米淀粉购自中粮公司；下述实施例中涉及的α-淀粉酶购自蔚蓝公司，此α-淀粉酶为中温α-淀粉酶；下述实施例中涉及的糖化酶A购自源叶公司，产品编号为S10017-250g；下述实施例中涉及的pPIC9K载体购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109购自生工生物工程(上海)有限公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21购自北纳生物；下述实施例中涉及的毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、琼脂15g/L。

YPD液体培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L，pH为6.5。

YPD固体培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L，pH为6.5。

组氨酸缺陷型固体培养基：配100mL，向80mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)，121℃灭菌20min，待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB10mL(13.4g/L)、10×葡萄糖10mL(20g/L)和500×生物素0.2mL(4×10^-4g/L)。

BMGY培养基：酵母粉10g、蛋白胨20g、甘油10mL、YNB13.4g、生物素4×10^-4g，用浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸钾缓冲液定容至1L。

BMMY培养基：酵母粉10g、蛋白胨20g、YNB13.4g、生物素4×10^-4g、甲醇5mL，用浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸钾缓冲液定容至1L。

MD固体培养基(g/L)：80mL水中加入琼脂糖2g，121℃灭菌20分钟，待温度降至60℃后，继续加入10×YNB10mL、10×葡萄糖10mL、500×生物素0.2mL。

下述实施例中涉及的试剂如下：

DNS试剂：先将18.2g酒石酸钾钠溶于50mL蒸馏水中，得到混合液A，然后将混合液A加热，得到热溶液，接着在热溶液中依次加入0.63g3,5-二硝基水杨酸、2.1gNaOH、0.5g苯酚，搅拌至溶，得到混合液B，最后待混合液B冷却后用蒸馏水定容混合液B至100mL，得到DNS试剂(DNS试剂贮于棕色瓶中，25℃保存)。

乙酸-乙酸钠缓冲液：将5.4g乙酸钠溶于50mL蒸馏水中，用冰醋酸调节pH值至4.6后加水稀释至100mL。

2％淀粉溶液：将2g可溶性淀粉缓慢加入到50mL沸水中后加水定容到100mL。

10％生玉米淀粉悬浮液：将10g生玉米淀粉溶解到100mLpH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液中，得到生淀粉颗粒悬浮液。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

糖化酶酶活的测定：以灭活后发酵上清液或纯酶为对照，以2％可溶性淀粉溶液为底物，在含有底物的反应体系中添加发酵上清液或纯酶后，于40℃反应10min，反应结束后，立即在反应液中添加1mLDNS终止反应，用DNS法测定反应液中产生的吸光度(以葡萄糖计)，将测得的吸光度带入葡萄糖标准曲线，计算反应液中产生的还原糖浓度，进而换算得到发酵上清液或纯酶的糖化酶酶活；

其中，反应体系为：400μL底物、400μLpH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液、200μL酶液；

葡萄糖标准曲线为：y＝1.1397x+0.005，其中，x为葡萄糖浓度，y为吸光度；

DNS法具体可参考文献：韦荣霞.生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质研究[D].2013.；

糖化酶酶活的计算公式为：糖化酶酶活＝25M/9，其中，M代表葡萄糖含量，单位为mg；

糖化酶酶活的定义为：在pH4.6、40℃的反应条件下，1min内水解可溶性淀粉产生1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。

生淀粉降解率的测定：降解率(％)＝葡萄糖含量(mg/mL)/生淀粉含量(mg/mL)×0.9×100；

其中，葡萄糖含量通过DNS法测定，DNS法具体可参考文献：韦荣霞.生淀粉糖化酶的分离纯化及酶学性质研究[D].2013.。

实施例1：糖化酶的生产

(1)毕赤酵母工程菌的构建

化学合成核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的编码糖化酶(氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示)的基因；以GA-F、GA-R为引物通过PCR扩增在编码糖化酶的基因的两端引入同源臂，获得扩增片段；将扩增片段和pPIC9K载体使用一步克隆试剂盒进行连接，获得连接产物；将获得的连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，得到转化产物1；将转化产物1涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养12～16h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pPIC9K-GA(质粒图谱见图1)；将重组质粒pPIC9K-GA转化至毕赤酵母GS115中，得到转化产物2；将转化产物2涂布在组氨酸缺陷型固体培养基上，于30℃的条件下倒置培养48h，得到转化子；挑取转化子接种至YPD液体培养基中，于30℃的条件下培养16～18h后提取基因组进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的毕赤酵母工程菌GS115-GA；

其中，引物如下：

GC-F:AGAGAGGCTGAAGCTGCCCCGCAGCTGAGCGCACGTGC(SEQ ID No.3)；

GC-R:CACTTGGCGTCACCACCACCACCACCACTGATACGTAGAATTCCCTAGG(SEQ ID No.4)。

(2)糖化酶的生产

将验证正确的毕赤酵母工程菌GS115-GA的转化子接种于BMGY培养基中，于30℃的条件下培养18h，得到菌液；将菌液于4000rpm的条件下离心10min后收集菌体；将菌体重悬于含有1％(v/v)甲醇的BMMY培养基中，得到重悬液；将重悬液于30℃的条件下继续培养120h，得到发酵液；将发酵液于4000rpm的条件下离心10min后取上清，得到发酵上清液；将发酵上清液经0.22um滤膜过滤后进行镍柱纯化，得到纯酶(糖化酶纯酶的SDS-PAGE分析结果见图2)。

(3)糖化酶的验证

检测发酵上清液中糖化酶的酶活，检测结果为：23.3U/mL。

以未经处理的纯酶为对照，将纯酶分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的条件下保存2h，保存期间，间隔30min取样测定经处理的纯酶的酶活，以未经处理的纯酶的酶活为100％，不同温度下保存不同时间后的酶活与之相比计算残留酶活，以考察其温度稳定性(检测结果见图3)。

由图3可知，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶在40℃下保存12h后的残留酶活高达95％，温度稳定性较好。

以未经处理的纯酶为对照，将纯酶分别添加至pH分别为4.6、5.5、6.5、8.5的条件下保存5h，保存期间，间隔30min取样测定经处理的纯酶的酶活，以未经处理的纯酶的酶活为100％，不同pH下保存不同时间后的酶活与之相比计算残留酶活，以考察其pH稳定性(检测结果见图4)。

由图4可知，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶在pH为4.6的条件下保存12h后的残留酶活高达96％，pH稳定性较好。

实施例3：生淀粉的降解

方案一：取实施例1获得的纯酶以0.1U/mg_生淀粉的添加量添加至10％生玉米淀粉悬浮液中，得到混合液；将混合液于50℃条件下反应24h，得到反应液1。

方案二：取实施例1获得的纯酶以0.1U/mg_生淀粉的添加量添加至10％生玉米淀粉悬浮液中后，取中温α-淀粉酶以0.1U/mg_生淀粉的添加量添加至10％生玉米淀粉悬浮液中，得到混合液；将混合液于50℃条件下反应24h，得到反应液2。

方案三：在方案一的基础上，将实施例1获得的纯酶替换为中温α-淀粉酶，得到反应液3。

方案四：在方案二的基础上，将实施例1获得的纯酶替换为糖化酶A，得到反应液4。

反应过程中，间隔3h对反应液1～4取样，检测反应液1～4中生淀粉的降解率和降解效率(检测结果见表1)。

由表1可知，将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶以0.1U/mg_生淀粉的加酶量添加至10％生玉米淀粉悬浮液中，于温度为50℃的条件下水解24h，即可使反应体系中生淀粉的降解率高达55％；将氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶和中温α-淀粉酶分别以0.1U/mg_生淀粉和0.1U/mg_生淀粉的加酶量协同添加至10％生玉米淀粉悬浮液中，于温度为50℃的条件下水解24h，即可使反应体系中生淀粉的降解率高达96％；而单独使用中温α-淀粉酶或将中温α-淀粉酶与糖化酶A复配降解生淀粉的效果远不如将中温α-淀粉酶与实施例1获得的纯酶复配。

表1反应液1～9中生淀粉的降解率和降解效率

其中，“--”为未检测。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 吉林中粮生化有限公司

江南大学

<120> 一种水解生淀粉的方法及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 612

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Pro Gln Leu Ser Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Trp Leu

1 5 10 15

Gly Thr Glu Thr Thr Val Ala Leu Asn Gly Ile Leu Ala Asn Ile Gly

20 25 30

Ala Asp Gly Ala Tyr Ala Lys Ser Ala Lys Pro Gly Ile Ile Ile Ala

35 40 45

Ser Pro Ser Thr Ser Glu Pro Asp Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp

50 55 60

Ala Ala Leu Val Thr Lys Val Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asn

65 70 75 80

Leu Gly Leu Gln Lys Val Ile Thr Glu Tyr Val Asn Ser Gln Ala Tyr

85 90 95

Leu Gln Thr Val Ser Asn Pro Ser Gly Gly Leu Ala Ser Gly Gly Leu

100 105 110

Ala Glu Pro Lys Tyr Asn Val Asp Met Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp

115 120 125

Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile

130 135 140

Asp Phe Gly Asn Trp Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Ser Ser Tyr Ala Val

145 150 155 160

Asn Asn Ile Trp Pro Ile Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ser Gln

165 170 175

Tyr Trp Ser Gln Ser Gly Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Met

180 185 190

Ser Phe Phe Thr Val Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser

195 200 205

Thr Phe Ala Lys Arg Val Gly Ala Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln

210 215 220

Ala Pro Gln Ile Leu Cys Tyr Met Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Tyr

225 230 235 240

Ile Asn Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr

245 250 255

Val Leu Ala Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Gly Cys Asp Asp

260 265 270

Thr Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val

275 280 285

Tyr Thr Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Pro

290 295 300

Gln Gly Ala Ala Val Ser Ala Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Tyr

305 310 315 320

Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Thr Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu

325 330 335

Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr

340 345 350

Ser Thr Ser Leu Ala Phe Phe Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Ala Ala Val

355 360 365

Gly Thr Tyr Ala Ser Ser Thr Ser Thr Phe Thr Asp Ile Ile Asn Ala

370 375 380

Val Lys Thr Tyr Ala Asp Gly Tyr Val Ser Ile Val Gln Ala His Ala

385 390 395 400

Met Asn Asn Gly Ser Leu Ser Glu Gln Phe Asp Lys Ser Ser Gly Leu

405 410 415

Ser Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Phe Leu Thr

420 425 430

Ala Asn Met Arg Arg Asn Gly Val Val Pro Ala Pro Trp Gly Ala Ala

435 440 445

Ser Ala Asn Ser Val Pro Ser Ser Cys Ser Met Gly Ser Ala Thr Gly

450 455 460

Thr Tyr Ser Thr Ala Thr Ala Thr Ser Trp Pro Ser Thr Leu Thr Ser

465 470 475 480

Gly Ser Pro Gly Ser Thr Thr Thr Val Gly Thr Thr Thr Ser Thr Thr

485 490 495

Ser Gly Thr Ala Thr Glu Thr Ala Cys Ala Thr Pro Thr Ala Val Ala

500 505 510

Val Thr Phe Asn Glu Ile Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Val Tyr

515 520 525

Ile Val Gly Ser Ile Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Thr Ser Lys Ala

530 535 540

Val Ala Leu Ser Ala Ser Lys Tyr Thr Ser Ser Asn Asn Leu Trp Tyr

545 550 555 560

Val Ser Val Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Phe Glu Tyr Lys Tyr Ile

565 570 575

Arg Lys Glu Ser Asp Gly Ser Ile Val Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg

580 585 590

Ser Tyr Thr Val Pro Ala Ala Cys Gly Val Ser Thr Ala Thr Glu Asn

595 600 605

Asp Thr Trp Arg

610

<210> 2

<211> 1836

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccccgcagc tgagcgcacg tgcaactggt tctttagaca gttggctggg taccgaaacc 60

accgtggcac tgaacggtat tctggcaaac atcggcgccg atggtgcata cgccaagagc 120

gcaaaaccgg gcatcatcat tgcaagcccg agcaccagcg agccggatta ctactatact 180

tggacacgcg atgccgcatt agttaccaag gtgctggttg atttattccg caatggcaat 240

ctgggtctgc agaaagtgat caccgagtat gtgaacagcc aagcttatct gcagaccgtg 300

agcaatccga gcggtggttt agcaagcggt ggtttagcag aaccgaaata caatgtggat 360

atgacagcat tcaccggcgc atggggtcgt ccgcagcgtg atggtccggc cttacgtgcc 420

accgctttaa ttgactttgg taattggctg atcgacaacg gctatagcag ctacgccgtt 480

aataacatct ggccgatcgt tcgtaacgat ctgagctacg tgagccagta ctggagtcag 540

agcggcttcg atttatggga agaggtgaac agcatgagct tcttcaccgt ggccgtgcag 600

catcgtgcac tggtggaagg cagcacattt gccaaacgcg ttggtgccag ttgcagctgg 660

tgtgatagcc aagctccgca gattttatgc tatatgcaga gtttttggac cggcagctat 720

atcaacgcca ataccggtgg tggtcgtagc ggtaaagatg caaacaccgt gctggcaagc 780

atccatacct tcgatcccga agctggttgt gacgatacca cctttcagcc gtgtagcccg 840

cgtgctttag ccaatcataa agtgtacacc gacagcttcc gtagcgtgta tgcaatcaac 900

agtggtatcc cgcaaggtgc agccgtgagt gctggtcgct atccggaaga cgtgtactac 960

aacggcaatc cgtggtttct gaccacactg gcagcagccg agcaactgta tgatgccatt 1020

tatcagtgga agaaaattgg cagtatcagc attaccagca ccagcttagc atttttcaaa 1080

gatatctaca gtagcgccgc agtgggtacc tatgccagca gtaccagtac atttacagat 1140

attatcaacg ccgtgaagac ctatgcagac ggctacgtta gcattgtgca agctcacgcc 1200

atgaacaacg gctctttaag tgaacagttc gacaaaagca gcggtttaag tctgagtgca 1260

cgcgatttaa cttggagtta tgccgccttt ttaaccgcaa atatgcgtcg caatggtgtt 1320

gtgcccgctc cttggggtgc cgcaagcgca aatagcgtgc cgagcagttg cagcatgggt 1380

agcgccaccg gtacctacag cacagccaca gcaaccagtt ggccgagcac tttaaccagt 1440

ggtagccccg gtagcaccac aaccgttggc accacaacaa gcaccaccag tggcaccgcc 1500

accgaaaccg catgtgccac cccgacagcc gtggccgtta cctttaatga gattgccacc 1560

accacctatg gcgaaaacgt gtacatcgtg ggcagcatca gcgaactggg taattgggat 1620

accagcaagg cagtggcttt aagtgccagt aaatatacaa gcagtaataa tctgtggtat 1680

gtgagtgtga ctttaccggc tggtaccacc ttcgagtaca agtacattcg caaagagagc 1740

gacggcagca tcgtgtggga aagcgacccg aaccgtagtt acacagttcc cgctgcatgt 1800

ggcgttagca ccgcaaccga gaacgacact tggcgt 1836

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agagaggctg aagctgcccc gcagctgagc gcacgtgc 38

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cacttggcgt caccaccacc accaccactg atacgtagaa ttccctagg 49

Claims

1.一种水解生淀粉的方法，其特征在于，所述方法为将糖化酶和α-淀粉酶添加至生淀粉中进行水解；所述糖化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述糖化酶在生淀粉中的添加量为0.1U/mg_生淀粉；所述α-淀粉酶在生淀粉中的添加量为0.1U/mg_生淀粉；所述α-淀粉酶为中温α-淀粉酶；所述水解的温度为50℃；所述生淀粉浓度为10％；所述水解时间为24h。

2.如权利要求1所述的一种水解生淀粉的方法，其特征在于，编码所述糖化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求1-2任一项所述的一种水解生淀粉的方法，其特征在于，所述糖化酶是由毕赤酵母工程菌分泌得到的；所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母为宿主表达编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶的基因。

4.如权利要求3所述的一种水解生淀粉的方法，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母GS115为宿主、以pPIC9K质粒为表达载体表达编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的糖化酶的基因。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种水解生淀粉的方法在水解生淀粉中的应用。