CN110804620B

CN110804620B - 一种麦芽糖生产用重组异淀粉酶高效表达及应用

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Publication number: CN110804620B
Application number: CN201911102807.5A
Authority: CN
Inventors: 李明全; 何球山; 黄海军; 邓希
Original assignee: Hunan Huisheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Jindai Technology Development Co.,Ltd.
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110804620A

Abstract

本发明公开了一种麦芽糖生产用重组异淀粉酶高效表达及应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明从富含淀粉的土壤中分离筛选目的菌株，通过菌株细胞破碎技术获取产异淀粉酶基因，设计引物，目的基因PCR扩增，选择合适质粒结合以大肠杆菌为受体细胞，建立细菌异淀粉酶基因的重组表达系统，获得高产量、高稳定性的异淀粉酶，摇瓶发酵产量可达113.7U/ml，将其用于麦芽糖生产，可使麦芽糖浆中的麦芽糖含量达95.13％，弥补工业上的需求。

Description

一种麦芽糖生产用重组异淀粉酶高效表达及应用

技术领域

本发明涉及一种麦芽糖生产用重组异淀粉酶高效表达及应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

异淀粉酶(E.C.3.2.1.33，Isoamylase)是一种内切型淀粉酶，仅专一性作用于支链淀粉分支点的α－1，6－糖苷键，使其形成直链淀粉，而对直链淀粉分子中的α－1，6－糖苷键不起作用，这种特性最早在淀粉结构的理论研究中应用。到七十年代，异淀粉酶的应用越来越广泛，逐步从实验室研究向工业化应用发展，已扩展到淀粉糖浆，啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工领域。主要原因是在淀粉加工过程中，异淀粉酶和糖化酶的协同作用可以加速糖化过程，并提高糖化率，和β－淀粉酶配合使用能极大提高麦芽糖得率。由于异淀粉酶可以将最小单位的支链分解，最大限度地利用淀粉原料，因此是一种需求量很大的支链淀粉酶。目前除了较成功地应用于高葡萄糖浆，高麦芽糖浆，低聚寡糖和啤酒生产，在医药领域亦有应用。

自然界中，异淀粉酶来源广泛。目前已在大米、甜玉米、马铃薯、蚕豆等许多植物中发现有异淀粉酶。高等动物的肝脏、肌肉中也有类似于异淀粉酶水解α－1，6－糖苷键的酶存在，但将这些来源的异淀粉酶应用于高速发展的工业上是远远不够的。微生物来源的异淀粉酶数量庞大，而且根据菌的生长特性可以分离出耐高温、耐低温、嗜酸性、嗜碱性等适合于不同工业需求的异淀粉酶，因此近年来，人们越来越多的关注微生物来源的异淀粉酶。1940年日本学者首次从酵母细胞提取液中发现异淀粉酶，但能满足工业化生产的菌种还是比较难得。1993年王武等对短杆菌异淀粉酶产生菌进行诱变，选育，从初始酶活为7U/mL的出发菌，获得了摇瓶发酵液中酶活单位最高可达20U/mL的突变菌株，是至今国内较为优良的产异淀粉酶菌种，但一直未见其后续研究及工业化生产的相关报道。2003年王弋等诱变中温地衣芽孢杆菌，其出发菌株的异淀粉酶活性达到3.35U/mL，诱变后酶活提高到7.37U/mL。2005年夏静等从云南梁河温泉水样中分离筛选到1株产异淀粉酶的栖热菌(Thermus)，其产酶的初始酶活达4.14U/mL。关于如何获得高产量、高稳定性微生物来源的异淀粉酶方面的报道在国内并不多见。2016年，冉红艳将嗜热放线菌的异淀粉酶基因克隆到大肠杆菌里，获得成功表达，酶活力是18.8U/mL。国外，1988年Amemura首先使用鸟枪克隆法克隆并测序了P.amyloderamosa的异淀粉酶编码基因。1989年Togoni等完成了来源于一株假单胞菌的异淀粉酶编码基因的克隆和测序。1999年Abe J将Flavobacterium odoratum KU异淀粉酶基因成功表达在大肠杆菌中，酶活力达到85.9U/mL。2007年Cho等克隆并鉴定了来自Pectobacterium carotovrum亚种carotovorum(Pcc)LY34的异淀粉酶基因，并将其表达在大肠杆菌DH5α中，酶活力为35.5U/mL。因此，细菌异淀粉酶普遍分泌量较低，常规方法如优化发酵产酶条件、紫外诱变等无法从根本上提高酶活，细菌异淀粉酶基因重组表达是解决这一难题的主要策略之一。

发明内容

本发明提供一种产异淀粉酶重组工程菌，该工程菌进行异源重组表达得到目标重组酶，分析重组酶的酶学性质和应用特性，并与天然酶的结果进行比较，鉴定性能优良的麦芽糖生产用高效胞外异淀粉酶的编码基因。

本发明的第一个目的是提供一种编码异淀粉酶的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种异淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因或表达所述异淀粉酶的载体或细胞系。

在一种实施方式中，所述细胞为微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物为大肠杆菌，包括但不限于：E.coli BL21、E.coliBL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，其特征在于，以pMD18T-simple为载体，以E.coli BL21(DE3)，表达SEQ ID NO.1所示的异淀粉酶基因。

本发明的第五个目的是提供所述异淀粉酶在食品领域的应用。

在一种实施方式中，所述应用是生产高葡萄糖浆，高麦芽糖浆，低聚寡糖或啤酒。

有益效果：本发明从富含淀粉的土壤中分离筛选目的菌株，通过菌株细胞破碎技术获取产异淀粉酶基因，设计引物，目的基因PCR扩增，选择合适质粒结合以大肠杆菌为受体细胞，建立细菌异淀粉酶基因的重组表达系统，获得高产量、高稳定性的异淀粉酶，摇瓶发酵产量可达113.7U/ml，将其用于麦芽糖生产，可使麦芽糖浆中的麦芽糖含量达95.13％，弥补工业上的需求。

附图说明

图1为不同温度下酶的相对活力；

图2为不同pH下酶的相对活力。

具体实施方式

异淀粉酶的酶活测定方法：

采用3，5－二硝基水杨酸法测定酶活力(以麦芽糖做标准曲线)，测定实验菌株在OD520nm的光密度值。酶活力单位定义：在40℃、pH6.0条件下，每分钟从1％的支链淀粉中释放出1mmol麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)

式中：K为标准曲线斜率；F为样品溶液反应前的总量，100mL；S为样品测试量，S＝0.5；T为时间，T＝10min；A为实验组吸光度；A₀为对照组吸光度。

取15mL具塞试管8支，编号，分别加入粗酶液和1％的支链淀粉溶液各0.5mL，以蒸馏水代替粗酶液的试管做对照。再加入3，5－二硝基水杨酸1.5mL，摇匀，沸水浴5min，取出冷却，用蒸馏水稀释至10mL，摇匀后用分光光度计于520nm波长下比色，记录吸光值，根据标准曲线进行结果计算，每个样平行做3份，求平均值。

实施例1野生产异淀粉酶菌种的筛选

(1)培养基的准备

分离培养基(按g/100ml培养基计)：蛋白胨0.5，Na₂HPO₄ 0.015，KH₂PO₄ 0.01，MgSO₄·7H₂O 0.05，NaCl 0.05，支链淀粉0.2，琼脂1.8，pH7.0-7.2，8磅30min灭菌。

LB斜面培养基(按g/100ml培养基计)：可溶性淀粉1，蛋白胨0.6，酵母膏0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，K₂HPO_4.0.05，pH7.0-7.2，15磅25min灭菌。

TB发酵培养基(按g/100ml培养基计)：可溶性淀粉1.2，蛋白胨0.6，酵母膏0.3，MgSO₄·7H₂O 0.05，K₂HPO_4.0.1，pH7.0-7.2，15磅25min灭菌。

(2)菌种的筛选及分离纯化

分别从含有淀粉的土壤、堆肥、温泉等自然环境中采集样品土壤，将样品土壤用无菌水适当稀释，均匀涂布于分离培养基上，32℃培养。待长出菌落后，挑取透明圈和菌落直径比较大的50株菌接入斜面，进一步纯化分离，将纯化好的菌种接入含有TB发酵培养基的摇瓶中，以32℃180r/min培养48h测酶活(接种量4mL)，表1为筛选获得的3株酶活最高的菌株。

表1不同菌株产酶能力

实施例2产异淀粉酶工程菌的制备及表达

(1)目的基因组的提取

从斜面培养基上挑取适量的纯化好的目标菌体L3，接种于液体培养基中，在50℃，200rpm振荡培养20h，取1.5ml菌体悬浮液离心，用于提取基因组DNA。

L3基因组DNA采用生工生物工程(上海)有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行提取，详细操作步骤见试剂盒使用说明书。最后将吸附柱上的基因组DNA用无菌超纯水进行洗脱，样品在-20℃下保存备用。

(2)目的基因的鉴定及PCR扩增

将菌株L3的基因组进行全基因组测序，对相关基因进行初步确定。根据基因组序列设计引物：

Tfu_F：5–CATATGATGGTGGAAGTCTGGCCTGG–3’含有NdeⅠ酶切位点

Tfu_R：5–AAGCTTGAGCACCAGGAACGACCGG–3’含有HindⅢ酶切位点

PCR反应体系如下所示：

PCR扩增程序设定为：94℃预变性4min后进入30个循环；98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸2.5min；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％琼脂凝胶电泳进行检测。

(3)PCR产物的纯化

使用生物工程(上海)有限公司生产的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化，具体操作间试剂盒说明书。最后将吸附在柱上的PCR产物用无菌超纯水进行洗脱，样品直接使用或保存在-20℃下备用。

(4)质粒的构建

Ta克隆载体为Takara公司的pMD18T-simple vector，连接体系如下：

PCA产物 5μL

pMD18T-simple 2μL

Solution 4μL

将上述连接反应混合物轻轻混匀并离心，于16℃连接过夜，然后转化克隆宿主JM109。

限制性内切酶采用NdeⅠ和HindⅢ，用质粒小量提取试剂盒来提取质粒，进行小量双酶切验证。将酶切验证正确的质粒送上海生工测序，然后将测序正确的表达载体pMD18T-simple/pulA转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，挑取阳性转化子接入LB培养基中培养过夜，并保存甘油管备用，构建得到重组菌株BL21(DE3)(pT7-7/Tfu_iso)。

(5)重组菌的摇瓶发酵

种子培养：取适量甘油管保藏的菌液接入LB种子培养基，37℃，200rpm摇瓶振荡培养8-9h。培养基使用前添加100μg/mL氨苄青霉素。

摇瓶发酵培养：以5％(V/V)的接种量将种子接入TB发酵培养基中，装液量50mL(250mL三角瓶)，200rpm，37℃培养至OD₆₀₀为1.0时，加入0.05mmol/LIPTG诱导，继续培养30h。培养基使用前添加100μg·mL^-1氨苄青霉素，异淀粉酶活力为38.4U/mL，是出发菌株的2.07倍。

(6)诱导条件的优化

保持诱导浓度为0.05mmo/L，分别将诱导温度降低至30℃和25℃，结果显示，酶活分别可达45.8U/mL和35.1U/mL。

将诱导温度控制为30℃，分别调至IPTG浓度为0.05、0.10和0.15mmo/L，比较诱导30h后的细胞生长情况和产酶情况，结果如表2所示。以37℃培养至OD₆₀₀为1.0时，加入0.1mmol/L IPTG诱导，于30℃继续培养30h作为最优的诱导条件。

表2不同诱导条件下的细胞生长及产酶情况

IPTG浓度(mmo/L)	细胞干重(g/L)	酶活力(U/mL)
			0.05	8.6	45.8
0.10	7.2	113.7
			0.15	7.0	65.1

(7)重组酶的分离纯化

发酵液于4℃、10000rpm离心20min收集得到菌体，菌体用50mmol·L^-1pH5.5Na₂HPO₄柠檬酸缓冲悬浮液悬浮，用超声波破碎仪破碎，破碎条件：工作3s，间歇3s，功率15％，总时间6min，实际工作时间是3min。菌体破碎后12000rpm，离心3min，上清液即为酶液。采用20％的(NH₄)₂SO₄进行盐析，离心收集沉淀。沉淀复溶后，在pH7.0，20mmol/L磷酸缓冲液中透析过夜。样品经过0.4μm膜过滤后制成上样样品；DEAE阴离子交换色谱柱进行纯化，260nm紫外在线监测收集目的组分，分部收集含异淀粉酶酶活的洗脱液。

表3重组酶的纯化过程参数

实施例3重组酶的酶学性质分析

配制不同pH值(pH4.0-7.0)的缓冲液代替异淀粉酶活力测定方法中的缓冲液，在45℃下测定异淀粉酶活力，考察酶的最适作用pH。

以支链淀粉为底物，用50mmol·L^-1pH5.0磷酸缓冲液，在不同温度下(30℃-70℃)测定异淀粉酶酶活以确定最适反应温度。结果如图1～2所示，重组酶在pH5.0，温度45℃时活性最强，在温度为40～45℃，pH4.5～5.5时，相对酶活可达90％以上。

实施例4重组酶在生产麦芽糖中的应用

向200g/L淀粉糊精中按照2U/gDS(干物质)的量添加异淀粉酶酶液，于pH5.0，45℃反应4h，再加富15U/gDS的β-淀粉酶，继续反应20h，测得麦芽糖浆中的麦芽糖含量达95.13％；以普鲁兰酶作为对照，在相同条件下进行反应，结果显示，麦芽糖含量仅78.22％。可见，本申请的异淀粉酶能够显著提高β-淀粉酶转化生成麦芽糖的效率，由于最适温度较低，更适于工业化应用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南汇升生物科技有限公司

<120> 一种麦芽糖生产用重组异淀粉酶高效表达及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2088

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtcgagg tctggcccgg caccccctac cccctcggcg ccacctacga cggctccggc 60

accaacttct ccctcttctc cgaggtcgcc accggcgtcg agctctgcct cttcgacgac 120

gacggcgccg agacccgcat cgagctcacc gagcgcgacg gccacgtctg gcacctctac 180

ctccccggcg tcggccccgg ccagcgctac ggctaccgcg tccacggccc ccacgacccc 240

acccgcggcc tccgctgcaa ccccaacaag ctcctcgtcg acccctacgc caaggccatc 300

gacggccgca tcgagtggca cgagtccctc ttcgactacc acttcgacga cccctcccgc 360

gtcaacaacc acgactccgc cccctacgtc cccacctgcg tcgtcgtctc ccccttcttc 420

gactggggcg ccgagcagca ccccaacatc ccctaccacg agaccgtcat ctacgaggcc 480

cacgtccgcg gcatgaccat ccgccacccc gacgtccccc cccccctccg cggcacctac 540

gccggcatgg cccaccccgc cgtcgtcgac cacctccgcg ccctcggcgt caccgccgtc 600

gagctcatgc ccgtccacca cttcctcccc gagcacgccc tcgtcgcccg cggcctcacc 660

aactactggg gctacaacac cctcgccttc ctcgcccccg actccggcta cgccgccacc 720

ggcacccgcg gcgagcaggt ccaggagttc aaggccatgg tcaaggccct ccacgaggcc 780

ggcatcgagg tcatcctcga cgtcgtctac aaccacaccg ccgagggcga ccacatgggc 840

cccaccctct ccctccgcgg catcgacaac ctcgcctact accgcgtccg cgaggacgac 900

cgccgctact acctcgacta caccggctgc ggcaactccc tcaacatgcg ccacccccac 960

tccctccagc tcatcatgga ctccctccgc tactgggtcc tcgagatgca cgtcgacggc 1020

ttccgcttcg acctcgcctc cgccctcgcc cgcgagttcc acgacgtcga ccgcctctcc 1080

accttcttcg acatcgtcca gcaggacccc gtcatcgagc aggtcaagct catcgccgag 1140

ccctgggacg tcggccccgg cggctaccag gtcggcaact tcccccccct ctggtccgag 1200

tggaacggcc tctaccgcga caccgtccgc gacttctggc gcggctaccc cgtcctcccc 1260

gagctcgcct cccgcctctc cggctcctcc gacctctacc aggccgacgg ccgccgcccc 1320

gtcgcctccg tcaacttcgt cacctgccac gacggcttca ccctcgccga cctcgtctcc 1380

tacgaccgca agcacaacga ggccaacggc gaggacaacc gcgacggcac caacgacaac 1440

cgctcctgga accacggcac cgagggcccc accaccgacc ccgccatcgc caccctccgc 1500

cgccgccaga tgcgcaacat gctcaccacc ctcatgctct cccagggcgt ccccatgctc 1560

tcccacggcg acgagatcgg ccgcacccag cacggcaaca acaacgccta ctgccaggac 1620

aacgagatcg cctggatgga ctgggagctc ggcgaggagc aggaggagct cctcgagttc 1680

gtccgccgcc tctcccgcct ccgccgcggc caccccgtct tccgccgccg ccgcttcttc 1740

cagggcgacc tctccggcca gggccgccag cgcgacatcg cctggctccg ccccgacggc 1800

ggcctcatgg ccaactccga ctggggccgc ggcggccgcg ccctcggcgt cttcctcaac 1860

ggcgacgcca tcaccgagcc cgaccgcctc ggccgccgcg tccgcgacga ctccttcctc 1920

ctcctcgcca acgccgaggt cggctccgtc cgcttcaccc tccccgaccg ctcctacggc 1980

tccgcctggg agaccgtcgt cgacaccgcc gagcccggcg tcaccggccg ccccctcctc 2040

ctcgccggcg gcggcgtcac cgtcgtcgac cgcgccttcc tcgtcctc 2088

<210> 2

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val Glu Val Trp Pro Gly Thr Pro Tyr Pro Leu Gly Ala Thr Tyr

1 5 10 15

Asp Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Phe Ser Glu Val Ala Thr Gly

20 25 30

Val Glu Leu Cys Leu Phe Asp Asp Asp Gly Ala Glu Thr Arg Ile Glu

35 40 45

Leu Thr Glu Arg Asp Gly His Val Trp His Leu Tyr Leu Pro Gly Val

50 55 60

Gly Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Tyr Arg Val His Gly Pro His Asp Pro

65 70 75 80

Thr Arg Gly Leu Arg Cys Asn Pro Asn Lys Leu Leu Val Asp Pro Tyr

85 90 95

Ala Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ile Glu Trp His Glu Ser Leu Phe Asp

100 105 110

Tyr His Phe Asp Asp Pro Ser Arg Val Asn Asn His Asp Ser Ala Pro

115 120 125

Tyr Val Pro Thr Cys Val Val Val Ser Pro Phe Phe Asp Trp Gly Ala

130 135 140

Glu Gln His Pro Asn Ile Pro Tyr His Glu Thr Val Ile Tyr Glu Ala

145 150 155 160

His Val Arg Gly Met Thr Ile Arg His Pro Asp Val Pro Pro Pro Leu

165 170 175

Arg Gly Thr Tyr Ala Gly Met Ala His Pro Ala Val Val Asp His Leu

180 185 190

Arg Ala Leu Gly Val Thr Ala Val Glu Leu Met Pro Val His His Phe

195 200 205

Leu Pro Glu His Ala Leu Val Ala Arg Gly Leu Thr Asn Tyr Trp Gly

210 215 220

Tyr Asn Thr Leu Ala Phe Leu Ala Pro Asp Ser Gly Tyr Ala Ala Thr

225 230 235 240

Gly Thr Arg Gly Glu Gln Val Gln Glu Phe Lys Ala Met Val Lys Ala

245 250 255

Leu His Glu Ala Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val Tyr Asn His

260 265 270

Thr Ala Glu Gly Asp His Met Gly Pro Thr Leu Ser Leu Arg Gly Ile

275 280 285

Asp Asn Leu Ala Tyr Tyr Arg Val Arg Glu Asp Asp Arg Arg Tyr Tyr

290 295 300

Leu Asp Tyr Thr Gly Cys Gly Asn Ser Leu Asn Met Arg His Pro His

305 310 315 320

Ser Leu Gln Leu Ile Met Asp Ser Leu Arg Tyr Trp Val Leu Glu Met

325 330 335

His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ala Leu Ala Arg Glu

340 345 350

Phe His Asp Val Asp Arg Leu Ser Thr Phe Phe Asp Ile Val Gln Gln

355 360 365

Asp Pro Val Ile Glu Gln Val Lys Leu Ile Ala Glu Pro Trp Asp Val

370 375 380

Gly Pro Gly Gly Tyr Gln Val Gly Asn Phe Pro Pro Leu Trp Ser Glu

385 390 395 400

Trp Asn Gly Leu Tyr Arg Asp Thr Val Arg Asp Phe Trp Arg Gly Tyr

405 410 415

Pro Val Leu Pro Glu Leu Ala Ser Arg Leu Ser Gly Ser Ser Asp Leu

420 425 430

Tyr Gln Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Ala Ser Val Asn Phe Val Thr

435 440 445

Cys His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val Ser Tyr Asp Arg Lys

450 455 460

His Asn Glu Ala Asn Gly Glu Asp Asn Arg Asp Gly Thr Asn Asp Asn

465 470 475 480

Arg Ser Trp Asn His Gly Thr Glu Gly Pro Thr Thr Asp Pro Ala Ile

485 490 495

Ala Thr Leu Arg Arg Arg Gln Met Arg Asn Met Leu Thr Thr Leu Met

500 505 510

Leu Ser Gln Gly Val Pro Met Leu Ser His Gly Asp Glu Ile Gly Arg

515 520 525

Thr Gln His Gly Asn Asn Asn Ala Tyr Cys Gln Asp Asn Glu Ile Ala

530 535 540

Trp Met Asp Trp Glu Leu Gly Glu Glu Gln Glu Glu Leu Leu Glu Phe

545 550 555 560

Val Arg Arg Leu Ser Arg Leu Arg Arg Gly His Pro Val Phe Arg Arg

565 570 575

Arg Arg Phe Phe Gln Gly Asp Leu Ser Gly Gln Gly Arg Gln Arg Asp

580 585 590

Ile Ala Trp Leu Arg Pro Asp Gly Gly Leu Met Ala Asn Ser Asp Trp

595 600 605

Gly Arg Gly Gly Arg Ala Leu Gly Val Phe Leu Asn Gly Asp Ala Ile

610 615 620

Thr Glu Pro Asp Arg Leu Gly Arg Arg Val Arg Asp Asp Ser Phe Leu

625 630 635 640

Leu Leu Ala Asn Ala Glu Val Gly Ser Val Arg Phe Thr Leu Pro Asp

645 650 655

Arg Ser Tyr Gly Ser Ala Trp Glu Thr Val Val Asp Thr Ala Glu Pro

660 665 670

Gly Val Thr Gly Arg Pro Leu Leu Leu Ala Gly Gly Gly Val Thr Val

675 680 685

Val Asp Arg Ala Phe Leu Val Leu

690 695

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatgatgg tggaagtctg gcctgg 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagcttgagc accaggaacg accgg 25

Claims

1.一种编码异淀粉酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种异淀粉酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.携带权利要求1所述基因的载体。

4.表达权利要求2所述异淀粉酶的细胞。

5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，包括细菌、真菌或古细菌。

6.一种基因工程菌，其特征在于，表达SEQ ID NO.1所示的异淀粉酶基因。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，以pMD18T-simple为载体，在大肠杆菌中表达SEQ ID NO.1所示的异淀粉酶基因。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E. coliBL21、E. coliBL21（DE3）、E. coliJM109、E. coliDH5α或E. coliTOP10。

9.权利要求2所述的异淀粉酶在食品领域的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，用于生产高葡萄糖浆，高麦芽糖浆，低聚寡糖或啤酒。