CN104762248B - 一种高产异淀粉酶的基因工程菌及其发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产异淀粉酶的基因工程菌及其发酵工艺，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明以E.coli MDS42为宿主，构建了高产异淀粉酶的基因工程菌E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)。该菌株产酶水平高，生产成本较低。以该菌株为生产菌株在发酵罐进行发酵产酶，酶活力可达16434U/mL，蛋白表达量可达13.4g/L。本发明降低了异淀粉酶生产成本，可实现异淀粉酶的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产异淀粉酶的基因工程菌及其发酵工艺，属于基因工程和发酵工程技术领域。
背景技术
异淀粉酶(EC 3.2.1.68)是淀粉脱支酶的一种，它可以水解糖原、支链淀粉和β-极限糊精中α-1,6-糖苷键，对α-极限糊精具有部分水解作用，但不能水解普鲁兰多糖。异淀粉酶在淀粉加工工业中具有重要的应用价值，可以与糖化酶、β-淀粉酶、CGT酶、4-α-葡聚糖转移酶等淀粉酶复配生产葡萄糖、麦芽糖、环糊精、抗性淀粉等产品，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。尽管异淀粉酶在工业上的应用范围越来越广，但是，迄今为止这仍然只有来源于假单胞菌Pseudomonas amyloderamosa的异淀粉酶实现了工业化生产。
我国关于异淀粉酶的研究起步于20世纪90年代，开展工作不多。目前为止，发表的文献只有10余篇，主要集中于菌株筛选、诱变改良、酶分离纯化以及酶学定性。其中，王武等首先在1993年筛选到1株产异淀粉酶的短杆菌BI25164，经过发酵优化胞外酶活力达到520U/mL，该酶最适温度为50℃，最适pH5.0。此后10年左右鲜有异淀粉酶的文献报道，直到2003年以后，国内学者又分别筛选到产异淀粉酶的Bacillus、Thermus等微生物，并开展了菌株的诱变改良和发酵优化等工作。之前本研究室段绪果以T.fusca基因组DNA为模板，通过PCR克隆得到了异淀粉酶编码基因，构建得到了产重组异淀粉酶的大肠杆菌，并优化了重组异淀粉酶摇瓶发酵产酶条件，重组菌摇瓶发酵36h后胞内酶活力水平达到879.2U/mL；2013年江南大学李由然筛选到1株产异淀粉酶的细菌，并对Bacillus lentus CICIM304异淀粉酶基因进行了克隆、鉴定和大肠杆菌中的功能性表达，重组菌细胞破碎液上清中酶活力为17.6±0.5U/mL，该酶最适温度为70℃，最适pH6.0；同时，李由然将来源于Bacilluslentus JNU3的异淀粉酶基因进行了克隆，在Pichia pastoris中实现了重组表达，并在10L发酵罐中进行了放大实验，分批发酵条件下，72h后酶活力最高达到318U/mL。虽然国内在异淀粉酶研究上虽然取得了一定的进展，但是还未实现工业化生产，市场上的商业化产品主要为进口酶制剂。
大肠杆菌菌株生长快、蛋白表达量高，是重组蛋白表达最常用的宿主。然而在之前的报道中，异淀粉酶在大肠杆菌中的产量依然较低，且大多为包涵体。虽然E.coli MDS42也曾被用来作为宿主菌，但是已有研究用E.coli MDS42来生产氯霉素乙酰转移酶，发现其表达量相比母本菌株E.coli MG1655并未提高，说明E.coli MDS42重组菌表达外源蛋白时，可能会对菌株生长或异源蛋白的表达分泌存在某些不确定的影响。
本发明首次把E.coli MDS42作为异淀粉酶的表达宿主，构建了一株高产异淀粉酶的基因工程菌，其摇瓶发酵产量可达1566U/mL，发酵罐发酵最高酶活力可达16434U/mL，降低了异淀粉酶生产成本，实现其工业化生产。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高产异淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程菌是以E.coli MDS42(Scarab Genomics公司，美国)为宿主，表达来源于嗜热裂孢菌Thermobifida fusca的异淀粉酶。
所述异淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述基因工程菌是以pSX2(Scarab Genomics公司，美国)为载体构建得到的。
本发明的第二个目的是提供一种所述的基因工程菌的构建方法是：将核苷酸序列为SEQ ID NO.2的异淀粉酶基因连接到表达载体pSX2上，然后在转化到大肠杆菌E.coliMDS42中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)。
本发明的第三个目的是提供一种所述基因工程菌发酵生产异淀粉酶的方法，所述方法是在发酵罐中，采用一次诱导或者多次诱导的策略发酵生产异淀粉酶。
所述一次诱导策略，在本发明的一种实施方式中，包括：(1)分批发酵阶段：将种子液以7-9％接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2，当细胞浓度达到1.7g/L-4g/L时加入IPTG诱导产酶；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，进行补料培养，控制温度36-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2，诱导19-27h。
所述一次诱导策略，在本发明的另一种实施方式中，包括：(1)分批发酵阶段：将种子液以7-9％接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，进行补料培养，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH6.8-7.2；(3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到20-35g/L时，加入IPTG诱导产酶，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2，诱导8-23h。
所述方法是采用二次诱导策略，在本发明的一种实施方式中，包括：(1)分批发酵阶段：将种子液以7-9％接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2；(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，进行补料培养，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2；(3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到20-35g/L、57—83g/L，分别加入IPTG诱导产酶，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2，诱导8-23h。
所述方法是采用三次诱导策略，在本发明的一种实施方式中，包括：(1)将种子液以7-9％接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2，当菌体细胞浓度达到1.7g/L-4g/L时加入IPTG诱导产酶一次；(2)待溶氧上升至80-100％，进行补料培养，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2；(3)当菌体细胞浓度达到20-35g/L、57—83g/L，分别加入IPTG诱导产酶，控制温度36-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2，从第二次加入诱导剂开始算起，诱导8-20h。
所述发酵方法中的诱导，在本发明的一种实施方式中，诱导温度为36-38℃。
所述发酵方法中的诱导，在本发明的一种实施方式中，诱导剂IPTG的终浓度为0.01-0.05mM。
所述发酵方法中的诱导，在本发明的一种实施方式中，诱导剂IPTG的终浓度0.05mM。
所述补料培养，在本发明的一种实施方式中，是采用指数流加的方式流加补料培养基。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)将种子液以8％接种量接入发酵培养基，控制溶氧30％、温度37℃、pH 7.0；(2)待溶氧上升至80-100％，以指数流加的方式补加补料培养基；(3)当细胞浓度达到23.0g/L、69.0g/L时，分别加入IPTG至IPTG终浓度为0.05mM，于37℃下诱导产酶，溶氧维持在30％、pH控制在6.8-7.0。
本发明所述诱导时间，无特殊说明的，是指从第一次加入诱导剂开始算起。
本发明的有益效果：
(1)本发明构建的基因工程菌E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)，具有高产异淀粉酶的性质，用于发酵罐生产，最高酶活力可达16434U/mL，能够解决现有发酵工艺中酶活力较低、生产成本高的问题，适合用于工业化生产；
(2)本发明对基因工程菌发酵生产条件进行了研究，发现诱导温度为30-38℃时采用一次诱导或者多次诱导的策略发酵生产都能得到产量高的异淀粉酶。尤其是诱导温度为36-38℃时，在20-35g/L细胞浓度是诱导或者联合其他诱导方式，诱导8h以上就能取得8000U/mL以上的酶活力。
附图说明
图1：5OD重组菌发酵破壁上清(摇瓶)SDS-PAGE电泳图；
图2：不同诱导温度下，重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线；图中实心图标代表酶活力，空心图标代表蛋白含量；
图3：重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线(早期诱导)；图中实心图标代表酶活力，空心图标代表蛋白含量；
图4：重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线(二次诱导)；图中实心图标代表酶活力，空心图标代表蛋白含量；
图5：重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线(三次诱导)；图中实心图标代表酶活力，空心图标代表蛋白含量。
具体实施方式
培养基：
(1)LB固体培养基的组成为：分子级蛋白胨9-11g/L，分子级酵母粉4-6g/L，NaCl9-11g/L，琼脂粉1.5-2％。
(2)LB液体培养基的组成为：分子级蛋白胨9-11g/L，分子级酵母粉4-6g/L，NaCl9-11g/L，pH 6.8-7.2。
(3)TB发酵培养基的组成为：甘油4-6g/L，工业级酵母粉23-25g/L，工业级蛋白胨11-13g/L，KH2PO42.2-2.4g/L，K2HPO416-17g/L。
(4)种子培养基：(工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，100mg/L卡那霉素，pH 7.00)
(5)发酵培养基为：甘油8g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉2g/L，(NH4)2HPO44.0g/L，KH2PO413.5g/L，柠檬酸1.7g/L，MgSO4·7H2O 1.4g/L，微量元素液10mL/L。还可以添加100μg/mL卡那霉素。
(6)微量元素液为：FeSO4·7H2O 10.0g/L，ZnSO4·7H2O 5.3g/L，CuSO4·5H2O3.0g/L，MnSO4·4H2O 0.5g/L，Na2B4O7·10H2O 0.23g/L，CaCl22.0g/L，(NH4)6Mo7O240.1g/L。
(7)补料培养基为：蛋白胨2.4g/L，酵母粉4.8g/L，MgSO4·7H2O 15g/L，甘油600g/L。
实施例1：E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)的构建
1、以实验室前期构建的Tfu_1891/pT7-7质粒(申请号201110459137.X)为模板PCR扩增异淀粉酶Tfu_1891基因(核苷酸序列是SEQ ID NO.1)。
根据异淀粉酶Tfu_1891和表达载体pSX2基因设计核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQID NO.3所示的引物Tfu_1891-F、Tfu_1891-R：
Tfu_1891-F：5′-CATATGCCCATGGTGGAAGTCTG-3′含有NdeⅠ酶切位点
Tfu_1891-R：5′-GGTACCTCAGGAGGGCAGGGCTTTC-3′含有KpnⅠ酶切位点
以Tfu_1891/pT7-7质粒为模板，PCR扩增含酶切位点的Tfu_1891基因。PCR体系(50μL)为：ddH2034.5μL，4μL dNTP mixture，10μL 5×PS buffer，20μM引物Tfu_1891-F和Tfu_1891-R各0.5μL，1μL PrimeStar聚合酶，模板1μL。PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸2min 8s，30个循环。将PCR产物纯化后割胶回收，与pMD18-T simple载体(商业化工具载体)，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选单菌落，接入LB液体培养基，8-10h提取质粒，命名为Tfu_1891/pMD18-T simple，将此质粒送去测序，测序结果正确。
2、将质粒Tfu_1891/pMD 18-T和载体pSX2分别用NdeⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，于16℃连接过夜，连接产物转化E.coliMDS42感受态细胞，转化产物涂布于含有卡那霉素(100μg/mL)抗性的LB平板，经37℃培养10-12h，挑取转化子于含卡那霉素(100μg/mL)抗性的LB液体培养基中，提取重组质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到表达质粒Tfu_1891/pSX2。
3、将质粒Tfu_1891/pSX2转化E.coli MDS42宿主菌得到基因工程菌E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)，涂布含卡那霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，经37℃培养10-12h。挑选单菌落至含卡那霉素(100μg/mL)抗性的液体LB中，37℃培养8h，保存甘油管，贮存于-80℃冰箱。
实施例2摇瓶发酵产酶
1、将-80℃甘油管保存的E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)菌株转接LB培养基中36-38℃培养8-10h，后将所得培养液按4-6％的接种量接入TB发酵培养基中，36-38℃，200r/min培养1.5-2.5h后，用终浓度为0.01-0.03mM的IPTG诱导，继续培养33-35h。测其细胞浓度，并通过计算取5OD的发酵液离心，收集菌体。用pH5.520mM的磷酸-柠檬酸缓冲液悬浮细胞，超声破碎，离心后测样品的酶活力。
2、酶活力测定方法：吸取71.4μL经过适当稀释的破壁上清液，加入到含有429μL0.833％支链淀粉底物的18mm×18cm试管中(50℃预热10min)，50℃孵育30min。30min后取出加入0.5mL碘液，然后迅速加入15mL稀硫酸溶液，混匀。室温静置10min在610nm下测其吸光度。1个单位的异淀粉酶定义为在50℃、pH5.5条件下，1分钟增加0.01个吸光度的酶量。
图1为摇瓶发酵36h时5OD重组菌破壁上清的SDS-PAGE蛋白电泳图，蛋白电泳结果显示在约79kDa处有一条与理论分子量一致的条带。此时，重组异淀粉酶酶活力为1566U/mL。
实施例3不同诱导温度对重组菌发酵产酶的影响
1、种子培养：将-80℃甘油管保存的E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)菌株接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37℃，转速200rpm，培养8h。
2、发酵产酶：
将种子液以8％接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30％，控制温度为37℃，流加25％(v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧上升至80-100％，则分批发酵培养结束。以指数流加的方式补加补料培养基。当细胞浓度达到23g/L时，一次性加入终浓度为0.05mM的IPTG，分别在37℃、30℃、25℃下诱导产酶，溶氧维持在30％，pH控制在7.0左右。诱导20h左右。发酵培养结束后，37℃诱导20h，异淀粉酶酶活力最高，达到13813U/mL，蛋白表达量为11.3g/L(图2)。
实施例4重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线(早期一次诱导)
1、种子培养：将-80℃甘油管保存的E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)菌株接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37℃，转速200rpm，培养8h。
2、发酵产酶：
将种子液以8％接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30％，控制温度为37℃，流加25％(v/v)的氨水控制pH在7.0。当细胞浓度达到1.7g/L时，分别一次性加入终浓度为0.05mM、0.02mM的IPTG 37℃下诱导产酶。待最初的甘油消耗完后，溶氧上升至80-100％，则分批发酵培养结束。以指数流加的方式补加补料培养基。溶氧维持在30％，pH控制在7.0左右。诱导20h左右。发酵培养结束后，早期诱导时，IPTG浓度0.02mM时，异淀粉酶酶活力达到最高，为3682U/mL，蛋白表达量为3.0g/L(图3)。
实施例5重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线(两次诱导)
1、种子培养：将-80℃甘油管保存的E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)菌株接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37℃，转速200rpm，培养8h。
2、发酵产酶：
将种子液以8％接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30％，控制温度为37℃，流加25％(v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧上升至80-100％，则分批发酵培养结束，接下来以指数流加的方式补加补料培养基。当细胞浓度达到23.0g/L、69.0g/L时，分别加入终浓度为0.05mM、0.02mM的IPTG，37℃下诱导产酶。溶氧维持在30％，pH控制在7.0左右。诱导20h左右。发酵培养结束后，二次诱导时，IPTG浓度为0.05mM时，异淀粉酶酶活力达到最高，为16434U/mL，蛋白表达量为13.4g/L(图4)。
实施例6重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线(三次诱导)
1、种子培养：将-80℃甘油管保存的E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)菌株接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37℃，转速200rpm，培养8h。
2、发酵产酶：
将种子液以8％接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持30％，控制温度为37℃，流加25％(v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧上升至80-100％，则分批发酵培养结束，接下来以指数流加的方式补加补料培养基。当细胞浓度达到1.7g/L、23.0g/L、69.0g/L时，分别加入终浓度为0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM的IPTG，37℃下诱导产酶。溶氧维持在30％，pH控制在7.0左右。从第二次加入诱导剂算起，诱导15h左右。发酵培养结束后，三次诱导时，IPTG浓度为0.02mM时，异淀粉酶酶活力达到最高，为13788U/mL，蛋白表达量为11.3g/L(图5)。
实施例7早期一次诱导发酵产酶
将E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)种子液按照7％接种量接种于发酵罐中，控制温度35℃、溶氧20％、pH 6.8-7.2，当细胞浓度达到3g/L时加入0.05mM IPTG诱导产酶。待溶氧上升至80-100％，进行补料培养，控制温度38℃、溶氧30％、pH 6.8-7.2，诱导27h。发酵结束后，测定异淀粉酶酶活力，结果显示酶活力可达3500U/mL以上。
实施例8早期一次诱导发酵产酶
将E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)种子液按照9％接种量接种于发酵罐中，控制温度38℃、溶氧30％、pH 6.8-7.2，当细胞浓度达到4g/L时加入0.01mM IPTG诱导产酶。待溶氧上升至80-100％，进行补料培养，控制温度36℃、溶氧30％、pH 6.8-7.2，诱导22h。发酵结束后，测定异淀粉酶酶活力，结果显示酶活力可达3600U/mL以上。
实施例9一次诱导发酵产酶
将E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)种子液以7％接种量接种于发酵罐中，控制温度35℃、溶氧30％、pH 6.8-7.2，待溶氧上升至80-100％，流加补料培养基进行补料培养，控制温度30℃、溶氧30％、pH 6.8-7.2；诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到35g/L时，加入终浓度为0.05mM的IPTG诱导产酶，控制温度38℃、溶氧20％、pH 6.8-7.2，诱导8h酶活力可达8700U/mL，诱导23h酶活力可达11200U/mL以上。发酵结束后，测定异淀粉酶酶活力，结果显示酶活力可达以上。其他条件相同，改用诱导温度30℃时，诱导23h，酶活力可达7150U/mL。
实施例10一次诱导发酵产酶
将E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)种子液以9％接种量接种于发酵罐中，控制温度38℃、溶氧20％、pH 6.8-7.2，待溶氧上升至80-100％，流加补料培养基进行补料培养，控制温度38℃、溶氧20％、pH 6.8-7.2；诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到20g/L时，加入IPTG诱导产酶，控制温度36℃、溶氧30％、pH 6.8-7.2，诱导22h。发酵结束后，测定异淀粉酶酶活力，结果显示酶活力可达12230U/mL以上。其他条件相同，改用诱导温度30℃时，诱导23h，酶活可达7000U/mL。
实施例11两次诱导发酵产酶
将E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)种子液以7-9％接种量接入发酵培养基。控制温度35℃、溶氧20％、氨水调节pH 6.8-7.2。待溶氧上升至80-100％，开始进行补料培养。当菌体细胞浓度达到20g/L、83g/L时，分两次分别加入终浓度为0.02mM的IPTG诱导产酶，控制温度36℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2。分别测定诱导8h、16h、23h后的异淀粉酶酶活力，结果显示酶活力分别可达7100U/mL、11230U/mL、13234U/mL。
其他条件相同，改用诱导温度30℃时，诱导23h，酶活可达7670U/mL。
实施例12两次诱导发酵产酶
将E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)种子液以7-9％接种量接入发酵培养基。控制温度38℃、溶氧25％、氨水调节pH。待溶氧上升至80-100％，开始进行补料培养。当菌体细胞浓度达到35g/L、57g/L时，分两次分别加入终浓度为0.03mM的IPTG诱导产酶，控制温度38℃、溶氧25％、诱导22h。发酵结束后，测定异淀粉酶酶活力，结果显示酶活力可达14228U/mL。
实施例13三次诱导发酵产酶
将E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)种子液以7-9％接种量接入发酵培养基。控制温度38℃、溶氧25％、氨水调节pH。当细胞浓度达到3g/L时加入终浓度为0.02mM的IPTG进行诱导一次。待溶氧上升至80-100％，开始进行补料培养。当菌体细胞浓度达到35g/L、57g/L时，分两次分别加入终浓度为0.03mM的IPTG诱导产酶，控制温度36℃、溶氧25％。以35g/L的诱导为时间起点，分别测定诱导8h、16h、20h后的测定异淀粉酶酶活力，结果显示酶活力分别可达9500U/mL、11570U/mL、12568U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种高产异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以E. coli MDS42为宿主，表达来源于嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的异淀粉酶，所述异淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因工程菌的构建方法是：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的异淀粉酶基因连接到表达载体pSX2上，然后再转化到大肠杆菌E. coli MDS42中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌E. coli MDS42（Tfu_1891/pSX2）。
2.一种利用权利要求1所述基因工程菌发酵生产异淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法是在发酵罐中，采用一次诱导或者二次诱导或者三次诱导的策略发酵生产异淀粉酶，所述二次诱导方法包括：（1）分批发酵阶段：将种子液以7-9%接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30%、pH 6.8-7.2；（2）补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100%，进行补料培养，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2；（3）诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到20-35 g/L、57-83 g/L，分别加入IPTG诱导产酶，控制温度30-38℃、溶氧20-30%、pH 6.8-7.2，诱导8-23 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：（1）将种子液以8%接种量接入发酵培养基，控制溶氧30%、温度37℃、pH 7.0；（2）待溶氧上升至80-100%，以指数流加的方式补加补料培养基；（3）当细胞浓度达到23.0 g/L、69.0 g/L时，分别加入IPTG至IPTG终浓度为0.05 mM，于37℃下诱导产酶，溶氧维持在30%、pH控制在6.8-7.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述一次诱导策略是策略（1）或者策略（2）：策略（1）：分批发酵阶段：将种子液以7-9%接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30%、pH 6.8-7.2，当细胞浓度达到1.7 g/L-4 g/L时加入IPTG诱导产酶；补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100%，进行补料培养，控制温度36-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2，诱导19-27 h；
策略（2）：分批发酵阶段：将种子液以7-9%接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30%、pH 6.8-7.2；补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100%，进行补料培养，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2；诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到20-35 g/L时，加入IPTG诱导产酶，控制温度30-38℃、溶氧20-30%、pH 6.8-7.2，诱导8-23 h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将种子液以7-9%接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38℃、溶氧20-30%、pH 6.8-7.2，当菌体细胞浓度达到1.7 g/L-4 g/L时加入IPTG诱导产酶一次；（2）待溶氧上升至80-100%，进行补料培养，控制温度30-38℃、溶氧20-30％、pH 6.8-7.2；（3）当菌体细胞浓度达到20-35 g/L、57-83 g/L，分别加入IPTG诱导产酶，控制温度36-38℃、溶氧20-30%、pH 6.8-7.2，诱导8-20 h。
6.根据权利要求2、4、5任一所述的方法，其特征在于，所述诱导的诱导温度为36-38℃、诱导剂IPTG的终浓度为0.01-0.05 mM。
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