CN105112348B - 一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过构建重组质粒pulA/pSVEB，并转化至短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis(CCTCC AB94025)中，得到重组菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis。该菌株产普鲁兰酶的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl2·6H2O 12g/L。培养条件为：发酵温度30℃，pH为7.0。本发明实现了普鲁兰酶在短小芽孢杆菌中的胞外表达，3L罐发酵72h，发酵上清液酶活可达988.5U/mL。本工艺采用工业上常用的葡萄糖、棉籽粉、牛肉浸膏、无机盐等原料进行生产，简单易行，适用于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
普鲁兰酶是一种能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉、α-极限糊精等分子中的α-1,6葡萄糖苷键的淀粉脱支酶。由于糖化酶等对糊精中的α-1，6-糖苷键水解效率很低，往往导致反应时间较长、副产物较多等问题。而普鲁兰酶能快速切割糊精中的分支点，与糖化酶协同作用，可大幅度缩短反应时间，提高原料的转化率。因此被广泛应用于葡萄糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品的生产中。
近年来，对于普鲁兰酶的开发已经成为了研究热点。然而，大部分的研究局限于在大肠杆菌中表达。由于大肠杆菌是一种条件性致病菌，这就极大地限制了普鲁兰酶在食品工业中的应用。虽然也有一些研究者将普鲁兰酶在非致病菌中进行表达，但表达量都很低。例如，张艳等将Bacillus naganoensis来源的普鲁兰酶克隆于枯草芽孢杆菌中，酶活为10.94U/mL，再经刘逸寒等发酵优化，酶活为20.16U/mL；谢银珠等将Bacillusderamificans来源的普鲁兰酶克隆于地衣芽孢杆菌中，经发酵优化，酶活为1.5ASPU/mL。因此，实现普鲁兰酶在非致病菌中过量表达，对普鲁兰酶在食品工业中的应用具有重大意义。
短小芽孢杆菌作为一种宿主菌表达异源蛋白，近年来受到了研究者的关注。首先，它是一种非致病菌，可应用于食品工业；其次，它能过量合成活性异源蛋白，表达量可达1mg/mL以上；再次，它属于革兰氏阳性菌，只有一层细胞膜，蛋白的胞外分泌良好。此外，它还有培养条件简单，生长周期较短等优点，非常适合于表达普鲁兰酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌。
所述重组菌以短小芽孢杆菌为宿主，通过重组质粒pulA/pSVEB表达来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶是来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶(GenBank号为AX203845)的突变体。本发明以普鲁兰酶突变体为例进行说明，保护范围不限于此。
在本发明的一种实施方式中，所述短小芽孢杆菌宿主为Brevibacillus brevisCCTCC AB94025。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒pulA/pSVEB是将缺失了启动子和信号肽的pWB980、普鲁兰酶表达元件、缺失了信号肽的pET20b(+)连接成环得到的；所述普鲁兰酶表达元件包括来源于短小芽孢杆菌的外壁蛋白启动子P2、外壁蛋白信号肽和来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶突变体基因。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶突变体的基因序列与CN201310610426.4中构建的D437H/D503Y/d2突变体的序列一致，为N端的CBM41和X25两个结构域删除了的且发生了D437H和D503Y突变的突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶表达元件的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒pulA/pSVEB的核苷酸序列是按照pWB980缺失启动子和信号肽后的序列、普鲁兰酶表达元件序列、pET20b(+)缺失信号肽后的序列，这样的方式进行连接成环得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒pulA/pSVEB的具体构建方法如下：
(1)合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的DNA片断；
(2)用Nde I和Nco I双酶切在pET-20b(+)基础上构建的表达D437H/D503Y/d2突变体的重组质粒(一种分泌效率和热稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其制备方法.CN201310610426.4)，得到含有普鲁兰酶突变体基因pulA和去除pelB信号肽的pET20b(+)的DNA片断；
(3)以核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物P1、P2扩增pWB980，得到缺失了P43启动子序列和信号肽序列的pWB980片断；
(4)使用In-Fusion酶将步骤(1)、(2)、(3)得到的片段进行连接，筛选即得到重组质粒pulA/pSVEB。
本发明还提供了一种所述重组菌的构建方法，所述方法是：
(1)按照缺失了启动子和信号肽的pWB980、SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶表达元件、缺失了信号肽的pET20b(+)的顺序，将这三段核苷酸序列用In-Fusion酶连接，得到重组质粒pulA/pSVEB；
(2)将重组质粒pulA/pSVEB电转至短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis CCTCCAB94025中，得到重组菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis。
本发明还提供一种利用所述重组菌生产普鲁兰酶的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组菌种子液接种至发酵培养基，于25-37℃发酵培养46-50h。
在本发明的一种实施方式中，种子液使用的种子培养基为TM培养基，其组成为：葡萄糖10g/L，多聚蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉2g/L，微量元素10mL/L，卡那霉素30μg/mL；其中微量元素液组成为：FeSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·4H2O 1g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中含有葡萄糖10-50g/L，棉籽粉1-10g/L，牛肉浸膏10-30g/L，MgCl2·6H2O 1-20g/L和卡那霉素。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将重组菌种子液接种至发酵罐，控制温度25-37℃、溶氧10-50％、pH 5.0-7.0，并流加葡萄糖维持发酵液中残糖浓度为1-30g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将培养好的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，控制在30℃、pH为7.0±0.1、通风量1.0vvm、溶氧为30％、残糖浓度在5g/L以上，培养72h；其中发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl2·6H2O12g/L和卡那霉素。
本发明的有益效果：
本发明构建的重组短小芽孢杆菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis在TM培养基中发酵48h，酶活为48.5U/mL。采用本发明提供的培养基和培养方法，摇瓶发酵48h，酶活可达531.5U/mL；3L罐发酵72h，酶活可达988.5U/mL。本发明还具有发酵原料低廉，发酵调控简单等优点，适合普鲁兰酶在工业生产中应用。
附图说明
图1产普鲁兰酶重组短小芽孢杆菌摇瓶发酵上清SDS-PAGE凝胶电泳图；1，发酵上清液；M，标准蛋白分子量；
图2不同碳源对重组菌生长和产酶的影响；普鲁兰酶活力(白色)，菌体干重(黑色)；
图3不同氮源对重组菌生长和产酶的影响；普鲁兰酶活力(白色)，菌体干重(黑色)，BE(牛肉浸膏)，PO(多聚蛋白胨)，YE(酵母粉)，PE(蛋白胨)，CO(棉籽粉)，AC(酸水解酪蛋白)；
图4不同金属离子对重组菌生长和产酶的影响；普鲁兰酶活力(白色)，菌体干重(黑色)；
图5重组菌产普鲁兰酶的3L罐分批发酵曲线；菌体干重(●)、普鲁兰酶活力(■)；
图6重组菌产普鲁兰酶的3L罐分批补料发酵曲线；菌体干重(●)、普鲁兰酶活力(■)；
图7重组菌产普鲁兰酶的SDS-PAGE凝胶电泳图；其中电泳带上的数值为对应样品的发酵时间(h)。
具体实施方式
实施例1：重组菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis的构建
根据Genbank中来源于Brevibacillus brevis的外壁蛋白启动子P2序列和来源于Brevibacillus brevis的外壁蛋白信号肽序列，人工合成5’端含pWB980同源序列、3’端含pET20b(+)同源序列的DNA片断(序列如SEQ ID NO.2所示)：
以在pET-20b(+)基础上构建的、表达D437H/D503Y/d2突变体的重组质粒为模板(一种分泌效率和热稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其制备方法.CN 201310610426.4)经Nde I和Nco I双酶切获得线性化的含有普鲁兰酶突变体基因pulA和去除pelB信号肽的pET20b(+)的DNA片断。
根据上述DNA片断序列合成含有同源序列的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的引物P1、P2：
以质粒pWB980(购自Novagen公司)为模板，P1、P2为引物扩增得到两端含上述同源序列并去掉P43启动子序列和信号肽序列的pWB980片断。PCR体系为：10μM引物P1和P2各1μL，2mM dNTP 4μL，5×PCR STARTM Buffer 10μL，HS DNA聚合酶1μL，模板0.5μL，加双蒸水补至50μL。PCR条件：94℃预变性5min；延伸循环开始，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2.5min，共循环30次。
将上述的合成片断2μL，含有pulA和pET20b(+)的片断1μL，含同源序列的pWB980片断1μL以及双蒸水4μL加入EP管中混匀，再加入In-Fusion酶2μL，42℃连接30min。将连接产物转化至E.coli JM109中，涂布含有100μg/mL氨苄霉素的LB平板，37℃培养10-12h。挑取阳性单克隆，提取质粒并进行测序鉴定，测序正确的即为重组质粒pulA/pSVEB。
将构建好的重组质粒通过电转换转入短小芽孢杆菌中，涂布于含30μg/mL卡那霉素的TM平板上，37℃培养12-15h。挑取单克隆，提取质粒并进行PCR和双酶切验证，并对发酵上清液进行蛋白电泳分析，能够正确表达普鲁兰酶的转化子即为重组短小芽孢杆菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis。
实施例2：短小芽孢杆菌的转化方法
按以下方法进行电转化：
1)新鲜TM平板(TM培养基：多聚蛋白胨1％，牛肉浸膏0.5％，酵母粉0.2％，葡萄糖1％)挑短小芽孢杆菌为Brevibacillus brevis CCTCC AB 94025(购自CCTCC)单菌落接种于10mL TM培养基中，过夜培养。
2)测量摇瓶内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD600在0.19-0.2之间。培养基为50mL GM(蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，葡萄糖0.5％，α-甘油磷酸钠1.9％，维生素C 0.05％，MgSO40.012％)。37℃，200rpm培养至OD600＝1.0(大约3-4小时)左右。
3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。
4)用40mL预冷的电转缓冲液ETM(山梨醇9％，甘露醇9％，丙三醇10％)洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。
5)将洗涤后的菌体重悬于等500μL的ETM中，每管分装60μL。
6)将60μL感受态细胞中加入1-6μL质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪设置：2.0kv，25uF，200Ω，1mm，电击1次.(持续时间4.5ms-5ms之间)。
7)电击完毕立即加入1mL复苏培养基TM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养，挑取菌落至含30μg/mL卡那霉素的TM培养基中，进行验证，正确后进行下一步产酶。
实施例3：普鲁兰酶酶活测定方法
普鲁兰酶酶活性的测定采用3,5-二硝基水杨酸发(DNS法)。普鲁兰酶在一定条件下，催化水解普鲁兰糖生成还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比，故可以在540nm的波长下进行比色，计算酶活。酶活单位定义：在上述条件下，每分钟催化产生1μmol葡萄糖的酶量作为一个活力单位。
酶活力测定步骤：
A.预热：取2mL的0.5％普鲁兰溶液(50mM pH 4.5醋酸缓冲液)于试管中，置于60℃水浴锅预热10min左右，
B.反应：加入0.1mL样品酶液，振荡混匀，准确计时10min，加入3mL DNS混匀，放入冰水中终止反应，沸水浴7min，冷却。
C.测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀。在540nm下测量其吸光值并计算酶活力。
实施例4：重组菌的摇瓶发酵培养
TM培养基中摇瓶发酵培养。
将实施例1中构建得到的重组菌株接种于TM培养基(多聚蛋白胨10g/L，牛肉粉5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0)，在30℃恒温培养48h后，离心收集上清液即为粗酶液。胞外上清样品SDS-PAGE蛋白电泳结果显示在79kDa位置上有一条较粗的目的条带(图1)，与理论大小一致；酶活力测定显示，胞外普鲁兰酶活力达到48.5U/mL。
实施例5：发酵培养基的优化
(1)碳源优化
将TM培养基作为初始培养基，以相同浓度的蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉代替葡萄糖作为碳源进行摇瓶发酵，结果见图2。由结果可知，以葡萄糖作为碳源时，菌浓和普鲁兰酶活力都为最高，分别为2.6g/L和51.1U/mL。因此，选择葡萄糖作为碳源。
(2)氮源优化。
以葡萄糖作为碳源，将TM培养基中的氮源换成等量的单一氮源(牛肉浸膏、多聚蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、棉籽粉、酸水解酪蛋白)进行摇瓶发酵，结果见图2。由结果可知，以牛肉浸膏为氮源时，酶活最高，但菌浓较低；而以酵母粉或棉籽粉作为氮源时，重组菌生长较好，但酶活较低。因此，将牛肉浸膏与酵母粉或棉籽粉作为复合氮源发酵，结果见图3。重组菌在复合氮源中生长的菌浓明显高于单一氮源；其中，以牛肉浸膏与棉籽粉的复合氮源，普鲁兰酶活力最高，为70.5U/mL。因此，选择牛肉浸膏与棉籽粉作为氮源。
(3)金属离子优化。
以葡萄糖为碳源、牛肉浸膏与棉籽粉为氮源，考察了金属离子(Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2 +、Zn2+、Ca2+)对重组菌产普鲁兰酶的影响，结果见图4。由结果可知，Mg2+对重组菌产普鲁兰酶的促进作用最明显，酶活可达177.6U/mL。因此，选择Mg2+作为发酵培养基中的金属离子。
实施例6：重组菌分批发酵培养产酶
重组菌产普鲁兰酶的3L罐分批发酵。
1)种子的制备：将短小芽孢杆菌单菌落挑在TM液体培养基中30℃、200rpm培养12-14h。
2)3L发酵罐发酵：将培养好的种子液接入接入装有1.5L发酵培养基3L发酵罐中，发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl2·6H2O 12g/L。培养温度为30℃，初始pH为7.0，通风量为1.0vvm，搅拌转速恒定为300rpm。发酵过程曲线如图5所示，培养48h，菌体干重和普鲁兰酶活力达到最高，分别为5.1g/L和322.4U/mL。
实施例7：重组菌分批补料发酵培养产酶
重组菌产普鲁兰酶的3L罐分批补料发酵。
1)种子的制备：将短小芽孢杆菌单菌落挑在TM液体培养基中30℃、200rpm培养12-14h。
2)3L发酵罐发酵：将培养好的种子液接入接入装有1.5L发酵培养基3L发酵罐中，发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl2·6H2O 12g/L。培养温度为30℃，以5M NaOH溶液控制发酵pH为7.0±0.1，通风量为1.0vvm，通过调节搅拌转速控制溶氧为30％左右，并在发酵过程中补加500g/L的葡萄糖以维持发酵液中残糖浓度在5g/L以上。发酵过程曲线如图6所示，培养72h，普鲁兰酶活力达到最高，988.5U/mL，此时的菌体干重为9.5g/L。胞外上清样品SDS-PAGE蛋白电泳结果显示在79kDa位置上的目的条带逐渐变粗(图7)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (5)
1.一种高产普鲁兰酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌以短小芽孢杆菌为宿主，通过重组质粒pulA/pSVEB表达来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶；
所述重组质粒pulA/pSVEB是将缺失了启动子和信号肽的pWB980、普鲁兰酶表达元件、缺失了信号肽的pET20b(+)连接成环得到的；所述普鲁兰酶表达元件的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，所述方法是：(1)按照缺失了启动子和信号肽的pWB980、SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶表达元件、缺失了信号肽的pET20b(+)的顺序，将这三段核苷酸序列用In-Fusion酶连接，得到重组质粒pulA/pSVEB；(2)将重组质粒pulA/pSVEB电转至短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis CCTCC AB94025中，得到重组菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis。
3.一种权利要求1所述重组菌生产普鲁兰酶的方法，其特征在于，所述方法是将重组菌种子液接种至发酵培养基，于25-37℃发酵培养；所述发酵培养基中含有葡萄糖10-50g/L，棉籽粉1-10g/L，牛肉浸膏10-30g/L，MgCl2·6H2O 1-20g/L和卡那霉素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法是将重组菌种子液接种至发酵罐，控制温度25-37℃、溶氧10-50％、pH5.0-7.0，并流加葡萄糖维持发酵液中残糖浓度为1-30g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法是将培养好的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，控制在30℃、pH为7.0±0.1、通风量1.0vvm、溶氧为30％、残糖浓度在5g/L以上，培养72h；其中发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl2·6H2O 12g/L和卡那霉素。
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