CN101475914B - 一种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法，尤其涉及一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母及其制备方法以及循环利用该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的方法。首先构建β-半乳糖苷酶酵母表面展示载体，将β-半乳糖苷酶展示在酿酒酵母细胞表面，然后循环利用该重组酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖。本发明所述的表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母可被循环利用生产低聚半乳糖，且产量高，生产成本低，工艺简单，具有广阔的工业化应用前景。

Description

一种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法 

技术领域

本发明涉及一种利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法，尤其涉及一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母及其制备方法以及循环利用该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的方法。 

技术背景 

低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的非消化类寡糖，是人类母乳中的主要成分，具有促进双歧杆菌增殖；降低龋齿发病率；保护肝脏，改善钙铁锌等矿物质的吸收；改善脂类代谢，降低血脂和胆固醇等功能。该类寡糖可通过微生物产生的β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成，制备方式有两种，一种是采用游离酶，另一种是采用固定化酶。游离酶在反应过程中不稳定，并且难以重复利用，不适合工业化生产，而固定化酶能有效提高酶的稳定性，可重复利用，适合于工业化生产。但固定化酶反应过程中存在副产物(葡萄糖)的抑制和酶的不断流失等问题，降低了其使用效率。因而迫切需要寻找简便高效的适合于固定化酶法生产低聚半乳糖的方法，提高固定化酶的使用效率，大大降低工业化生产成本。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母和循环利用该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的方法。 

一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞，该重组酿酒酵母细胞含有插入了β-半乳糖苷酶基因序列的质粒载体。 

优选的，所述的β-半乳糖苷酶基因选自扩张青霉(Penicillium expansum)CGMCC No.2352中的β-半乳糖苷酶基因。 

一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下： 

1)将β-半乳糖苷酶基因插入酵母表面展示质粒pYD1，得重组质粒pYD1； 

2)将步骤1)构建的重组质粒pYD1转化大肠杆菌DH5α，然后从阳性重组大肠杆菌中提取含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pYD1，再用该重组质粒pYD1转化酿酒酵母EBY-100，获得含有重组质粒pYD1的重组酿酒酵母； 

3)将步骤2)获得的含有重组质粒pYD1的重组酿酒酵母接种于YNB-CAA-葡萄糖培养液，30℃培养，当菌液OD₆₀₀为2.0～5.0时，3000转/分离心3～5分钟，收集重组酿酒酵母细胞；4)将步骤3)收集的重组酿酒酵母细胞用诱导产酶培养液重悬菌细胞，并调OD₆₀₀为0.5～1.0，20℃～25℃诱导38～42小时，3000转/分离心3～5分钟，收集已表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞。 

所述YNB-CAA-葡萄糖培养液成分：无氨基酸酵母氮源(YNB，购自Difco公司，产品号0919-15)6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA，购自Sigma公司，产品号A2427)5g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟。 

所述诱导产酶培养液成分：无氨基酸酵母氮源(YNB)6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA)5g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟；使用之前加入过滤除菌的半乳糖溶液至终浓度20g/L。

优选的，所述步骤1)中的β-半乳糖苷酶基因来源于扩张青霉(Penicillium expansum)CGMCC No.2352。 

优选的，所述步骤4)中的诱导产酶温度为20℃。 

优选的，所述步骤4)中的诱导产酶时间为40小时。 

一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞在生产低聚半乳糖的应用，其特征在于，先将表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞悬于YNB-CAA-乳糖培养液，调OD₆₀₀为8.0～10.0，25℃培养4～6天；然后3000转/分离心3～5分钟，对离心后所得的上清液通过高效液相色谱分析其低聚半乳糖含量；将离心后所得的重组酵母细胞，重悬于新的YNB-CAA-乳糖培养液，按上述方法循环利用该重组酿酒酵母细胞发酵乳糖生产低聚半乳糖，并分析每个循环所得上清液的低聚半乳糖含量。 

所述YNB-CAA-乳糖培养液成分为：无氨基酸酵母氮源(YNB)6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA)5g/L，乳糖100g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟。 

本发明中所涉及的实验步骤及实验试剂，除有特别说明，均为本领域常规操作和普通市售产品。 

本发明提供了一种简便高效的固定化酶生产低聚半乳糖的方法，即利用表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖。该方法应用分子生物学技术将β-半乳糖苷酶直接锚定在酿酒酵母细胞表面，以乳糖为底物催化合成低聚半乳糖，节省了固定化酶所需要的载体材料，解决了固定化酶反应过程中酶的不断流失、酶稳定性差、使用效率低等问题，该方法还利用酿酒酵母代谢葡萄糖的特点，解决了β-半乳糖苷酶反应过程中葡萄糖副产物的抑制问题。重组酵母细胞在发酵过程中利用葡萄糖进行生长繁殖，有利于低聚半乳糖的生产；同时重组酵母细胞能被反应过程中新生成的半乳糖诱导产酶，即在其细胞表面展示β-半乳糖苷酶，可及时补充反应过程中酶的损耗。此外，一个批次反应结束后离心收集的重组酵母细胞仍然保持较高的β-半乳糖苷酶活性，可作为酶源直接用于下一个批次的低聚半乳糖合成，简化了生产流程。本发明所述的低聚半乳糖生产方法具有产量高、成本低、步骤简单合理、可重复利用等优点，具有广阔的工业化前景。 

附图说明

图1是循环利用重组酿酒酵母发酵乳糖生产的低聚半乳糖的含量分析图； 

其中纵坐标表示低聚半乳糖含量；横坐标表示发酵时间；图上方“1-7”数字表示循环数，每个循环的曲线图均表示低聚半乳糖含量随发酵时间的变化趋势。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，β-半乳糖苷酶基因来源于菌株扩张青霉CGMCCNo.2352，但不限于此。 

实施例1：β-半乳糖苷酶的酿酒酵母表面展示载体构建及其在酵母表面表达 

根据扩张青霉CGMCC No.2352β-半乳糖苷酶基因序列(GenBank Accession No.EU543998)设计引物F和R，分别引入能插入质粒pYD1(购自Invitrogen公司，该质粒载体具有α-凝集素受体基因部分序列，可将重组蛋白锚定在酵母细胞表面)的EcoR I、Not I限制内切酶位点(下划线所示)，序列如下： 

F：5’-CATGAATTCGGAGTTGCTTCAAAAATATGTGACTTGGG-3’ 

R：5’-GCATGCGGCCGCGTACGCCCCCTTTCGAGAC-3’

以提取的扩张青霉总RNA为模板，采用上述R引物进行反转录合成cDNA第一条链。以cDNA第一链为模板，用F和R引物进行PCR扩增，回收PCR产物，加限制性内切酶EcoRI、Not I于37℃保温5小时，凝胶回收目的片段，采用同样酶切方法处理表达载体pYD1。将制备好的基因片段与酶切处理后的酵母表面展示质粒pYD1混合，于16℃连接24小时。采用CaCl₂转化法转化宿主菌大肠杆菌DH5α，转化菌液涂布氨苄青霉素LB平板，37℃过夜培养，选取阳性质粒，采用电转化法转化酿酒酵母EBY-100，转化液涂布YNB-CAA-葡萄糖筛选平板，30℃培养2～3天，挑选生长良好的酵母菌落，采用菌落PCR法验证阳性转化子。 

将上述重组质粒阳性转化子及pYD1空质粒对照转化子的单菌落接种于YNB-CAA-葡萄糖培养液中，30℃培养至OD₆₀₀达到2.0～5.0，3000转/分离心5分钟收集细胞，弃去上清，用YNB-CAA-半乳糖培养液重悬细胞，并调OD₆₀₀为0.5～1.0，20℃半乳糖诱导40小时。测定细胞表面的β-半乳糖苷酶活性，将完全符合要求的重组酵母作为菌种保存。 

上述LB平板成分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl7g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0～7.5，121℃灭菌20分钟； 

上述YNB-CAA-葡萄糖平板成分：无氨基酸酵母氮源(YNB)6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA)5g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟。 

上述细胞表面β-半乳糖苷酶活性的测定方法：取1mL培养液，离心收集菌体，加2mmol/L的邻硝基苯-β-D-半乳糖苷溶液450μL，50℃反应10分钟，加1mL0.5mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，12,000转/分离心1分钟，上清液测OD₄₀₀。酶的活力单位规定：以1分钟水解邻硝基苯-β-D-半乳糖苷释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。 

实施例2：循环利用细胞表面重组酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖 

将实施例1保存的重组酵母接种于YNB-CAA-葡萄糖培养液，30℃培养至OD₆₀₀达到2.0～5.0，3000转/分离心5分钟收集细胞，弃去上清，用YNB-CAA-半乳糖培养液重悬细胞，并调OD₆₀₀为0.5～1.0，20℃半乳糖诱导40小时，然后3000转/分离心5分钟，收集表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母EBY-100，重悬于YNB-CAA-乳糖培养液，调OD₆₀₀为8.0～10.0，25℃培养4～6天，3000转/分离心5分钟，所得上清液进行高效液相色谱分析低聚半乳糖含量，所得酵母细胞重悬于新的YNB-CAA-乳糖培养液，按照上述方法重复进行下一循环培养。 

其中所述第一个循环的上清液的高效液相色谱分析结果表明：糖组分含量为低聚半乳糖43.6％，半乳糖1.41％，葡萄糖0、乳糖54.99％。 

按上述方法连续进行7个循环，高效液相色谱分析结果表明，每个循环所得的低聚半乳糖含量均高于40％(图1)。 

上述高效液相色谱分析所用设备及条件如下： 

岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为超纯水，流速为0.4mL/min，柱温70℃；结果分析软件为Class-VP6.0。含低聚半乳糖的上清液用超纯水稀释成重量体积百分比为1％的溶液，煮沸离心后，上清液用0.22μm的滤膜过滤，进样分析。

                    SEQUENCE LISTING 

<110>山东大学 

<120>一种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>38 

<212>DNA 

<213>人工合成 

<400>1 

catgaattcg gagttgcttc aaaaatatgt gacttggg                  38 

<210>2 

<211>31 

<212>DNA 

<213>人工合成 

<400>2 

gcatgcggcc gcgtacgccc cctttcgaga c                         31 

Claims (1)

1.一种利用表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞生产低聚半乳糖的应用，其特征在于，所述的重组酿酒酵母细胞为含有插入了扩张青霉CGMCC No.2352中的β-半乳糖苷酶基因序列的质粒载体；步骤如下：

先将表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母悬于YNB-CAA-乳糖培养液，调OD₆₀₀为8.0～10.0，25℃培养4～6天；然后3000转/分离心3～5分钟，对离心后所得的上清液通过高效液相色谱分析其低聚半乳糖含量；将离心后所得的重组酵母细胞，重悬于新的YNB-CAA-乳糖培养液，按上述方法循环发酵乳糖生产低聚半乳糖，并分析每个循环所得上清液的低聚半乳糖含量；

所述YNB-CAA-乳糖培养液成分为：无氨基酸酵母氮源6.7g/L，酪蛋白水解物5g/L，乳糖100g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟。

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