CN105154346B - 一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母，含有外源蛋白酶基因。本发明还公开了上述基因重组酿酒酵母的构建方法。本发明的基因重组酿酒酵母是通过对蛋白酶基因进行密码子改造，与酿酒酵母表达载体重组并转入酿酒酵母细胞，获得正确的表达构建而成。该基因重组酿酒酵母有效地提高了酵母细胞对蛋白质的降解效率，且具有生产成本低、生物量可重复利用、无二次污染等特点，对环境领域蛋白类物质的降解、工业领域蛋白酶的规模发酵与生产具有积极的推动作用。

Description

一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地公开了一种高效降解蛋白的基因重组酿酒酵母。

本发明还涉及上述基因重组酿酒酵母的构建方法。

本发明还涉及上述基因重组酿酒酵母在降解蛋白质方面的应用。

背景技术

微生物蛋白酶具有来源广、成本低等优势，在工业化生产中发挥着重要作用。丝氨酸蛋白酶是最常见的一类蛋白酶，被广泛应用于医药、食品、酿造等行业，具有重要的研究和应用价值。目前研究主要集中于产酶菌株的筛选、酶学性质研究和产酶基因片段的克隆等方面，提高对环境的适应性及稳定性、扩大其应用范围是工业化生产中亟待解决的主要问题。基因工程技术为该问题的解决及该酶的应用改造提供了平台。

酿酒酵母是工业化发酵的常见菌种，生物安全性高，其表面展示系统能够使外源蛋白在细胞表面大量表达。细胞表面展示技术的原理是将外源肽以融合蛋白的形式固定在细胞的外膜，被表达的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活性，集表达、纯化、固定于一体，在医药、食品、生物燃料、环境保护等多个领域都有广泛的应用前景。截至目前，对于密码子改造后的sub基因在酿酒酵母细胞外膜表达是否可以提高酶活性，国内外尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母。

本发明的又一目的是提供一种上述基因重组酿酒酵母的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供的降解蛋白质的基因重组酿酒酵母，含有外源蛋白酶基因。

本发明提供的上述降解蛋白质的基因重组酿酒酵母的构建方法，步骤为：

S1、按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造蛋白酶基因编码序列，合成该基因；

S2、将蛋白酶基因与酿酒酵母表面展示载体pYD1连接构建重组表达载体；

S3、将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EBY100中，构建基因重组酿酒酵母。

本发明提供的的基因重组酿酒酵母可以应用于蛋白质的降解。

本发明的基因重组酿酒酵母有效地提高了酵母细胞对蛋白质的降解效率，且具有生产成本低、生物量可重复利用、无二次污染等特点，对环境领域蛋白类物质的降解、工业领域蛋白酶的规模发酵与生产具有积极的推动作用。

附图说明

图1是表达载体pYD1质粒图谱。

图2是重组蛋白酶酿酒酵母转化子菌落PCR鉴定。

具体实施方式

本发明构建了高产蛋白酶的基因工程菌，研究了其酶学特性，该工程菌可用于大量生产高纯度蛋白酶，表达量高，成本低，应用范围广，为蛋白酶的工业化生产提供一种新方法，为工业化大量生产该蛋白酶提供了技术参考，为油脂精深加工、生物能源等方面工业蛋白酶源的开发提供条件。

本发明提供的表面展示蛋白酶的重组酿酒酵母，通过在细胞表面表达蛋白酶，增大酶与底物的接触面积，达到提高蛋白质降解效率的目的。所述蛋白酶基因连接到载体pYD1，并转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EBY100中。同时，对该酶特性进行了分析。

本发明的具体方案为：

1)按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造蛋白酶基因编码序列，合成该基因；

2)将蛋白酶基因与酿酒酵母表面展示载体pYD1连接，构建重组表达载体；

3)将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EBY100中，得到基因重组酿酒酵母。

以下为本发明技术方案的具体描述：

质粒及基因重组酿酒酵母的构建：

根据Genebank数据库中公布的蛋白酶基因编码序列，经密码子改造后，进行全基因合成；将人工合成的蛋白酶基因克隆到质粒pYD1(购自Invitrogen生物技术有限公司，货号：V835-01)构件表面展示表达载体；将构建好的表达载体转化酿酒酵母EBY100(MATαura3-52trp1leu2Δ1his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL(pIU211:URA3))。PCR方法验证阳性转化子，引物序列为：SUB1-GGATCCATGACTGAAAGAAAGCA，SUB2-CTCGAGGTTAACCTTTTGAACT)。

酿酒酵母的培养：

YPD培养基：用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的生长、培养。1％酵母提取物(Yeastextract)，2％胰化蛋白胨(Typtone)，2％葡萄糖(Glucose)，2％琼脂(Agar)(配制固体培养基)，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20min。配制YPD固体培养基时，为防止葡萄糖在高温下发生焦化，不与琼脂一起高温灭菌，而采用过滤除菌加入培养基中。

MD基本培养基：用于酿酒酵母转化子的培养、筛选。0.67％YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，2％葡萄糖(Glucose)，0.01％亮氨酸(Leucine)，0.01％色氨酸(Tryptophan)(按验要求添加)，2％琼脂(Agar)(配制固体培养基)，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20min。2％葡萄糖过滤除菌加入培养基。

酿酒酵母的活化：使用处于4℃保存的酿酒酵母前必须首先进行活化。用接种针挑取一个酿酒酵母单菌落，在新的YPD平板上划线，于30℃静置培养2d。

酶学特性分析：

使用YPD培养基培养重组酿酒酵母，检测不同反应pH、温度、NaCl浓度、抑制剂和变性剂等对外源蛋白酶活性的影响，比较最优反应条件下密码子改造对重组酶活性的影响。

本发明通过基因改造，将蛋白酶基因sub转入酿酒酵母细胞，实现了该蛋白在细胞表面的展示，获得了一株高效降解蛋白酶的基因重组酿酒酵母EBY100-SUB。酪蛋白双层平板检测表明在诱导48h时重组酶具有相对较大的透明圈出现，具有蛋白酶生物学活性。该工程菌所产酶的酶学特性：最适反应温度为55℃；最适pH值为7.5；1M NaCl胁迫下可保持80％活性，对盐具有一定的耐受性；对十二烷基硫酸钠(SDS)敏感，乙二胺四乙酸(EDTA)≥5mM时无活性，对咪唑、组氨酸(含咪唑基)具有较高抗性；与出发菌株EBY100相比，密码子改造后重组酶活性提高了20.16％。以上特性表明该重组蛋白酶耐盐、耐高温，对抑制剂和变性剂具有普遍抗性，对碱性环境表现出较强的适应力，具有非常好的市场应用前景。

以下作详细说明。

1、目的序列获得与表达载体构建

从Genbank上获得蛋白酶基因编码序列，分析酿酒酵母密码子使用规律，使用偏爱密码子代替稀有密码子。同时，在C端和N端分别引入BamHI和XhoI两个酶切位点，获得改造的蛋白酶基因序列：

GGATCCATGACTGAAAGAAAGCAAGTTTGGTTCGAAGAAGCCAACTCTAGATTGGACCCAGGTTTGGTTGGTCAATTGATGAAGAAGAGAAAGGAAGACCCAAACGAAACTTCTGAAGACACTTTGCCAGTTATTGTTAAGGTTTACCAAAACTGTACTAAGGACATGAAGGAAGACTTGTTGAAGACTTGTGAAGGTGACTCTTGTAACACTTTGAACGACGACATGGAAATTTTGCACTCTTTGTACGGTGACTTGACTCCAAAGAAGATTAGAGAATTGAAGAACCACGAAGCTGTTGAAAGAATTTTCTACGACAGAGACGTTACTGCTTTCTTGGACGTTGCTACTAAGGAAATTAACGCTGTTGAAGTTCAACAAGACTTGGGTTTGACTGGTAAGGACATTACTATTGCTGTTATTGACTCTGGTGTTTTCCCACACCCAGACTTGACTAAGCCAGAAAACAGAATTGTTGCTTTCAAGGACTTCGTTAACAAGCAAGAAGAACCATACGACGACAACGGTCACGGTACTCACTGTTGTGGTGACGCTGCTGGTAACGGTCACCACTCTAACGGTAAGTACACTGGTCCAGCTCCAGCTGCTTCTATTGTTGGTGTTAAGGTTTTGAACGAAAAGGGTGGTGGTAAGTTGTCTACTATTATTAGAGGTATTGAATGGTGTATGAAGCACAGAGAAAAGTACGGTATTAGAATTATTTCTTTGTCTTTGGGTGCTGAAGCTTACGAATCTTACAGAGACGACCCATTGACTCAAGCTACTCAAAAGGCTTGGCACTCTGGTATTGTTGTTTGTGCTGCTGCTGGTAACGACGGTCCATCTAGATCTACTATTTCTACTCCAGCTATTGACCCATTCATTATTACTGTTGGTTCTGCTGACGACCAAAACACTGTTACTAGATCTGACGCTGTTATTTCTAAGTTCTCTTCTAGAGGTCCAACTATTGACGAATTGGTTAAGCCAGACATTTACGCTCCAGGTTCTAACATTATTTCTTTGTTGTCTCCAGGTTCTGCTTTGGAAAAGCAAATTCCAGAAAGAGTTATTGACGAAAACTACGTTTCTTTGTCTGGTACTTCTATGGCTACTCCAATTTGTGCTGGTGTTATTGCTTTGATGTTGGAAGCTAACCCACAATTGTCTCCAAACGACATTAAGTCTATTTTGCAAGCTACTTCTCAACCAACTTTGGCTGACAAGTGGGGTTACATTCACGCTAAGACTGCTGTTGAAATGGCTAAGGACTACGTTCAACAAGTTCAAAAGGTTAACCTCGAG

按上述序列，由英潍捷基(上海)合成改造的蛋白酶基因，使用常规方法将该基因连接到质粒pYD1上，得到重组质粒pYD-sub(见图1)，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用热激法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，获得含有质粒pYD-sub的阳性菌株，-80℃保存备用。

2、重组质粒pYD-sub的提取

采用碱变性法，参考普通质粒小提试剂盒的使用说明，具体方法如下：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取1.5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心一分钟，尽量吸除上清。

3)重复2步骤。

4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用漩涡振荡器悬浮沉淀。

5)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转10次使菌体充分裂解。

6)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现沉淀。12000rpm离心10min，此时将在底部形成沉淀。

7)将上一步收集的上清转移到吸附柱CP3中，注意不要吸出沉淀。12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8)向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

9)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(加无水乙醇)，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。10)重复步骤9。

11)将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

12)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

3、SS-DNA的制备

在250mL的试剂瓶中，将1g小牛胸腺DNA溶解于100mL TE(10mg/mL)中，反复吹打至溶解完全；4℃温育过夜；用超声波处理1min，得到平均长度大约为6kb的DNA片段，跑琼脂糖凝胶电泳鉴定结果DNA的大小，以确定其满足在4kb～8kb之间；每管25mL分装至四个新的离心管中；加25mL TE饱和的酚，4℃，12000r/min离心5min，分别转移上清(DNA)至一个新的离心管；加25mL TE饱和的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，4℃，12000r/min离心5min，分别转移上清(DNA)至一个新的离心管；加25mL氯仿，4℃，12000r/min离心5min，分别转移上清(DNA)至一个250mL的大离心管；加5mL 3M，pH6.0的NaAc及125mL预冷的95％的冰乙醇，沉淀DNA；4℃，12000g离心5min沉淀DNA；用200mL70％的乙醇洗涤DNA，4℃，12000g继续离心5min，去上清，干燥DNA；将DNA转到一个250mL的无菌瓶中，加100mL无菌的TE(10mg/mL)溶解DNA；煮沸20min使DNA变性，而后迅速置于冰上，以防其复性。-20℃保存。

4、酿酒酵母的LiAc/SS-DNA/PEG转化

1)将已活化的酿酒酵母(S.cerevisiae)EBY100菌株5个单菌落挑至50mL YPD液体培养基中，30℃，170r/min过夜培养至OD₆₀₀nm达1.0左右。

2)将过夜培养的菌液稀释到新的50mL YPD液体培养基中，使OD₆₀₀约为0.6，继续培养3h，至OD₆₀₀nm约为1.0。

3)用50mL离心管收集菌体，2500r/min离心5min，弃上清，用40mL1×TE重悬菌体。

4)2500r/min继续离心5min，弃上清，菌体用2mL 1×LiAc/0.5×TE重悬。

5)30℃，80r/min温育1h；将2mL菌液重悬液分装，每管100μL。

6)在各管中加入质粒、SS-DNA及700μL 1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，混合均匀；30℃温育30min，后加入88μL DMSO，混合均匀。

7)42℃热激7min；4000r/min离心1min，除去上清，收集菌体。

8)用1mL 1×TE重悬菌体，4000r/min继续离心1min，去上清，菌体用100μL 1×TE重悬；涂布于SC-U-G选择性平板，筛选转化子。

5、酿酒酵母转化子的菌落PCR鉴定(见图2)

从平板上挑取单菌落，稀释于20μL ddH₂O，部分菌液划另外一个氨苄青霉素选择性平板，其余部分(约20μL)99.9℃煮10min，置于冰上。然后向体系中加入Ex-Taq、10×Ex-Taq Buffer、dNTP及引物，进行PCR反应；利用0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定。菌落PCR反应体系如下：

反应条件：

6、重组酶酶学特性研究

1)pH对重组酶活性的影响

通过添加不同的100mM缓冲液检测pH对重组酶活性的影响。所使用缓冲液为：乙酸钠缓冲液(pH 5.0，5.5),磷酸缓冲液(pH 6.0,6.5,7.0)，Tris-HCl缓冲液(pH7.5,8.0,8.5,9.0)，Tris-glycine缓冲液(pH 9.5)，和甘氨酸缓冲液(pH 10)。

2)温度对重组酶活性的影响

在最佳pH缓冲液当中，设置不同反应温度以检测温度对重组酶活性的影响。分别设定为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃。此外，将重组酶在不同温度下(0℃、15℃、30℃、45℃、60℃、70℃)水浴120min后测定剩余蛋白酶活性，用以检测重组酶的温度稳定性。

3)NaCl对重组酶活性的影响

将重组酶在不同浓度(0,0.5，1.0,1.5，2.0，2.5，3.0mol/L)的NaCl溶液中，25℃保温24h后，在最适PH值、最适温度条件下测定酶活性。

4)抑制剂和变性剂对重组酶活性的影响

分别将EDTA(0.5、1、5mM)、咪唑(0.5M)、组氨酸(0.5M)、Urea(1M)、SDS(0.5％)、DTT(1mM)加入菌液，混合室温放置30min后，测定酶活。

7、重组蛋白酶活性测定

1)试剂的配制

(1)0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g，以蒸馏水溶解定溶至1000ml。

(2)0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸，以蒸馏水溶解定溶至1000ml。

(3)0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml。

(4)10.00mg/ml酪素溶液：称取酪素1.000g，准确至0.001g，用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿，加入适量的各适宜的缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻度，此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天.

(5)100μg/ml酪氨酸标准溶液：准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.10g，用1mol/L的盐酸60ml溶解后定容至100ml，即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液。吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml，用0.1mol/L盐酸定容至100ml，即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液。

2)粗酶液的制备

在诱导培养基中诱导培养96h，每隔12h取样，选取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时间点样品，放置4℃保存，13000rpm离心收集菌体细胞，无菌蒸馏水洗涤两次，用等量的无菌蒸馏水(50mmol/L的Tris-HCI缓冲液)重悬菌体，即为粗酶液。(或将菌体平铺于平板中，于冷冻干燥机冻干24h，获得全细胞酶生物催化剂。将冻干粉放在密闭瓶子中，于低温干燥箱中备用。)

3)平板酶活测定

酪蛋白双层平板：A-0.67％的YNB，0.5％的酸水解酪素，2％琼脂，灭菌后加入半乳糖至终浓度2％。B-4％的酪蛋白；C-4％的琼脂粉；将B、C两种培养基合并，倒入无菌平板，待凝固后，倒入培养基A。在平板上用枪头点诱导过的菌液，在平板上直径约1mm，培养3天。

4)标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液按表1配制。

分别取上述溶液各1ml(须做平行试验)，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1ml，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于波长680nm，比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量(μg)，即为吸光常数K值，其K值应在95～100范围内。

5)样品测定

(1)先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min。

(2)取4支试管，各加入1ml酶液。

(3)取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1ml酪素，摇匀，40℃保温10min。

(4)取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。静置10min，过滤沉淀。

(5)各取1ml滤液，分别加0.4mol/L的Na2CO3 5ml、福林试剂1ml。在40℃显色20min。680nm处测OD值。以空白管调零点。

6)计算

酶活定义：1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在40℃(酸性pH＝3.0、中性pH＝7.5、碱性pH＝10.5)条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。计算酶的活性单位依据以下公式：蛋白酶的活力＝A×K×4/10×n U/g(ml)＝A×89.04×0.4/0.0027。其中A为样品平行试验的平均OD值，K为吸光常数，4为反应试剂的总体积，10为酶解反应时间，n为酶液稀释总倍数。

表1

Claims (3)

1.一种降解蛋白质的基因重组酿酒酵母，含有外源蛋白酶基因，其中所述外源蛋白酶基因是通过使用偏爱密码子代替稀有密码子，同时在C端和N端分别引入BamHI和XhoI两个酶切位点，获得如SEQ ID NO：1所示序列的改造蛋白酶基因。

2.一种如权利要求1所述的降解蛋白质的基因重组酿酒酵母的构建方法，步骤为：

S1.按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造蛋白酶基因编码序列，合成该基因；

S2.将蛋白酶基因与酿酒酵母表面展示载体pYD1连接构建重组表达载体；

S3.将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母EBY100中，构建基因重组酿酒酵母。

3.一种如权利要求1所述的降解蛋白质的基因重组酿酒酵母在蛋白质降解中的应用。