CN105039190B - 一种降解纤维素的基因重组酿酒酵母及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种降解纤维素的基因重组酿酒酵母，含有外源纤维素酶基因。本发明还公开了上述基因重组酿酒酵母的构建方法。本发明的基因重组酿酒酵母可有效提高酵母细胞对纤维素的降解效率，且具有生产成本低、生物量可重复利用、无二次污染等特点，对环境领域纤维素类物质的降解、农业废弃物资源化、工业领域纤维素酶的规模发酵及生产具有积极的推动作用。

Description

一种降解纤维素的基因重组酿酒酵母及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种高效降解纤维素的基因重组酿酒酵母。

本发明还涉及上述基因重组酿酒酵母的构建方法。

本发明还涉及上述基因重组酿酒酵母在降解纤维素方面的应用。

背景技术

纤维素是地球上大量存在的可利用资源，在造纸业、纺织业、农产品加工等领域使用广泛。纤维素酶可降解纤维素，在解决纤维素资源化利用方面具有重要的应用前景。外切葡聚糖酶是纤维素降解过程中的重要限速酶，但因其属于胞内酶，表达量较低，工业化应用困难。

酿酒酵母是工业化发酵的常见菌种，生物安全性高，其表面展示系统能够使外源蛋白在细胞表面大量表达。细胞表面展示技术的原理是将外源肽以融合蛋白的形式固定在细胞的外膜，被表达的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活性，该技术集表达、纯化和固定于一体，在医药、食品、生物燃料、环境保护等多个领域都具有广泛的应用前景。截至目前，对于密码子改造后的cbh1基因在酿酒酵母细胞表面展示是否可以提高酶活性，国内外尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效降解纤维素的基因重组酿酒酵母。

本发明的又一目的是提供一种上述基因重组酿酒酵母的构建方法。

为实现上述目的，本发明提供的降解纤维素的基因重组酿酒酵母，含有外源纤维素酶基因。

本发明提供的上述基因重组酿酒酵母的构建方法，步骤为：

S1、按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造纤维素酶基因编码序列，合成该基因；

S2、将纤维素酶基因与酿酒酵母表面展示载体pYD1连接构建重组表达载体；

S3、将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EBY100中，构建基因重组酿酒酵母。

本发明的基因重组酿酒酵母，可用于大量生产高纯度纤维素酶，表达量高，成本低，应用范围广，为纤维素酶的工业化生产提供一种新方法，为农业废弃物资源化、生物能源制备、工业纤维素酶源开发等方面提供技术参考。

附图说明

图1是表达载体pYD1质粒图谱。

图2是重组纤维素酶酿酒酵母转化子菌落PCR鉴定图。

具体实施方式

本发明所要解决的技术问题是提供一种表面展示纤维素酶的重组酿酒酵母，通过在细胞表面表达纤维素酶，增大酶与底物的接触面积，达到提高纤维素降解效率的目的。所述纤维素酶基因连接到载体pYD1(见图1)，并转化到酿酒酵母(S.cerevisiae)EBY100中。同时，对该酶特性进行了分析。

为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：

1)按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造纤维素酶基因编码序列，合成该基因；

2)将该基因与酿酒酵母表面展示载体pYD1连接，构建重组表达载体；

3)将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母(S.cerevisiae)EBY100中，得到基因重组酿酒酵母。

以下为本发明技术方案的具体描述：

质粒及基因重组酿酒酵母的构建：

根据Genbank数据库中公布的纤维素酶基因编码序列，经密码子改造后，进行全基因合成；将人工合成的纤维素酶基因克隆到质粒pYD1(购自Invitrogen生物技术有限公司，货号：V835-01)构建表面展示表达载体；将构建好的表达载体转化酿酒酵母EBY100(MATαura3-52trp1leu2Δ1his3Δ200pep4::HIS3prb1Δ1.6R can1GAL(pIU211:URA3))。PCR方法验证阳性转化子，引物序列为：CBH1-AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC，CBH2-GTCGATTTTGTTACATCTACAC。

酿酒酵母的培养：

YPD培养基：用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的生长、培养。1％酵母提取物(Yeastextract)，2％胰化蛋白胨(Typtone)，2％葡萄糖(Glucose)，2％琼脂(Agar)(配制固体培养基)，1.05kg/cm²、121.3℃条件下灭菌20min。配制YPD固体培养基时，为防止葡萄糖在高温下发生焦化，不与琼脂一起高温灭菌，而采用过滤除菌后加入培养基中。

MD基本培养基：用于酿酒酵母转化子的培养、筛选。0.67％YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，2％葡萄糖(Glucose)，0.01％亮氨酸(Leucine)，0.01％色氨酸(Tryptophan)(按试验要求添加)，2％琼脂(Agar)(配制固体培养基)，1.05kg/cm²、121.3℃条件下灭菌20min。2％葡萄糖过滤除菌后加入培养基。

酿酒酵母的活化：使用处于4℃保存的酿酒酵母前必须首先进行活化。用接种针挑取一个酿酒酵母单菌落，在新的YPD平板上划线，于30℃静置培养2d。

酶学特性分析：

使用YPD培养基培养重组酿酒酵母，检测不同反应pH、温度、底物最佳反应时间及金属离子等对外源纤维素酶活性的影响，比较最优反应条件下密码子改造对重组酶活性的影响。

本发明通过基因改造，将纤维素酶基因cbh1转入酿酒酵母细胞，实现了该蛋白在细胞表面的展示，获得了一株高效降解纤维素酶的基因重组酿酒酵母EBY100-CBH。该重组酶特性如下：最适反应温度为50℃；最适pH值为5.0，在pH4.0-6.0之间酶活性相对稳定；与底物最佳反应时间为10min；Ca²⁺、Mn²⁺在终浓度为1.0mM时对酶活有促进作用，Cu²⁺、Zn²⁺、Fe^{2 +}在终浓度为5.0mM时对酶活有促进作用；多代连续培养证明该酶遗传稳定；与出发菌株EBY100相比，密码子改造后重组酶活性提高了26.71％。具有非常好的市场应用前景，可应用于环境领域纤维素类物质的降解，或工业领域纤维素酶的规模发酵与生产。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。

以下做详细说明：

1、目的序列获得与表达载体构建

从Genbank上获得纤维素酶基因编码序列，分析酿酒酵母密码子使用规律，使用偏爱密码子代替稀有密码子。同时，在C端和N端分别引入EcoR I和XhoI两个酶切位点，获得改造的纤维素酶基因序列：

GAATTCATGTACAGAAAGTTGGCTGTTATTTCTGCTTTCTTGGCTGCTGCTAGAGCTCAACAAGTTTGTACTCAACAAGCTGAAACTCACCCACCATTGACTTGGCAAAAGTGTACTGCTTCTGGTTGTACTCCACAACAAGGTTCTGTTGTTTGGGACGCTAACTGGAGATGGACTCACGACACTAAGTCTACTACTAACTGTTACGACGGTAACACTTGGTCTTCTACTTTGTGTCCAGACGACGCTACTTGTGCTAAGAACTGTTGTTTGGACGGTGCTAACTACTCTGGTACTTACGGTGTTACTACTTCTGGTGACGCTTTGACTTTGCAATTCGTTACTGCTTCTAACGTTGGTTCTAGATTGTACTTGATGGCTAACGACTCTACTTACCAAGAATTCACTTTGTCTGGTAACGAATTCTCTTTCGACGTTGACGTTTCTCAATTGCCATGTGGTTTGAACGGTGCTTTGTACTTCGTTTCTATGGACGCTGACGGTGGTCAATCTAAGTACCCAGGTAACGCTGCTGGTGCTAAGTACGGTACTGGTTACTGTGACTCTCAATGTCCAAGAGACTTGAAGTTCATTAACGGTCAAGCTAACGTTGAAGGTTGGGAACCATCTTCTAACAACGCTAACACTGGTGTTGGTGGTCACGGTTCTTGTTGTTCTGAAATGGACATTTGGGAAGCTAACTCTATTTCTGAAGCTTTGACTCCACACCCATGTGAAACTGTTGGTCAAACTATGTGTTCTGGTGACTCTTGTGGTGGTACTTACTCTAACGACAGATACGGTGGTACTTGTGACCCAGACGGTTGTGACTGGAACCCATACAGATTGGGTAACACTTCTTTCTACGGTCCAGGTTCTTCTTTCGCTTTGGACACTACTAAGAAGTTGACTGTTGTTACTCAATTCGCTACTGACGGTTCTATTTCTAGATACTACGTTCAAAACGGTGTTAAGTTCCAACAACCAAACGCTCAAGTTGGTTCTTACTCTGGTAACACTATTAACACTGACTACTGTGCTGCTGAACAAACTGCTTTCGGTGGTACTTCTTTCACTGACAAGGGTGGTTTGGCTCAAATTAACAAGGCTTTCCAAGGTGGTATGGTTTTGGTTATGTCTTTGTGGGACGACTACGCTGTTAACATGTTGTGGTTGGACTCTACTTACCCAACTAACGCTACTGCTTCTACTCCAGGTGCTAAGAGAGGTTCTTGTTCTACTTCTTCTGGTGTTCCAGCTCAAGTTGAAGCTCAATCTCCAAACTCTAAGGTTATTTACTCTAACATTAGATTCGGTCCAATTGGTTCTACTGGTGGTAACACTGGTTCTAACCCACCAGGTACTTCTACTACTAGAGCTCCACCATCTTCTACTGGTTCTTCTCCAACTGCTACTCAAACTCACTACGGTCAATGTGGTGGTACTGGTTGGACTGGTCCAACTAGATGTGCTTCTGGTTACACTTGTCAAGTTTTGAACCCATTCTACTCTCAATGTTTGTAACTCGAG

按上述序列，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成改造的纤维素酶基因，使用常规方法将该基因连接到质粒pYD1上，得到重组质粒pYD-cbh，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，采用热激法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，获得含有质粒pYD-cbh的阳性菌株，-80℃保存备用。

2、重组质粒pYD-cbh的提取

采用碱变性法，参考普通质粒小提试剂盒的使用说明，具体方法如下：

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)取1.5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。

(3)重复2步骤。

(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用漩涡振荡器悬浮沉淀。

(5)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转10次使菌体充分裂解。

(6)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，12000rpm离心10min，此时将在底部形成沉淀。

(7)将上一步收集的上清转移到吸附柱CP3中，注意不要吸出沉淀。12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

(9)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(加无水乙醇)，12000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

(10)重复步骤9。

(11)将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(12)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

3、醋酸锂法转化酿酒酵母EBY100

(1)向100μL酿酒酵母感受态细胞中加入1μg质粒DNA、100μg鲑鱼精DNA及700μL的1×LiAc/40％PEG-3350/1×TE，混合均匀。

(2)30℃孵育30min。

(3)向离心管内加入88μL的DMSO，42℃热激7min。

(4)在离心机中5000rpm离心30s，小心用移液枪移去上清。

(5)向离心管内加入1mL1×TE，重悬细胞，5000rpm离心30s。

(6)加入50μL TE重悬细胞，均匀涂布于筛选培养基，于30℃培养3-5天，挑取转化子进行鉴定。

4、转化子的筛选与鉴定

根据Invitrogen公司的pYD1Yeast Display Vector说明书，酿酒酵母EBY100是色氨酸缺陷型，据此筛选阳性转化子并提取重组质粒，采用PCR的方法进一步鉴定(见图2)。酵母细胞壁较厚，采取碱裂解法提取质粒。具体方法如下：

(1)取菌液1.5mL，4000rpm离心5min，弃上清。

(2)加入预冷的100μl溶液I，震荡混匀，室温放置5min。

(3)加入200μl溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次(不要剧烈震荡)，冰浴放置5min。

(4)加入预冷的150μl溶液III，温和震荡混匀，冰浴5min。

(5)12000rpm离心5min。

(6)取400ul上清至另一干净的EP离心管中，加入400μl氯仿:异戊醇，混匀。12000rpm离心5min。

(7)轻轻取350ul上清至另一干净的EP离心管中，加入700μl无水乙醇充分混匀后，室温静置沉淀5～10min。

(8)12000rpm离心5min，弃上清。

(9)用500μl 70％的乙醇漂洗沉淀1次，5000rpm离心5min。

(10)沉淀物自然干燥后加入30μl含RNAase的TE(pH8.0)，以溶解质粒DNA。

(11)电泳检测实验结果。

在提取质粒后，需要以质粒为模板进行PCR，反应体系如下：

反应程序如下：

5、重组表面展示酵母诱导表达蛋白

(1)分别接种阳性转化子EBY100-pYD1-CBH1、EBY100和EBY100-pYD1于10ml含2.0％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基中，30℃、180rpm过夜培养。

(2)读取培养液的OD值，使OD₆₀₀保持在2.0-5.0之间。

(3)室温条件下，5000rpm离心10min，弃上清。

(4)重悬细胞于含2.0％半乳糖的YNB-CAA液体培养基中，使OD₆₀₀介于0.5-1.0之间，用于保证细胞处于对数生长期。

(5)22℃、220rpm恒温培养96h以诱导蛋白表达。

(6)以EBY100酵母菌株为阴性对照、以含有pYD1空质粒载体的菌株为阳性对照。诱导表达后，每隔12h取样，测其600nm处的吸光度，并测定各时间点的蛋白浓度和酶活。

6、Bradford法蛋白浓度的测定

根据Bradford法(考马斯亮蓝法)测定样品中蛋白的浓度。在考马斯亮蓝试剂中加入样品0.1mL，用移液枪反复吹打使之充分混合，室温静置2min后比色，以不含有牛血清蛋白的标准溶液作为空白样，测定595nm处的吸光度，根据蛋白浓度标准曲线换算得到样品中蛋白的浓度。

7、不同诱导时间对重组酶活性的影响

在诱导培养基中诱导培养96h，选取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时间点样品，放置4℃保存，13000rpm离心收集菌体细胞，无菌蒸馏水洗涤两次，用等量的无菌蒸馏水重悬菌体，即为粗酶液，用于进行纤维素酶活的测定。具体方法为：

(1)用0.05mol/L、pH5.0的柠檬酸缓冲液配制1％微晶纤维素的溶液，取1ml该溶液，加入1ml粗酶液，于60℃条件下反应1h。

(2)12000rpm离心10min去除不溶物。

(3)取1ml的反应上清液用DNS法测定还原糖浓度。DNS法即取1ml的反应上清液于试管中，向试管中加入1ml 0.05mol/L、pH5.0的柠檬酸缓冲液和1.5ml DNS试剂，沸水浴中加热10min，冷却后用蒸馏水定容至25mL，测定在波长540nm处的吸光度。

8、反应温度对重组酶活性的影响

根据DNS法测定纤维素外切葡聚糖酶的方法，将表面展示纤维素酶与底物微晶纤维素混合后，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃温度下水浴，测定表面展示酶的活性，分析反应温度对酿酒酵母表面展示纤维素酶活性的影响。

9、pH对重组酶活性的影响

通过添加不同的100mM缓冲液检测pH对重组酶活性的影响。所使用缓冲液为：乙酸钠缓冲液(pH4.0、4.5、5.0、5.5)，磷酸缓冲液(pH 6.0、6.5、7.0)，Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。

10、与底物反应时间对重组酶活性的影响

在最适温度和最适pH值条件下，设置5、10、15、20、25、30min不同反应时间梯度，以检测反应时间对酿酒酵母表面展示纤维素外切酶酶活性的影响，以相同体积的蒸馏水作为对照。

11、金属离子对重组酶活性的影响

在确定最适温度和最适pH值后，分别在粗酶液与底物微晶纤维素的反应液中加入不同的金属离子，使终反应浓度为1.0mmol/L和5.0mmol/L，主要测定Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Mn²⁺对表面展示纤维素酶活的影响，室温反应30min，以相同体积的蒸馏水作为对照，测定金属离子对酿酒酵母表面展示纤维素外切酶酶活的影响。

12、重组酶遗传稳定性研究

将阳性转化子接种至筛选培养基，传代10次，进行分子鉴定及酶活的检测，检测重组质粒是否丢失及生物活性是否发生变化。

13、重组纤维素酶活性测定

1)葡萄糖标准曲线的绘制

取24支具有刻度试管，每种浓度三个平行，按下表顺序加入以下试剂。

将上述各试剂依次混匀后，在沸水浴中加热10min后，立即用流动冷水进行冷却，每个试管加蒸馏水至25mL刻度线，充分混匀后，用空白管溶液调零点，测定540nm处吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

2)粗酶液的制备

在诱导培养基中诱导培养96h，每隔12h取样，选取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h时间点取样，放置4℃保存，13000rpm离心收集菌体细胞，无菌蒸馏水洗涤两次，用等量的无菌蒸馏水重悬菌体，即为粗酶液，用于进行纤维素酶活的测定。

3)纤维素外切葡聚糖酶活的测定

(1)用0.05mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液配制1％微晶纤维素的溶液，取1ml加入1ml粗酶液，60℃反应60min。

(2)12000rpm离心10min以除去不溶物。

(3)然后取1ml的反应上清液用DNS法测定还原糖浓度。DNS法即取1ml的反应上清液于试管中，向试管中加入1ml 0.05mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液和1.5ml DNS试剂，沸水浴中加热10min，冷却后用蒸馏水定容至刻度至25mL刻度线，在波长540nm处测定吸光度，记录结果。

定义：每毫升酶液每分钟水解底物产生1umol的葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位。

其中n为OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量。

Claims (3)

1.一种降解纤维素的基因重组酿酒酵母，含有外源纤维素酶基因，其中该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述降解纤维素的基因重组酿酒酵母的构建方法，步骤为：

S1、按照酿酒酵母密码子偏爱性，改造纤维素酶基因编码序列，合成该基因；

S2、将纤维素酶基因与酿酒酵母表面展示载体pYD1连接构建重组表达载体；

S3、将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母EBY100中，构建基因重组酿酒酵母。

3.权利要求1的基因重组酿酒酵母在纤维素类物质降解中的应用。