CN103045614B - 突变噬菌体e基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物基因工程领域，公开了一种经基因突变后获得的PhiX174噬菌体E基因的DNA，其序列号如SEQ ID NO：1所示，还公开了上述DNA的制备方法以及含该DNA的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用。本发明的突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中的表达量大大高于现有噬菌体E基因在禽沙门氏菌中的表达量；其相对于现有噬菌体E基因对禽少门氏菌的裂解率提高了30－70%，增加了禽沙门氏菌的菌脱可作为候选疫苗的可能性。

Description

突变噬菌体E基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用

技术领域

本发是明涉及一种经基因突变后获得的PhiX174噬菌体E基因的DNA及其制备方法，还涉及含有该DNA的打孔质粒载体，还进一步涉及该打孔质粒载体在制备疫苗菌脱中的应用，属于生物基因工程领域。

背景技术

在细菌中表达PhiX174噬菌体E裂解基因，能够通过渗透压的作用使细菌的细胞膜破裂，造成细菌细胞内的胞浆和核酸成分流出，而形成一种空的细菌外壳，即为“bacterial ghost”(菌脱)。由于菌脱和活菌具有一样的细菌膜结构担保和相关抗原蛋白，与通过甲醛等化学方法灭活的细菌比较其刺激机体产生免疫反应的抗原物质未发生变性，因此菌脱是良好的候选疫苗。目前E蛋白介导的溶解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎少门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、支气管败血博德特氏杆菌等。但是，如果菌脱作为疫苗使用，尤其是对于强致病性细菌时，此时就需要菌脱中不含活菌，否则在使用菌脱免疫动物时，容易造成动物因感染强致病性活菌而发病。虽然菌脱已经广泛应用于革兰氏阴性菌中，对于Top10、DH5a等基因工程大肠杆菌的裂解效果较好，而对于野生型大肠杆菌或者其革兰氏阴性菌的裂解效果一般。因此，有必要提高E基因的裂解效果。

禽沙门氏菌病在世界各地普遍存在，对养禽业的危害性很大。提高E基因对禽沙门氏菌的裂解效果，有利于增加禽沙门氏菌菌脱作为候选疫苗的可能性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种突变噬菌体E基因；

本发明的目的之二在于提供上述突变噬菌体E基因的制备方法；

本发明的目的之三在于提供含上述突变噬菌体E基因的打孔载体；

本发明的目的之四在于构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法；

本发明的目的之五在于将上述突变噬菌体E基因应用于制备禽沙门氏菌菌脱疫苗。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种突变噬菌体E基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。该突变噬菌体E基因相对于PhiX174噬菌体E基因在禽少门氏菌中的表达量大大提高。

一种突变噬菌体E基因的制备方法，其特征在于顺次包括以下步骤：

1）通过引物1（SEQ ID NO：3）和引物2（SEQ ID NO：4）进行PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序，其序列为SEQ ID NO：2所示；

2）对序列为SEQ ID NO：2所示的E基因进行点突变，E基因点突变后的序列为SEQ ID NO：1所示。

将本发明的突变噬菌体E基因与pMD18-T等可操作性载体连接，即可得到打孔载体。

具体地，一种构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法，使用引物3（SEQ ID NO：5）和引物4（SEQ ID NO：6）将上述的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接。

一种制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在含氨苄青霉素的LB中接种含权上述突变噬菌体E基因的打孔载体的基因工程大肠杆菌，培养后提取表达载体质粒；

2）使用电极仪或者氯化钙转化法把表达载体质粒转入禽沙门氏菌中，在含氨苄青霉素的LB固体培养板中培养，通过PCR鉴定并挑取含表达载体质粒的阳性禽沙门氏菌；

3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达；

4）收集溶菌结束后形成的禽沙门氏菌菌脱，用纯水洗涤，-20℃保存。

优选地，步骤1）所述表达载体质粒通过如下方法获得：把突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接，然后转入Top感受态细胞，并取100ul该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素100ug/mL的LB琼脂平板上，放入37℃培养箱；等培养板干了之后，倒置培养10-14h，挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒；使用Sac I和BamH I对含有突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切；突变噬菌体E基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体或温控型表达载体连接在一起，然后转入Top感受态细胸，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒，即获得化学诱导型表达载体质粒或温控型表达载本质粒。

优选地，步骤3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达可通过下面两种方法进行：

a)化学诱导型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，加入0.5M的IPTG在37℃的温度下进行诱导培养；

b)温控型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，在42℃的温度下进行诱导培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中的表达量大大高于现有噬菌体E基因在禽沙门氏菌中的表达量；本发明的突变噬菌E基因相对于现有噬菌体E基因对禽少门氏菌的裂解率提高了30-70%，增加了禽沙门氏菌的菌脱可作为候选疫苗的可能性。

附图说明

图1为突变前后PhiX174噬菌体E基因连接化学诱导型表达载体在禽沙门氏菌中的表达效果图，其中，M为蛋白Marker，NC为空白对照组（4h）；1、2为PhiX174噬菌体E基因表达组分别为2h、4h取样，3、4为突变噬菌体E基因表达组分别为2h、4h取样；

图2为突变前后PhiX174噬菌体E基因连接温控型表达载体在禽沙门氏菌中的表达效果图，其中，M为蛋白Marker，NC为空白对照组（4h）；1、2为PhiX174噬菌体E基因表达组分别为2h、4h取样，3、4为突变噬菌体E基因表达组分别为2h、4h取样；

图3为PhiX174噬菌体E基因突变前后裂解禽沙门氏菌菌脱的透射电镜图，其中，A为PhiX174噬菌体E基因突变前裂解禽沙门氏菌菌脱的透射电镜图，B为PhiX174噬菌体E基因突变后裂解禽沙门氏菌菌脱的透射电镜图。

具体实施方式

下面通过具体实施例子对本发明作进一步详细说明。

实施例1突变PhiX174噬菌体E基因的制备方法

首先，通过引物1E 1S：ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGA 3′（SEQ ID NO：3）和引物2E 1A：TCACTCCTTCCGCACGTAATTTTTG 3′（SEQ ID NO：4）PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序，其序列如SEQ ID NO：2所示:

ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA

然后对上述PhiX174噬菌体E基因进行点突变，突变后的序列如SEQ IDNO：1所示:

ATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGCTTATTGCTGCCGTCGTTGCTGATTATGTTCATCCCGTCGACGTTCAAACGCCCGGTCTCGTCGTGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGCTTAAAACCGCTGAATTGCTCGCGTTTACCGTGCGTGTATGCGCAGGAAACGCTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACATGCGTCAAAAATTATGTGCGCAAAGAGTGA

实施例2构建含上述突变噬菌体E基因的打孔载体的方法

使用引物3（SEQ ID NO：5）和引物4（SEQ ID NO：6）将实施例1的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接。

实施例3制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法

一种制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其包括以下步骤：

1）在含氨苄青霉素的LB中接种含实施例1的突变噬菌体E基因的打孔载体的基因工程大肠杆菌，培养后提取表达载体质粒，具体是：

把突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接，然后转入Top感受态细胞，并取100ul该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素100ug/mL的LB琼脂平板上，放入37℃培养箱；等培养板干了之后，倒置培养10-14h，挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒；使用Sac I和BamH I对含有突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切；突变噬菌体E基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体或温控型表达载体连接在一起，然后转入Top感受态细胸，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒，即获得化学诱导型表达载体质粒或温控型表达载本质粒。优选方案中，所述化学诱导型表达载体为pET表达载体，所述温控型表达载体为pEAS-1a表达载体。

2）使用电极仪或者氯化钙转化法把表达载体质粒转入禽沙门氏菌中，在含氨苄青霉素的LB固体培养板中培养，通过PCR鉴定并挑取含表达载体质粒的阳性禽沙门氏菌；

3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达，具体是：

a)化学诱导型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，加入0.5M的IPTG在37℃的温度下进行诱导培养；

b)温控型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，在42℃的温度下进行诱导培养。

4）收集溶菌结束后形成的禽沙门氏菌菌脱，用纯水洗涤，-20℃保存。

实施例4噬菌体E基因突变前后在禽沙门氏菌中的表达

首先，通过引物1E 1S：ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGA 3′（SEQ ID NO：3）和引物2E 1A：TCACTCCTTCCGCACGTAATTTTTG 3′（SEQ ID NO：4）PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序，其序列如SEQ ID NO：2所示:

ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA

然后对上述PhiX174噬菌体E基因进行点突变，突变后的序列如SEQ IDNO：1所示:

ATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGCTTATTGCTGCCGTCGTTGCTGATTATGTTCATCCCGTCGACGTTCAAACGCCCGGTCTCGTCGTGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGCTTAAAACCGCTGAATTGCTCGCGTTTACCGTGCGTGTATGCGCAGGAAACGCTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAAAACATGCGTCAAAAATTATGTGCGCAAAGAGTGA

然后使用引物3E 2S:（Sac I）5′GGGC

ATGGTGCGCTGGACGTTGTGGGA（SEQ ID NO：5）和引物4E 2A:（BamH I）5′GGGC

TCACTCTTTGCGCACATAATTTTTG把PCR扩增的PhiX174噬菌体E基因和突变噬菌体E基因分别与pMD18-T载体相连接；转入Top10感受态细胞，并取取100μl该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB琼脂平板上；放入37℃培养箱，等培养板干了之后，倒置培养10～14h；挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒。使用Sac I和BamH I分别对含有PhiX174噬菌体E基因和突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切。PhiX174噬菌体E基因和突变噬菌体E基因的双酶切产物分别与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体和温控型表达载体连接在一起，然后转入Top10感受态细胞，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒，即获得表达载体质粒。把表达载体质粒分别转入同一株沙门氏菌中，同时进行诱导表达。

取1ml相同OD的含有表达质粒的禽沙门氏菌加入100ml含有氨苄青霉素（200μg/mL）的LB中进行培养，培养条件为28℃，150转/分。培养5-8小时后，含有化学诱导型表达载体质粒的禽沙门氏菌就加入IPTG至终浓度为1mmol/L，进行37℃诱导表达，同时设定非诱导对照组。培养5-8小时后，含有温控型表达载体质粒的禽沙门氏菌调节培养温度为37℃进行诱导表达，同时设定非诱导对照组。

在加入诱导后的2h、4h时分别对诱导组和4h对照组取样1ml然后离心收集菌液，直接煮沸变性后（5min,100℃），用12%十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析重组蛋白的表达产物，其结果如图1和2。其表明突变噬菌体E基因不论在温控型表达载体还是在化学诱导型表达载体中，其在沙门氏菌中的表达量都显著提高。

实施例5噬菌体E基因突变前后对野生沙门氏菌的裂解效果比较

一、在温控型表达载体pEAS-1a中突变前后噬菌体E基因对禽沙门氏菌的裂解程序

1）把含目的质粒的禽沙门氏菌在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上涂板并且培养10-14小时后，挑取单菌落的禽沙门氏菌，同时进行PCR鉴定；PCR鉴定为阳性菌时，把该禽沙门氏菌转入含氨苄青霉素的LB液体培养基28℃培养10-16小时；当沙门氏菌浓度OD值达到0.4时，按照1:100的比例把培养后的禽沙门氏菌加入到新的氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养。

2）当沙门氏菌OD值到达0.3时，培养物分成2份，一份在26-30℃继续培养，另外一份在42℃诱导培养。

3）培养2-4小时后，同时取28℃和42℃培养的沙门氏菌各10μl适当稀释后涂LB平板进行活菌CFU检测。

4）禽沙门氏菌裂解结束后形成的菌脱，使用纯水洗涤3-4次，-20℃保存。

二、在化学诱导表达型表达载体pET中突变前后噬菌体E基因对禽沙门氏菌的裂解程序

1）把含目的质粒的禽沙门氏菌在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上涂板并且培养10-14小时后，挑取单菌落的禽沙门氏菌，同时进行PCR鉴定；PCR鉴定为阳性菌时，把该禽沙门氏菌转入含氨苄青霉素的LB液体培养基37℃培养10-16小时；当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.4时，按照1:100的比例把培养后的禽沙门氏菌加入到新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养。

2）当沙门氏菌OD值到达0.3时，培养物分成2份，一份在37℃继续培养，另外一份在37℃诱导培养的同时加入0.5M的IPTG进行诱导培养。

3）培养2-4小时后，同时取加入IPTG诱导的和非诱导的沙门氏菌各10μl，适当稀释后涂LB平板进行活菌CFU检测。

4）禽沙门氏菌裂解结束后形成的菌脱，使用纯水洗涤3-4次，-20℃保存。

实验结果见以下表1

实施例6噬菌体E基因突变前后裂解禽沙门氏菌菌脱的透射电镜检测

将实施例2获得的菌脱，以2.5%戊二醛固定细菌，置4℃下4h，0.02mol/L的PBS洗涤3次，离心后经过四氧化锇再固定、乙醇逐级脱水、包埋等步骤处理后进行电镜观察，电镜检测结果见图3。

〈110〉广东大华农动物保健品股份有限公司

〈120〉突变噬菌体E基因、含该基因的打孔质粒载体及其在制备疫苗中的应用

〈160〉6

 

〈210〉1

〈211〉276

〈212〉DNA

〈213〉phage

〈400〉1

ATGGTGCGCT  GGACGTTGTG GGATACCCTC GCTTTCCTGC TCCTGTTGAG     50

CTTATTGCTG  CCGTCGTTGC TGATTATGTT CATCCCGTCGACGTTCAAAC     100

GCCCGGTCTC GTCGTGGAAG GCGCTGAATT TACGGAAAAC ATTATTAATG     150

GCGTCGAGCG  TCCGCTTAAAACCGCTGAAT TGCTCGCGTT TACCGTGCGT     200

GTATGCGCAG  GAAACGCTGA CGTTCTTACT GACGCAGAAG AAAACATGCG     250

TCAAAAATTA TGTGCGCAAA GAGTGA                              276

 

〈210〉2

〈211〉276

〈212〉DNA

〈213〉phage

〈400〉2

ATGGTACGCT GGACTTTGTG GGATACCCTC GCTTTCCTGC TCCTGTTGAG        50

TTTATTGCTG CCGTCATTGC TTATTATGTT CATCCCGTCAACATTCAAAC        100

GGCCTGTCTCATCATGGAAG GCGCTGAATT TACGGAAAAC ATTATTAATG        150

GCGTCGAGCG TCCGGTTAAAGCCGCTGAAT TGTTCGCGTT TACCTTGCGT        200

GTACGCGCAG GAAACACTGA CGTTCTTACT GACGCAGAAG AAAACGTGCG        250

TCAAAAATTA CGTGCGGAAG GAGTGA                                276

 

〈210〉3

〈211〉23

〈212〉DNA

〈213〉artifical

〈400〉3

ATGGTACGCT  GGACTTTGTG  GGA                                   23

 

〈210〉4

〈211〉25

〈212〉DNA

〈213〉artifical

〈400〉4

TCACTCCTTC  CGCACGTAAT  TTTTG                                  25

 

〈210〉5

〈211〉33

〈212〉DNA

〈213〉artifical

〈400〉5

 GGGCGAGCTC  ATGGTGCGCT  GGACGTTGTG  GGA                        33

 

〈210〉6

〈211〉35

〈212〉DNA

〈213〉artifical

〈400〉6

 GGGCGGATCC  TCACTCTTTG  CGCACATAAT  TTTTG                       35

 

Claims (8)

1.突变噬菌体E基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述的突变噬菌体E基因的制备方法，其特征在于顺次包括以下步骤：

1）通过序列为SEQ ID NO：3所示的引物1和序列为SEQ ID NO：4所示的引物2进行PCR扩增获得PhiX174噬菌体E基因并测序，其序列为SEQ ID NO：2所示；

2）对序列为SEQ ID NO：2所示的E基因进行点突变，E基因点突变后的序列为SEQ ID NO：1所示。

3.含权利要求1所述的突变噬菌体E基因的打孔载体。

4.如权利要求3所述的打孔载体，其特征在于：该打孔载体是将权利要求1的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体可操作性相连接得到的。

5.一种构建权利要求4所述的含突变噬菌体E基因的打孔载体的方法，其特征在于：使用序列为SEQ ID NO：5所示的引物3和序列为SEQ ID NO：6所示的引物4将权利要求1的突变噬菌体E基因与pMD18-T载体相连接。

6.一种制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在含氨苄青霉素的LB中接种含权利要求3的打孔载体的基因工程大肠杆菌，培养后提取表达载体质粒；

2）使用电极仪或者氯化钙转化法将表达载体质粒转入禽沙门氏菌中，在含氨苄青霉素的LB固体培养板中培养，通过PCR鉴定并挑取含表达载体质粒的阳性禽沙门氏菌；

3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达；

4）收集溶菌结束后形成的禽沙门氏菌菌脱，用纯水洗涤，－20℃保存。

7.如权利要求6所述的制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于：步骤1）

所述表达载体质粒通过如下方法获得：把突变噬菌体E基因与pMD18－T载体相连接，然后转入Top感受态细胞，并取100ul该培养液均匀涂布于含氨苄青霉素100ug/mL的LB琼脂平板上，放入37℃培养箱；等培养板干了之后，倒置培养10－14h，挑白色单菌落进行扩大培养，并提取质粒；使用Sac I和BamH I对含有突变噬菌体E基因的质粒进行双酶切；突变噬菌体 E基因的双酶切产物与使用Sac I和BamH I双酶切后的化学诱导型表达载体或温控型表达载体连接在一起，然后转入Top感受态细胞，挑取阳性菌落，扩大培养后提取质粒，即获得化学诱导型表达载体质粒或温控型表达载本质粒。

8.如权利要求6或7所述的制备禽沙门氏菌菌脱疫苗的方法，其特征在于：步骤3）诱导突变噬菌体E基因在禽沙门氏菌中表达可通过下面两种方法进行：

a)化学诱导型表达载体质粒在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，加入0.5M的IPTG在37℃的温度下进行诱导培养；

b) 温控型表达载体质粒在在禽沙门氏菌中表达：当禽沙门氏菌浓度OD值达到0.3时，在42℃的温度下进行诱导培养。

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