CN110478480A - 基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮f1l疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗及其制备方法；该融合蛋白是将羊口疮F1L蛋白通过基因工程的方法外接于铁蛋白表面上，形成纳米颗粒，即羊口疮F1L/Fe融合蛋白。本发明的目标蛋白具有很好的免疫原性，可以用于预防羊口疮病毒的感染。

Description

基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫疫苗技术领域，具体涉及一种基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗及其制备方法。
背景技术
纳米颗粒材料的理化特征赋予其许多独特的生物学性状，广泛用于疫苗、药物等的研发中。铁蛋白是广泛存在于生物体的铁贮藏蛋白，可自组装形成纳米颗粒，是生物纳米材料研究领域的热点。在疫苗研发中，铁蛋白是理想的抗原载体。MasaruKanekiyo等将流感病毒H1N1的HA蛋白融合表达在幽门螺旋杆菌铁蛋白的N端，形成表面带有8个HA三聚体的纳米疫苗，与灭活三价流感病毒疫苗相比，能引起10倍以上的抗体应答的增强，同时还能产生广谱性的保护作用(Kanekiyo,Wei et al.2013)。Sebyung Kang实验室对强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)铁蛋白进行了改造，将OTI、OTII肽段融合表达在铁蛋白的表面(第142位氨基酸处)或C端形成纳米疫苗，能够引起较强的CD4、CD8T细胞应答(Han,Kang etal.2014)。此外，将HIV的外壳蛋白融合表达在铁蛋白纳米颗粒的表面也能在小鼠中引起8倍左右抗体应答的增强(Sliepen,Ozorowski et al.2015)。可见，用铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此铁蛋白是理想的纳米疫苗平台。在药物研发中，铁蛋白还被用于化疗药物或探针的载体，用于肿瘤的诊断和治疗。
羊口疮病毒F1L基因是OrfV第59个完整开放阅读框，编码39kD蛋白，是病毒表面的微管组成成分之一，能够介导细胞免疫和诱导机体产生中和抗体，还与病毒的吸附和侵入有关。虽然不同地区、不同宿主的OrfV F1L基因长度各不相同，但是F1L基因高度保守，F1L基因是OrfV新型疫苗研究中的一个重要免疫原性基因。
羊口疮病毒(ORFV)的成熟病毒粒子呈砖形或椭圆形毛线团样外观，外层由较厚的囊膜包裹，与VACV相似也具有IMV、EEV等多种病毒粒子形式(Rziha et al.,2003)。临床预防羊口疮的主要手段是接种疫苗，常用的有灭活苗和细胞弱毒苗，但存在产生抗体水平较低，免疫保护期短，不宜大量生产、储存的缺点。目前对该病尚无特效的治疗方法，只能采取临床外伤处置及支持疗法，在防控上国内外主要采取接种羊口疮弱毒活疫苗进行预防，但这种疫苗仍不能够彻底消除和控制该病，在免疫力和安全性方面均存在一定的缺陷，因此，创制安全、高效的新型疫苗势在必行，新型基因工程疫苗的研究具有重要的意义。
本发明首次选择铁蛋白作为羊口疮病毒F1L的抗原载体，将铁蛋白与F1L基因使用融合PCR的方法融合起来，连接pET-32a载体，构建原核表达载体pET-F1L-Fe，通过大肠杆菌表达系统表达F1L-Fe融合蛋白，以此作为羊口疮的亚单位疫苗。
本发明将F1L与Fe蛋白融合后，原核表达量提高了，且铁蛋白自组装将F1L蛋白形成圆形纳米颗粒，将其展示，在后续动物试验中能够有效地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗及其制备方法。将羊口疮抗原F1L连接到铁蛋白表面制成的纳米疫苗可以显著地增强F1L特异性的抗体水平，能够有效地预防羊口疮病毒的感染。
本发明的羊口疮F1L/Fe融合蛋白的制备方法，包括两大阶段，即表达工程菌的构建和目标融合蛋白的制备。
本发明的第一部分为工程菌的构建。该工程菌的构建的核心是pET32a(+)/F1L-Fe的构建。其中融合方式不影响活性蛋白的制备。
本发明的第二部分目标蛋白的制备与纯化。出于成本的考虑，本发明优先采用原核表达系统中的包涵体变复性法制备活性F1L-Fe融合蛋白。本发明还通过蛋白的电镜实验证明了该目标蛋白的活性。
具体而言，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗，所述疫苗的有效成分为羊口疮F1L/Fe融合蛋白；所述羊口疮F1L/Fe融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及一种羊口疮F1L/Fe融合蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及一种构建前述的羊口疮F1L/Fe融合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、构建pET32a-F1L/Fe表达工程菌：采用融合PCR技术扩增F1L-Fe的基因，并将片段插于pE32a(+)载体上，片段和载体连接后，转化入DH5α感受态细胞内之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil.Rosseta(DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌；
S2、诱导pET32a-F1L/Fe表达菌表达F1L/Fe目标蛋白；
S3、分离与纯化包涵体；
S4、变复性制备活性F1L/Fe目标蛋白。
步骤S2具体为：将pET32a-F1L/Fe表达工程菌以1∶100的接种比例接种于LB培养基中，加入IPTG培养，离心洗涤，收集菌体。
具体的，所述洗涤是以含有tritonX-100溶液进行洗涤沉淀。
步骤S3包括：破碎菌体，离心后回收沉淀。
步骤S4具体为：以8M尿素溶液溶解步骤S3获得的包涵体；透析复性制备F1L/Fe目标蛋白。
本发明还涉及一种前述羊口疮F1L/Fe融合蛋白在制备预防羊口疮的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明提供了有效的预防性疫苗，该疫苗是一种以铁蛋白为载体的纳米疫苗，其具有制备迅速、效果显著的特点，解决了疫苗制备周期长、弱免疫原应答低等问题；
2)本发明通过构建原核表达质粒作为疫苗来预防羊口疮，所述羊口疮疫苗中含有能表达羊口疮病毒F1L与铁蛋白的原核表达质粒pET-F1L-Fe，F1L能引起机体产生免疫应答，铁蛋白作为载体能够有效地提高免疫功能，通过构建其原核表达质粒作为疫苗来预防羊口疮能够有效刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且易于制备，具有重要的临床意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为F1L已截短基因PCR图；
图2为F1L/Fe融合PCR图；
图3为pET32a-F1L/Fe载体酶切鉴定图；
图4为F1L-Fe以及F1L融合蛋白的诱导表达SDS-PAGE分析；
图5为F1L/Fe蛋白的纯化图
图6为F1L/Fe蛋白的Western-blot鉴定图；
图7为实施例1中所制备的F1L/Fe目标蛋白的透射电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗及其制备方法；具体步骤如下：
步骤1)、构建pET32a-F1L/Fe表达工程菌：
根据GenBank上已经发表的羊口疮F1L基因序列，去除其跨膜区(TMH)设计用于扩增F1L截短基因的PCR引物，扩增片段大小为873bp。并设计融合PCR引物将F1L与Fe通过linker蛋白(SGG)连接起来，上下游引物两端分别添加EcoR I、EcoRⅤ的酶切位点。引物序列如表1所示：
表1
引物由上海擎科公司生物科技有限公司合成。
先以ORFV基因组为模板以第一对引物进行PCR扩增，将PCR扩增片段回收后，连接PMD-19T载体，转化后获得PMD-19T-F1L，然后将上述重组质粒以第二对引物进行PCR扩增，胶回收后加入DMT转化至DH5α感受态细胞，过夜培养后挑取单克隆进行PCR鉴定，PCR扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，如图1可知，在700～1000bp处有特异性条带，大小约873bp，与预期相符。鉴定正确后进行分别扩增F1L(TMH)以及Fe蛋白，胶回收后进行融合PCR，第一次反应条件为95℃预变性5min，94℃变性20s、72℃延伸90s进行10个循环，72℃延伸5min，10个循环后，取出反应管加入引物。第二次反应条件为95℃预变性5min，94℃变性20s、56℃退火20s、72℃延伸40s进行10个循环，72℃延伸5min。待反应完毕后，如图2可知，在1000-～2000bp处有特异性条带，大小约为1371bp，与预期相符，胶回收PCR产物。用EcoR I和EcoRⅤ双酶切后进行胶回收，然后与同样经EcoR I和EcoRⅤ双酶切的pET-32a载体连接，并转化DH5α感受态细胞，将菌液涂布于含氨苄青霉素(AMP，100μg/ml)的固体琼脂平板，倒置于37℃培养箱培养过夜。次日挑单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基揺菌，并进行菌液PCR鉴定。对鉴定正确的菌液提取质粒，进行EcoR I和EcoRⅤ双酶切鉴定，如图3可知，分别在5900bp和1300bp左右处有条带，与预期相符。
F1L/Fe目标融合蛋白序列如下所述(SEQ ID NO.1)：
MGEVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVLEFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES。
步骤2)、F1L/Fe目标蛋白的制备
(1)诱导pET-F1L/Fe以及pET-F1L表达菌表达F1L-Fe以及F1L目标蛋白：
从平板上挑取单克隆工程表达菌落，至于5ml LB液体培养基中(40％NaCl，40％Tryptone，20％Yeast Extract，Ampicillin 100μg/ml)，置于37℃恒温摇床内，220rpm，过夜培养。于次日按接种量1％接种至300ml LB液体培养基中(成分及抗生素浓度同上)。置于37℃恒温摇床内，培养至OD为0.5-0.8时，加入终浓度为0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃，诱导6h。最后在4℃、8000rpm条件下经15min离心收集菌体，菌体存放于-20℃。将本实验室保存的pET-F1L表达菌同pET-F1L/Fe表达菌一同诱导，并进行SDS-PAGE分析，如图4可知，F1L/Fe以及F1L融合蛋白均能有效表达，且F1L/Fe的蛋白表达量明显提高。
(2)分离与纯化F1L/Fe包涵体：
取出经过反复冻融的菌体，加入20ml的磷酸缓冲盐溶液重悬菌体[2mM KH2PO4,
8mM Na2HPO4，136mM NaCl，2.6mM KCL)，pH7.2]。在功率为650W的超声破碎仪中破碎菌体180个周期(每个周期工作2s，间隙8s)。在4℃，8000rpm条件下30min离心，除去上清，收集沉淀。加入洗涤液[2M Urea(尿素)，50mM NaCl，1mM EDTA(乙二胺四乙酸)，1％tritonX-100(C34H62O11)，pH7.9]，洗涤所得的沉淀4次，如图5可知，得到较纯的包涵体。
(3)变复性制备活性F1L/Fe目标蛋白：
向沉淀中加入20ml变性液[50mM Tris-HCl，8M Urea(尿素)，1mM EDTA，10mM DTT(二硫苏糖醇)，pH7.9]重悬洗涤后的包涵体。置于4℃的冰箱中过夜，使包涵体溶解。随后置于透析带中，在4℃下浸没于复性液中透析，每隔6h，更换一次复性液(即依次降低更换的复性液中的尿素浓度)。待透析复性结束后，过滤收集复性后的蛋白溶液。
(4)F1L/Fe目标蛋白的Western-blot以及电镜鉴定：
将上述获得的具有活性的F1L/Fe目标蛋白经SDS-PAGE电泳后，半干转法转移至硝酸纤维素滤膜上，使用含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭2h。加入1:2000稀释的鼠源HIS标签一抗，于4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，每次10min。加入HRP.羊抗小鼠IgG二抗，37℃1h，最后用ECL显色观察。如图6可知，得到了一条与目的条带大小相似的特异性条带。
将经F1L/Fe目标蛋白8000rpm，4℃离心10min，去上清20μL滴加于铜网中进行磷钨酸染色，进行透射电镜观察，如图7可知，透射电镜负染可见F1L/Fe蛋白自组装为球形颗粒，其类似于铁蛋白。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗及其制备方法
<130> DD05700
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列(F1L/Fe融合蛋白)(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln
50 55 60
Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ser
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr
100 105 110
Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
145 150 155 160
Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Phe Ala Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr Leu Val Met Tyr Ala
180 185 190
Arg Asn Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr
225 230 235 240
Leu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Phe Met Thr Thr
245 250 255
Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala
260 265 270
Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr Val Tyr
275 280 285
Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Lys Asn
290 295 300
Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu His Ala
305 310 315 320
Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu
325 330 335
Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly Leu Asn
340 345 350
Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu
355 360 365
Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys
370 375 380
Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala Ile Lys
385 390 395 400
Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu
405 410 415
Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly Asp Ser
420 425 430
Asp Asn Glu Ser
435
<210> 2
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L/Fe)(Artificial Sequence)
<400> 2
atggatccac ccgaaatcac ggcctacata atcggggttg tcgaaggccg cgggaccaag 60
gaggtgttcc ccacgctgcc gtacctagtg ggcctcgccg acgacccgcc caagcctcaa 120
cccgcacctg ctccctctcc tgcgccagcg ccagccccag cgccggcccc agctccgtca 180
ccggcccctg cgccggcacc caagccatct cctcccgcgc cgcaccccaa gggcgaccac 240
gtgctcaagg cggtggaatg gaaagacgtg gactccaaag actacccgca tttcttcacg 300
gacatgtgca agtccacgtg tccgaaggag atgcagcgcc gcgcggcaca ccacctcaac 360
ctctgggaga gcatatcggc cggcactgtc tccaccaagt actccgacaa tgacttcatc 420
ctggtggtcg acaacgacat gaccttccgc aagcccgaga tggtaaagcc gctcatcgag 480
gcgatgagga cgaacggctg gtacatggcg cagctcaagg agacctacat gaccggcgcg 540
ctggccacca acgtccccgg caccggcgac cccgagctca tggtctaccc cggcggatac 600
gacgtctcgc tggacgccta catcatcaac gtcggcggca tgaagaagct ctacgacgcg 660
atcatcaagg atggagggct gcgcagcggc ctgctcaccg aggtgttcac gctagagaag 720
cggctctctc tggcgcgcgt ggtgctctcc ggcgccgagc aggtggtcta ccccgagtac 780
tacatacagg tgaagacgcg gctcggcggc gcgccctccc tgtggtcgct gctcgccacg 840
tgggccgggc tgctggtcac ggccatcgtg tccggtggcg acatcatcaa gctgctgaac 900
gaacaggtga acaaggagat gcagtccagc aacctgtaca tgtctatgtc ttcatggtgc 960
tacacccact cactggacgg agctggtctg ttcctgttcg accacgctgc cgaggaatac 1020
gaacacgcca agaagctgat catcttcctg aacgagaaca acgtgcctgt ccagctgacc 1080
tccatcagcg ctcccgaaca caagttcgag ggtctgactc aaatcttcca gaaggcctac 1140
gaacacgagc agcacatctc tgaatcaatc aacaacatcg tggaccacgc tatcaagagc 1200
aaggaccacg ccactttcaa cttcctgcaa tggtacgtgg ctgagcagca cgaggaagag 1260
gtcctgttca aggacatcct ggacaagatc gaactgatcg gcaacgagaa ccacggactg 1320
tacctggctg accagtacgt caagggcatc gccaagtccc gcaagagcta a 1371
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L F)(Artificial Sequence)
<400> 3
atggatccac ccgaaatc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L R)(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgatggcc gtgaccag 18
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L-F(TMH))(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgggctgc tggtca 16
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L-R(TMH))(Artificial Sequence)
<400> 6
gaccagcagc ccggcccacg tggcgagcag c 31
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L-Fe F1(EcoR V))(Artificial Sequence)
<400> 7
gcgatatcat ggatccaccc gaaatc 26
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L-Fe R1(EcoRⅠ))(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgaattctt agctcttgcg ggacttggcg at 32
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L-Fe F2)(Artificial Sequence)
<400> 9
gggctgctgg tcacggccat cgtgtccggt ggcgacatca tcaagctg 48
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(F1L-Fe R2)(Artificial Sequence)
<400> 10
cagcttgatg atgtcgccac cggacacgat ggccgtgacc agcagccc 48

Claims (7)

1.一种基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮F1L疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分为羊口疮F1L/Fe融合蛋白；所述羊口疮F1L/Fe融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种羊口疮F1L/Fe融合蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种构建如权利要求1所述的羊口疮F1L/Fe融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、构建pET32a-F1L/Fe表达工程菌：采用融合PCR技术扩增F1L-Fe的基因，并将片段插于pE32a(+)载体上，片段和载体连接后，转化入DH5α感受态细胞内之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil.Rosseta(DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌；
S2、诱导pET32a-F1L/Fe表达菌表达F1L/Fe目标蛋白；
S3、分离与纯化包涵体；
S4、变复性制备活性F1L/Fe目标蛋白。
4.如权利要求3所述的构建羊口疮F1L/Fe融合蛋白的方法，其特征在于，步骤S2具体为：将pET32a-F1L/Fe表达工程菌以1∶100的接种比例接种于LB培养基中，加入IPTG培养，离心洗涤，收集菌体。
5.如权利要求4所述的构建羊口疮F1L/Fe融合蛋白的方法，其特征在于，所述洗涤是以含有tritonX-100溶液进行洗涤沉淀。
6.如权利要求3所述的构建羊口疮F1L/Fe融合蛋白的方法，其特征在于，步骤S4具体为：以8M尿素溶液溶解步骤S3获得的包涵体；透析复性制备F1L/Fe目标蛋白。
7.一种如权利要求2所述羊口疮F1L/Fe融合蛋白在制备预防羊口疮的药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111116757A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 河南农业大学 带有半乳糖结合凝集素ew29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
CN111171157A (zh) * 2019-12-31 2020-05-19 河南农业大学 A型fmdv 1d蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040006001A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-08 Carter Daniel C. Ferritin fusion proteins for use in vaccines and other applications
CN101864434A (zh) * 2009-12-21 2010-10-20 中国农业科学院兰州兽医研究所 羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及制备方法
CN106983860A (zh) * 2017-03-09 2017-07-28 贵州大学 羊口疮疫苗及其制备方法和应用
CN108434450A (zh) * 2018-02-06 2018-08-24 中国科学院生物物理研究所 基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040006001A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-08 Carter Daniel C. Ferritin fusion proteins for use in vaccines and other applications
CN101864434A (zh) * 2009-12-21 2010-10-20 中国农业科学院兰州兽医研究所 羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及制备方法
CN106983860A (zh) * 2017-03-09 2017-07-28 贵州大学 羊口疮疫苗及其制备方法和应用
CN108434450A (zh) * 2018-02-06 2018-08-24 中国科学院生物物理研究所 基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L. GALLINA 等: "Cloning and Expression of the Orf Virus F1L Gene:Possible Use as a Subunit Vaccine", 《VETERINARY RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
邢雪等: "羊口疮病毒F1L融合Fe蛋白的表达与鉴定", 《江苏农业学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111116757A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 河南农业大学 带有半乳糖结合凝集素ew29标签的铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法
CN111171157A (zh) * 2019-12-31 2020-05-19 河南农业大学 A型fmdv 1d蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

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