CN111171157A

CN111171157A - A型fmdv 1d蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

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Publication number: CN111171157A
Application number: CN201911411903.8A
Authority: CN
Inventors: 郭玉堃; 于朋伟; 郭豫杰; 曾磊; 杨国宇
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-05-19

Abstract

本发明公开了A型FMDV 1D蛋白‑铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。本发明将含有A型FMDV优势表位与铁蛋白片段的核苷酸序列串联，设计并合成了A型FMDV 1D蛋白表位‑铁蛋白片段；然后与促溶标签和亲和标签EW29相连，得到EW29/促溶标签/A型FMDV 1D蛋白表位‑铁蛋白片段，诱导、亲和纯化后即得A型FMDV 1D蛋白‑铁蛋白融合蛋白。电镜结果显示，该融合蛋白形成了20～25 nm的蛋白笼纳米颗粒。本发明为进一步研制安全、有效的A型FMDV 1D蛋白疫苗奠定了基础。

Description

A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

通过DNA重组技术，融合蛋白已经很容易在原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（酵母和哺乳动物细胞）进行高效表达，其产物在生物和医学上得到了广泛应用，也促进了其快速发展。与真核表达系统相比，大肠杆菌由于易操作、廉价和产量高等优点，仍然是目前生产重组蛋白的主要宿主。但是，当大肠杆菌细菌系统表达重组蛋白时，有许多本身难以克服的缺点：1、重组蛋白往往以无活性的包涵体形式出现；2、缺乏真核细胞翻译后修饰（糖基化、磷酸化和乙酰化等）机制，得到的重组蛋白虽然在一级氨基酸序列正确，但在高级结构和构象上与天然蛋白相差较大，无活性或活性极差；3、宿主细胞（大肠杆菌）自身蛋白成为热原，难以除去，存在安全性，这些问题限制了原核表达的重组蛋白在实际中的进一步应用。鉴于此，选择更有效的亲和促溶性标签以期获得纯度高、可溶性好，活性强的重组蛋白至关重要。

来自蚯蚓（Lumbricus terrestris）半乳糖结合凝集素EW29 C-末端的半乳糖结合结构域，其分子量为14.5kDa，可以和亲和层析的常用介质琼脂糖的半乳糖残基可逆结合，是一个高效的亲和标签。同时，EW29蛋白本身有很好的可溶性，和其它外源蛋白融合表达时，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性（Yabe R, Suzuki R, Kuno A, Fujimoto Z,Jigami Y and Hirabayashi J (2007) Tailoring a novel sialic acidbinding lectinfrom a ricin-B chain-like galactosebinding protein by natural evolution-mimicry. J Biochem 141, 389–399.）。

铁蛋白(Ferritin)几乎存在于藻类、细菌、高等植物和动物等所有生物体，是生物体生命所必需的。蛋白壳是由24个亚基以高度对称性方式组成的内空心结构，空心直径约为8nm，外直径约为12nm。研究发现铁蛋白在体外可以自组装，形成套袖样的蛋白笼纳米颗粒；同时，铁蛋白纳米笼可以将外源小分子蛋白装入其纳米笼内，从而有效降低小分子抗原的降解，提高抗原的有效浓度，还可以有效协助靶细胞对相应抗原的摄取、加工，显著增强抗原蛋白的抗原稳定性和免疫原性。因此，铁蛋白独特的结构及理化性质使其可以作为一种新型的抗原递呈纳米运送平台。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由 FMD 疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，FMDV 属于微 RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，病毒基因组为单股正链 RNA，全长约为 8.5 kb，四种结构蛋白 VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1B）和VP1（1D）与 FMDV RNA 组装成为成熟的病毒粒子。FMDV 根据血清型特点的不同，可以分为A 型、O 型、C 型、南非 I 型、南非 II 型、南非 III 型和亚洲 I 型七个血清型。研究表明，各型 FMDV 的 VP1 （1D）参与组成病毒的主要中和抗原位点，尤其是 VP1 的 140～160和 200～213 氨基酸残基。

亚单位疫苗因其操作简单，价格低廉，可区分病毒感染与疫苗免疫，在动物疫苗的研发和应用越来越受到重视。通过表达高免疫原性的口蹄疫结构蛋白作为疫苗也引起学者的注意。很多表达系统已经被用于表达FMDV 1D蛋白，但大都存在可溶性差，免疫原性弱、外壳蛋白组装效率不高以及成本高等缺点，导致口蹄疫疫苗仍以灭活苗为主。

为了解决可溶性差和抗原免疫原性弱等难题，有研究者也尝试换用表达系统，通过酵母或杆状病毒表达系统表达可溶性好，免疫原性强的口蹄疫亚单位疫苗，也有学者通过将口蹄疫结构蛋白上的优势中和表位串联表达，或者嵌合到适宜蛋白的外表面，通过增加蛋白分子量、争取折叠以及某些蛋白在体外自组装而将表位展示在病毒颗粒外表面，从而提高抗原的稳定性和免疫原性（梁特, 杨德成, 刘蒙蒙, et al. O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达 [J]. 中国预防兽医学报, 2013, 35(3): 185-8.徐义兵. FMDVP1-2A、3C蛋白在毕赤酵母中的共表达及免疫原性研究 [D]; 华南农业大学, 2012.）。但目前均没有获得既能提高融合蛋白的可溶性又能提高抗原免疫原性的良好方案。

发明内容

本发明利用半乳糖结合凝集素EW29作为亲和标签，并在促溶标签的作用下，高效可溶性表达和纯化A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，该融合蛋白经过自组装可形成蛋白笼纳米颗粒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，包括亲和标签、促溶标签、A型FMDV 1D蛋白表位和铁蛋白片段，所述促溶标签位于亲和标签的C端，所述A型FMDV 1D蛋白表位位于促溶标签的C端，所述铁蛋白片段位于A型FMDV 1D蛋白表位的C端，亲和标签为EW29标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，促溶标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～9所示；该A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封A型FMDV 1D蛋白的蛋白笼纳米颗粒。

优选的，所述A型FMDV 1D蛋白表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

优选的，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，表达所述促溶标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～20所示。

优选的，表达所述A型FMDV 1D蛋白表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

本发明第二方面提供A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。

本发明第三方面提供上述蛋白笼纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将A型FMDV 1D蛋白的核苷酸序列和铁蛋白片段串联，合成A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段；

步骤2：将A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段与促溶标签相连，得到促溶标签/A型FMDV1D蛋白表位-铁蛋白片段，再将半乳糖结合凝集素EW29作为亲和标签与促溶标签/A型FMDV1D蛋白表位-铁蛋白片段进行串联，形成重组序列，将重组序列连接至表达载体，构建重组载体；

步骤3：将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过诱导表达和亲和层析纯化，得到目的蛋白A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白；纯化的目的蛋白进行自组装形成蛋白笼纳米颗粒。

本发明第四方面提供一种重组载体，所述的重组表达载体包含有如上述任一项所述的核苷酸序列。

本发明第五方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述的重组载体。

本发明第六方面，提供上述的A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、上述的A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒、上述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法在制备FMD 1D蛋白疫苗中的应用。

现有研究表明，半乳糖结合凝集素EW29 作为一种促溶、亲和标签，可以替代常用的His亲和标签和促溶标签二者的功能，用于原核表达系统（大肠杆菌）融合蛋白的可溶性表达和纯化。然而本发明在将表达半乳糖结合凝集素EW29标签-A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段的重组表达载体转入大肠杆菌后，得到的均为包涵体表达，EW29 标签并不能作为促溶标签促进A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段的溶解。为得到高可溶性表达的、有生物学活性的A型FMDV 1D蛋白，本发明将促溶标签与EW29标签-A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段连接构建融合蛋白。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明将EW29标签-A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段与促溶标签连接，得到了高可溶性表达的、有生物学活性的A型FMDV 1D蛋白；同时，琼脂糖可逆结合的EW29蛋白的引入，为后期蛋白纯化提供便利，具体表现在EW29蛋白可以和琼脂糖可逆结合，为亲和层析纯化目的蛋白奠定了基础，规避了常规His亲和标签纯化过程中咪唑溶液含有毒性作用的影响，本发明在含有5mM乳糖的缓冲液条件下通过洗脱得到了高纯度的特异性目的蛋白。铁蛋白的引入，使得目的蛋白可以自组装成铁纳米笼，提高了目的蛋白的稳定性和高免疫原性。通过透射电镜检测，目的蛋白形成了颗粒均一、20～25nm的铁蛋白纳米颗粒。通过Westernblot检测，A型口蹄疫高免血清可以和重组蛋白特异性结合，说明目的蛋白正确表达，且具有良好的免疫原性。

2、本发明的促溶标签如除PpiB外均促进了融合蛋白表达量。其中MBP标签不仅能显著提高表达量，又能促进其可溶性表达。

3、本发明构建的重组表达载体可使重组蛋白在E.coli中大量且廉价表达，便于分离纯化，避免了对包涵体变性复性处理，为纯化保持目的蛋白A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白的活性提供保证。

附图说明

图1 为本发明实施例1的重组表达载体EW29亲和促溶标签和目的基因构建示意图。

图2为本发明实施例1的质粒的BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切图。图2A中的1泳道为pET21b/EW29/AfFtn通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切获得pET21b/EW29载体片段；图2B的2泳道为质粒pUC57/CcFnt166AS通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到CcFnt166AS片段。M为DL 5000。

图3泳道2为本发明实施例1的重组质粒pET21b/EW29/CcFnt166AS通过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定图。M为DL5000。

图4为本发明实施例1的重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达在不同pH条件下可溶性SDS-PAGE分析图。M. Prestained Protein Marker I；A：1.诱导前全菌；2.pH6.0破碎后总蛋白；3. pH6.0破碎后上清；4. pH6.0破碎后沉淀；5.pH7.0破碎后总蛋白；6. pH7.0破碎后上清；7. pH7.0破碎后沉淀。B：1.诱导前全菌；2.pH8.0破碎后总蛋白；3. pH8.0破碎后上清；4. pH8.0破碎后沉淀；5.pH9.0破碎后总蛋白；6. pH9.0破碎后上清；7. pH9.0破碎后沉淀；8.pH10.0破碎后总蛋白；9. pH10.0破碎后上清；10. pH10.0破碎后沉淀。C：1.诱导前全菌；2.pH11.0破碎后总蛋白；3. pH11.0破碎后上清；4. pH11.0破碎后沉淀；5.pH12.0破碎后总蛋白；6. pH12.0破碎后上清；7. pH12.0破碎后沉淀；8.pH13.0破碎后总蛋白；9.pH13.0破碎后上清；10. pH13.0破碎后沉淀。

图5 为本发明实施例2的重组表达载体EW29亲和促溶标签、促溶标签与目的基因构建示意图。

图6为本发明实施例2的质粒的NheⅠ和 XhoⅠ双酶切图。图6A中的1泳道为pET21b/EW29/AfFtn通过NheⅠ和XhoⅠ双酶切；图6B的1～8泳道为重组质粒pET21b/His/Grifin（GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB/CcFnt166AS通过NheⅠ和XhoⅠ双酶切。M为DL 5000。

图7为本发明实施例2的重组质粒pET21b/EW29/Grifin（GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB）/CcFnt166AS通过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定图。M为DL5000。

图8为本发明实施例2的重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达SDS-PAGE分析图。M. Prestained Protein Marker I；1.诱导前全菌；2.诱导后全菌；3.破碎后总蛋白；4.破碎后上清；5.破碎后沉淀。A.pET21b/EW29/Grifin/CcFnt166AS、B.pET21b/EW29/GST/CcFnt166AS、C.pET21b/EW29/MBP/CcFnt166AS、D.pET21b/EW29/Sumo/CcFnt166AS、E.pET21b/EW29/Thioredoxin/CcFnt166AS、F.pET21b/EW29/γ-crystallin/CcFnt166AS、G.pET21b/EW29/ArsC/CcFnt166AS、H.pET21b/EW29/PpiB/CcFnt166AS.

图9为本发明实施例2的重组蛋白pET21b/EW29/MBP/CcFnt166AS纯化SDS-PAGE分析和Western鉴定图。A. M. Prestained Protein Marker I；1.诱导前全菌；2.诱导后全菌；3.破碎后上清；4.破碎后沉淀；5.滤液；6.洗杂5 mM乳糖；7.洗杂10 mM乳糖；8.洗杂20 mM乳糖；9.洗杂50 mM乳糖；10.洗杂100 mM乳糖；11.洗杂200 mM乳糖；12.洗杂500 mM乳糖；B.M. Prestained Protein Marker I；泳道2.纯化后的CcFnt166AS重组蛋白。

图10为本发明实施例2的透射电子显微镜观察铁蛋白纳米颗粒物理表征图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。

实施例1

1、材料和方法

带有EW29基因的表达载体pET-21b/EW29/AfFtn（EW29在pET-21b的插入位点为NdeⅠ和NheⅠ之间，AfFtn在pET-21b的插入位点为BamHⅠ和XhoⅠ之间）为河南农业大学动物生化与营养重点开放实验室保存。

带有A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白融合蛋白的的载体PUC57-CcFnt166AS（CcFnt166AS在PUC57的插入位点为BamHI和XhoI之间）由南京金斯瑞构建合成。CcFnt166AS表示A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段。A型FMDV 1D蛋白表位是根据FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白的氨基酸，对其表位进行大肠杆菌表达密码子优化得到的序列，该氨基酸如SEQ ID NO.10所示，表达该A型FMDV 1D蛋白表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。所述的铁蛋白片段是从肠弯曲杆菌(Campylobacter coli) 中分离得到的铁蛋白基因片段，该基因片段如SEQ ID NO.22所示，该基因片段表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。EW29标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达该EW29标签的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。

T4 DNA 连接酶、限制性内切酶NdeⅠ、BamHI和XhoⅠ均购自英国 NEB公司；DNA分子质量标准DL 5000购自TaKaRa公司；Prestained Protein MarkerⅠ购自上海鼎国生物技术有限公司；质粒小量快速提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.1、原核表达载体的构建及鉴定

带有A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白融合蛋白的载体PUC57- CcFnt 166AS用BamHI和XhoI双酶切，获得CcFnt165AS目的片段，然后与BamHI和XhoI双酶切的pET-21b/EW29/AfFtn载体在T4连接酶进行连接，得到如图1所示的重组载体。将重组载体转化至E.coliDH5α，涂布于含氨苄青霉素(Amp 100 mg/L)的Luria-Bertanil( LB)固态培养基，37℃培养，挑选阳性克隆，经NdeI-XhoI双酶切验证后（见图3泳道2），送往上海生工生物工程有限公司测序鉴定，测序正确的重组质粒分别命名为：pET21b/EW29/ /CcFnt165AS。

1.2、重组蛋白的诱导表达及可溶性鉴定

将测序正确的重组质粒转化至E.coliBL21 (DE3)感受态细胞。在含氨苄青霉素100mg/L 的LB固态培养基上挑取含重组质粒的单个菌落，接种于含100 mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜。将得到的菌液按体积比1:100 接种于含100mg/L氨苄青霉素的 100 ml LB液体培养基中，37 ℃、220r/min振荡培养至对数中期( OD ₆₀₀达0. 6～0. 8)进行诱导表达，SDS-PAGE检测蛋白的表达。实验选定诱导剂IPTG诱导终浓度为0.5mmol/L，25 ℃、140 r/min 诱导表达6 h为最佳诱导表达条件。次日诱导结束后，吸取1 ml菌液，离心去上清，加PBS重悬，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10 min。剩余的菌液离心收集沉淀，10 ml不同pH值的Binding Buffer(pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0、pH12.0、pH13.0)重悬菌体，加溶菌酶(1 g/L) 冰浴30 min后，低温超声波破碎菌体(超声时间5 s，间歇10s，120次)。分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，检测重组蛋白在不同pH值条件下的可溶性表达效果。

SDS-PAGE检测结果显示，诱导后的全菌和上清样品在58.52kDa处有与预期大小一致的蛋白条带，如图4A～4C，图4A～4C分别表示重组质粒pET21b/EW29/ CcFnt165AS在pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0、pH12.0、pH13.0的表达结果。结果表明，除pH13.0条件下的重组蛋白外，其他pH条件下重组蛋白均为包涵体。但pH13.0为极碱性条件，该条件下重组蛋白已经变性，不能保持融合蛋白的活性，无法用于制备O型FMDV衣壳蛋白疫苗。

实施例2

1、材料和方法

8种带有促溶标签及含有目的基因（FMDV表位+铁蛋白序列）的重组质粒pET21b-His₆-Grifin/GST/MBP/Sumo/Thioredoxin/γ-crystallin/ArsC/PpiB - CcFnt166AS (简称为pET21b1-pET21b8)、以及带有EW29基因的表达载体pET-21b/EW29/AfFtn（EW29在pET-21b的插入位点为NdeⅠ和NheⅠ之间，AfFtn在pET-21b的插入位点为BamHⅠ和XhoⅠ之间）为河南农业大学动物生化与营养重点开放实验室保存。

pET21b1-pET21b8构建过程参考文献（郭玉堃, 明胜利, 郭婉莹, et al. A型口蹄疫病毒1D蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及电子显微镜检测[J]. 解剖学报(06):97-102.），其中CcFnt166AS表示A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段。A型FMDV 1D蛋白表位是根据FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白的氨基酸，对其表位进行大肠杆菌表达密码子优化得到的序列，该氨基酸如SEQ ID NO.10所示，表达该A型FMDV 1D蛋白表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。所述的铁蛋白片段是从肠弯曲杆菌(Campylobacter coli) 中分离得到的铁蛋白基因片段，该基因片段如SEQ ID NO.22所示，该基因片段表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。EW29标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达该EW29标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。促溶标签Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC和PpiB的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2～9所示，表达促溶标签Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC和PpiB的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.13～20所示。

T4 DNA 连接酶、限制性内切酶NdeⅠ、NheⅠ和XhoⅠ均购自英国 NEB公司；DNA分子质量标准DL 5000购自TaKaRa公司；Prestained Protein MarkerⅠ购自上海鼎国生物技术有限公司；质粒小量快速提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.1、原核表达载体的构建及鉴定

8种带有促溶标签及含有目的基因的重组质粒pET21b1-pET21b8分别用NheⅠ和 XhoⅠ双酶切，获得Grifin-CcFnt166AS(1 731 bp)、GST-CcFnt166AS(1 968 bp)、MBP-CcFnt166AS(2 418 bp)、Sumo-CcFnt166AS(1 614 bp)、Thioredoxin-CcFnt166AS(1 641 bp)、γ-crystallinCcFnt166AS(1 847 bp)、ArsC-CcFnt166AS(1 737 bp)、PpiB-CcFnt166AS(1806 bp)等8种促溶标签-CcFnt166AS目的片段，分别与NheⅠ和 XhoⅠ双酶切的pET-21b/EW29/AfFtn载体在T4连接酶进行连接，得到如图5所示的重组载体，转化至E.coli DH5α，涂布于含氨苄青霉素(Amp 100 mg/L)的Luria-Bertanil( LB)固态培养基，37℃培养，挑选阳性克隆，经NdeI和XhoI双酶切验证后，送往上海生工生物工程有限公司测序鉴定，测序正确的重组质粒分别命名为：pET21b/EW29/Grifin（GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB)/CcFnt166AS。

其中，pET21b/EW29/AfFtn通过NheⅠ和XhoⅠ双酶切得到pET21b/EW29载体，如图6A所示，8种重组质粒pET21b/His/Grifin（GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB）/CcFnt166AS通过NheⅠ和XhoⅠ双酶切分别切出Grifin-CcFnt166AS、GST-CcFnt166AS、MBP-CcFnt166AS、Sumo-CcFnt166AS、Thioredoxin-CcFnt166AS、γ-crystallin-CcFnt166AS、ArsC-CcFnt166AS、PpiB-CcFnt166AS，如图6B所示。pET21b//EW29/Grifin（GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB）/CcFnt166AS通过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切分别切出2 145 bp、2 382 bp、2 832 bp、2 028 bp、2 055 bp、2 262bp、2 151 bp、2 220 bp，表明重组载体构建成功，如图7所示；测序也说明重组载体构建成功。

1.2、重组蛋白的诱导表达及可溶性鉴定

将测序正确的重组质粒转化至E.coliBL21 (DE3)感受态细胞。在含氨苄青霉素100mg/L 的LB固态培养基上挑取含重组质粒的单个菌落，接种于含100 mg/L的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜。将得到的菌液按体积比1∶100 接种于含100mg/L氨苄青霉素的 100 ml LB液体培养基中，37 ℃、220r/min振荡培养至对数中期( OD ₆₀₀达0. 6～0. 8)进行诱导表达，SDS-PAGE检测蛋白的表达。实验对不同浓度梯度的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactiside，IPTG) (0.5、1.0 mmol/L)，诱导时间（4h、6h）和诱导温度（25℃、37℃）进行优化组合，最终选定诱导剂IPTG诱导终浓度为0.5 mmol/L，25 ℃、140 r/min 诱导表达6 h为最佳诱导表达条件。次日诱导结束后，吸取1 ml菌液，离心去上清，加PBS重悬，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10 min。剩余的菌液离心收集沉淀，10 ml PBS重悬菌体，加溶菌酶(1 g/L) 冰浴30 min后，低温超声波破碎菌体(超声时间5 s，间歇10s，120次)。分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，检测重组蛋白的表达。

SDS-PAGE检测结果显示，除带有促溶标签PpiB的重组质粒菌株外，诱导后的全菌和上清样品在78.65、87.34、103.84、74.36、75.35、82.94、78.87kDa处均有与预期大小一致的蛋白条带，如图8A～8H所示。图8A～8H分别表示重组质粒pET21b/EW29/Grifin（GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB）/CcFnt166AS的诱导表达结果。结果显示只有标签MBP明显提高了重组蛋白的可溶性水平，且有很高的表达量。

1.3、重组蛋白亲和纯化和Western鉴定

综合分析8种不同融合蛋白的表达量以及可溶性，选择可溶性好、表达量高的含有pET21b/EW29/ MBP/ CcFnt166AS的大肠杆菌作为后续表达工程菌株。

重组蛋白亲和纯化：以IPTG诱导终浓度为0.5 mmol/L，25 ℃、140 r/min 诱导筛选的菌株进行诱导表达，诱导6 h后收集菌体，在低温下进行超声破碎。破碎后低温离心30min，取100 μL上清制备SDS-PAGE电泳样品。剩余的上清液加到预处理好的琼脂糖介质中，4℃ 200r/min结合3 h，将上清-琼脂糖介质混合物用5倍体积的Tris-HCl（pH=8.0）洗3次，洗去非特异性杂带，然后用含有不同浓度的乳糖（5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM和500mM）Tris-HCl洗脱靶蛋白，收集不同浓度的洗脱液。吸取100 μL每个浓度的洗脱液，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10 min，-20℃保存。得到的蛋白通过透析去除乳糖。

EW29蛋白C-末端的半乳糖结合结构域，可以和亲和层析介质琼脂糖的半乳糖残基可逆结合，在一定浓度的乳糖下，可以洗脱含EW29的目的蛋白。分别用含5，10，20，50，100，200，500 mmol/L乳糖的缓冲液梯度洗脱，收集各自洗脱液，用SDS-PAGE电泳检测纯化效果如图9A。结果显示，在含5 mmol/L乳糖的缓冲液洗脱下，目的蛋白可以被特异性的洗脱出来。

通过Western blot鉴定重组蛋白：根据PAGE胶大小，剪取大小合适的PVDF膜浸于甲醇溶液中活化1 min，将电泳好的PAGE胶和吸水滤纸用转膜缓冲液浸润，依次将滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸按由下到上的顺序置于转膜仪上，保证每层之间无气泡存在，在15 V恒压下电转50 min，电转移完成后，取下PVDF膜，侵入5%脱脂奶溶液中，37℃摇床中温浴封闭2 h，封闭结束后，加入1:1000稀释的豚鼠抗FMDV高免血清，37℃结合1 h，用PBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，然后将PVDF膜置于1:5000倍稀释的兔抗豚鼠IgG-HRP；37℃反应40min，再次洗涤3次后，使用AEC液显色，观察显色情况，等出现明显条带时，立即加入单蒸水终止显色，照相保存。

Western blot结果如图9B泳道2，结果表明，目的蛋白可被豚鼠抗FMDV高免血清识别，并特异性结合，说明重组表达蛋白具有较好的抗原性。

1.4、铁蛋白纳米笼的形成及物理表征（电镜检测）

为了进一步分析重组蛋白EW29/ MBP/ CcFnt166AS是否形成了纳米颗粒以及颗粒是否均一，对重组蛋白分别进行了透射电镜（TEM）物理表征。使用透射电镜观察铁蛋白纳米笼形成情况：取10µL浓缩后的纯化蛋白滴到铜网上，静置10min，用滤纸从铜网的一边吸取液体；然后再滴加10µL 1%磷钨酸染色液，静置2min，再用滤纸从铜网的一边吸取染色液；用镊子夹取铜网放入玻璃平皿中，让铜网上的液体自然晾干；将制备好的铜网固定在样品握持杆的样品台上，插入到样品室内，抽真空后，在观察窗找到合适的视野，进行观察和分析纯化的融合蛋白是否形成纳米颗粒。

图10表明，重组蛋白EW29/ MBP/ CcFnt166AS形成了20～25 nm蛋白笼纳米颗粒。

本实施例成功构建八种pET21b-EW29-亲和标签-CcFnt166AS原核表达载体，并建立活性CcFnt166AS重组蛋白制备的方法，电镜结果显示EW29/ MBP/ CcFnt166AS形成了蛋白笼纳米颗粒。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

<130> 无

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 138

<212> PRT

<213> Lumbricus terrestris

<400> 1

His Met Lys Tyr Tyr Lys Pro Lys Phe Phe Tyr Ile Lys Ser Glu Leu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Val Leu Asp Ile Glu Gly Gln Asn Pro Ala Pro Gly Ser

20 25 30

Lys Ile Ile Thr Trp Asp Gln Lys Lys Gly Pro Thr Ala Val Asn Gln

35 40 45

Leu Trp Tyr Thr Asp Gln Gln Gly Val Ile Arg Ser Lys Leu Asn Asp

50 55 60

Phe Ala Ile Asp Ala Ser His Glu Gln Ile Glu Thr Gln Pro Phe Asp

65 70 75 80

Pro Asn Asn Pro Lys Arg Ala Trp Ile Val Ser Gly Asn Thr Ile Ala

85 90 95

Gln Leu Ser Asp Arg Asp Ile Val Leu Asp Ile Ile Lys Ser Asp Lys

100 105 110

Glu Ala Gly Ala His Ile Cys Ala Trp Lys Gln His Gly Gly Pro Asn

115 120 125

Gln Lys Phe Ile Ile Glu Ser Glu Ala Ser

130 135

<210> 2

<211> 183

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Thr Leu Arg Phe Glu Ala Ser Cys Pro Asp Gly Leu Cys Pro Gly

35 40 45

Trp Ser Val Ile Leu Lys Gly Glu Thr Pro Pro Glu Ala Ser Lys Phe

50 55 60

Glu Ile Asn Phe Leu Cys Asp Arg Asp Asp Arg Val Ala Phe His Phe

65 70 75 80

Asn Pro Arg Phe Thr Glu Ser Asp Ile Ile Cys Asn Ser Tyr Met Ala

85 90 95

Asn Arg Trp Gly Gln Glu Glu Arg Cys Asn His Phe Pro Leu Gly Val

100 105 110

Glu Glu Pro Phe Gln Ile Glu Ile Tyr Ser Asp Asn Asp His Phe His

115 120 125

Val Tyr Ile Asp Lys Ala Lys Val Met Gln Tyr Lys His Arg Val Glu

130 135 140

Asp Leu Lys Thr Ile Thr Lys Leu Gln Val Val Asn Asp Val Lys Ile

145 150 155 160

Ser Ser Leu Glu Ile Thr Lys Lys Leu Phe Tyr Gly Ile Glu Glu Asn

165 170 175

Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

180

<210> 3

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

35 40 45

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

50 55 60

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

65 70 75 80

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

85 90 95

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

100 105 110

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

115 120 125

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

130 135 140

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

145 150 155 160

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

165 170 175

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

180 185 190

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

195 200 205

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

210 215 220

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Gly Ile Glu Glu Asn Leu

245 250 255

Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

260

<210> 4

<211> 412

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

35 40 45

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

50 55 60

Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

65 70 75 80

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

85 90 95

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

100 105 110

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

115 120 125

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

130 135 140

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

145 150 155 160

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

165 170 175

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

180 185 190

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

195 200 205

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

210 215 220

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

225 230 235 240

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

245 250 255

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

260 265 270

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

275 280 285

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

290 295 300

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

305 310 315 320

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

325 330 335

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

340 345 350

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

355 360 365

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

370 375 380

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

385 390 395 400

Gly Ile Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

405 410

<210> 5

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu

35 40 45

Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser

50 55 60

Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu

65 70 75 80

Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp

85 90 95

Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr

100 105 110

Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg

115 120 125

Glu Gln Ile Gly Gly Ile Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

130 135 140

<210> 6

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

35 40 45

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

50 55 60

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

65 70 75 80

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

85 90 95

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

100 105 110

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

115 120 125

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ile Glu

130 135 140

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

145 150

<210> 7

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Ser Lys Thr Gly Thr Lys Ile Thr Phe Tyr Glu Asp Lys Asn Phe

35 40 45

Gln Gly Arg Arg Tyr Asp Cys Asp Cys Asp Cys Ala Asp Phe His Thr

50 55 60

Tyr Leu Ser Arg Cys Asn Ser Ile Lys Val Glu Gly Gly Thr Trp Ala

65 70 75 80

Val Tyr Glu Arg Pro Asn Phe Ala Gly Tyr Met Tyr Ile Leu Pro Gln

85 90 95

Gly Glu Tyr Pro Glu Tyr Gln Arg Trp Met Gly Leu Asn Asp Arg Leu

100 105 110

Ser Ser Cys Arg Ala Val His Leu Pro Ser Gly Gly Gln Tyr Lys Ile

115 120 125

Gln Ile Phe Glu Lys Gly Asp Phe Ser Gly Gln Met Tyr Glu Thr Thr

130 135 140

Glu Asp Cys Pro Ser Ile Met Glu Gln Phe His Met Arg Glu Ile His

145 150 155 160

Ser Cys Lys Val Leu Glu Gly Val Trp Ile Phe Tyr Glu Leu Pro Asn

165 170 175

Tyr Arg Gly Arg Gln Tyr Leu Leu Asp Lys Lys Glu Tyr Arg Lys Pro

180 185 190

Ile Asp Trp Gly Ala Ala Ser Pro Ala Val Gln Ser Phe Arg Arg Ile

195 200 205

Val Glu Gly Ile Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

210 215 220

<210> 8

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Ser Asn Ile Thr Ile Tyr His Asn Pro Ala Cys Gly Thr Ser Arg

35 40 45

Asn Thr Leu Glu Met Ile Arg Asn Ser Gly Thr Glu Pro Thr Ile Ile

50 55 60

His Tyr Leu Glu Thr Pro Pro Thr Arg Asp Glu Leu Val Lys Leu Ile

65 70 75 80

Ala Asp Met Gly Ile Ser Val Arg Ala Leu Leu Arg Lys Asn Val Glu

85 90 95

Pro Tyr Glu Glu Leu Gly Leu Ala Glu Asp Lys Phe Thr Asp Asp Arg

100 105 110

Leu Ile Asp Phe Met Leu Gln His Pro Ile Leu Ile Asn Arg Pro Ile

115 120 125

Val Val Thr Pro Leu Gly Thr Arg Leu Cys Arg Pro Ser Glu Val Val

130 135 140

Leu Glu Ile Leu Pro Asp Ala Gln Lys Gly Ala Phe Ser Lys Glu Asp

145 150 155 160

Gly Glu Lys Val Val Asp Glu Ala Gly Lys Arg Leu Lys Gly Ile Glu

165 170 175

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

180 185

<210> 9

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

His Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Asp Ser Ala Arg Gly Phe Lys Lys

1 5 10 15

Pro Gly Lys Arg Ala Ser Ser His His His His His His Gly Ser Ser

20 25 30

Met Val Thr Phe His Thr Asn His Gly Asp Ile Val Ile Lys Thr Phe

35 40 45

Asp Asp Lys Ala Pro Glu Thr Val Lys Asn Phe Leu Asp Tyr Cys Arg

50 55 60

Glu Gly Phe Tyr Asn Asn Thr Ile Phe His Arg Val Ile Asn Gly Phe

65 70 75 80

Met Ile Gln Gly Gly Gly Phe Glu Pro Gly Met Lys Gln Lys Ala Thr

85 90 95

Lys Glu Pro Ile Lys Asn Glu Ala Asn Asn Gly Leu Lys Asn Thr Arg

100 105 110

Gly Thr Leu Ala Met Ala Arg Thr Gln Ala Pro His Ser Ala Thr Ala

115 120 125

Gln Phe Phe Ile Asn Val Val Asp Asn Asp Phe Leu Asn Phe Ser Gly

130 135 140

Glu Ser Leu Gln Gly Trp Gly Tyr Cys Val Phe Ala Glu Val Val Asp

145 150 155 160

Gly Met Asp Val Val Asp Lys Ile Lys Gly Val Ala Thr Gly Arg Ser

165 170 175

Gly Met His Gln Asp Val Pro Lys Glu Asp Val Ile Ile Glu Ser Val

180 185 190

Thr Val Ser Glu Gly Ile Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Ser

195 200 205

<210> 10

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

Gly Ser Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr

1 5 10 15

Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Tyr His Thr

20 25 30

Asp Val Gly Phe Leu Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Gly

35 40 45

Pro Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val

50 55 60

Gly Ala Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile

65 70 75 80

Val Val Asn His Thr Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro

85 90 95

Glu Ala Ala Leu Gln Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala

100 105 110

Pro Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu

115 120 125

Ala Thr Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg

130 135 140

Arg Gly Asp Ser Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro

145 150 155 160

Ala Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Glu Ile Arg Glu Leu

165 170 175

Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

180 185 190

Ala Val Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala

195 200 205

Pro Ala Lys Gln Leu Leu Glu Leu

210 215

<210> 11

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

Glu Leu Gly Arg Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Lys Ala Phe Leu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Lys Lys Val Val Asp Leu Leu Asn Glu Gln Ile Asn Lys

20 25 30

Glu Met Tyr Ala Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr

35 40 45

Glu Asn Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Gln His Ala Ser

50 55 60

Glu Glu Ser Glu His Ala Arg Lys Leu Ile Thr Tyr Leu Asn Glu Thr

65 70 75 80

Asp Ser His Val Glu Leu Lys Glu Val Lys Gln Pro Glu Gln Asn Phe

85 90 95

Lys Ser Leu Leu Asp Val Phe Glu Lys Thr Tyr Glu His Glu Gln Ser

100 105 110

Ile Thr Lys Ser Ile Asn Asp Leu Val Glu His Met Leu Gly Asn Lys

115 120 125

Asp Tyr Ser Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ser Glu Gln His

130 135 140

Glu Glu Glu Ala Leu Phe Arg Gly Ile Val Asp Lys Ile Lys Leu Ile

145 150 155 160

Ser Asp Asn Gly Asn Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Ile Lys Asn

165 170 175

Leu Ala Leu Ser Lys Lys

180

<210> 12

<211> 414

<212> DNA

<213> Lumbricus terrestris

<400> 12

catatgaaat attataaacc gaagttcttt tacatcaaga gcgagctgaa cggtaaagtg 60

ctggacattg agggtcagaa cccggcgccg ggcagcaaga tcattacctg ggaccagaag 120

aaaggtccga ccgcggtgaa ccaactgtgg tataccgatc agcaaggcgt tatccgtagc 180

aaactgaacg acttcgcgat cgatgcgagc cacgagcaga ttgaaaccca accgtttgat 240

ccgaacaacc cgaagcgtgc gtggatcgtg agcggtaaca ccattgcgca gctgagcgac 300

cgtgatatcg ttctggacat cattaagagc gataaagagg cgggcgcgca catttgcgcg 360

tggaagcagc atggtggccc gaaccaaaaa ttcatcattg agagcgaagc tagc 414

<210> 13

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatga ccctgcgttt cgaagcttct 120

tgcccggacg gtctgtgccc gggttggtct gttatcctga aaggtgaaac cccgccggaa 180

gcttctaaat tcgaaatcaa cttcctgtgc gaccgtgacg accgtgttgc tttccacttc 240

aacccgcgtt tcaccgaatc tgacatcatc tgcaactctt acatggctaa ccgttggggt 300

caggaagaac gttgcaacca cttcccgctg ggtgttgaag aaccgttcca gatcgaaatc 360

tactctgaca acgaccactt ccacgtttac atcgacaaag ctaaagttat gcagtacaaa 420

caccgtgttg aagacctgaa aaccatcacc aaactgcagg ttgttaacga cgttaaaatc 480

tcttctctgg aaatcaccaa aaaactgttc tacgggatcg aggaaaacct gtacttccaa 540

tccggatcc 549

<210> 14

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatgt cccctatact aggttattgg 120

aaaattaagg gccttgtgca acccactcga cttcttttgg aatatcttga agaaaaatat 180

gaagagcatt tgtatgagcg cgatgaaggt gataaatggc gaaacaaaaa gtttgaattg 240

ggtttggagt ttcccaatct tccttattat attgatggtg atgttaaatt aacacagtct 300

atggccatca tacgttatat agctgacaag cacaacatgt tgggtggttg tccaaaagag 360

cgtgcagaga tttcaatgct tgaaggagcg gttttggata ttagatacgg tgtttcgaga 420

attgcatata gtaaagactt tgaaactctc aaagttgatt ttcttagcaa gctacctgaa 480

atgctgaaaa tgttcgaaga tcgtttatgt cataaaacat atttaaatgg tgatcatgta 540

acccatcctg acttcatgtt gtatgacgct cttgatgttg ttttatacat ggacccaatg 600

tgcctggatg cgttcccaaa attagtttgt tttaaaaaac gtattgaagc tatcccacaa 660

attgataagt acttgaaatc cagcaagtat atagcatggc ctttgcaggg ctggcaagcc 720

acgtttggtg gtggcgacca tcctccaaaa gggatcgagg aaaacctgta cttccaatcc 780

ggatcc 786

<210> 15

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 15

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatga aaatcgaaga aggtaaactg 120

gtaatctgga ttaacggcga taaaggctat aacggtctcg ctgaagtcgg taagaaattc 180

gagaaagata ccggaattaa agtcaccgtt gagcatccgg ataaactgga agagaaattc 240

ccacaggttg cggcaactgg cgatggccct gacattatct tctgggcaca cgaccgcttt 300

ggtggctacg ctcaatctgg cctgttggct gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac 360

aagctgtatc cgtttacctg ggatgccgta cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg 420

atcgctgttg aagcgttatc gctgatttat aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa 480

acctgggaag agatcccggc gctggataaa gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg 540

atgttcaacc tgcaagaacc gtacttcacc tggccgctga ttgctgctga cgggggttat 600

gcgttcaagt atgaaaacgg caagtacgac attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc 660

gcgaaagcgg gtctgacctt cctggttgac ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac 720

accgattact ccatcgcaga agctgccttt aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac 780

ggcccgtggg catggtccaa catcgacacc agcaaagtga attatggtgt aacggtactg 840

ccgaccttca agggtcaacc atccaaaccg ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac 900

gccgccagtc cgaacaaaga gctggcaaaa gagttcctcg aaaactatct gctgactgat 960

gaaggtctgg aagcggttaa taaagacaaa ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac 1020

gaggaagagt tggcgaaaga tccacgtatt gccgccacta tggaaaacgc ccagaaaggt 1080

gaaatcatgc cgaacatccc gcagatgtcc gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg 1140

atcaacgccg ccagcggtcg tcagactgtc gatgaagccc tgaaagacgc gcagactaat 1200

gggatcgagg aaaacctgta cttccaatcc ggatcc 1236

<210> 16

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 16

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatgg ctagcatgtc ggactcagaa 120

gtcaatcaag aagctaagcc agaggtcaag ccagaagtca agcctgagac tcacatcaat 180

ttaaaggtgt ccgatggatc ttcagagatc ttcttcaaga tcaaaaagac cactccttta 240

agaaggctga tggaagcgtt cgctaaaaga cagggtaagg aaatggactc cttaagattc 300

ttgtacgacg gtattagaat tcaagctgat cagacccctg aagatttgga catggaggat 360

aacgatatta ttgaggctca cagagaacag attggtggga tcgaggaaaa cctgtacttc 420

caatccggat cc 432

<210> 17

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 17

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatga gcgataaaat tattcacctg 120

actgacgaca gttttgacac ggatgtactc aaagcggacg gggcgatcct cgtcgatttc 180

tgggcagagt ggtgcggtcc gtgcaaaatg atcgccccga ttctggatga aatcgctgac 240

gaatatcagg gcaaactgac cgttgcaaaa ctgaacatcg atcaaaaccc tggcactgcg 300

ccgaaatatg gcatccgtgg tatcccgact ctgctgctgt tcaaaaacgg tgaagtggcg 360

gcaaccaaag tgggtgcact gtctaaaggt cagttgaaag agttcctcga cgctaacctg 420

gccgggatcg aggaaaacct gtacttccaa tccggatcc 459

<210> 18

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 18

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatgt ctaaaactgg aaccaagatt 120

actttctatg aagacaaaaa ttttcaaggc cgtcgctatg actgtgattg cgactgtgca 180

gatttccaca catacctaag tcgctgcaac tccattaaag tggaaggagg cacctgggct 240

gtttatgaaa ggcccaactt tgctgggtac atgtacatct taccacaggg agagtaccct 300

gaataccagc gttggatggg cctcaacgac cgcctcagct cctgcagagc tgttcatctg 360

cctagtggag gccagtataa gattcagatc tttgagaaag gggattttag tggtcagatg 420

tatgaaacca ccgaagattg cccttccatc atggagcaat ttcacatgcg agagatccac 480

tcctgtaagg tgctggaggg tgtctggatt ttctatgagc tacccaacta ccgtggcagg 540

cagtacctcc tggacaagaa ggagtaccgg aagcccatcg attggggtgc agcctcccca 600

gctgtccagt ctttccgccg cattgtggag gggatcgagg aaaacctgta cttccaatcc 660

ggatcc 666

<210> 19

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 19

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatga gcaacattac catttatcac 120

aacccggcct gcggcacgtc gcgtaatacg ctggagatga tccgcaacag cggcacagaa 180

ccgactatta tccattatct ggaaactccg ccaacgcgcg atgaactggt caaactcatt 240

gccgatatgg ggatttccgt acgcgcgctg ctgcgtaaaa acgtcgaacc gtatgaggag 300

ctgggccttg cggaagataa atttactgac gatcggttaa tcgactttat gcttcagcac 360

ccgattctga ttaatcgccc gattgtggtg acgccgctgg gaactcgcct gtgccgccct 420

tcagaagtgg tgctggaaat tctgccagat gcgcaaaaag gcgcattctc caaggaagat 480

ggcgagaaag tggttgatga agcgggtaag cgcctgaaag ggatcgagga aaacctgtac 540

ttccaatccg gatcc 555

<210> 20

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 20

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt 60

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatgg ttactttcca caccaatcac 120

ggcgatattg tcatcaaaac ttttgacgat aaagcacctg aaacagttaa aaacttcctg 180

gactactgcc gcgaaggttt ttacaacaac accattttcc accgtgttat caacggcttt 240

atgattcagg gcggcggttt tgaaccgggc atgaaacaaa aagccaccaa agaaccgatc 300

aaaaacgaag ccaacaacgg cctgaaaaat acccgtggta cgctggcaat ggcacgtact 360

caggctccgc actctgcaac tgcacagttc ttcatcaacg tggttgataa cgacttcctg 420

aacttctctg gcgaaagcct gcaaggttgg ggctactgcg tgtttgctga agtggttgac 480

ggcatggacg tggtagacaa aatcaaaggt gttgcaaccg gtcgtagcgg tatgcaccag 540

gacgtgccaa aagaagacgt tatcattgaa agcgtgaccg ttagcgaggg gatcgaggaa 600

aacctgtact tccaatccgg atcc 624

<210> 21

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 21

ggatccacca ccgctaccgg tgaatctgct gacccggtta ccaccaccgt tgaaaactac 60

ggtggtgaaa cccaggttca gcgtcgttac cacaccgacg ttggtttcct gatggaccgt 120

ttcgttcaga tcaaaccggt tggtccgacc cacgttatcg acctgatgca gacccaccag 180

cacggtctgg ttggtgctat gctgcgtgct gctacctact acttctctga cctggaaatc 240

gttgttaacc acaccggtaa cctgacctgg gttccgaacg gtgctccgga agctgctctg 300

cagaacacct ctaacccgac cgcttaccac aaagctccgt tcacccgtct ggctctgccg 360

tacaccgctc cgcaccgtgt tctggctacc gtttactctg gtacctctaa atactctgct 420

ccgcagaacc gtcgtggtga ctctggtccg ctggctgctc gtctggctgc tcagctgccg 480

gcttctttca acttcggtgc tatccgtgct accgaaatcc gtgaactgct ggttcgtatg 540

aaacgtgctg aactgtactg cccgcgtccg ctgctggctg ttgaagtttc ttctcaggac 600

cgtcacaaac agaaaatcat cgctccggct aaacagctgc tggagctc 648

<210> 22

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 22

gagctcggtc gtctggaagt tctgttccag ggtccgaaag ctttcctgga actgtctaaa 60

aaagttgttg acctgctgaa cgaacagatc aacaaagaaa tgtacgctgc taacctgtac 120

ctgtctatgt cttcttggtg ctacgaaaac tctctggacg gtgctggtct gttcctgttc 180

cagcacgctt ctgaagaatc tgaacacgct cgtaaactga tcacctacct gaacgaaacc 240

gactctcacg ttgaactgaa agaagttaaa cagccggaac agaacttcaa atctctgctg 300

gacgttttcg aaaaaaccta cgaacacgaa cagtctatca ccaaatctat caacgacctg 360

gttgaacaca tgctgggtaa caaagactac tctaccttca acttcctgca gtggtacgtt 420

tctgaacagc acgaagaaga agctctgttc cgtggtatcg ttgacaaaat caaactgatc 480

tctgacaacg gtaacggtct gtacctggct gaccagtaca tcaaaaacct ggctctgtct 540

aaaaaataac tcgag 555

Claims

1.A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，包括亲和标签、促溶标签、A型FMDV1D蛋白表位和铁蛋白片段，所述促溶标签位于亲和标签的C端，所述A型FMDV 1D蛋白表位位于促溶标签的C端，所述铁蛋白片段位于A型FMDV 1D蛋白表位的C端，亲和标签为EW29标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，促溶标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～9所示；该A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白可自组装形成铁蛋白包封A型FMDV 1D蛋白的蛋白笼纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，所述A型FMDV1D蛋白表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示。

3.根据权利要求1所述的A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述EW29标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，表达所述促溶标签的核苷酸序列如SEQ IDNO.13～20所示。

4.根据权利要求2所述的A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白，其特征在于，表达所述A型FMDV 1D蛋白表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；表达所述铁蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。

5.权利要求1～4任一项所述的A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。

6.权利要求5所述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将A型FMDV 1D蛋白的核苷酸序列和铁蛋白片段的核苷酸序列串联，合成A型FMDV 1D蛋白表位-铁蛋白片段；

7.一种重组载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含有如权利要求3～4任一项所述的核苷酸序列。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有权利要求7所述的重组载体。

9.权利要求1～4所述的A型FMDV 1D蛋白-铁蛋白融合蛋白、权利要求5所述的A型FMDV1D蛋白-铁蛋白融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒、权利要求6所述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法在制备A型FMDV 1D蛋白疫苗中的应用。