CN105018510A - 一种提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法。该方法为，在采用基因工程进行口蹄疫蛋白表达时，通过基因工程手段，在口蹄疫蛋白的C端增加His6-MBP标签可增加口蹄疫蛋白的可溶性；所述His6表示6个组氨酸标签，MBP表示麦芽糖酶结合蛋白。本发明还提供了利用该方法所制备的针对A型口蹄疫用免疫口蹄疫蛋白CDG276。本发明与现有的基因工程所制备的FMDV？VPI蛋白相比，表达量有较为明显提高，同时由于加入了可溶性的标签麦芽糖结合蛋白（MBP），所表达的FMDVA1蛋白可溶度提升明显，因而具有较好的推广应用价值。

Description

一种提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and—mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染病，主要危害牛、羊、猪等，发病率极高，传播速度极快，尤其在猪群中能引起大范围流行，造成严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为通报疫病，我国农业部也将其划定为一类动物传染病。目前已知的FMDV包括A、O、C、Asia l、SAT 1、SAT2和SAT 3 7个没有交叉免疫保护的血清型，在长期的相互传播感染中又形成60余个亚型。

随着现代分子生物学技术的发展，FMD疫苗的研制不断深入和改进，已从传统疫苗向新型疫苗方向发展，即应用生物技术提供一种安全、有效的基因疫苗来控制FMD的发生。弱毒疫苗中减弱的毒株对一种动物的减毒并不能保证对其他动物减毒，且由于新的亚型不断出现及毒株致弱结果和致弱时间都不能确定。1964年欧洲口蹄疫防治委员会决定欧洲国家不用弱毒疫苗免疫，停止了弱毒疫苗的研究。目前世界许多国家和地区在FMD的防治中都采用灭活疫苗，但灭活疫苗的缺点是热稳定性差，需要低温保存，免疫持续期短，抗病毒谱有限，不能区分注射疫苗动物和自然感染动物，同时存在病毒灭活不彻底而散毒的可能性。

现有技术中，常采用基因工程来制备疫苗所需活性蛋白。但活性蛋白的提取与应用是与其表达量和可溶性高度相关的。一般而言，决定蛋白能否用于科学试验或者临床研究主要有三个因素：表达、可溶和纯化。相对而言，蛋白表达和纯化的技术难题比较容易克服，而蛋白的可溶性表达则是一个技术性瓶颈。蛋白不可溶的原因与机理研究尚处于探索阶段，但一般认为两个因素导致了蛋白的不可溶：一个是蛋白翻译的速率，另一个是蛋白折叠的速率。

现有研究中，提高蛋白表达可溶性的一种途径是通过表达菌株和改变表达的条件来提高蛋白表达的可溶性，但是效果有时不太理想，而且由于包涵体的存在，因而这种途径的改进效果是不稳定的；另外一种较为重要和有效的方法是在活性蛋白末端增加可溶性标签，通过可溶性标签和目的蛋白的融合，通过标签自身的折叠从而来增加目的蛋白的可溶性。但是不同的可溶性标签对于不同的活性蛋白，其所能提高的可溶度效果是不同的，而且由于可溶性标签在后期常需进一步移除，因而针对不同的活性蛋白，选择最适的可溶性标签常是重点，也是难点工作。

发明内容

本发明目的在于提供一种可提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法，该方法主要是通过同时增加多聚组氨酸（6×His）标签和MBP标签的方法来提高口蹄疫蛋白的可溶性；同时本发明以此方法为基础，提供了一种口蹄疫重组蛋白CDG276，结果表明，采用该方法后，其表达量和可溶性均有较大改进。

本发明所采取的实际技术方案如下。

一种提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法，在采用基因工程进行口蹄疫蛋白表达时，通过基因工程手段，在口蹄疫蛋白的C端通过增加His6-MBP标签可增加口蹄疫蛋白的可溶性，所述His6（6×His）表示6个组氨酸标签，MBP（Maltose-binding protein）表示麦芽糖酶结合蛋白。

所述免疫用口蹄疫蛋白，为针对A型口蹄疫用免疫口蹄疫蛋白。

所述提高口蹄疫蛋白可溶性的方法，进一步的可增加TEV标签，即在口蹄疫蛋白末端所增加标签为His6-MBP-TEV，以便于作为蛋白酶切割位点，所述TEV表示烟草蚀刻病毒蛋白酶。

利用所述提高口蹄疫蛋白可溶性的方法所制备的免疫用口蹄疫重组蛋白，该蛋白编号为CDG276，其是以A型FMDV VPI上部分抗原表位构象氨基酸碱基序列为抗原位点，该蛋白表示形式为：NdeI-Extag-Sitag3-NheI-YPYDVPDYA-ENLYFQ-BamHI-FMDVA1-XhoI，其中NdeI、NheI、BamHI、XhoI表示相应的酶切位点序列，Extag-Sitag3为Extag-Sitag3标签序列，YPYDVPDYA、ENLYFQ、FMDVA1分别表示相应的蛋白序列，具体碱基序列如SEQ ID NO．1所示。

所述免疫用口蹄疫重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）构建如SEQ ID NO．1所示免疫用口蹄疫重组蛋白CDG276碱基序列，

（2）将免疫用口蹄疫重组蛋白CDG276碱基序列与质粒载体连接，所述质粒载体选择质粒pET21b，酶切位点选择NdeI酶和XhoI酶两个酶切切位点之间，构建重组质粒表达载体pET21b-CDG276；

（3）构建携带有可提高可溶性标签His6-MBP-TEV的重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV，可溶性标签His6-MBP-TEV的碱基序列如SEQ ID NO．2所示；

（4）NheⅠ和BamHⅠ分别双酶切步骤（2）中的pET21b-CDG276与步骤（3）中的pMD19-T-His6-MBP-TEV，双酶切后回收相应片段并连接，构建用于FMDVA1蛋白表达的pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重组表达质粒，为便于描述，将此重组表达质粒命名为pET-9，碱基序列如SEQ ID NO．3所示；

（5）将pET-9转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导表达，表达完成后超声破碎、离心、纯化即可获得FMDVA1蛋白。

一般而言，基因工程疫苗由于只含有病毒衣壳蛋白，不含有核酸，因而具有很高的安全性。对FMDV抗原结构研究表明，VPl片段是FMDV的主要抗原位点，能诱导机体产生保护性的中和抗体，并能产生部分的保护作用。本发明以A型FMDV VPI上的部分抗原表位构象氨基酸碱基序列为抗原位点，设计出了最佳的表位组合形式，特异性地用于FMDVA1蛋白的表达纯化。与现有的基因工程所制备的FMDV VPI蛋白相比，表达量有较为明显提高，同时由于加入了可溶性的标签麦芽糖结合蛋白（MBP），所表达的FMDVA1蛋白可溶度提升明显，因而具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为质粒pET21b-CDG276的NheⅠ和BamHⅠ双酶切电泳结果，其中1是DNA分子质量标准DL5000，2、3是双酶切电泳结果；

图2是质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV的NheⅠ和BamHⅠ双酶切结果，其中1是DNA分子质量标准DL2000，2是双酶切电泳结果；

图3为重组质粒pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276（pET-9）的菌液PCR鉴定结果，其中1是DNA分子质量标准DL2000，2~6是菌液PCR结果，其中4~6为正确条带；

图4为重组质粒pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276（pET-9）转化菌株BL21诱导表达蛋白后菌液PCR鉴定结果，其中1是DNA分子质量标准DL2000，2~4是菌液PCR结果；

图5为构建pET-9重组质粒表达载体流程示意图；

图6为pET21b-CDG276诱导后的SDS-PAGE结果，其中5为Prestained Protein Marker Ⅰ，1~4为pET21b-CDG276未诱导全菌、诱导全菌、破碎后上清和破碎后沉淀；

图7为pET-9诱导后的SDS-PAGE结果，其中1为Prestained Protein Marker Ⅰ，2~5为实验组pET-9未诱导全菌、诱导全菌、破碎后上清和破碎后沉淀。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细介绍，介绍具体实施例前，对本发明中所用到部分试剂简要介绍如下。

主要试剂：

rTaq酶(RR901A)、DNA Maker DL2000、DL5000购自TaKaRa公司；

Prestained Protein Marker Ⅰ、Agarose（琼脂糖）购自GENVIEW公司；

限制性内切酶BamHⅠ（FD0054）、NheⅠ（FD0974）购自Thermo Scientific；

质粒切胶回收纯化试剂盒(SK8132)、质粒小量提取试剂盒（SK8192）、IPTG购自上海生工生物工程有限公司；

Tryptone（胰蛋白胨）、Yeast Extract（酵母提取物）、Agar power（琼脂粉）均购自OXIOD公司；

BCA蛋白定量试剂盒（43B00150）、四甲基乙二胺（TEMED）、2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术公司；

T4 DNA连接酶（M0202S）、10×连接酶缓冲液购自NEW ENGLAND BioLabs。

常规试剂及配制方法：

（1）100mg/mL氨苄青霉素（Ampicillin，简写Amp）：称取5g的Ampicillin粉末，加入无菌水溶解，定容至50mL，用滤膜过滤除菌，然后分装至高压过的EP管中，-20℃保存；

（2）100mmol/L IPTG ：称取0.24g IPTG粉末，加入无菌水溶解，定容至10 mL，用滤膜过滤除菌，-20℃储存；

（3）LB液体培养基：称取Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，加入超纯水充分溶解，定容至1L，调节pH值至7，高压蒸汽灭菌，4℃保存；

（4）LB(Amp)液体培养基：将1L的LB液体培养基中加入1mL 100mg/mL的Ampicillin，使其终浓度为100μg/mL，4℃保存；

（5）LB(Amp)固体培养基：称取Tryptone10g，Yeast Extract 5g，NaCl 10g，加入超纯水充分溶解，定容至1L，加入15g Agar power，高压灭菌，高压结束后，待冷却到60℃左右时，加入1mL的100mg/mL Ampicillin，使其终浓度为100μg/mL，倒入平皿中，倒置放于4℃保存；

（6）PBS缓冲液：称取NaH₂PO₄ 1.48g，Na₂HPO₄ 14.5g和NaCl 29.3g，加入超纯水充分溶解，用超纯水将溶液定容至1L，把pH调节到7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存；

（7） 50 × TAE 电泳缓冲液：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O，加入超纯水充分溶解，加入57.1mL的醋酸充分混匀，用超纯水将溶液定容至1L，常温放置备用；

（8）1% 琼脂糖凝胶：准确称取0.25g Agarose，将其加入25mL TAE缓冲液中，在微波炉中反复沸腾三次，冷却至室温，加入0.7μL的EB溶液（溴化乙锭溶液，0.5μg/mL），充分混匀，倒入插有梳子的凝胶板中冷却至其凝固；

（9）0.5M Tris-HCl (pH=6.8)：称取60. 55g Tris，缓慢加浓盐酸调整至pH6.8(溶液冷却至室温再调定PH值)，最后将溶液体积定容至1000 mL，室温保存备用；加入超纯水充分溶解，用超纯水将溶液定容至1L，调节pH至6.8，常温放置备用；

（10）1.5M Tris-HCl (pH=8.8)：称取181.71g Tris碱，加入超纯水充分溶解，用超纯水将溶液定容至1L，调节pH至8.8，常温放置备用；

（11）10% SDS：称取10 g SDS，加入超纯水充分溶解，用超纯水将溶液定容至100 mL，室温保存备用；

（12）40% 丙烯酰胺（Acrylamide）-甲叉丙烯酰胺（Bis）（37.5:1）：称取78g Acrylamide和2.08g Bis，加入超纯水充分溶解，用超纯水将溶液定容至200mL，用磁力搅拌器搅拌过夜，第2天用滤纸进行过滤，装于棕色瓶中，4℃保存备用；

（13）50%甘油：量取50 mL Glycerol，用超纯水将溶液定容至100 mL，混合均匀后4℃保存备用；

（14）10%APS：称取1g过硫酸铵，加入超纯水充分溶解，用超纯水定容到10 mL，4℃保存备用；

（15）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：称取15.15g Tris，5 g SDS，72.05 g甘氨酸，加入超纯水充分溶解，定容至1000 mL，4℃保存备用；

（16）考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 1 g，量取250 mL的异丙醇，加入100 mL冰醋酸，加入650 mL的超纯水充分搅拌溶解，用滤纸过滤去除颗粒物，室温保存备用；

（17）考马斯亮蓝脱色液：量取无水乙醇100 mL、冰醋酸100 mL，超纯水定容至500 mL，充分混匀室温保存备用；

（18）12%分离胶和5%浓缩胶：配方如下表所示。

实施例

本发明所提供的提高口蹄疫蛋白可溶性的方法，主要原理是在相关基因操作时，通过在口蹄疫蛋白的末端（C端）通过增加His6-MBP标签来增加口蹄疫蛋白的可溶性，优选方案是增加His6-MBP-TEV标签，从而便于相关蛋白的酶切。

本实施例即以上述方法为基础，制备了一种具体的口蹄疫重组蛋白CDG276，表示形式如下：NdeI-Extag-Sitag3-NheI-YPYDVPDYA-ENLYFQ-BamHI-FMDVA1-XhoI；具体碱基序列如下所示（或SEQ ID NO．1所示）。

CATATGACAGATGTAACGATTAAAGACTCTGCTCGTGGTTTCAAAAAACCGGGTAAACGTGCTAGCTACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTGAAAACCTGTACTTCCAAGGATCCACCACCGCTACCGGTGAATCTGCTGACCCGGTTACCACCACCGTTGAAAACTACGGTGGTGAAACCCAGGTTCAGCGTCGTTACCACACCGACGTTGGTTTCCTGATGGACCGTTTCGTTCAGATCAAACCGGTTGGTCCGACCCACGTTATCGACCTGATGCAGACCCACCAGCACGGTCTGGTTGGTGCTATGCTGCGTGCTGCTACCTACTACTTCTCTGACCTGGAAATCGTTGTTAACCACACCGGTAACCTGACCTGGGTTCCGAACGGTGCTCCGGAAGCTGCTCTGCAGAACACCTCTAACCCGACCGCTTACCACAAAGCTCCGTTCACCCGTCTGGCTCTGCCGTACACCGCTCCGCACCGTGTTCTGGCTACCGTTTACTCTGGTACCTCTAAATACTCTGCTCCGCAGAACCGTCGTGGTGACTCTGGTCCGCTGGCTGCTCGTCTGGCTGCTCAGCTGCCGGCTTCTTTCAACTTCGGTGCTATCCGTGCTACCGAAATCCGTGAACTGCTGGTTCGTATGAAACGTGCTGAACTGTACTGCCCGCGTCCGCTGCTGGCTGTTGAAGTTTCTTCTCAGGACCGTCACAAACAGAAAATCATCGCTCCGGCTAAACAGCTGCTGTAACTCGAG。

需要解释的是，上述序列中，带有下划线的CATATG序列为NdeI酶切位点，带有下划线的GCTAGC序列为NheI酶切位点，而NdeI酶切位点与NheI酶切位点之间的碱基序列为Extag-Sitag3标签序列，Extag-Sitag3标签序列后依次为YPYDVPDYA、ENLYFQ氨基酸所对应碱基序列，带有下划线的GGATCC序列为BamHI酶切位点，带有下划线的CTCGAG序列为XhoI酶切位点，BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间为FMDVA1碱基序列。

口蹄疫重组蛋白CDG276的具体制备方法，简要介绍如下。

（1）构建如SEQ ID NO．1所示免疫用口蹄疫重组蛋白CDG276碱基序列。

本申请中所用CDG276碱基序列由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成提供。

（2）构建重组质粒表达载体pET21b-CDG276。

常规实验操作，将步骤（1）中免疫用口蹄疫重组蛋白CDG276碱基序列与质粒载体连接，所述质粒载体选择质粒pET21b，酶切位点选择NdeI酶和XhoI酶两个酶切切位点之间，构建重组质粒表达载体pET21b-CDG276。

（3）构建携带有可提高可溶性标签His6-MBP-TEV的重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV，可溶性标签His6-MBP-TEV的碱基序列如SEQ ID NO．2所示。

重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV可人工合成提供，亦可采用PCR技术手段扩增His6-MBP-TEV序列后，与pMD19-T质粒连接构建获得，对此生物方法简要介绍如下。

本申请中以包含有His6-MBP-TEV序列的质粒（所述质粒为申请号2014105258236中所述pEX-MBP重组质粒 ）为PCR对象，设计引物并扩增His6-MBP-TEV序列，引物序列设计如下（引物序列由生工生物工程有限公司（上海）合成提供）：

HisTag Nhe I：5’- CTAGCTAGCTCTCACCATCACCATCACCATG- 3’，其中GCTAGC部分序列为Nhe I酶切位点；

HisTag BamH I：5’- CGGGATCCGGATTGGAAGTACAGGTTTTC- 3’，其中GGATCC部分序列为BamH I酶切位点。

His6-MBP-TEV序列扩增完成后进行琼脂糖电泳分离，并使用胶回收试剂盒回收相应片段。

将所回收His6-MBP-TEV序列片段与pMD 19-T载体分别进行酶切，然后进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化产物（菌液）37℃平板培养过夜后进行蓝白斑筛选，经蓝白斑筛选后挑取白色单克隆菌落扩大培养，培养菌液PCR鉴定，并对鉴定阳性菌液进行测序鉴定，测序由生工生物工程有限公司（上海）进行。测序鉴定结果显示，所获重组质粒碱基对与所设计的pMD19-T-His6-MBP-TEV碱基序列比对100%匹配，无碱基突变或缺失，表明重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV构建成功。

（4）构建pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重组质粒（pET-9）。

NheⅠ和BamHⅠ分别双酶切步骤（2）中的pET21b-CDG276与步骤（3）中的pMD19-T-His6-MBP-TEV，双酶切后回收相应片段并连接，构建用于FMDVA1蛋白表达的pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重组质粒，将此重组质粒命名为pET-9，具体碱基序列如SEQ ID NO．3所示，构建过程可参考图5所示。具体步骤如下。

第一，将步骤（2）中所构建的质粒pET21b-CDG276和步骤（3）所构建的重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV首先转化大肠杆菌DH5α，扩大培养并使用质粒提取试剂盒提取质粒，所提取质粒直接用于后续实验或-20℃保存备用。

第二，将扩大培养后所提取的质粒pET21b-CDG276、重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV分别用NheⅠ和BamHⅠ进行双酶切并回收产物，20μL双酶切体系设置如下：

NheⅠ，1μL；

BamHⅠ，1μL；

10×酶切缓冲液，2μL；

pET21b-CDG276 (90ng/μL)，11μL；或pMD19-T-His6-MBP-TEV（200ng/μL），10μL；

ddH₂O加至20μL。

37℃酶切30min。

pET21b-CDG276质粒双酶切结果如图1所示，切胶回收试剂盒最终回收得到6068bp左右的片段；重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV的双酶切结果如图2所示，切胶回收试剂盒最终回收得到1169bp左右的片段。

第三，将pET21b-CDG276质粒与重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV的双酶切回收产物用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系设置如下：

T4 DNA连接酶，1 μL；

10×连接酶缓冲液，1μL；

pET21b-CDG276切胶回收产物 (30ng/μL)，2μL；

pMD19-T-His6-MBP-TEV切胶回收产物(15ng/μL)，6μL。

18℃连接20min。

连接完成后即可得到用于FMDVA1蛋白表达的pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重组质粒，并命名为pET-9。

为验证所制备的pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重组质粒是否构建重组正确，可将pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重组质粒转化大肠杆菌（DH5α）细胞后，进一步进行菌液PCR鉴定和测序鉴定。具体过程简要介绍如下。

从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL) 大肠杆菌DH5α感受态菌，室温下解冻，然后置冰上；加入10μL的上述连接体系并轻轻振荡后放入冰上放置30min；轻轻摇匀后42℃水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min；加入890μL LB培养基（不含抗生素）轻轻混匀后，37℃摇床震荡培养1h；取40μL转化液均匀涂布到LB(Amp，100μg/mL)固体培养基上，37℃培养30~60min至表面的液体渗透到培养基后，倒置培养过夜。

挑取单菌落于2mL的LB(Amp，100μg/mL)液体培养基中，37℃摇床培养4h扩增。培养结束后对菌液进行PCR鉴定。菌液PCR鉴定体系设置如下：

rTaq酶，5μL；

HisTag Nhe I（引物序列见步骤（3），20 μmol/L），0.5μL；

HisTag BamH I（引物序列见步骤（3），20 μmol/L），0.5μL；

pET-9菌液，1μL；

ddH₂O，3μL。

反应条件：95℃ 5min，95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 90s，反应35个循环，72℃ 10min。

PCR产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。进一步的，将鉴定结果为阳性的菌液进行测序鉴定（生工生物工程有限公司（上海））。测序结果显示重组质粒pET-9从起始密码子ATG到终止密码子TAA与所设计序列的碱基比对100%匹配，无碱基突变或缺失。

对测序完全正确的用质粒提取试剂盒提取质粒备用。

（5）将pET-9质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导表达，表达完成后超声破碎、离心、纯化即可获得FMDVA1蛋白。

为鉴定本发明所提供的FMDVA1蛋白的可溶性，本发明以质粒pET21b-CDG276的诱导表达蛋白（常规表达，不包含可溶性标签）作为对照，进行了可溶性检验，总体过程简要介绍如下。

将鉴定并测序正确的步骤（4）中所提取的pET-9重组质粒和步骤（2）所构建的pET21b-CDG276质粒表达载体转化大肠杆菌表达菌株BL21细胞，将转化后细胞均匀涂覆在有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上进行培养过夜。

挑取单个阳性菌落进行过夜培养扩增。分别将转化有pET-9的菌液和转化有pET21b-CDG276的菌液按1︰100的体积比接种到50mL含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃培养到OD₆₀₀=0.6~0.8。

扩增培养结束后，18℃下加入100 mMol/L的IPTG溶液250μL即终浓度为0.5mMol/L， 160rpm振荡培养过夜，诱导蛋白表达。

对转化pET-9重组质粒的大肠杆菌表达菌株BL21 IPTG诱导表达FMDVA1蛋白后的菌液PCR鉴定结果如图4所示。

对于IPTG诱导后蛋白表达量及相应灰度检测结果（对转化pET-9和pET21b-CDG276的菌液分别采用相同方法处理），简要介绍说明如下。

蛋白表达量对比

分别取诱导菌液50 mL 4℃、10000rpm离心10min收菌，弃上清，菌体用5mL PBS溶液重悬。

将未诱导和诱导菌液分别采用超声波破碎，功率160W，工作4s，间歇8s，共持续25min。

将超声波破碎后上清分别用BCA蛋白定量试剂盒进行定量处理，结果如下表所示。

从上表可以看出，本发明实验组重组质粒pET-9所表达的蛋白上清浓度是现有的表达载体pET21b-CDG276所表达蛋白的1.53倍，表达量有较为明显提升。

灰度检测结果对比

对未诱导全菌、诱导全菌、蛋白上清液和蛋白沉淀同比例倍数稀释。其中，对于未诱导全菌、诱导全菌的稀释方法如下：分别取1 mL未诱导全菌和1 mL诱导全菌，4℃、10000rpm离心2min30s，收菌，弃上清，菌体用100 μL PBS溶液重悬。

采用12%的SDS-PAGE胶，各吸取40uL上述处理的未诱导全菌、诱导全菌、蛋白上清液和蛋白沉淀液并加入40uL 2×SDS上样缓冲液99℃变性5~10min。

每孔上样20uL进行SDS-PAGE检测，结果见图6和图7。

将SDA-PAGE结果进行灰度扫描分析（Gel-Pro analyzer4软件），结果如下表所示。

从上表可以看出pET-9诱导全菌目的蛋白量是现有的表达载体pET21b-CDG276所表达目的蛋白的2.86倍，且可溶性部分占比60%远高于即与现有载体的28%。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  河南农业大学

 

<120>  一种提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法

 

<130>  none

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  762

<212>  DNA

<213>  CDG276

 

<400>  1

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt       60

 

gctagctacc cgtacgacgt tccggactac gctgaaaacc tgtacttcca aggatccacc      120

 

accgctaccg gtgaatctgc tgacccggtt accaccaccg ttgaaaacta cggtggtgaa      180

 

acccaggttc agcgtcgtta ccacaccgac gttggtttcc tgatggaccg tttcgttcag      240

 

atcaaaccgg ttggtccgac ccacgttatc gacctgatgc agacccacca gcacggtctg      300

 

gttggtgcta tgctgcgtgc tgctacctac tacttctctg acctggaaat cgttgttaac      360

 

cacaccggta acctgacctg ggttccgaac ggtgctccgg aagctgctct gcagaacacc      420

 

tctaacccga ccgcttacca caaagctccg ttcacccgtc tggctctgcc gtacaccgct      480

 

ccgcaccgtg ttctggctac cgtttactct ggtacctcta aatactctgc tccgcagaac      540

 

cgtcgtggtg actctggtcc gctggctgct cgtctggctg ctcagctgcc ggcttctttc      600

 

aacttcggtg ctatccgtgc taccgaaatc cgtgaactgc tggttcgtat gaaacgtgct      660

 

gaactgtact gcccgcgtcc gctgctggct gttgaagttt cttctcagga ccgtcacaaa      720

 

cagaaaatca tcgctccggc taaacagctg ctgtaactcg ag                         762

 

 

<210>  2

<211>  1164

<212>  DNA

<213>  His6-MBP-TEV

 

<400>  2

tctcaccatc accatcacca tggttcttct atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc       60

 

tggattaacg gcgataaagg ctataacggt ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa      120

 

gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat ccggataaac tggaagagaa attcccacag      180

 

gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc      240

 

tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc accccggaca aagcgttcca ggacaagctg      300

 

tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct      360

 

gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg      420

 

gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc      480

 

aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc      540

 

aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa      600

 

gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat      660

 

tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg      720

 

tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc      780

 

ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc      840

 

agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt      900

 

ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa      960

 

gagttggcga aagatccacg tattgccgcc actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc     1020

 

atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac     1080

 

gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taatgggatc     1140

 

gaggaaaacc tgtacttcca atcc                                            1164

 

 

<210>  3

<211>  1881

<212>  DNA

<213>  pET-9

 

<400>  3

catatgacag atgtaacgat taaagactct gctcgtggtt tcaaaaaacc gggtaaacgt       60

 

gctagctctc accatcacca tcaccatggt tcttctatga aaatcgaaga aggtaaactg      120

 

gtaatctgga ttaacggcga taaaggctat aacggtctcg ctgaagtcgg taagaaattc      180

 

gagaaagata ccggaattaa agtcaccgtt gagcatccgg ataaactgga agagaaattc      240

 

ccacaggttg cggcaactgg cgatggccct gacattatct tctgggcaca cgaccgcttt      300

 

ggtggctacg ctcaatctgg cctgttggct gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac      360

 

aagctgtatc cgtttacctg ggatgccgta cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg      420

 

atcgctgttg aagcgttatc gctgatttat aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa      480

 

acctgggaag agatcccggc gctggataaa gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg      540

 

atgttcaacc tgcaagaacc gtacttcacc tggccgctga ttgctgctga cgggggttat      600

 

gcgttcaagt atgaaaacgg caagtacgac attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc      660

 

gcgaaagcgg gtctgacctt cctggttgac ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac      720

 

accgattact ccatcgcaga agctgccttt aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac      780

 

ggcccgtggg catggtccaa catcgacacc agcaaagtga attatggtgt aacggtactg      840

 

ccgaccttca agggtcaacc atccaaaccg ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac      900

 

gccgccagtc cgaacaaaga gctggcaaaa gagttcctcg aaaactatct gctgactgat      960

 

gaaggtctgg aagcggttaa taaagacaaa ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac     1020

 

gaggaagagt tggcgaaaga tccacgtatt gccgccacta tggaaaacgc ccagaaaggt     1080

 

gaaatcatgc cgaacatccc gcagatgtcc gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg     1140

 

atcaacgccg ccagcggtcg tcagactgtc gatgaagccc tgaaagacgc gcagactaat     1200

 

gggatcgagg aaaacctgta cttccaatcc ggatccacca ccgctaccgg tgaatctgct     1260

 

gacccggtta ccaccaccgt tgaaaactac ggtggtgaaa cccaggttca gcgtcgttac     1320

 

cacaccgacg ttggtttcct gatggaccgt ttcgttcaga tcaaaccggt tggtccgacc     1380

 

cacgttatcg acctgatgca gacccaccag cacggtctgg ttggtgctat gctgcgtgct     1440

 

gctacctact acttctctga cctggaaatc gttgttaacc acaccggtaa cctgacctgg     1500

 

gttccgaacg gtgctccgga agctgctctg cagaacacct ctaacccgac cgcttaccac     1560

 

aaagctccgt tcacccgtct ggctctgccg tacaccgctc cgcaccgtgt tctggctacc     1620

 

gtttactctg gtacctctaa atactctgct ccgcagaacc gtcgtggtga ctctggtccg     1680

 

ctggctgctc gtctggctgc tcagctgccg gcttctttca acttcggtgc tatccgtgct     1740

 

accgaaatcc gtgaactgct ggttcgtatg aaacgtgctg aactgtactg cccgcgtccg     1800

 

ctgctggctg ttgaagtttc ttctcaggac cgtcacaaac agaaaatcat cgctccggct     1860

 

aaacagctgc tgtaactcga g                                               1881

Claims (5)

1.一种提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法，其特征在于，该方法为，在采用基因工程进行口蹄疫蛋白表达时，通过基因工程手段，在口蹄疫蛋白的C端增加His6-MBP标签；

所述His6表示6个组氨酸标签，MBP表示麦芽糖酶结合蛋白。

2.如权利要求1所述提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法，其特征在于，在口蹄疫蛋白的C端所增加标签为His6-MBP-TEV，其中TEV表示烟草蚀刻病毒蛋白酶。

3.如权利要求1或2所述提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法，其特征在于，所述免疫用口蹄疫蛋白，为针对A型口蹄疫用免疫口蹄疫蛋白。

4.利用权利要求2所述提高免疫用口蹄疫蛋白可溶性的方法所制备的免疫用口蹄疫重组蛋白，其特征在于，该蛋白编号为CDG276，其是以A型FMDV VPI上部分抗原表位构象氨基酸碱基序列为抗原位点，该蛋白表示形式为：NdeI-Extag-Sitag3-NheI-YPYDVPDYA-ENLYFQ-BamHI-FMDVA1-XhoI，

其中NdeI、NheI、BamHI、XhoI表示相应的酶切位点序列，Extag-Sitag3为Extag-Sitag3标签序列，YPYDVPDYA、ENLYFQ、FMDVA1分别表示相应的蛋白序列，具体碱基序列如SEQ ID NO．1所示。

5.权利要求4所述免疫用口蹄疫重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）构建如SEQ ID NO．1所示免疫用口蹄疫重组蛋白CDG276碱基序列；

（2）将免疫用口蹄疫重组蛋白CDG276碱基序列与质粒载体连接，所述质粒载体选择质粒pET21b，酶切位点选择NdeI酶和XhoI酶两个酶切切位点之间，构建重组质粒表达载体pET21b-CDG276；

（3）构建携带有可提高可溶性标签His6-MBP-TEV的重组质粒pMD19-T-His6-MBP-TEV，可溶性标签His6-MBP-TEV的碱基序列如SEQ ID NO．2所示；

（4）NheⅠ和BamHⅠ分别双酶切步骤（2）中的pET21b-CDG276与步骤（3）中的pMD19-T-His6-MBP-TEV，双酶切后回收相应片段并连接，构建用于FMDVA1蛋白表达的pET21b-His6-MBP-TEV-CDG276重组表达质粒，将此重组表达质粒命名为pET-9；

（5）将pET-9转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导表达，表达完成后超声破碎、离心、纯化即可获得FMDVA1蛋白。