CN108239652B - 寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体及构建及应用 - Google Patents

寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体及构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体及构建及应用，寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP‑ZIKV_capcid_pET22b中所述MBP‑ZIKV_capcid的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示。本发明利用MBP基因与寨卡病毒衣壳蛋白基因进行刚性融合能在体外大量表达和纯化寨卡病毒衣壳蛋白，寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体转化到宿主细胞后，克服了现有技术寨卡病毒衣壳蛋白单个蛋白的蛋白表达水平低和蛋白高聚的问题，蛋白溶解度提高﹑使蛋白纯化容易，能高效获得寨卡病毒衣壳蛋白，为纯化该蛋白及其相关种属蛋白提供了新技术，可用于医疗检测和生物学功能实验相关产品的开发。

Description

寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体及构建及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体及构建及应用。
背景技术
黄病毒科(Flaviviridae)包括肝炎病毒、瘟病毒和黄热病毒3个属,黄热病毒属病毒简称黄病毒,包括约68种病毒,其中多数(约38种病毒)与人类疾病有关,如登革(DEN)、黄热(YF)和寨卡(ZIKA)等病毒严重影响着人类健康。近年来，全球登革热感染的病例急剧增加。该疾病在非洲，美洲，东地中海，东南亚和西太平洋的100多个国家是地方性的。据报导全世界每年约50-1000万例的DENV(登革热病毒)感染，约50万例出血热需要住院治疗和25,000例死亡。黄热病在非洲和拉丁美洲的45个国家流行，全世界约20万人感染，有30,000人死亡。寨卡病毒最早于1947年从乌干达森林中的猕猴身上分离出来。1952年首次从人体分离出来。截至上世纪末，寨卡病毒感染被认为仅在赤道周围的非洲、美洲、亚洲和太平洋地区散发，被证实的人类感染病例仅14例。该病毒自2007年开始出现暴发流行。2015年底至2016年初，美洲出现寨卡疫情，并通过旅游者输入到其他国家。截至2016年2月，美洲、非洲、亚洲等地已有超过30个国家出现寨卡病毒传播。
寨卡病毒基因组为长约10kb的单股正链RNA,由单一的开放读码框(ORF)编码一多聚蛋白(poly protein),经病毒和宿主蛋白酶对其进行协同翻译和翻译后加工,最后形成3种结构蛋白(C、PrM和E)和7种非结构蛋白。其中C又称衣壳蛋白位于病毒颗粒内部,与基因组RNA共同构成病毒核衣壳。它在病毒RNA衣壳化和病毒颗粒组装过程中起重要作用。Jones等研究发现黄病毒衣壳蛋白(包括寨卡病毒衣壳蛋白)单个蛋白的蛋白表达水平低，溶解度差及纯化困难(Jones C T,Ma L,Burgner J W,et al.Flavivirus capsid is a dimericalpha-helical protein.[J].Journal of Virology,2003,77(12):7143-9.)。而刚性融合是通过刚性连接肽将两个蛋白相连接，是一类有稳定二级结构的不易弯折的连接肽。注重多肽的二级结构和螺旋后的空间长度，能有效分隔功能蛋白的功能域。可以通过控制氨基酸排列来有效控制两端蛋白的距离。MBP是麦芽糖结合蛋白，MBP融合蛋白具有表达效率高、易于纯化等优点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的寨卡病毒衣壳蛋白单个蛋白的蛋白表达水平低，溶解度差及纯化困难的问题，提供一种寨卡病毒衣壳蛋白表达量高、溶解度有所提高的寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体。
本发明的第二个目的是提供一种操作纯化方便的寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种含有寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体的宿主细胞。
本发明的第四个目的是提供上述宿主细胞在表达寨卡病毒衣壳蛋白中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b，所述MBP-ZIKV_capsid的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示。
寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b的构建方法，包括如下步骤：
将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构建到pET22b载体上，得到寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b，
含有寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b的宿主细胞。
上述宿主细胞在表达寨卡病毒衣壳蛋白中的应用。
本发明的优点：
本发明利用MBP基因与寨卡病毒衣壳蛋白基因进行刚性融合能在体外大量表达和纯化寨卡病毒衣壳蛋白，寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体转化到宿主细胞后，克服了现有技术寨卡病毒衣壳蛋白单个蛋白的蛋白表达水平低和蛋白高聚的问题，蛋白溶解度提高﹑使蛋白纯化容易，能高效获得寨卡病毒衣壳蛋白，为纯化该蛋白及其相关种属蛋白提供了新技术，可用于医疗检测和生物学功能实验相关产品的开发。
附图说明
图1为MBP-ZIKV_capsid测序报告。
图2为本发明的目的蛋白寨卡病毒衣壳蛋白与MBP刚性融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
M为预染Maker，1为Superdex-75凝胶过滤层析纯化前的蛋白，2-7为经Superdex-75凝胶过滤层析纯化后的蛋白。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b的构建。
A.引物设计
(1)扩增MBP基因(MBP为麦芽糖结合蛋白)
引物序列：
FW1：GGAATTCCATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGT(SEQ ID NO.2)
RV1：GACACAGTGATACGAGTCTGCGCGTC(SEQ ID NO.3)
(2)ZIKV衣壳蛋白基因(ZIKV_capsid基因)序列的扩增
引物序列
FW2：AGACTCGTATCACTGTGTCTCCGTTCGGCGGCTTA(SEQ ID NO.4)
RV2：CCGCTCGAGACGCGCATTTATAATTCTT(SEQ ID NO.5)
(3)扩增MBP-ZIKV_capsid序列
以FW1为正向引物，RV2为反向引物，(1)与(2)中PCR产物作为模板，扩增得到MBP-ZIKV_capsid序列(SEQ ID NO.1)，并扩增。
PCR扩增反应(50μL)：
模板：1μL；10×缓冲液(PyrobestTM Buffer)：5μL；dNTPs(2.5mM)：4μL；FW:2μL；RV:2μL；高保真DNA聚合酶(pyrobest DNA polymerase)1μL；水：35μL。
B.将MBP-ZIKV_capsid的DNA片段的PCR产物克隆到pET22b(Novagen公司)载体上；
目的蛋白基因序列PCR产物和pET22b分别用Nde1和Xho1双酶切(实验方法参照﹤分子克隆﹥)；使用胶回收试剂盒回收双酶切产物；在使用T4 DNA连接酶连接；构建出寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b。
将MBP-ZIKV_capsid_pET22b转化入感受态细胞DH5α中，含氨苄霉素的平板过夜培养，挑选正确的克隆进行双酶切鉴定和测序，测序结果显示正确。其测序结果如图1所示。
实施例2
目的蛋白的表达
A.将MBP-ZIKV_capsid_pET22b质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并于LB平板筛选阳性克隆；
B.将A中所示的LB平板上挑取阳性克隆，培养14h，转入0.8L LB培养基中，LB培养基中含100mg/L的氨苄霉素，当OD600达到0.8时，加IPTG 16℃诱导培养16h；
C.以5000rpm离心15min，弃去上清，得到细菌沉淀物，用破菌Buffer重悬，得到重悬菌液，-80℃保存。
实施例3
表达产物的纯化
A.取出实施例2获得的-80℃保存的菌，并向悬菌液中加入DNase和RNase去除核酸，然后高压破菌6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
B.将上清液加入悬菌Buffer预平衡的MBP柱中，该悬菌Buffer为50mM TrispH8.0,300mM NaCl，挂柱1个小时。
C.高低盐洗杂，50mM Tris pH8.0,150mM(低盐)/1M NaCl(高盐)，高低盐交替洗杂，各洗杂50mL左右。最后用50mM Tris pH8.0,300mM NaCl,30mM Maltose洗脱蛋白。
D.将得到的蛋白降盐换液到Buffer 50mM MES pH6.0,60mM NaCl中。然后过Histrap S柱，使用Buffer A和Buffer B分别为50mM MES pH6.0和50mM MES pH6.0，1MNaCl。
E.将Histrap S柱得到的蛋白浓缩至500μL过superdex 200，使用Buffer为50mMMES pH6.0,150mM NaCl,5mM maltose，得到纯化的蛋白。
其中质粒小提试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的TIANprep产品。基因是由青兰生物公司合成，所用引物是由生工生物工程股份有限公司合成。
应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或者不宜获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
MBP-ZIKV_capsid序列:
Figure GDA0002276216080000041
上述序列中划线、不加粗部分表示MBP基因序列；
仅加粗部分表示编码刚性融合连接肽RIT三个氨基酸的DNA序列；
又划线又加粗部分表示ZIKV衣壳蛋白基因ZIKV_capsid基因序列。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体及构建及应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat tgacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960
acaatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac tcgtatcact gtgtctccgt tcggcggctt aaagcgttta 1140
ccggctggtc ttttactggg tcatggaccc attcgcatgg tcctggccat cctggccttt 1200
cttcggttca ccgccatcaa accttcgttg gggctgatca accgctgggg cagtgtcgga 1260
aagaaggagg ctatggagat aatcaagaag ttcaaaaaag acttggccgc catgttaaga 1320
attataaatg cgcgt 1335
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggaattccat atgaaaatcg aagaaggtaa actggt 36
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gacacagtga tacgagtctg cgcgtc 26
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
agactcgtat cactgtgtct ccgttcggcg gctta 35
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ccgctcgaga cgcgcattta taattctt 28

Claims (4)

1.寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b，其特征是所述MBP-ZIKV_capsid的核苷酸序列用SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述载体的构建方法，其特征是包括如下步骤：
将SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列构建到pET22b载体上，得到寨卡病毒衣壳蛋白刚性融合表达载体MBP-ZIKV_capsid_pET22b。
3.含有权利要求1所述载体的宿主细胞。
4.权利要求3所述宿主细胞在表达寨卡病毒衣壳蛋白中的应用。
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