CN108018271B - 单亚基rna聚合酶、其纯化方法及在rna合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用。所述的单亚基RNA聚合酶，为来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或来自与所述φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25%并含有如序列表SEQ ID NO.1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在800~830之间的其他噬菌体单亚基RNA聚合酶。经研究发现本发明提供的RNA聚合酶与现有的RNA工具酶亲缘关系较远，其转录效率较高。在与现有T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶相比较时，针对后二者在合成富含稳定高级结构RNA时产物复杂的问题，本发明单亚基RNA聚合酶显示出转录产物均一的显著优点。

Description

单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用

技术领域

本发明属于微生物核酸代谢酶研究领域，具体涉及单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用。

背景技术

RNA(核糖核酸)是所有生物遗传信息传递的最重要的一类大分子，同时在生物体内也扮演着多种多样的调控角色。近年来RNA研究已成为生物学研究中最热门的领域之一。RNA主要包括mRNA、tRNA、rRNA等大类，随着近些年生物学技术的快速发展，科学家们发现一些新颖的RNA如microRNA(miRNA)(Cheng et al.,2005)、long non-coding RNA(lncRNA)(Shi et al.,2016)、nanostructure RNA(Geary et al.,2014)等也对生物体发挥着至关重要的作用。设计好的RNA序列可以编码，并可被翻译为任何蛋白质，因此理论上可以替代现存的任何蛋白质药物；且RNA结构相较蛋白质结构要简单得多，容易构建。RNA作为药物的另一个巨大优点是代谢快、半衰期短、翻译产生蛋白质后迅速被降解，相比基因治疗(改变DNA产生永久不可逆的效果)副作用几乎不必考虑。小RNA还可以通过翻译以外的机制如RNA干扰(RNAi)以及RNA指导的基因编辑(CRISPR gRNA)治疗疾病。随着RNA导入细胞方法的完善，以及各种增强稳定性及减少免疫反应的RNA修饰方法的发现，RNA治疗在美国已成为最热门的药物研究方向。大型制药公司如Merck、AstraZeneca、Shire等纷纷投入力量重点开发RNA药物。

正是由于这些围绕RNA的研究和应用相继大量开展，对RNA体外合成在质和量两方面提出了很高的挑战。而RNA的体外制备恰恰是RNA研究和应用的最大瓶颈。由于RNA本身不稳定的性质，RNA的化学合成远不如DNA合成高效，化学合成RNA仅限于小RNA(几到几十个核苷酸长度)，随着RNA长度的增加，化学合成的成本迅速上升。RNA长度达一百个核苷酸以上化学合成法已不再适用(Gallo et al.,2005)，而编码蛋白质的RNA通常都长达几千个核苷酸。目前制备长RNA唯一的方法是体外酶法合成，酶法合成是指在体外以DNA双链为模板利用RNA聚合酶进行转录合成RNA的一种方法，目前这种利用DNA依赖的RNA聚合酶进行体外RNA转录的技术广泛应用于杂交分析、晶体结构研究、生物化学和遗传研究等(Kessler etal.,2017；Romanienko et al.,2016)。这一方法利用一种简单微生物大肠杆菌噬菌体T7的RNA合成机器——单亚基的T7 RNA聚合酶，在体外从带有T7启动子序列的DNA模版上反复转录产生大量所需的RNA。虽然大部分生物自身拥有RNA聚合酶，但是大多都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作体外合成RNA的酶工具，只有来源于某些最小最简单的病毒，如T7噬菌体的单亚基RNA聚合酶适合这类用途。自然界中被鉴定的这类单亚基RNA聚合酶只有来源于噬菌体T7、T3和SP6三种，后两种在序列和功能上与T7 RNA聚合酶高度相似因而基本被摒弃，因而对于RNA合成这样一个重要的生物技术人们现在只有一个酶工具可用。

T7 RNA聚合酶于上世纪70年代被鉴定，当时人们所知的噬菌体只有寥寥几种，其并不是一个最理想的RNA合成工具酶。它的最主要缺点包括提前终止、延伸性能弱、产物末端不均一、必须以一种核苷酸起始、对修饰核苷酸掺入效率低、对产物RNA高级结构敏感等等(Chamberlin and Ring,1973；Lyakhov et al.,1998)，以致很多情况下所需的RNA无法有效合成，因而选择T7作为体外合成RNA的标准酶具有很大的随机性。在随后的数十年中，人们对T7 RNA聚合酶进行了大量的优化和改造，相关论文和专利不计其数，然而这个酶并不是天然为RNA体外合成而设，其主要缺点越来越成为RNA这一热门研究和应用领域的限制因素。海洋蓝细菌噬菌体Syn5(Pope et al.,2007)RNA聚合酶，具有与T7RNA聚合酶基因有微弱相似性的基因。经分子克隆，表达纯化和酶学性质分析，该基因产物确实是一个新的RNA聚合酶(Zhu et al.,2013)。尽管在众多性能方面，尤其是T7系统的几个薄弱环节，Syn5RNA聚合酶显示出明显的优势，但对于体外转录富含高级结构的RNA，Syn5RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶一样都具有转录产物不均一的缺点，这无疑对更多新颖的RNA聚合酶的研究和开发带来需求和挑战。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供新的单亚基RNA聚合酶，可用于体外RNA的合成，与现有的T7、SP6和P60类RNA聚合酶存在显著差异，为RNA研究与应用提供一种有效的候选酶工具。

本发明的另一目的是提供所述单亚基RNA聚合酶在体外转录合成RNA中的应用。

本发明的另一目的是提供所述单亚基RNA聚合酶的纯化方法，可获得纯度较高的KP34 RNA聚合酶。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种单亚基RNA聚合酶，来自

类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或来自与所述

类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25％并含有如序列表SEQID NO.1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在800～830之间的其他噬菌体的单亚基RNA聚合酶；其中，序列表SEQ ID NO.1中每个Xaa独立代表任意氨基酸；

所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有组氨酸标签，所述组氨酸的编码碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；或者，

所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的一种；

所述标签与单亚基RNA聚合酶之间由0～10个氨基酸组成保持柔性的肽段连接。

根据基因排列及相似性进行的分类研究发现，噬菌体T7、T3与SP6亲缘关系较近，因而它们的RNA聚合酶性质相似；而以Syn5为代表的海洋短尾噬菌体则与上述噬菌体进化关系较远，反映在Syn5RNA聚合酶的大小、序列和功能上也与T7 RNA聚合酶差异较大，因而形成新的RNA合成工具和系统。

类噬菌体与上述短尾噬菌体亲缘关系更远，成员间异质性较大，推测其RNA聚合酶转录体系与已知的噬菌体转录体系差异很大。T7类、SP6类、P60类(含Syn5)和

类的亲缘关系参见图1(Druliskawa et al.,2011)。

本发明单亚基RNA聚合酶排除了T7、SP6和P60类RNA聚合酶，T7及SP6类RNA聚合酶含有883(+/-15)个氨基酸，P60类RNA聚合酶含有779(+/-15)个氨基酸。

所述如序列表SEQ ID NO.1所示的特征氨基酸序列，经研究发现，该序列为来自

类噬菌体KP34、VP93、RSB1、

的RNA聚合酶同源序列，为RNA聚合酶发挥催化活性的关键氨基酸序列。

在所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端连接标签，利于后续进行亲和层析纯化得到不含RNA酶污染的应用级蛋白质。所述保持柔性的肽段可采用现有富含甘氨酸或丝氨酸的串联组合，例如Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser等，其中也可包含蛋白酶切位点如Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser，它们的作用是使所关联的标签充分展示，同时不影响RNA聚合酶的正确折叠。更优选的，所述保持柔性的肽段为Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His。

优选地，所述的单亚基RNA聚合酶，为

类噬菌体KP34的RNA聚合酶，所述标签与KP34的RNA聚合酶之间的肽段由10个氨基酸组成；在KP34的RNA聚合酶基因5’末端前30个碱基处带有所述如序列表SEQ ID NO.2所示的组氨酸标签。

噬箘体KP34属于

类噬菌体，是一种从污水中浓缩分离得到的新型病毒，其宿主为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae strains)。肺炎克雷伯氏菌是一种革兰氏阴性菌，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，噬箘体KP34也被认为是治疗肺炎克雷伯氏菌的候选疗法之一。噬箘体KP34的基因组为典型的双链DNA结构，其基因组大小为43809bp，共含有57个开放阅读框。实验证明，噬菌体KP34的RNA聚合酶单个蛋白质就可以在体外高效完成RNA的合成，且与已知的T7类和Syn5类单亚基RNA聚合酶在氨基酸序列、蛋白质大小、进化地位以及功能特征等方面存在显著差异。

迄今为止，尚没有对短尾噬箘体KP34的RNA聚合酶的研究报道，而目前所有体外合成RNA的RNA聚合酶都来自于与KP34亲缘关系较远的短尾噬菌体，因而本发明认为噬箘体KP34可作为探索新颖RNA聚合酶的候选目标，申请人对KP34的RNA聚合酶进行了表达及纯化，确定了KP34 RNA聚合酶的功能，并发现了其在RNA合成与应用中的优势，开发出一种全新的用于体外转录的RNA聚合酶工具。

发明人通过基因克隆的方法，得到了KP34的RNA聚合酶基因，将其插入到原核表达载体pET-28b中，然后转到大肠杆菌中进行诱导表达，为了得到高纯度及活性的RNA聚合酶，申请人进一步利用镍柱层析、Blue亲和层析、5′-ATP–agarose纯化、蛋白透析、凝胶过滤层析、磷酸纤维柱层析等多种方法对表达的蛋白进行纯化及纯化方法的优化，最终优化了纯化条件和纯化方法，得到了高纯度的RNA聚合酶。为了检验得到的RNA聚合酶的活性，申请人进行了体外转录实验，发现获得的RNA聚合酶活性较高，体外合成RNA转录效率高。

本发明还提供所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成RNA中的应用。

利用所述的单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成RNA的方法，包括如下步骤：

S1.获得编码所需RNA的DNA转录模板；

S2.加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH7.9Tris-HCl，氯化镁，亚精胺，DTT，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应。

优选的，步骤S2所述转录反应的时间为1～2h。当转录时间达到1h以上可以得到大量的转录产物，转录效果较好，综合考虑转录反应时间为1～2h较佳。

本发明还提供所述进行体外转录合成RNA的方法在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用。

本发明还提供所述单亚基RNA聚合酶的纯化方法，包括如下步骤：

(1)镍柱亲和层析：将所述噬菌体的菌体裂解上清液通过镍柱，带所述标签的蛋白与镍柱结合，加入由低浓度到高浓度的咪唑溶液与镍柱竞争结合洗脱蛋白，带有所述标签的目的蛋白在加入高浓度的咪唑溶液时被洗脱，收集目的蛋白；

(2)Blue亲和层析：使用5mL HiTrap Blue HP进行亲和层析，用结合缓冲液平衡5-10个柱体积，控制液体流速为2-5mL/min；将步骤(1)处理后的蛋白样品以同样的流速过柱，用结合缓冲液洗5-10个柱体积，最后使用5-10个柱体积洗脱缓冲液通过不断提高盐离子强度进行洗脱并收集蛋白；

(3)5′-ATP–agarose纯化：将5′-ATP–agarose树脂用水清洗后用中性缓冲液平衡树脂；将步骤(2)处理的蛋白样品过柱，再按由低到高浓度的顺序用含有10-100mM ATP或ADP的平衡缓冲液进行连续梯度洗脱，并不断提高盐浓度减少非特异结合的蛋白，收集洗脱蛋白；

(4)蛋白透析：将步骤(3)获得的蛋白进行多次透析，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

优选地，所述纯化方法，步骤(1)所述咪唑溶液的浓度由低到高分别为20uM、50uM、100uM三种浓度，由pH8.0、50mM磷酸二氢钠和300mM NaCl对咪唑进行稀释得到。

优选地，所述纯化方法，步骤(2)所述结合缓冲液含有pH7.0、50mM磷酸二氢钾或pH7.0、20mM磷酸钠；所述洗脱缓冲液含有pH7.0、50mM磷酸二氢钾和0-1.5M KCl，或含有pH7.0、20mM磷酸钠、0-2M NaCl；

步骤(3)所述中性缓冲液含有pH7.5、10mM HEPES，25mM NaCl，0.5mM DTT，1mMEDTA和10％甘油。

优选地，所述纯化方法，所述步骤(4)具体步骤包括：将步骤(3)获得的蛋白加入透析袋中密封后置于1L透析液中进行透析，2.5～3h后更换干净透析液继续透析2.5～3h，最后再次更换透析液透析过夜，收集透析后蛋白保存；所述透析液含有pH7.5、20mM磷酸二氢钾，0.1mM DTT，0.1mM EDTA，50％甘油。

优选地，所述纯化方法，步骤(1)采用的噬菌体的菌体裂解上清液由如下方法获得：

基因扩增及蛋白表达：利用PCR的方法扩增RNA聚合酶的基因，将其克隆到原核表达载体pET-28b的酶切位点NdeI和NotI之间，得到重组载体后转化E.coli BL21(DE3)；之后将菌置于37℃含有50ug/ml卡那的LB培养基中摇床培养至OD600值接近1.2，然后加入终浓度为0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)于30℃摇床诱导表达3h；

细菌裂解：将诱导表达获得的混合物在5000rpm、4℃离心15min，收集菌体沉淀，将菌体重悬于含有50mM磷酸二氢钠(pH8.0)、300mM NaCl、0.5mg/ml溶菌酶、0.5mM DTT的裂解液中，立即于-80℃冷冻，凝固后取出置于冰上融化1h，接着再反复冻融两次；35000rpm、4℃离心1h，离心后将上清转移，将分离出的上清液通过0.45μm孔径的滤膜过滤进一步去除杂质，过滤后的细胞裂解上清液可直接用于镍柱纯化或4℃短暂保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种新的RNA聚合酶、以及其纯化和使用的方法，其转录效率较高。在与现有T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶相比较时，针对后二者在合成富含稳定高级结构RNA时产物复杂的问题，KP34 RNA聚合酶显示出转录产物均一的显著优点。

附图说明

图1所示本发明

类噬菌体与T7类、SP6类、P60类噬菌体的亲缘关系图。

图2所示为实施例1中SDS-PAGE电泳检测KP34 RNA聚合酶的纯化效果图；M代表蛋白Marker。

图3所示为实施例2中利用KP34 RNA聚合酶进行体外转录不同时间的结果图；泳道1至泳道5分别为KP34 RNA聚合酶转录0h、0.5h、1h、2h、4h的转录结果；上方条带为DNA模版，下方条带为RNA产物。

图4所示为对比例1中利用两步纯化的KP34 RNA聚合酶进行体外转录结果图。

图5所示为对比例2中不同RNA聚合酶合成具有强二级结构的RNA结果图；泳道1为Syn5 RNA聚合酶的转录结果，泳道2和泳道3为KP34 RNA聚合酶的转录结果，泳道4为T7 RNA聚合酶的转录结果。

具体实施方式

本发明的单亚基RNA聚合酶可以为来自

类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或者，也可以是其他噬菌体的单亚基RNA聚合酶，经大量研究，并通过对

类噬菌体的单亚基RNA聚合酶进行同源比对，得到的关键序列如序列表SEQ ID NO.1所示，将其作为本发明单亚基RNA聚合酶的特征氨基酸序列；同时，本发明RNA聚合酶还需满足以下两个条件①与所述

类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25％及②总氨基酸序列数目在800～830之间；最后，经标签修饰得到的上述RNA聚合酶均可以达到本发明所述的有益效果。

由于实验原理大体相同，以下实施例仅以

类噬菌体KP34 RNA聚合酶为例，本发明包含的其他单亚基RNA聚合酶均可以参照实施例中的方法获得RNA体外转录结果。所有本发明所述的单亚基RNA聚合酶的氨基酸序列均可在基因序列查询网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上查询。

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1KP34 RNA聚合酶基因扩增及蛋白表达纯化

(1)KP34 RNA聚合酶基因扩增及蛋白表达

利用PCR的方法扩增KP34 RNA聚合酶的基因，将其克隆到原核表达载体pET-28b的酶切位点NdeI和NotI之间，使其基因5’末端融合48个碱基长度的DNA片段，该DNA片段编码所述如序列表SEQ ID NO.2所示的组氨酸标签以及标签与KP34 RNA聚合酶之间保持柔性的连接肽段，连接肽段序列为Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His，将得到的重组载体转化E.coli BL21(DE3)，之后将菌置于37℃含有50ug/ml卡那的LB培养基中摇床培养至OD₆₀₀值接近1.2，然后加入终浓度为0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)于30℃摇床诱导表达3h。

(2)KP34 RNA聚合酶的纯化

细菌裂解：将步骤(1)获得的混合物在5000rpm、4℃离心15min，收集菌体沉淀，将菌体重悬于含有50mM磷酸二氢钠(pH8.0)、300mM NaCl、0.5mg/ml溶菌酶、0.5mM DTT的裂解液中，立即于-80℃冷冻，凝固后取出置于冰上融化1h，接着再反复冻融两次；置于冷冻高速离心机中35000rpm、4℃离心1h，离心后将上清转移至另一干净的离心管中，然后将分离出的上清液通过0.45μm孔径的滤膜过滤进一步去除杂质，过滤后的细胞裂解液可直接用于镍柱纯化或4℃短暂保存。

镍柱纯化：配制含有50mM磷酸二氢钠(pH8.0)、300mM NaCl的洗脱缓冲液，利用洗脱缓冲液对咪唑进行稀释，得到20uM、50uM、100uM三种浓度的咪唑溶液备用；使用10倍镍柱填料体积的洗脱缓冲液平衡镍柱，然后将所述过滤后的细胞裂解液缓慢流过镍柱，下一步按照由低浓度到高浓度的顺序分批加入20uM、50uM、100uM的咪唑溶液过柱，洗脱非特异性结合的杂蛋白并最终将与镍柱结合的蛋白竞争性的洗脱下来；在加入不同浓度梯度的咪唑溶液洗脱时，每一浓度洗脱下来的蛋白液需用若干干净的冻存管保存，并按洗脱的先后顺序及咪唑浓度作好标记，最后将所有洗脱下来的蛋白液通过SDS-PAGE电泳进行检测，选择较高纯度的KP34 RNA聚合酶于4℃保存。

Blue亲和层析：使用5mL HiTrap Blue HP(GE Healthcare)进行亲和层析；配制含有50mM磷酸二氢钾(pH7.0)或20mM磷酸钠(pH7.0)的结合缓冲液，另外配制含有50mM磷酸二氢钾(pH7.0)、1.5M KCl或20mM磷酸钠(pH7.0)、2M NaCl的洗脱缓冲液备用，用结合缓冲液平衡5-10个柱体积，控制液体流速为2-5mL/min，将蛋白样品以同样的流速过柱，用结合缓冲液洗5-10个柱体积，最后使用5-10个柱体积洗脱缓冲液通过不断提高盐离子强度进行洗脱并收集蛋白。

5′-ATP–agarose纯化：将5′-ATP–agarose树脂(Sigma-Aldrich)用水清洗后用中性缓冲液(10mM HEPES,pH 7.5,25mM NaCl,0.5mM DTT,1mM EDTA和10％甘油)平衡树脂，按由低到高浓度的顺序用含有10-100mM ATP或ADP的平衡缓冲液进行连续梯度洗脱，并不断提高盐浓度减少非特异结合的蛋白，收集洗脱蛋白。

蛋白透析：剪取一段10-15cm透析袋，底部用重力夹夹紧，将蛋白加入透析袋中然后塑料夹封口，将加有蛋白的透析袋置于1L含有20mM磷酸二氢钾(pH7.5)、0.1mM DTT、0.1mM EDTA、50％甘油的透析液中，加入磁珠后置于磁力搅拌器上搅拌促进溶液交换，透析约3h后更换干净透析液继续透析3h以上，最后再次更换透析液透析过夜，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

(3)SDS-PAGE电泳检测KP34 RNA聚合酶纯化效果

透析后进行SDS-PAGE电泳，然后利用考马斯亮蓝染色对透析后的KP34 RNA聚合酶的纯度进行检测，结果如图2所示，可以看出透析后蛋白条带单一，说明KP34 RNA聚合酶经过以上纯化步骤后得到的纯度较高。带有组氨酸标签和连接肽段的KP34 RNA聚合酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

实施例2利用KP34 RNA聚合酶进行体外转录

(1)转录反应模板的获取及纯化

通过PCR方法扩增pUC19载体序列，使前引物上带有KP34 RNA聚合酶的启动子序列，PCR反应体系总体积为20ul：2X PrimeSTAR Max 10ul，pUC19质粒1ng，双蒸水补至20ul。扩增条件：95℃预变性1min；95℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸45s、35个循环；72℃终延伸5min，16℃保存2min。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测是否扩增出单一条带。使用PCR产物纯化试剂盒DNA Clean&Concentrator^TM-5(购自ZYMO RESEARCH生物科技公司)对PCR产物进行纯化，具体纯化步骤如下：

a.加入5倍PCR产物体积的DNA Binding Buffer与PCR产物混合均匀；

b.将混合液加入Zymo-Spin^TM Column中，12000rpm离心30s后去除废液；

c.加入200μl DNA Wash Buffer到吸附柱中，12000rpm离心30s后去除废液；

d.重复上一步骤一次；

e.将吸附柱转移至一干净的收集管中，加入20ul DEPC水，静置1min后12000rpm离心30s洗脱DNA。

(2)体外转录反应

体外转录反应的体系成分如下：40mM Tris-HCL(pH7.9)，6mM MgCl₂，2mM亚精胺，10mM DTT，200μΜ ATP、GTP、CTP、UTP，0.3ul RNA酶抑制剂，0.2ul焦磷酸酶，1μΜ KP34 RNA聚合酶，20ng/ul转录模板，补DEPC水至10ul。将反应体系混合好后置于37℃进行转录，分别在转录0.25h、0.5h、1h、2h、4h取1ul转录产物加入甲酰胺和EDTA配置的上样缓冲液后冻存。对不同转录时间的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，当转录时间达到1h以上可以得到了大量的转录产物，转录效果较好。

比较例1

本对比例与实施例1的方法大体相同，不同之处在于，KP34 RNA聚合酶的纯化的步骤中仅通过镍柱纯化和蛋白透析得到纯化后的蛋白，镍柱纯化和蛋白透析的方法与实施例1相同，透析后进行SDS-PAGE电泳，获得单一条带，说明蛋白达到了较高纯度。

将本对比例纯化后的蛋白按照实施例2的方法进行体外转录，对转录产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，可以发现，两步纯化方法得到的蛋白虽然表观能达到较高的纯度，但是大肠杆菌内源的RNA酶依然存在，因此转录产量低，效果较差。

对比例2T7、Syn5、KP34三种噬菌体RNA聚合酶体外转录效果的比较

(1)转录模板的获取

利用合成DNA单链再退火成双链的方法获得转录模板(武汉金开瑞生物工程有限公司合成)，采用PAGE纯化方式，将单链用DEPC水溶解稀释至50μΜ，然后分别吸取20ul50uM完全互补的正向和反向引物，再加入5ul 10x引物退火缓冲液混合均匀后于金属浴95℃5min，然后关闭金属浴电源，自然降温至室温以完成双链退火，双链模板的终浓度为20μΜ。转录模板如序列表SEQ ID NO.4所示。

(2)体外转录反应

进行体外转录反应的体系与实施例2中的体外转录反应的体系完全一致，除了将KP34 RNA聚合酶替换成T7或Syn5RNA聚合酶，带有同样的组氨酸标签(如序列表SEQ IDNO.2所示)和保持柔性的肽段(Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His)。将反应体系混合好后置于37℃进行转录4h。配置12％TBE胶进行电泳，利用EB染色，结果如图5所示，利用KP34 RNA聚合酶进行转录得到的RNA产物比T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶单一，特异性更强。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉核圣生物技术有限公司

<120> 单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(14)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 1

Asp Xaa Arg Xaa Arg Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Gln

1 5 10 15

Gly Xaa Asp Xaa Xaa Lys

20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catcatcatc atcatcac 18

<210> 3

<211> 838

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His

1 5 10 15

Met Ile Ser Ala Leu Ser Thr Val Val Val Pro Glu Glu Ala Leu Val

20 25 30

Lys Arg Gln Leu Glu Leu Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Arg Gly Ile Glu

35 40 45

Arg Ala Arg Lys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Gln Asn Gly Gly Ile Met

50 55 60

Asn Leu Pro Met Thr Gln Arg Met Leu Thr Ser Ala Tyr Glu Val Ala

65 70 75 80

Ala Ala Ala Ile Asp Glu Met Arg Asn Val Lys Ala Pro Gly Ile Gly

85 90 95

Gly Lys Tyr Arg Arg Phe Leu Arg Leu Ile Pro Leu Asp Val Leu Thr

100 105 110

Thr Leu Ser Leu Cys Thr Met Phe Glu Ala Phe Ser Val Ala Pro Gly

115 120 125

Glu Ser Ala Ser Arg Arg Gln Thr Ala Gln Ala Val Met Ser Ala Leu

130 135 140

Gly Arg Asn Val Gln Ser Glu Leu Leu Ser Leu Gln Leu Arg Asn Val

145 150 155 160

Ala Pro Ala Tyr Met Asp Arg Val Tyr Glu Tyr Leu Thr Glu Arg Arg

165 170 175

Thr Lys Ser Pro Thr His Ile Leu Arg Thr Leu Arg Ala Ser Ala Glu

180 185 190

Asn Val His Tyr Gly His Glu Pro Trp Thr Asn Ala Gln Asn Ile Ser

195 200 205

Val Gly Arg Leu Leu Cys Ala Ala Val Phe Glu Thr Gly Leu Phe Gln

210 215 220

Trp Lys Thr Gly Ser Gly Asn Leu Ser Met Leu Tyr Pro Ala Asp Asp

225 230 235 240

Val Met Glu Ala Phe Gln Gln Leu Val Glu Ser Ala Asp Thr Val Thr

245 250 255

Met Lys Pro Pro Met Leu Val Pro Pro Val Gln His Thr Thr Met Trp

260 265 270

Asp Gly Gly Tyr Leu Thr Pro Ile Asp Asn Arg Gly Thr Tyr His Asn

275 280 285

Ser His Ile Asp Arg Thr Arg Leu Arg Glu Val Ala Glu Ala Phe Lys

290 295 300

Ser Ala Asp Gly Ile Lys Lys Ala Leu Asn Lys Ala Gln Glu Thr Pro

305 310 315 320

Tyr Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Glu Leu Val Gln Glu Ala Arg Ala

325 330 335

Leu Gly Ile Gly Val Gly Met Pro Arg Ser Val Pro Glu Pro Lys Pro

340 345 350

Glu Trp Tyr Leu Asp Gly Val Pro Lys Glu Asn Tyr Thr Glu Glu Glu

355 360 365

Leu Asp Arg Phe Gly Glu Trp Lys Thr Arg Met Ser Leu Trp Tyr Ser

370 375 380

Ala Asp Arg Lys Arg Val Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Thr Thr Leu

385 390 395 400

Glu Met Ala Glu Glu Phe Lys Asp Glu Lys Ala Leu Tyr Phe Pro Thr

405 410 415

Cys Val Asp Trp Arg Tyr Arg Leu Tyr Phe Lys Ser Ser Leu His Pro

420 425 430

Gln Gly Ser Asp Leu Gln Lys Ala Leu Leu Glu Phe Gly Arg Gly Lys

435 440 445

Pro Leu Gly Asp Arg Gly Leu Phe Trp Leu Lys Val His Val Ala Thr

450 455 460

Cys Phe Gly Tyr Asp Lys Thr Leu Phe Glu Asp Arg Ala Ala Trp Val

465 470 475 480

Asp Ala Asn Phe Ala Glu Ile Glu Gln Leu Thr Val Ser Pro Phe Asp

485 490 495

Cys Pro Ala Phe Thr Ser Ala Asp Ser Pro Trp Cys Leu Leu Ala Ala

500 505 510

Ala Ile Asp Leu Val Asn Ala Val Arg Ser Gly Cys Pro Glu Glu His

515 520 525

Ile Ser Arg Ile Pro Val Ala Met Asp Ala Thr Asn Ser Gly Gly Gln

530 535 540

His Leu Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Val Gly Gly Arg Leu Thr Asn

545 550 555 560

Leu Tyr Trp Glu Gly Asn Asp Lys Lys Ala Asp Leu Tyr Met Asp Val

565 570 575

Lys Arg Arg Thr Asp Glu Lys Val Ile Leu Asp Leu Asp Lys Glu Asp

580 585 590

Phe Ile Ile Gln Ser Thr Tyr Trp Arg Glu Asn Glu Ile Thr Arg Ser

595 600 605

Met Thr Lys Arg Pro Ser Met Thr Tyr Phe Tyr Ser Ala Thr Val Arg

610 615 620

Ser Cys Ser Asp Tyr Ile Phe Glu Gly Ala Cys Ala Glu Gly Tyr Glu

625 630 635 640

Gly Thr Asp Thr Asn Ser Leu Trp Asn Leu Ser Cys Tyr Leu Ala Pro

645 650 655

Arg Met Arg Ala Ala Ile Glu Glu Ala Asn Pro Ala Ala Ala Ala Val

660 665 670

Met Gly Tyr Leu Gln Asn Leu Ala Arg Arg Val Pro Ala Ser Gln His

675 680 685

Leu Gln Trp Tyr Thr Pro Leu Gly Gly Leu Val Met Asn Arg Tyr Thr

690 695 700

Gln Arg Glu Glu Val Arg Val Arg Ile Asp Cys Met Asn Leu Ser Ala

705 710 715 720

Val Leu Val His Asn Arg Asp Phe Lys Thr Cys Asn Lys Arg Lys Ala

725 730 735

Ala Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His Ser Leu Asp Ser Thr His

740 745 750

Leu Met Met Val Leu Cys Ala Ala Glu Gly Leu Asp Ile Val Pro Ile

755 760 765

His Asp Ser Leu Ala Thr His Ala Ala Asp Val Asp Asp Met His Arg

770 775 780

His Ile Arg Glu Gln Phe Val Arg Leu Tyr Glu Glu Asn Asp Leu Leu

785 790 795 800

Gly Asp Ile Thr Arg Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Leu Thr Asp

805 810 815

Leu Asp Met Pro Glu Val Gly Thr Leu Asp Ile Arg Gln Val Leu Glu

820 825 830

Ser Pro Phe Phe Phe Cys

835

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaaagcttc ggctggtgca gtggcctcat aagaggcggc ccctaacagg 50

Claims (8)

1.单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，所述单亚基RNA聚合酶为来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端含有组氨酸标签，所述组氨酸的编码碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

或者，所述单亚基RNA聚合酶为来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶，所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端含有FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的一种；所述标签与单亚基RNA聚合酶之间由0~10个氨基酸组成保持柔性的肽段连接。

2.根据权利要求1所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，为φKMV类噬菌体KP34的RNA聚合酶，所述标签与KP34的RNA聚合酶之间的肽段由10个氨基酸组成；在KP34的RNA聚合酶与肽段形成的融合蛋白的氨基端处带有如序列表SEQ ID NO.2所示的组氨酸标签。

3.根据权利要求1或2所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA的方法包括如下步骤：S1.获得编码所需RNA的DNA转录模板；S2.加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH7.9 Tris-HCl，氯化镁，亚精胺，DTT，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应。

4.根据权利要求3所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，步骤S2所述转录反应的时间为1~2h。

5.根据权利要求1或2所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，所述单亚基RNA聚合酶的纯化方法包括如下步骤：（1）镍柱亲和层析：将所述噬菌体的菌体裂解上清液通过镍柱，带所述标签的蛋白与镍柱结合，加入由低浓度到高浓度的咪唑溶液与镍柱竞争结合洗脱蛋白，带有所述标签的目的蛋白在加入高浓度的咪唑溶液时被洗脱，收集目的蛋白；（2）Blue亲和层析：使用5 mL HiTrap Blue HP进行亲和层析，用结合缓冲液平衡5-10个柱体积，控制液体流速为2-5 mL/min；将步骤（1）处理后的蛋白样品以同样的流速过柱，用结合缓冲液洗5-10个柱体积，最后使用5-10个柱体积洗脱缓冲液通过不断提高盐离子强度进行洗脱并收集蛋白；（3）5’-ATP–agarose纯化：将5’-ATP–agarose树脂用水清洗后用中性缓冲液平衡树脂；将步骤（2）处理的蛋白样品过柱，再按由低到高浓度的顺序用含有10-100 mM ATP或ADP的平衡缓冲液进行连续梯度洗脱，并不断提高盐浓度减少非特异结合的蛋白，收集洗脱蛋白；（4）蛋白透析：将步骤（3）获得的蛋白进行多次透析，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

6.根据权利要求5所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，步骤（1）所述咪唑溶液的浓度由低到高分别为20 uM、50 uM、100 uM三种浓度，由pH8.0、50 mM磷酸二氢钠和300 mM NaCl对咪唑进行稀释得到。

7.根据权利要求5所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，步骤（2）所述结合缓冲液含有pH 7.0、50 mM磷酸二氢钾或pH 7.0、20 mM磷酸钠；所述洗脱缓冲液含有pH 7.0、50 mM磷酸二氢钾和0-1.5 M KCl，或含有pH 7.0、20 mM磷酸钠、0-2 M NaCl；步骤（3）所述中性缓冲液含有pH 7.5、10 mM HEPES，25 mM NaCl，0.5mM DTT，1 mM EDTA和10%甘油。

8.根据权利要求5所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用，其特征在于，所述步骤（4）具体步骤包括：将步骤（3）获得的蛋白加入透析袋中密封后置于1 L透析液中进行透析，2.5~3 h后更换干净透析液继续透析2.5~3 h，最后再次更换透析液透析过夜，收集透析后蛋白保存；所述透析液含有pH 7.5、20 mM磷酸二氢钾，0.1 mMDTT，0.1 mM EDTA，50%甘油。

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