CN110144338A - 一种以rna为模板的rna聚合酶制备方法及该聚合酶的应用 - Google Patents

一种以rna为模板的rna聚合酶制备方法及该聚合酶的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法及该聚合酶的应用，该制备方法以alpha坏死病毒属病毒作为原料，利用含聚合酶结构域且无N‑末端的跨膜区或跨膜区突变的病毒复制蛋白为基础制备重组蛋白，获得具有RNA依赖的RNA聚合酶，具体为首先选取番茄丛矮病毒科的alpha坏死病毒属病毒作为原料；然后利用截短或突变除去病毒RNA的N‑末端的跨膜区，得到模板RNA；最后通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成；采用本发明的方法获得重组蛋白，其RNA产量大于1毫克/毫升，适合工业化RNA的合成与生产。

Description

一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法及该聚合酶的应用
技术领域
本发明属于酶生产技术领域，具体的，涉及一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法及该聚合酶的应用。
背景技术
RNA是真核细胞与原核细胞中的一种重要成分，它参与转录、翻译等多种重要的的功能，转录即基因组信息转移，基因组信息是指DNA信息，将这一信息由细胞核转移至细胞质，翻译是指将转录信息翻译为氨基酸或蛋白质，而RNA聚合酶是以一条DNA链或RNA为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶，因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶；
在现有技术中，无法通过RNA模板高效地合成RNA，因此导致该技术无法应用于工业化生产，为了解决这一问题，本发明提供了以下技术方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法及该聚合酶的应用。
本发明需要解决的技术问题为：
在现有技术中，无法以RNA为模板高效的合成RNA聚合酶，导致无法适用于工业化的RNA聚合酶合成与生产。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法，包括如下步骤：
a、选取番茄丛矮病毒科的alpha坏死病毒属病毒作为原料；
b、利用截短或突变除去病毒RNA的N-末端的跨膜区，以去除病毒蛋白的细胞毒性并增强重组蛋白的可溶性；
c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。
作为本发明的进一步方案，所述步骤b中通过突变除去N-末端的跨膜区的具体方法为缺失突变或点突变；
作为本发明的进一步方案，在细胞外制备目标RNA时，首先RNA聚合酶通过原核表达或真核表达后通过初提装置初步纯化，成为酶制品，在细胞外的缓冲液环境中，利用目标模板RNA合成互补链RNA，在本发明的一个实施例中，缓冲液由100mM KCl、5mM MgCl2与pH7.5的50mM Tris-HCl组成；
所述初提装置包括主动结构、从动结构、传导结构与隔音外壳，其中主动结构通过传导结构与从动结构连接，主动结构、从动结构与传导结构固定设置在隔音外壳内；
所述主动结构包括底盘、超声圆环、超声槽、超声发生装置与主动电机，所述底盘为圆盘结构，底盘的一面上固定超声圆环，超声圆环与底盘同心设置，其中超声圆环上环形阵列分布有超声槽，超声槽内固定设置有超声发生装置，超声槽内乘装有纯净水；底盘与超声圆环相背的一面连接有主动电机，主动电机固定安装在隔音外壳的底部；
传导结构包括联接块、升降电机、螺纹杆与限位固定杆，所述底盘安装超声圆环的一面上固定有联接块，联接块为圆柱结构，联接块与底盘同心设置，联接块内同心固定有升降电机，升降电机连接有螺纹杆，螺纹杆与联接块垂直设置且螺纹杆与联接块同心设置，联接块上还垂直固定有至少两个限位固定杆，若干限位固定杆以螺纹杆为圆形环形阵列分布；
所述从动结构包括圆柱形的板芯件、固定套接在板芯件侧壁上的离心转盘以及以离心转盘圆心为中心环形阵列分布的若干试管套，所述板芯件上对应螺纹杆开有螺纹孔，板芯件上对应限位固定杆开有光滑孔，所述试管套的内壁为弹性材料制成且试管套为两端开口的管式结构，试管套的长度小于试管的长度，即试管的底部延伸出试管套，作为本发明的进一步方案，所述弹性材料为橡胶材料；
作为本发明的进一步方案，所述限位固定杆的底部设置有纤维块，防止试管套内的试管与超声槽的底部发生撞击；
本发明所述初提装置的工作方法为：
通过升降电机驱动螺纹杆转动以驱动从动结构上下移动，方便操作人员进行操作，将待破碎的一定浓度的细胞加入试管中，将试管加入试管套固定后，通过升降电机将各试管对应移动至超声槽内，关闭隔音外壳后，开启超声处理，一段时间后，停止超声，并开启主动电机，进行离心操作，本发明能够进行超声-离心同时操作或循环操作，减少细胞浆液的频繁移动，相较于现有技术中通过探针直接进行超声来解决超声-离心同时操作或循环操作十分麻烦的情况，减少细胞被污染的概率，并且降低了清洗消毒等工序的难度。
通过初提装置提纯真核表达的RNA聚合酶的方法为：首先超声处理20-30min，通过超声对真核细胞进行初步破碎，再在30000g条件下离心1-1.5h，同时进行处理，然后不超声，在50000g的条件下离心2h，得到初步纯化的RNA聚合酶；
作为本发明的进一步方案，在细胞内制备目标RNA时，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中，在真核细胞内表达后，利用细胞内的目标模板RNA合成互补链RNA；所述真核表达载体包括哺乳动物表达载体、昆虫表达载体、酵母表达载体；
作为本发明的进一步方案，对病毒来源的蛋白可以通过但不局限于添加标签序列的方式，以便于原核或真核表达后的纯化；
作为本发明的进一步方案，提高聚合酶酶活的方法包括但不局限于：提高细胞内基因的拷贝数、提高酶的表达水平、改变酶的序列从而提高稳定性、去除引起抑制的氨基酸残基与改变蛋白质的转运和胞内聚集；
作为本发明的进一步方案，通过将与模板RNA互补配对的短RNA与模板形成双链结构，利用该双链结构作为引物，能够促进互补链RNA的合成，提高RNA合成效率；
作为本发明的进一步方案，通过将模板RNA的3’末端设计为与自身互补配对，并将配对后的末端RNA作为引物，能够促进互补链RNA的合成。
在本发明的一个实施例中，所述步骤a中所述番茄丛矮病毒科的alpha坏死病毒属具体为烟草坏死病毒Ac(Tobacco necrosis virus-Ac)，其中烟草坏死病毒Ac的复制蛋白编码区序列中，1-668位包含穿膜区(即有下划线部分)，669-2234位包含RNA聚合酶活性，通过截短或突变将序列中1-668位的穿膜区除去，以序列中669-2234位作为RNA模板来合成互补链RNA，其RNA产量大于1mg/mL。
本发明的有益效果：
本发明利用含聚合酶结构域且无N-末端的跨膜区或跨膜区突变的病毒为基础制备重组蛋白，其RNA产量为模板RNA量的95％以上，适合工业化RNA的合成与生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。
图1为烟草坏死病毒Ac的复制蛋白编码区序列；
图2为初提装置的结构示意图；
图3为主动结构的局部结构示意图；
图4为从动结构的局部结构示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法，包括如下步骤：
a、选取烟草坏死病毒Ac作为原料；
b、利用截短或突变除去病毒RNA的N-末端的跨膜区，以去除病毒蛋白的细胞毒性并增强重组蛋白的可溶性；
c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。
所述步骤b中通过突变除去N-末端的跨膜区的具体方法为缺失突变；
在细胞外制备目标RNA时，首先RNA聚合酶通过原核表达或真核表达后通过初提装置纯化，成为酶制品，在细胞外的缓冲液环境中，利用目标模板RNA合成互补链RNA，缓冲液由100mM KCl、5mM MgCl2与Ph7.5的50mM Tris-HCl组成；
如图1所示，所述初提装置包括主动结构、从动结构、传导结构与隔音外壳4，其中主动结构通过传导结构与从动结构连接，主动结构、从动结构与传导结构固定设置在隔音外壳4内；
如图1、图2所示，所述主动结构包括底盘31、超声圆环34、超声槽32、超声发生装置33与主动电机35，所述底盘31为圆盘结构，底盘31的一面上固定超声圆环34，超声圆环34与底盘31同心设置，其中超声圆环34上环形阵列分布有超声槽32，超声槽32内固定设置有超声发生装置33，超声槽32内乘装有纯净水；底盘31与超声圆环34相背的一面连接有主动电机35，主动电机35固定安装在隔音外壳4的底部；
传导结构包括联接块21、升降电机22、螺纹杆23与限位固定杆24，所述底盘31安装超声圆环34的一面上固定有联接块21，联接块21为圆柱结构，联接块21与底盘31同心设置，联接块21内同心固定有升降电机22，升降电机22连接有螺纹杆23，螺纹杆23与联接块21垂直设置且螺纹杆23与联接块21同心设置，联接块21上还垂直固定有至少两个限位固定杆24，若干限位固定杆24以螺纹杆23为圆形环形阵列分布；
如图1、图3所示，所述从动结构包括圆柱形的板芯件11、固定套接在板芯件11侧壁上的离心转盘12以及以离心转盘12圆心为中心环形阵列分布的若干试管套13，所述板芯件11上对应螺纹杆23开有螺纹孔，板芯件11上对应限位固定杆24开有光滑孔，所述试管套13的内壁为弹性材料制成且试管套13为两端开口的管式结构，试管套13的长度小于试管的长度，即试管的底部延伸出试管套13，作为本发明的进一步方案，所述弹性材料为橡胶材料；
作为本发明的进一步方案，所述限位固定杆24的底部设置有纤维块，防止试管套13内的试管与超声槽32的底部发生撞击；
本发明所述初提装置的工作方法为：
通过升降电机22驱动螺纹杆23转动以驱动从动结构上下移动，方便操作人员进行操作，将待破碎的一定浓度的细胞加入试管中，将试管加入试管套13固定后，通过升降电机22将各试管对应移动至超声槽32内，关闭隔音外壳4后，开启超声处理，一段时间后，停止超声，并开启主动电机35，进行离心操作，本发明能够进行超声-离心同时操作或循环操作，减少细胞浆液的频繁移动，相较于现有技术中通过探针直接进行超声来解决超声-离心同时操作或循环操作十分麻烦的情况，减少细胞被污染的概率，并且降低了清洗消毒等工序的难度。
通过将与模板RNA互补配对的短RNA与模板形成双链结构，利用该双链结构作为引物，能够促进互补链RNA的合成，提高RNA合成效率；
如图1所示，烟草坏死病毒Ac的复制蛋白编码区序列中，1-668位包含穿膜区(即有下划线部分)，669-2234位包含RNA聚合酶活性，通过截短或突变将序列中1-668位的穿膜区除去，以序列中669-2234位作为RNA模板来合成互补链RNA，其RNA产量为模板RNA量的95％以上。
实施例2
一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法，包括如下步骤：
a、选取烟草坏死病毒Ac作为原料；
b、利用截短或突变除去病毒RNA的N-末端的跨膜区，以去除病毒蛋白的细胞毒性并增强重组蛋白的可溶性；
c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。
所述步骤b中通过突变除去N-末端的跨膜区的具体方法为点突变；
在细胞内制备目标RNA时，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中，在真核细胞内表达后，利用细胞内的目标模板RNA合成互补链RNA；所述真核表达载体为哺乳动物表达载体；
通过将模板RNA的3’末端设计为与自身互补配对，并将配对后的末端RNA作为引物，能够促进互补链RNA的合成。
如图1所示，烟草坏死病毒Ac的复制蛋白编码区序列中，1-668位包含穿膜区(即有下划线部分)，669-2234位包含RNA聚合酶活性，通过截短或突变将序列中1-668位的穿膜区除去，以序列中669-2234位作为RNA模板来合成互补链RNA，其RNA产量为模板RNA量的95％以上。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、选取番茄丛矮病毒科的alpha坏死病毒属病毒作为原料；
b、利用截短或突变除去病毒RNA的N-末端的跨膜区，得到模板RNA；
c、通过原核表达或真核表达在细胞内或细胞外进行RNA聚合酶的合成。
2.根据权利要求1所述的一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法，其特征在于，步骤b中通过突变除去N-末端的跨膜区的具体方法为缺失突变或点突变。
3.根据权利要求1所述的一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法，其特征在于，所述番茄丛矮病毒科的alpha坏死病毒属病毒具体为烟草坏死病毒Ac。
4.根据权利要求1所述的一种以RNA为模板的RNA聚合酶制备方法制备得到的聚合酶，其特征在于，该RNA聚合酶用于在细胞内或细胞外制备目标RNA。
5.根据权利要求4所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，在细胞外制备目标RNA时，首先RNA聚合酶通过原核表达或真核表达后通过初提装置进行纯化，成为酶制品，在细胞外的缓冲液环境中，利用目标模板RNA合成互补链RNA。
6.根据权利要求4所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，在细胞内制备目标RNA时，将聚合酶模板RNA构建在真核表达载体中，在真核细胞内表达后，利用细胞内的目标模板RNA合成互补链RNA。
7.根据权利要求6所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，所述真核表达载体包括哺乳动物表达载体、昆虫表达载体、酵母表达载体。
8.根据权利要求4所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，将与目标模板RNA互补配对的短RNA与所述模板RNA形成双链结构，并以该双链结构作为引物，合成互补链RNA。
9.根据权利要求4所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，将目标模板RNA的3’末端设计为与自身互补配对，并将配对后的末端RNA作为引物，合成互补链RNA。
10.根据权利要求5所述的RNA聚合酶的应用，其特征在于，所述初提装置包括主动结构、从动结构、传导结构与隔音外壳(4)，其中主动结构通过传导结构与从动结构连接，主动结构、从动结构与传导结构固定设置在隔音外壳(4)内；
所述主动结构包括底盘(31)、超声圆环(34)、超声槽(32)、超声发生装置(33)与主动电机(35)，所述底盘(31)为圆盘结构，底盘(31)的一面上固定超声圆环(34)，超声圆环(34)与底盘(31)同心设置，其中超声圆环(34)上环形阵列分布有超声槽(32)，超声槽(32)内固定设置有超声发生装置(33)，超声槽(32)内乘装有纯净水；底盘(31)与超声圆环(34)相背的一面连接有主动电机(35)，主动电机(35)固定安装在隔音外壳(4)的底部；
传导结构包括联接块(21)、升降电机(22)、螺纹杆(23)与限位固定杆(24)，所述底盘(31)安装超声圆环(34)的一面上固定有联接块(21)，联接块(21)为圆柱结构，联接块(21)与底盘(31)同心设置，联接块(21)内同心固定有升降电机(22)，升降电机(22)连接有螺纹杆(23)，螺纹杆(23)与联接块(21)垂直设置且螺纹杆(23)与联接块(21)同心设置，联接块(21)上还垂直固定有至少两个限位固定杆(24)，若干限位固定杆(24)以螺纹杆(23)为圆形环形阵列分布；
所述从动结构包括圆柱形的板芯件(11)、固定套接在板芯件(11)侧壁上的离心转盘(12)以及以离心转盘(12)圆心为中心环形阵列分布的若干试管套(13)，所述板芯件(11)上对应螺纹杆(23)开有螺纹孔，板芯件(11)上对应限位固定杆(24)开有光滑孔，所述试管套(13)的内壁为弹性材料制成且试管套(13)为两端开口的管式结构，试管套(13)的长度小于试管的长度。
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