CN101978051A

CN101978051A - 线形病毒组载体及方法

Info

Publication number: CN101978051A
Application number: CN2009801107817A
Authority: CN
Inventors: V·V·多尔亚; V·V·佩雷米斯洛夫
Original assignee: Oregon State
Current assignee: Oregon State
Priority date: 2008-01-31
Filing date: 2009-01-29
Publication date: 2011-02-16
Also published as: EP2240580A4; AU2009210508A1; AU2009210508B2; AR070326A1; EP2240580B1; US20130133109A1; US20100333230A1; EP2240580A2; CL2009000193A1; WO2009099877A2; ES2478041T3; US8415147B2; ZA201005866B; WO2009099877A3

Abstract

本公开内容涉及开发和应用基于线形病毒组的载体用于递送核苷酸至植物。具体地说，本公开内容提供基于葡萄卷叶伴随病毒-2的载体用于在植物尤其是葡萄植物中递送和表达基因。还设想了制造和使用这些载体的方法以及由这些载体转化的植物。

Description

线形病毒组载体及方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2008年1月31日的美国临时申请第61/063,305号和提交于2008年7月24日的第61/083,504号的权益，所述申请案通过整体引用结合于本文中。

发明领域

本公开内容涉及线形病毒组和其用作植物基因递送载体的领域。

发明背景

葡萄树(葡萄属)是主要的全球性水果类作物，具有巨大的经济和文化意义，尤其是欧洲葡萄(Vitis vinifera)，其用于葡萄酒发酵。因为植株是杂合的并且不纯种传代，所以相对少量的欧洲葡萄栽培种在商业上用于保持果实的一致性。因此，因为如此多的商用葡萄作物依赖于这些栽培种(其具有有限的多样性)，所以主要关心的是抗病性。为提高抗病性的传统育种技术通常削减水果质量，使得葡萄树成为遗传操作提高抗病性的主要候选者。然而，转基因葡萄树的生产已证明是困难的，因为木本多年生植物例如葡萄树以对转化具有抗性而知名，且由于未转化细胞的外来竞争作用，农杆菌介导转化所需的选择方法显著地更苛刻，这导致高度易变的成功率(Mullins等，Meth.Mol.Bio.344：273-285，1990；Bouquet等，Methods Mol.Biol.344：273-285，2006)。因此，对可靠的、有效的方法存在需求，该方法用于给葡萄树递送基因用于疾病治疗和为了所需形状修饰葡萄树。

过去二十年中，用于植物和动物中蛋白瞬时表达的病毒载体成为分子生物学和生物医学必不可少的工具(Pogue等，Annu.Rev.Phytopathol.40：45-74，2002；Gleba等，Curr Opin Biotechnol 18：134-141，1007)。随着RNA干扰(RNAi)或RNA沉默的出现，病毒载体也被开发用于病毒诱导的基因沉默或VIGS(Godge等，Plant Cell Rep27(2)：209-219，2008；e-pub ahead of print，2007)。总之，迅速地过表达或沉默目的基因的能力使得病毒载体在功能性基因组学中成为重要的工具。

多种植物病毒已被改造为病毒载体，每种都有局限性和植物特异性。多数仅适用于双子叶草本植物。基本上，二十面体病毒主要由于它们衣壳的有限大小而不适合容纳外来基因。一般，较长的病毒已表现出较好的容纳重组基因并以极高水平表达它们的能力。目前，最通常使用的载体为基于棒状烟草花叶病毒(TMV，烟草花叶病毒组属)的载体(Pogue等，Annu.Rev.Phytopathol.40：45-74，2002；Gleba等，CurrOpin Biotechnol 18：134-141，1007)。这些载体的特征为高表达水平但相对低的遗传稳定性，尤其是遇到大的外来插入片段时。

另一系列的载体基于棒状烟草脆裂病毒(TRV，烟草花叶病毒组属)(Godge等，Plant Cell Rep 27(2)：209-219，2008；网上公开于出版前，2007)。从丝状病毒获得的载体通常基于马铃薯X病毒(PVX，马铃薯X病毒组属)(Chapman等，Plant J 2：549-557，1992)和烟草蚀斑病毒(TEV，马铃薯Y病毒组属)(Dolja等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10208-10212，1992)。TMV、TRV和PVX载体包含具有亚基因组RNA启动子的表达盒，而TEV载体利用基于多蛋白加工的替代性蛋白表达原理。后者的特征提供遗传稳定性比含启动子载体高得多的马铃薯Y病毒组载体(Dolja等，Virology 252：269-274，1998)。

已开发出基于甜菜黄化病毒(BYV，线形病毒组属)的基因表达载体(Hagiwara等，J.Virol.73：7988-7993，1999；Peremyslov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96，14771-14776，1999)。虽然线形病毒载体可实现的蛋白表达水平可能比TMV或TRV低，但是基于其额外的异源亚基因组RNA启动子或多蛋白加工，这些载体已证明在遗传上极为稳定且能容纳多个表达盒。线形病毒载体的这种多能性很可能是由于大的线形病毒基因组和存在以下基因，其显著增加基因组复制能力和基因表达能力并可提供增加的RNA复制保真性(Dolja等，Virus Res.117：38-51，2006)。RNAi的强阻抑基因(Reed等，Virology 306：203-209，2003；Chiba等，Virology 346：7-14，2006)和线形病毒组的前导蛋白酶(Peng等，J.Virol.75(24)，12153-12160，2001)是以下基因之一，其保证线形病毒组的高遗传和高进化性能并为容纳额外的基因(病毒的或外来的)预处理它们的基因组。

病毒载体的其中一个最关键特征是其宿主范围，该范围严重地限制其对所需作物的潜在应用。上述所有载体都仅能感染双子叶草本植物。换言之，给单子叶植物或木本作物例如葡萄树产生病毒载体的需求支配着将天然感染这种植物的病毒用作载体开发平台的需求。

至今，非常少潜在适合于木质植物的病毒载体已被开发出，资料显示的表达通常局限于狭窄范围的模型植物。这些载体的一种是基于苹果潜隐球状病毒RNA 2(ALSV，伴生病毒科)(Li等，Arch.Virol.149：1541-1558，2004)。虽然作者声称ALSV载体在机械接种至苹果树苗时能通过多蛋白加工表达绿色荧光蛋白(GFP)，但是论文中没有出现关于这种能力的令人信服的实验证据。同样的，没有数据可用于支持近来宣称的基于番茄黄色卷叶双生病毒(Tomato yellow leaf curl geminivirus)的“通用”载体，据说其能系统地感染多种植物从双子叶植物至单子叶植物直至树和藤。(Peretz等，Plant Physiol.145(4)：1251-1263，2007)。另一种载体为使用葡萄病毒A(GVA，葡萄病毒属)开发的。在烟草上展示了其表达外来蛋白的能力(Haviv等，J.Virol.Meth.132：227-231，2006)，但依然未对葡萄树证明。另一种载体基于柑桔衰退病毒(CTV)，一种与BYV紧密相关的线形病毒组(Folimonov等，Virology 368(1)：205-216，2007)。然而，CTV仅用于柑桔属，且在用分离的病毒体裂口接种柑桔树前，其繁殖涉及在原生质体中进行循环的麻烦方法。因此，对适于转化木质植物的特别是葡萄树的病毒载体存在强烈需求。

发明概述

本公开内容涉及复制型的植物基因转移载体，所述载体包含核酸，该核酸编码来自葡萄卷叶伴随病毒-2(LR-2)的选自甲基转移酶、RNA解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶和p24的病毒基因；前导蛋白酶L1和L2；及有效连接至启动子的异源多核苷酸，其中异源多核苷酸在植物细胞中表达；其中所述载体在植物细胞中能感染性复制。

本公开内容还包括条件复制型植物基因转移载体，所述载体包含核酸，该核酸编码来自葡萄卷叶伴随病毒-2(LR-2)的选自甲基转移酶、RNA解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶和p24的病毒基因；前导蛋白酶L1和L2，其中至少一个前导蛋白酶是失活的，使得载体不能独立地感染性复制；及有效连接至启动子的异源多核苷酸，其中异源多核苷酸在植物细胞中表达。

任选地，本文提供的载体也可包括来自葡萄卷叶伴随病毒-2(LR-2)的一个或多个病毒基因，该基因涉及病毒体组装和/或植物内转运。这种基因包括例如p6、Hsp70h、p63、CPm、CP和p19。在特定实施方案中，所有这些基因包含在载体内，从而促进系统性感染。这种载体可指全长载体；在本文中描述了这种载体的实例。

在所述载体中的异源多核苷酸可编码一个或多个报道分子、选择标记或治疗基因，治疗基因可编码所需蛋白例如用于改善植物的营养特征或美感性，或编码抗病性基因，其可为抗真菌、抗细菌或抗病毒的基因。所述治疗基因可用于皮尔斯病(Pierce’s disease)的治疗，例如引发病毒诱导的基因沉默或编码溶菌酶多肽的多核苷酸。

所述前导蛋白酶可为来自LR-2的L1和/或L2。该前导蛋白酶(例如SEQ ID NO：4或6)可由SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：5编码。该前导蛋白酶之一或两者可通过载体中前导蛋白酶编码序列的置换、插入、部分缺失或完全破坏而失活。

所述载体还可包含用于转化植物细胞的T DNA序列。该载体可包含甜菜黄化病毒或其它相关线形病毒组的启动子或天然LR-2启动子。可引入多于一种载体进入植物，例如编码治疗基因的载体和编码p24RNAi阻抑基因的载体。

也设想了包含本文中所述载体的植物细胞或植物，例如葡萄树细胞或葡萄树。

也提供制备所述载体的方法，包括培养包含该载体的细胞和从细胞或培养细胞的培养基中回收载体。该载体可任选在质粒中，例如适于细菌扩增的质粒和/或适于农杆菌接种的双元质粒。

另一个实施方案为在植物细胞中表达异源基因的方法，包括将本发明的载体引入植物细胞中。在一个实施方案，所述植物细胞为葡萄树细胞。在另一个实施方案，所述载体为通过农杆菌接种法引入。

另一个实施方案为在植物细胞中表达异源基因的方法，包括将复制型载体引入植物细胞使得所述载体随后复制并感染至少一个其它的植物细胞。该方法还包括系统性感染选自组织、叶、茎、根、果实、种子或整株植株的植物结构。

另一个实施方案为引入抗病性的方法，包括将本发明的载体引入植物细胞。该载体可引入多于一次。该载体可包含异源多核苷酸，其编码赋予对疾病抗性的基因。这种异源多核苷酸可为例如引发病毒诱导的基因沉默、Run1多核苷酸或编码溶菌酶多肽的多核苷酸。

另一个实施方案为在葡萄树中治疗或预防皮尔斯病或白粉病的方法，包括将本发明的载体引入葡萄树细胞。该载体可通过农杆菌接种法引入并可引入多于一次。

另一个实施方案为修饰美感性(例如汁液的味道和香味)、或提高植物的营养或其它农业特性的方法，包括将本发明的载体引入植物细胞。

另一个实施方案为制备转基因植物的方法，包括将本发明的载体引入植物细胞和在促进植物生长的条件下培养植物细胞，其中异源基因在转基因植物中表达。转基因植物可为葡萄树。

根据下面参照附图进行详述的几个实施方案，前述的和其它的特征和优点将变得更显而易见。

附图简述

图1A-1C为GLRaV-2基因组的基因图，表明病毒基因的功能(图1A)、用于重组基因表达的盒(图1B)和包含带有ER-GFP插入物的全长GLRaV-2基因组的双元载体(图1C)。(图1A)依据所编码的蛋白命名基因：(图1B)LR-2CP启动子，启动CP基因表达的天然LR-2启动子；ER-GFP，内质网靶向型绿色荧光蛋白；BYV CP启动子，源自甜菜黄化病毒的工程异源启动子，启动CP基因的表达；Pac I和Fse I，相应限制性核酸内切酶的工程位点。(图1C)按顺时针方向从左起：35S，源自花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)的35S RNA聚合酶II启动子(箭头)；～17,500nts，约17,500核苷酸长、通过插入ER-GFP标记的LR-2的全长cDNA克隆(矩形，标注为～17,500nts)；RZ，定制的核酶，当插入的DNA在植物细胞核内转录时其促进自催化释放LR-r RNA的3’-端(带箭头的矩形，标注为RZ)；RNA聚合酶II的NOS终止子；右缘，识别序列，质粒DNA由农杆菌在此切割以传递进植物细胞(弯曲箭头)；Ori，质粒复制起点(箭头)；Kan^R，卡那霉素抗性基因；左缘，识别序列，质粒DNA由农杆菌在此切割以传递进植物细胞(弯曲箭头)。

图2显示了使用共聚焦激光扫描显微镜在不同比例下的以农杆菌接种法用GLRaV-2/ER-GFP感染的烟草本塞姆氏(N.benthamiana)细胞。由于病毒表达ER-GFP标记，绿颜色标出该受病毒感染细胞的内质网。红色背景是由于叶绿体的自身荧光。线段，50mm。

图3显示了通过表面荧光显微镜取得的组织图像，该组织来自以农杆菌接种法用GLRaV-2/ER-GFP系统性感染的烟草本塞姆氏的植株，该植株(底排)与未感染的植株对照(顶排)相比较。绿颜色高亮突出被病毒感染并表达ER-GFP的韧皮细胞。在显微成像前将茎和叶柄人工横向切开。红色背景是由于叶绿体的自身荧光。

图4(图4A)使用CP特异性抗体对提取物的免疫印迹分析，该提取物来自野生型病毒和修饰为表达ER-GFP的病毒感染的植株(如图下方所示)。初始叶片提取物的稀释度显示在上方。(图4B)RNA的RT-PCR分析，RNA分离自被野生型病毒和修饰为表达ER-GFP的病毒感染的烟草本塞姆氏植株。RT-PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中分离并用溴化乙锭染色。M，DNA大小标记；用箭头标示的条带相应为1kb和2kb DNA。

图5上部，显示双元载体的设计图，该载体表达p24，24-kDa的RNA沉默的LR-2阻抑基因，其克隆至双元载体pCB302上。TEV前导，cDNA序列相当于烟草蚀斑病毒的5’-非翻译区并用于增强p24的翻译。下部，被miniBYV-GFP单独感染(左栏)及miniBYV-GFP和p24共表达感染(右栏)的罕见细胞的共聚焦图。图像来自Chiba等(Virology 346：7-14，2006)。

图6在烟草本塞姆氏16c系中病毒载体LR-GFP的GFP转基因沉默。在对照中，由于转基因GFP的产生，所有细胞为绿色。在感染植株，亮绿色细胞为病毒在其中制造额外GFP的那些细胞。红色区域包含以下细胞：在其中由于病毒诱导的RNA干扰，转基因GFP被沉默。

图7(图7A)在微繁殖的品丽珠(Cabernet franc)叶中GFP的最大表达，GFP利用农杆菌通过超声处理引入。(图7B)较不易感的叶，然而其显示在叶脉中表达GFP。GFP直接从如(图7C)所示改造的双元载体表达。

图8由农杆菌渗入法产生的用miniLR-2-GFP感染的葡萄树，显示了接种叶和单个GFP表达型绿色细胞的图像(顶行)及miniLR-GFP复制子的基因图。L1和L2，前导蛋白酶；MET，甲基转移酶功能区；HEL，RNA解旋酶功能区；POL，RNA-依赖性RNA聚合酶；GFP，绿色荧光蛋白；p24，24-kDa蛋白。

图9由农杆菌渗入法产生的用全长LR-2-GFP感染的葡萄树，显示了接种叶和单个GFP表达型绿色细胞的图像。

图10(图10A)GLRaV-2病毒、全长载体(LR_GFP)和微载体(mLR-GFP/GUS)的示意图。(图10B)具有蛋白水解加工、基因表达和感染的前导蛋白酶L1和L2的结构域导致所示的烟草本塞姆氏。

图11如图示以HA-标记(图11A)和放射性同位素标记(图11B)处理载体。

图12(图12A)载体的长距离转运和系统性感染烟草本塞姆氏叶。(图12B)GFP在烟草本塞姆氏叶中积累。(C)接种后烟草本塞姆氏的上叶中基因表达的缺失。

图13梯度的免疫印迹分析，该梯度来自分离自被感染烟草本塞姆氏叶的病毒体的蔗糖分级分离。

图14GLRaV-2载体的烟草本塞姆氏衍生(Nb；上道)变体和欧洲葡萄衍生(Vv，下道)变体的核苷酸序列比对。两种分离物中不同的核苷酸以粗体和下划线表示。

序列表

列于本文中的核酸和/或氨基酸序列和/或随附的序列表是以核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母码(定义于37C.F.R.§1.822)显示的。各核苷酸序列仅显示一条链，但是互补链应理解为通过对展示链的任何引用而包含于其中。随附序列表中：

SEQ ID NO：1为p35S-LR-2/ERGFP的核酸序列，其为全长的葡萄卷叶病毒-2衍生的基因表达和沉默载体，包含编码ER-靶向型GFP报道基因的重组基因。该序列包含双元载体pCB301(1-3305)及整个病毒表达盒(3306-21957)。显示于图1C的下列特征也反映在序列中：35S启动子(3306-4063)、包含GFP报道基因表达盒(18648-19439)的病毒序列(4064-21643)、异源BYV CP启动子(18440-19723)、核酶(21644-21698)和NOS终止子(21705-21957)。

SEQ ID NO：2为MiniLR-GFP/GUS的核酸序列。

SEQ ID NO：3和4为蛋白酶L1的核苷酸序列和氨基酸序列。

SEQ ID NO：5和6为蛋白酶L2的核苷酸序列和氨基酸序列。

SEQ ID NO：7为全长的葡萄卷叶伴随病毒-2衍生的基因表达和沉默载体的核苷酸序列，所述载体包含编码ER-靶向型GFP报道基因的重组基因(LR2-Vitis)。所有葡萄卷叶伴随病毒-2的核苷酸序列对应于天然存在于黑比诺葡萄树中的病毒分离群的共有序列。不同于出现在最初烟草本塞姆氏衍生病毒核苷酸(SEQ ID NO：1)的核苷酸在图14中突出显示。病毒表达盒外的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的相同。

SEQ ID NO：8为典型的欧洲葡萄染色体基因组序列，包含推定的韧皮部特异性启动子、AtSUC2直向同源启动子(GSVIVT00002302001_VvSUC27_AF021810_Genomic)和适于韧皮部特异性表达的LR-2载体。

SEQ ID NO：9为典型的欧洲葡萄染色体基因组序列，包含推定的韧皮部特异性启动子、AtAHA3直向同源启动子(VV78X258876_VITISV_014422_AM487422_CAN64375_Genomic)和适于韧皮部特异性表达的LR-2载体。

SEQ ID NO：10为典型的欧洲葡萄染色体基因组序列，包含推定的韧皮部特异性启动子、AtAsus1直向同源启动子(VV78X051063_CAN82840_VITISV_024563_GI147856448_Genomic)和适于韧皮部特异性表达的LR-2载体。

SEQ ID NO：11为血凝素表位(HA)标记的氨基酸序列。

发明详述

除非另有指出，按照习惯用法使用技术术语。分子生物学常用术语的定义可见Benjamin Lewin，Genes V，牛津大学出版社出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：aComprehensive Desk Reference，由VCH出版社出版，Inc.，1995(ISBN1-56081-569-8)。为了帮助阅读本发明的各实施方案，本文提供具体术语的说明。

术语“葡萄树”“葡萄植物”或“葡萄树植物”指葡萄属或圆叶葡萄(Muscadinia)属的任何植物(例如欧洲葡萄、美洲葡萄(V.labrusca)、河岸葡萄(V.riparia)、圆叶葡萄(V.rotundifolia)、夏葡萄(V.aestivalis))，及其种。所述葡萄树可为接穗、根茎、栽培种或杂交株。术语“葡萄”为葡萄树的浆果或果实，其可吃整个或可从其榨出汁液用于喝和/或发酵成酒。葡萄树其它可吃的部分包括叶和种子。

除非另有说明，本文所使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同。除非上下文明显指出，所述单数术语“一”“一个”和“这”包括复数所指对象。同样的，除非上下文明显指出，“或”意在包括“和”。因此“包括A或B”意思为包括A、或B或A和B。也应该理解的是，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量值或分子质量值都是大概的，只是用于说明。尽管在本发明的实施或测试中能使用与本文所描述的类似或等同的方法和材料，但在下面描述适合的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利或其它参考文献都通过整体引用结合。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的任何说明)为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性，并不意在限制。

几个实施方案的综述

本公开内容提供基因转移载体，其至少包括葡萄卷叶伴随病毒-2(LR-2)的复制基因。LR-2已测序(Meng等，Virus Genes 31：31-41，2005)并已与其它已知线形病毒组在功能上比较(Dolja等，Virus Res.117(1)：38-51，2006)。两篇参考文献都通过引用结合到本文。LR-2的核心病毒基因包括Met(甲基转移酶)、Hel(RNA解旋酶)和Pol(RNA-依赖性RNA聚合酶)，而与BYV的同源基因比较，L1、L2和p24在基因组复制上起辅助作用。其它基因也可包含在本发明载体中，例如p6、Hsp70h、p63、CPm、CP和p19(参见，例如Peremyslov等，J.Virol.72：5870-5876，1998，其通过引用结合到本文中)。

本公开内容涉及包含前导蛋白酶L1和L2的载体，和其中一个或两个前导蛋白酶失活的载体。本领域的技术人员能立即认识到有无数的方法能令蛋白酶失活，且本文已设想了所有这些方法。对相关的线形病毒组BYV，相应的前导蛋白酶L-Pro对有效的RNA扩增和病毒的长距离转运是必需的，这些以前已有说明(Peng等，J.Virol.77，2843-2849，2003；Peng & Dolja，J.Virol.74，9766-9770，2000)。令人感兴趣的是，用来自其它线形病毒组(Peng等，J.Virol.75(24)，12153-12160，2001)或甚至动物动脉炎病毒属(Peng等，Virology 294，75-84，2002)的蛋白酶代替L-Pro能拯救RNA扩增，但不能拯救前导蛋白酶的转运功能。葡萄卷叶伴随病毒-2(GLRaV-2)在线形病毒组属中是BYV近亲，其遗传构成与BYV几乎一样(Zhu等，J.Gen.Virol.79：1289-1298，1998)。然而，不像BYV含有一个前导蛋白酶，GLRaV-2编码两个前导蛋白酶L1和L2(Meng等，Virus Genes 31，31-41，2005；Peng等，J.Virol.75(24)，12153-12160，2001)(图1A，上图)。本文第一次表明L1和L2在最初接种的细胞中建立GLRaV-2感染和系统性转运中具有互补功能。引人注意的是，与实验性草本宿主烟草本塞姆氏相比，在天然病毒宿主葡萄树中L1和L2对病毒感染的总体贡献是更为关键的。因此，利用L1和L2的特性，用于将异源基因引入葡萄树的载体可构建为复制型的(包含L1和L2两者)或条件复制型的(具有失活的一个或两个前导蛋白酶)。

复制型载体为在转运中不需提供额外的因子就能产生侵染性病毒体的载体。在接种或转导进入植物细胞后，这种载体产生侵染性的病毒体并感染其它细胞。因为所述载体可传播到最初的转导细胞外并增加总体转导作用，这种载体在当需要系统性感染植物时可能很有用。例如，所述载体可在组织内传播、组织间传播、贯穿整株植株传播或甚至植株间传播。例如，所述载体可感染整片叶、多于一片叶、一片或多片叶和植物的茎或果实，以及根。

条件复制型载体缺乏独立产生侵染性病毒体所必需的病毒因子。本公开内容包括以下载体，其具有一个或两个失活的前导蛋白酶，使得所述载体不能产生侵染性病毒体，在接种或转导后也不能感染其它细胞。当不需要传播载体或有限传播是有益的时候，这种载体可能有用。由于载体的传播以及异源基因的表达不会超出最初的转导，所述载体可增加安全性。

在具体实施方案中，本文所提供的植物转化载体包括一个或多个来自葡萄卷叶伴随病毒-2(LR-2)的病毒基因，其涉及病毒体组装和/或植物内转运。这些基因包括例如p6、Hsp70h、p63、CPm、CP和p19。在特定实施方案，所有这些基因都包括于载体内，从而促进系统性感染。这种载体可指全长载体。

整个LR-2基因组(或基本所有基因组，或其相等物)可包括于载体内。所述载体可包含额外的异源序列，例如促进繁殖或转化的序列。这种序列可为农杆菌感染的控制元件，例如双元载体，这为本领域众所周知。所述载体可具有如本文提供的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或可用不同异源序列代替作为实例提供的报道基因(GFP和GUS)。所述载体的前导蛋白酶可为来自LR-2的L1(SEQ IDNO：4)和/或L2(SEQ ID NO：6)，也可分别由SEQ ID NO：3和5编码。此外，RNA沉默的阻抑基因也可用载体引入。这种阻抑基因可为来自甜菜黄化病毒的LR-2 p24或p21(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。

所述载体包括有效连接至启动子的异源多核苷酸。所述启动子可为天然LR-2启动子，例如LR-2CP启动子，或其也可为异源启动子，例如来自属于线形病毒组属其它病毒(例如甜菜黄化病毒)的启动子，例如BYV CP启动子、甜菜黄矮病毒(Beet yellow stunt virus)启动子、香石竹黄点病毒(Carnation yellow fleck virus)启动子、柑桔衰退病毒启动子、薄荷病毒1(Mint virus 1)启动子等。尽管这些病毒的CP启动子通常提供最高表达水平，但是来自这些病毒的一些其它启动子可能有用。很多适合的启动子为本领域已知。所述异源多核苷酸可编码报道分子、选择标记和/或治疗基因。报道分子的实例包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和其它本领域已知的报道分子。选择标记的实例也包括抗生素耐受标记、对亲和纯化有用的表位标记等。治疗基因的实例包括那些赋予对病状或疾病抗性的基因。

本公开内容包括以下方法，其通过将本公开内容的植物基因表达载体引入细胞而在植物或植物细胞中诱导出疾病抗性。葡萄植物的这种疾病包括但不限于真菌性疾病、细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫和环境胁迫。真菌性疾病的实例包括葡萄球座菌(Guignardia bidwellii)(黑腐病)、葡萄属单轴霉(Plasmopara viticola)(霜霉病)、葡萄白粉病(Erysiphe necator)(白粉病，前称葡萄钩丝壳(Uncinula necator))、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(葡萄果梗萎缩病)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)(牙腐菌核病)、Eutypia armenicae(Eutypia dieback)、痂囊腔菌(Elsinoe ampelina)(炭疽病)、链格孢(Alternaria alternata)(alternia rot)、葡萄斑叶四孢藻(Pseudopezicula tetraspora)、细窄尾孢(Cercospora brachypus)、葡萄痂圆孢(Sphaceloma ampelinum)、壳二孢属棘孢曲霉(Ascochyta sp.Aspergillus aculeatus)、芽枝霉属(Cladosporium spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、长蠕孢属(Helminthosporium spp.)、念珠菌属(Monilia sp.)、匍柄霉(Stemphylium botryosumv)、迟熟格孢腔菌(Pleospora tarda)、串珠菌属(Torula sp.)、Greeneria uvicola、Botryosphaeria stevensii、平截色二孢(Diplodia mutila)、青霉菌属(Penicillium spp.)、Botryotinia fuckeliana、Anthostomella pullulans、芽孢梭菌属(Clostridium spp.)、Libertella blepharis、柯柯豆毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)、褐座坚壳(Rosellinia necatrix)、白纹羽束丝菌(Dematophora necatrix)、Roesleriasubterranea、葡萄褐斑病菌(Mycosphaerella personata)、葡萄假尾孢(Pseudocercospora vitis)、褐斑拟棒束孢(Isariopsis clavispora)、Briosia ampelophaga、棉根腐病菌(Phymatotrichopsis omnivora)、白纹羽束丝菌(Dematophora necatrix)、Cristulariella moricola、Grovesinia pyramidalis、头孢属(Cephalosporium spp.)、火木层孔菌(Phellinus igniarius)、毛韧革菌(Stereum hirsutum)、白蔹壳锈菌(Physopella ampelopsidis)和葡萄馒割病菌(Phompopsis viticola)(拟点霉属叶(phomopsis leaf)和茎斑点疾病(cane spot disease))。

细菌性疾病的实例包括苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)(皮尔斯病)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(冠瘿病)、假单胞菌(Pseudomonas syringae)和葡萄嗜木杆菌(Xylophilus ampelmus)(细菌疫病(bacterial blight))。

病毒性疾病的实例包括葡萄卷叶伴随病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄病毒A、葡萄病毒B、番茄环斑病毒、茎痘伴随病毒(Rupestris stempitting associated virus)、烟草环斑病、南芥菜花叶病毒、菊芋意大利潜病病毒(Artichoke Italian latent virus)、苜蓿花叶病毒、布拉迪斯拉发花叶病毒(Bratislava mosaic virus)、蚕豆束枯萎病毒、葡萄草莓潜隐环斑病毒(grapevine strawberry latent ringspot virus)、烟草坏死病毒、烟草花叶病毒、葡萄铬黄花叶病毒、矮牵牛星状花叶病毒和番茄黑环病毒。

害虫的实例包括葡萄根疣蚜(Daktulosphaira vitifoliae)、鳞翅目(Lepidoptera)、葡萄黑耳喙象(Otiorhynchus sulcatus)、半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)、剑线虫属(Xiphinema spp.)、短体线虫(Pratylenchus spp.)、长针线虫属(Longidorus spp.)、钩针线虫(Paratylenchus hamatus)、钩针线虫(Paratylenchus hamatus)、肾形线虫属(Rotylenchulus spp.)、薄叶小环线虫(Criconemella xenoplax)、根结线虫属(Meloidogyne spp.)、螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.)、Paratrichodorus christiei和矮化线虫属(Tylenchorhynchus spp.)。

环境胁迫的实例包括干旱、热胁迫、盐胁迫、铁缺乏、锌缺乏、臭氧和环境毒素。或者，本发明载体可用于赋予对除草剂、杀真菌剂、杀虫剂和杀病毒剂的抗性。

因细菌苛养木杆菌感染引起的皮尔斯病(PD)对葡萄栽培种的种植者特别重要。该细菌在木质部繁殖，引起水移动的堵塞及特征性的叶枯病或叶坏死，尤其在热胁迫或缺水时。处理法目前集中于通过针对在摄食时从植物到植物传播细菌的昆虫载体而预防感染。已知许多昆虫载体，包括各种神射手(sharpshooter)，例如透明羽翼的神射手。很多商业上重要的栽培种易感染PD，因此急需控制这种疾病。

这种疾病的治疗可包括表达治疗蛋白(例如致病生物或侵染性生物的基因)或抑制宿主基因以减少非所需的反应。治疗蛋白的实例包括直接靶向致病生物或致病物的蛋白，例如降解防护性真菌壁的几丁质酶(例如Adams，Microbiology 150：2029-2035，2004)、抑制复制的复制酶(例如WO 98/052964)、攻击细菌壁的溶菌酶或发现于抗病性植物的基因。已表明溶菌酶具有抗细菌性质，可能有效用于抗木质部小菌属。通过引用结合到本文中的美国申请第20020104126号表明在极低pH下有活性的牛溶菌酶可在烟草植物中表达，并在体外试验中保持活性。然而，未试验在木质植物即葡萄树中表达溶菌酶的可行性或其抗木质部小菌属或治疗PD的有效性。葡萄白粉病抗性基因Run1，当其通过假回交(pseudo-backcross)策略转化及使用细菌的人工染色体递送时，已表明能对易感欧洲葡萄赋予抗性(Barker等，Theor.Appl.Genet.111：370-377，2005)。因此，Run1和其它与抗病性有关的基因适用于本文描述的方法和构建物/载体中。

或者，本发明载体可用于诱导RNA沉默(病毒诱导基因沉默或VIGS)而抑制不需要的基因表达，例如来自致病生物或不需要的宿主基因的基因表达。作为用于检验植物基因功能的机理，VIGS为本领域周知的现象(Godge等，Plant Cell Rep 27(2)：209-219，2008；网上公开于出版前，2007)。为诱导VIGS，所述载体可编码来自目标基因的一部分核苷酸序列。该核苷酸序列可来自基因表达转录产物的任何部分，包括蛋白编码区或未翻译序列。

本公开内容的另一个实施方案为将本发明的载体用于引入以下基因，其涉及转导或转基因植物可食用部分的美味修饰，例如汁液的味道或香味。这种可食用部分包括植物的根、茎、叶、花、种子和/或果实，或源自其中的任何可食用物质。特别的是，可修饰葡萄或源自其中的汁液使得影响味觉受体的物质能阻断或增强某种味道，例如苦味、甜味、酸味等。或者，所述物质增强在葡萄或汁液中发现的芳香化合物。这种物质可为蛋白，例如莫内林、竹芋蛋白、味转导素、类萜和其它本领域已知的这种蛋白。为了美味修饰，本公开内容的载体可改造为编码美味修饰分子例如蛋白，然后该载体用于转入植物细胞，该细胞随后表达所述分子。

本公开的方法和载体也可用于引入与葡萄新陈代谢途径(代谢物组学)有关的基因以改进营养特征。例如，已发现发现于葡萄中的多酚化合物(3，4’，5-三羟基二苯乙烯)白藜芦醇具有某种健康益处，例如抗癌特性并与心血管疾病的减少关联。发现于葡萄中有潜在健康益处的其它化合物包括植物营养素例如栎精、儿茶酚、花青素和原花色素。黑比诺葡萄品种的测序以及代谢型分析技术(例如核磁共振分光技术)的发展对开发适合与本文所述载体和表达系统一起使用的基因提供了有价值的信息。其它感兴趣的基因涉及到成熟过程(例如flb基因)，以及植物生长、发育和可能所需的农业生产的任何方面。

本公开内容包括通过将所述植物基因表达载体引入细胞而用于在植物细胞中表达异源基因的方法。所述植物基因转移载体可通过任何本领域已知的方法引入植物细胞中，例如通过真空侵入法、超声处理法、弹射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、聚乙二醇融合法、直接转化法(Lorz等，Mol.Genet.199：179-182，1985)和其它方法。所述载体可以以侵染性病毒颗粒或以非侵染性核苷酸引入。一种方法是农杆菌接种法，例如使所述载体插入具有适合控制元件的双元质粒中以在农杆菌属种(例如根癌农杆菌、发根农杆菌(A.rhizogenes)和葡萄农杆菌(A.vitis))中表达所述载体。这种方法为本领域已知，例如描述于Leiser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9136-9140，1992和Bouquet等，Methods in Mol.Bio.344：273-285，Agrobacterium Protocols，2^d ed.vol.2，Wang ed(2006)的方法，这两篇都通过引用结合。农杆菌属可通过真空侵入或超声处理的方法引入到整株微繁殖的葡萄树植株中。改造为表达病毒载体的农杆菌菌株可与改造为表达RNAi病毒阻抑基因的另一种菌株混合以增加载体感染性(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。

可引入所述载体用于稳定表达或瞬时表达。可通过各种已知方法获得稳定表达，例如使用Bouquet等(Methods Mol.Biol.344：273-285，2006)的方法将胚芽期的葡萄组织与包含所述载体的农杆菌共培养。也可通过各种已知方法获得瞬时表达，例如描述于本说明书实施例中的方法。其它方法包括但不限于叶渗入法、真空侵入法和用包被DNA的粒子轰击目标组织。

也可通过施用含所述载体的溶液(例如通过喷洒)将载体施用于葡萄树或其任何部位。这种溶液包含作为DNA、包被DNA的粒子或包含于农杆菌的载体以及盐和缓冲液。所述溶液可包含例如0.1M pH7的磷酸缓冲液或其可包含烟碱。这种配方为本领域众所周知，可用作适用于本方法的配方。所述溶液还可包含研磨剂，例如金刚砂(例如500目金刚沙、高岭土或

硅藻土)。所述溶液也可包含表面活性剂，例如本领域所周知的Triton或Tween。所述溶液可通过抹、滴、浸泡、喷洒或其它的方法应用于所述植物。参见，例如Graft transmissible diseases of grapevines.Martelli ed.1993，Rome，Italy，Food and Agriculture Organization of the United Nations publ。

本公开进一步包括包含本文所述载体的组合物。除载体和任选的其它功能性成分(例如研磨剂和/或表面活性剂)外，这种组合物可包括适用于将载体引入植物细胞中的赋形剂，例如盐(例如氯化镁)和缓冲液(例如MES或磷酸盐缓冲液)，并且这种组合物通常为水溶液。参见，例如Graft transmissible diseases of grapevines.Martelli ed.1993，Rome，Italy，Food and Agriculture Organization of the United Nations publ。

可每日、每月、每季或每年应用所述载体。可在疾病发作或疾病载体侵袭期间或之前应用所述载体。例如，一年可观察到两次疾病的症状：暮春时叶和茎的变形和坏死，秋天时异常色素沉着和其它畸形(Graft transmissible diseases of grapevines.Martelli ed.1993，Rome，Italy，Food and Agriculture Organization of the United Nations publ)。一旦辨明症状，可施用所述载体，例如通过喷洒含研磨剂的溶液。或者，在疾病的已知载体(例如某种线虫类或葡萄叶蝉)侵袭时，或在已知诱导疾病有利条件的某种天气条件或季节(例如潮湿天气和白粉菌)时，可喷洒于植物。这种情形的指南和目录为本领域众所周知，例如加利福尼亚大学害虫管理指南(University of California Pest Management Guidelines)、全州综合害虫管理系统(Statewide Integrated Pest Manage-ment Systems)(在环球网at.ipm.ucdavis.edu/PMG/r302101211.html(上次访问于2008年1月27日)可获得)，其通过引用结合到本文中。此外，本发明载体可与其它已知抗病剂(例如油类、杀真菌剂等)一起施用。

本公开内容包括转化植物的方法，包括引导所述植物基因一次或多次转入所述植物。可将所述载体引入所述植物2、3、4、5、6、7、8、9、10次或多于10次。所述植物可系统地或局部地表达所述异源多核苷酸。

所述植物细胞可培育成转基因植物，例如使用Bouquet等(Methods Mol.Biol.344：273-285，2006)的方法。或者，所述植物细胞可为多细胞植物的部分，使得植物仅部分转化。例如根状茎、茎或叶可为转化的。可在疾病发作前将所述载体引入以赋予抗性，或可在观测到疾病后将所述载体引入以减少或减轻疾病、保护植物未感染的部分或防止疾病传播至别的植物。

其它引用

Agranovsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(7)，2470-2473，1995

Alzhanova等，Virology 268(1)，192-200，2000

Alzhanova，EMBO J.20，6997-7007，2001

Alzhanova等，Virology 359，220-226，2007

Barrett & Rawlings，Biol.Chem.382，727-733，2001

Boyko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，9156-9160，1992

de los Santos等，J.Virol.80，1906-1914，2006

Ding & Voinnet，Cell 130，413-426，2007

Donson等，Proc Natl Acad Sci USA 88：7204-7208，1991

Dougherty & Semler，Microbiol.Rev.57(4)，781-822，1993

Gabrenaite-Verkhovskaya等，J.Gen.Virol.89，829-838，2008

Gorbalenya等，FEBS Lett 243，103-114，1989

Gorbalenya等，Virus Res.，117(1)：17-37，2006

Gorbalenya等，FEBS Lett.288(1-2)，201-5，1991

Karasev，Annu.Rev.Phytopathol.38，293-324，2000

Kasschau等，Virology 228(2)，251-62，1997

Koonin & Dolja，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.28(5)，375-430，1993

Koonin & Dolja，Virus Res 117，1-4，2006

Lakatos等，EMBO J.25，2768-2780，2006

Lu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，15742-15747，2004

Marillonnet等，Nat.Biotechnol.23：718-723，2005

Napuli等，J.Virol.77，2377-2384，2003

Ng & Falk，Annu.Rev.Phytopathol.44，183-212，2006

Satyanarayana等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，799-804，2004

Satyanarayana等，Virology 278(1)，253-265，2000

Segers等，Eukaryot.Cell 5，896-904，2006

Susaimuthu等，Virus Res.131，145-151，2008

Tian等，J.Gen.Virol.80，1111-1117，1999

Tijms等，J.Virol.81，10496-10505，2007

Torrance等，J.Mol.Biol.357，1-8，2005

Valli等，J.Virol.80，10055-10063，2006

Ziebuhr等，J.Virol.81，3922-3932，2007

Ziebuhr等，J.Gen.Virol.81，853-879，2000

提供以下实例用于阐明某些具体特征和/或实施方案。不应将这些实例理解为限制本发明至描述的具体特征或实施方案。

实施例

寻找本地病毒分离群。进行本地葡萄园的调查以确定LR-2是否天然存在于俄勒冈州，发现展示早期叶变红的LR-2类似症状的葡萄树。用市售LR-2免疫检测试剂盒(Bioreba AG，Reinach，瑞士；Cat.No120775)和定制抗体进行免疫印迹分析，该抗体使用分离自如下所述的烟草本塞姆氏的LR-2病毒体产生。RT-PCR分析也证明葡萄树确实包含所述病毒，该分析使用设计用于扩增LR-2基因组约2kb区域的包含病毒衣壳蛋白基因的引物。

分子克隆和核苷酸测序。为促进LR-2的积累和分离，使用来自感染葡萄树的物质机械地接种烟草本塞姆氏。利用纯化的病毒颗粒得到病毒的RNA，通过RT-PCR扩增，并将cDNA产物克隆进pBlueScript载体质粒。使用RLM-RACE克隆病毒基因组的末端序列。测序大量的独立克隆以提供病毒基因组的多重覆盖。所得到的共有核苷酸序列第一次包括整个病毒基因组并包含正确的5’-末端和3’-末端区域。该序列的比对分析显示与先前公开的纽约LR-2分离群的不完整序列在重叠区域上99.9％一致(Zhu等，J.Gen.Virol.79：1289-1298，1998)。图1A表示了约16,500核苷酸长的LR-2基因组的功能图。

如Goszczynski等描述，用LR-2进行烟草本塞姆氏的初始接种(Vitis 35：133-135，1996)。随后，将烟草本塞姆氏的感染叶用于制备接种物以使病毒在此实验性病毒宿主上繁殖。常规的，将1g感染组织在5ml pH7.00.05磷酸钠缓冲液中磨碎，并在金刚砂的帮助下用于新植株的人工接种。

如Peremyslov和Dolja(Curr.Protocols Microbiol.，“Cloning of Large Positive-Strand RNA Viruses”Suppl.7.，Coico，ed.，11月，2007)中所述(通过引用结合到本文中)，进行全长cDNA克隆的RT-PCR扩增、克隆和组装。

基因表达盒的插入。将在LR-2近亲甜菜黄化病毒(BYV)中启动主要衣壳蛋白表达的强亚基因RNA启动子克隆，并连同Pac I和Fse I单一限制位点插入到部分LR-2cDNA克隆之一中的同功LR-2启动子的下游。将编码靶向内质网的绿色荧光蛋白(ER-GFP)的报道基因插入两个启动子间(图1B)。预期该设计导致来自可靠LR-2启动子的ER-GFP的高水平生产，以及来自重组BYV启动子的LR-2衣壳蛋白的高水平生产，如(Agranovsky等，J.Gen.Virol.72：15-23，1991)中描述和SEQ ID NO：1中阐明的。

LR-2全长cDNA克隆的产生。使用重叠的部分cDNA克隆，在噬菌体SP6RNA聚合酶启动子的控制下，于

(Stratagene，La Jolla，CA)中组装数个包含表达盒的原型全长LR-2克隆。在体外得到相应的加帽RNA转录产物，并用于转染烟草悬浮培养的原生质体和接种烟草本塞姆氏植株。因为这些实验没有一个是导致病毒增殖和感染的，所以重新测序克隆的病毒基因组。检测到多个有害的突变遍及基因组，暗示着在RT-PCR扩增基因组片段的过程中引入了差错。为了可服这个主要障碍，从cDNA片段重组装整个LR-2基因组，该cDNA片段使用逆转录和Klenow DNA聚合酶代替PCR而得到。尽管这个方法导致致命突变数量的显著减少，但所得到的克隆中没有一个是完全没有致命突变的。这些结果表明有功能、无突变形式的LR-2cDNA很可能对用于克隆的大肠杆菌有毒。

可减轻重组DNA毒性的其中一个方法为使用低拷贝数质粒用于克隆。为了测试这种可能性，使用pCB-302(Xiang等，Plant Mol.Biol.40：711-717，1999)和适合在大肠杆菌和根癌农杆菌中克隆的微双元载体。已将该载体修饰为容纳所有对随后使用农杆菌接种法在植物中表达LR-2基因组所必需的控制元件。这些元件包括35S RNA聚合酶启动子、NOS终止子和专门设计用于在LR-2RNA转录时释放其真正3’-末端的核酶。后一加工事件对病毒RNA在植物中复制的能力是关键性的。在这些修饰之后，将全长LR-2cDNA克隆进pCB-302并命名为质粒pCB-LR-GFP(SEQ ID NO：1)。

所述LR-2cDNA克隆到质粒pCB-302的T-DNA右缘和左缘之间。所得到的质粒图示于图1C。整个克隆病毒基因组的核苷酸测序显示没有有害突变。

在烟草本塞姆氏中的感染性测定。将pCB-LR-GFP转化进农杆菌中，培养、诱导所得菌株，并用于烟草本塞姆氏植株的农杆菌渗入。一般在接种后2-3周，一些植株表现出典型的感染症状。共聚焦激光扫描显微镜在渗入叶的表皮细胞中检测到强GFP表达。正如所料，GFP荧光被限制在内质网(ER)和ER源病毒复制复合体的特征网络中(图2)。检查有症状植物的上叶、茎和叶柄，显示在整株植株的韧皮组织高水平的ER-GFP积累，这是LR-2和其它线形病毒组的典型(图3)。感染组织的超微结构分析证实在韧皮细胞尤其在环绕木质部和筛分子的维管束鞘细胞中有大量的丝状LR-2病毒体的积累。此外，免疫印迹分析证实LR-2衣壳蛋白的有效积累(图4A)。这些实验表明克隆的重组LR-2是高侵染性的、能系统性传播和在实验性宿主烟草本塞姆氏中表达重组蛋白。

农杆菌感染效率的改进。尽管LR-2感染一致地出现于农杆菌接种时，但在接种叶中初始感染的细胞数量少且仅部分接种植株形成系统性感染。为了增强重组病毒建立感染的能力，使用基于在接种时表达RNAi的病毒阻抑基因的方法(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。此外，已证明LR-2编码RNAi的非常有效的阻抑基因p24。因此，将改造为表达p24的农杆菌加至接种物。此技术导致由农杆菌产生的病毒特异感染性增加约5000倍(图5)(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。现在常规地就能得到农杆菌接种的烟草本塞姆氏植株的100％感染。

LR-2基因表达载体的遗传稳定性。为了测试LR-2载体是否能保留完整的编码报道蛋白的外来插入物，已从4株单独感染的烟草本塞姆氏植株的顶部叶中分离出RNA。使用这些RNA和位于ER-GFP表达盒下游和上游的引物完成RT-PCR。所得到的PCR产物为预期大小，表明在各测试植株中保留了完整盒(图4B)。重要的是，没有检测到可能源自所述盒部分丢失或全部丢失的较短产物。这些数据证实所述工程载体是遗传稳定的且能用于重组蛋白的有效表达。

用于功能性基因组学和病毒控制的基因沉默载体的开发。为了测试LR-2载体的病毒诱导基因沉默(VIGS)的潜力，使用GFP转基因型烟草本塞姆氏16c系和GFP表达型LR-2。在用LR-2-GFP接种之后，在系统性感染的16c植株的叶上观察到强GFP沉默(图6)。此实验证明LR-2-GFP与已知VIGS载体的作用类似，通过响应病毒同源基因的过量表达诱导转基因的RNAi，这为利用LR-2载体的VIGS这个概念提供了证据。

微繁殖葡萄树并迁移至土壤。为了测试新载体，使用以下技术形成全年稳定供应的实验性葡萄树植株，该技术为在无菌条件下于使用琼脂基生长培养基的塑料盒中微繁殖葡萄树。这种植株可直接用于感染性测定。此外，有未证实的报道指出微繁殖植株对病毒感染具有增加的易感性。或者，可将微繁殖植株迁移至土壤并在温室中培养以得到木本植株，其在易感性上更类似于在开放土壤中生长的植株。将这种迁移的条件最优化，得到持续供应的微繁殖葡萄树植株和温室葡萄树植株。

简而言之，将具有至少两个芽的12英尺插枝捆成20-30根一组，在10％漂白溶液中浸泡10分钟，在水中洗涤三次，然后浸入水中12-24小时。然后将所述捆浸在生根溶液中(Dip’N Grow，Dip’N Grow Inc.，Clackamas，OR)，然后种植在温热至85°F的潮湿的蛭石中。生根出现于3-4周内。然后将所述插枝在设为3秒每8个太阳单位(日间)和3秒每2个小时(夜间)的喷雾床下于盆栽土中植入4-6英尺深。一旦大概2周内出现叶子，减少喷雾以防止霉菌生长。

为了在组织培养中形成葡萄树，摘下新嫩枝并从嫩枝尖摘掉除一片叶外的所有叶。所述嫩枝在0.05％Ivory液体皂(Proctor and Gamble，Cincinnati，OH)中培养10分钟，在水中洗涤1个小时，然后在超声水浴中超声处理10分钟。在5％漂白液中表面消毒该嫩枝6分钟，并移至层流净化罩以消毒处理。在无菌去离子水中洗涤该嫩枝，在碱中平衡并种植于OH琼脂培养基中。在生长室中培养该嫩枝2周；加入GS1液，再培养2周，然后移至GS1琼脂培养基。每2周加入新培养基，1个月后将该嫩枝换至下一阶段培养基(GS2，GS3)中。根在GS3培养基中形成。

葡萄OH培养基

成分浓度g/L

M&S盐 3.22g

硫胺素 0.8ml母液(0.5mg/ml)

肌醇 0.100g

蔗糖 7g

NaH₂PO₄ 0.170g

硫酸腺嘌呤 0.08g

调节pH至5.7

琼脂 3g

高压灭菌20分钟，在50℃水浴冷却30分钟，然后加入抗生素：头孢噻肟0.2g。过滤除菌至冷的培养基并混合。分装至无菌的测试管。

葡萄阶段1(GS1)培养基

成分浓度g/L

M&S盐 3.22g

硫胺素 0.8ml母液(0.5mg/ml)

肌醇 0.1g

蔗糖 20g

BAP 2ml母液(0.5mg/ml)

高压灭菌20分钟，在50℃水浴冷却30分钟，然后加入抗生素：头孢噻肟0.2g。过滤除菌至冷的培养基并混合。分装至24只无菌的Magenta盒。

葡萄阶段2培养基

成分浓度g/L

M&S盐 3.22g

硫胺素 0.8ml母液(0.5mg/ml)

肌醇 .025g

蔗糖 15g

NaH₂PO₄ 0.05g

BAP 4ml母液(0.5mg/ml)

IAA 0.5mls IAA母液(1mg/ml)

调节pH至5.3

琼脂 2g

结冷胶 1.2g

高压灭菌20分钟，在50℃水浴冷却30分钟，然后加入抗生素：头孢噻肟0.2g。过滤除菌至冷的培养基并混合。分装至24无菌的Magenta盒。

葡萄阶段3(GS3)培养基

成分浓度g/L

M&S盐 3.22g

硫胺素 0.8ml母液(0.5mg/ml)

肌醇 .025g

蔗糖 12.5g

NaH₂PO₄ 0.05

IAA 1ml母液(1mg/ml)

调节pH至5.3

琼脂 1g

结冷胶 1g

高压灭菌20分钟，在50℃水浴冷却30分钟，然后加入抗生素：头孢噻肟0.2g。过滤除菌至冷的培养基并混合。分装至24只无菌的Magenta盒或12只双层的Magenta盒。

正在微繁殖很多葡萄品种并检测它们对农杆菌渗入的易感性和外来蛋白表达。品丽珠和西哈(Sirah)品种已表明所需的特征。此外，已初步发现转移至无抗生素培养基的无菌植物对农杆菌渗入更易感。

农杆菌制备。为了制备农杆菌，将土壤成分划线至的LB卡那霉素(50μg/ml)琼脂平板上并在28℃培养3天。挑出单菌落并加至LB卡那霉素(50μg/ml)、MES(10mM)和乙酰丁香酮(20μM)的5ml培养物中，并在220rpm和28℃下振荡。如果使用土壤菌株C58GV2260，则加入利福平(50μg/ml)。将初始培养物转移至500ml LB卡那霉素(50μg/ml)、MES(10mM)和乙酰丁香酮(20μM)中，并在28℃振摇过夜(1-20小时)。在室温6000rpm离心培养物10分钟，将细胞团悬浮于20ml诱导缓冲液中，通过与阻抑基因p24的0.1-0.14OD₆₀₀混合并加入额外的诱导缓冲液，对全病毒构建物达到终浓度为2.0OD₆₀₀，或对仅GFP标记构建物达到终浓度为0.7OD₆₀₀。

为了制备所述阻抑基因p24构建物，如上述制备土壤储液，然后悬浮于20ml诱导缓冲液至终浓度0.1OD₆₀₀，以与全病毒构建物悬浮液混合，或至终浓度0.14OD₆₀₀，以与仅GFP标记悬浮液混合。

诱导缓冲液

10mM MgCl₂＝2ml的0.5MgCl₂

10mM MES pH 5.85＝2ml的0.5M pH 5.85的MES/100ml

150μM乙酰丁香酮＝100μl的150mM乙酰丁香酮

微繁殖的葡萄叶或整株植株的农杆菌渗入。通过用31g针刺大叶脉和叶面损伤来自微繁殖植株的健康叶。将单片叶放置在含5-10ml诱导悬浮液的管中，或将整株植株松弛地放在含200ml诱导悬浮液的烧杯中。将所述葡萄树/土壤悬浮液在Branson 3510超声处理水浴中超声处理10分钟，超声处理后在诱导悬浮液中浸泡2-3小时。在无菌纸巾上吸干所述葡萄叶或植株，然后将叶放置在水琼脂平板(7g琼脂/1L水)上，而将整株栽入含盆栽混合物的4英尺盆并自由浇水。将塑料杯紧紧地放置在植株上以减少在生长室的蒸腾。在两周的周期内通过倾斜杯子的角度将周围的空气逐渐引至盆栽植株，直至最终移去塑料杯。

对仅GFP标记构建物在4天后，对全病毒/GFP构建物12-14天后，通过显微镜监测叶的GFP表达。

类似的技术可用于植株的其它部分，例如根茎。

利用农杆菌在葡萄树中表达GFP。在尽力产生LR-2的感染性克隆同时，进行以下实验，目标是开发在葡萄树中重组基因的农杆菌介导瞬时表达技术。设计这些实验用于促进未来在葡萄树中的感染性测试。利用改造用于表达自由GFP报道基因的农杆菌(图7C)和细菌悬浮液真空侵入叶或整株植株的技术，展示了在微繁殖植株中GFP的积累。为此，在22℃的植株生长室中将分离的农杆菌渗入叶保存在Petri皿水琼脂上4天，并用配备着GFP2滤镜和数码照相机的表面荧光立体显微镜Leica MZ 16F(如图7A和B所示)或共聚焦激光显微镜筛选GFP表达。使用配备着488nm激发滤镜和508nm发射滤镜的ZeissLSM 510META(Zeiss，德国)显微镜进行共聚焦激光扫描显微。将制造商提供的软件包用于图像处理。

如上述也测试使用将植株与细菌悬浮液浸入超声水浴中的农杆菌接种替代技术。证明该方法跟渗入法是同样成功的，且具有额外的简单性好处(图7A)。此外，超声处理导致在脉管叶组织频繁表达GFP(图7B)。因为LR-2将优先络合韧皮部，所以此技术有望促进感染。

利用葡萄农杆菌(Agrobacterium vitis)分离物和发根农杆菌(A.rhizogenes)分离物正在进行补充的测试，以确定与传统的根癌农杆菌相比这些细菌是否可在葡萄中提供更高效的农杆菌接种。此外，为了最优化农杆菌渗入和超声处理的方案，正在进行测试农杆菌感染法结合嫁接法(用细菌悬浮液处理ω嫁接插条)及剥皮愈合农杆菌接种技术(将细菌悬浮液应用于被剥皮暴露的韧皮部)的效用以改进转化。

在葡萄树中测定感染性。将两不同的LR-2克隆用于农杆菌接种法：i)miniLR-GFP/GUS(此微基因组仅包括对复制必需的基因加GFP/GUS报道基因，缺乏对病毒组装和植株中转运所必需的基因；SEQ ID NO：2)。所述GFP/GUS报道基因代表GFP和GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)的融合，该GFP可用表面荧光显微镜检测，该GUS具有酶促活性以在原位和体外测定中提供敏感性。miniLR-GFP/GUS的图谱示于图8；相对应的核苷酸序列提供为SEQ ID NO：2；和ii)全长LR-2-GFP(SEQ ID NO：1)。当筛选用与p24表达质粒混合的miniLR2-GFP/GUS进行农杆菌接种的微繁殖植株时，观察到大量的在ER中表达ER-GFP报道基因的感染细胞(图8)，表明所述微载体在葡萄叶细胞中复制和表达报道蛋白的能力。因此，表面荧光或共聚焦激光扫描显微镜检测到的各GFP阳性细胞代表成功的事件，其中发送病毒载体并得到病毒载体(在本发明中由微复制子表示)报道基因的表达。

然而，全长载体的类似实验导致有限数量细胞的感染(图9)。事实上，在先前BYV的工作中，就发现用农杆菌感染时微基因组具有高很多的感染性(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。

全长LR-2载体的进一步开发。使用LR-2基因组RNA产生所述最初的全长LR-2克隆，该LR-2基因组RNA分离自繁殖于烟草本塞姆氏的病毒。为了提高葡萄树感染性和减少因病毒适应实验性宿主而可能的突变，从cDNA片段重新组装全长克隆，该cDNA片段直接源于得自俄勒冈州本地葡萄园的LR-2感染的黑比诺葡萄。

使用Plant RNeasy试剂盒(QIAGEN)自叶中纯化总RNA，并将总RNA用作随机引物cDNA构建的模板。然后自该cDNA PCR扩增2至4kb邻接片段。基于GRLaV-2的公开序列和存在于该病毒cDNA中的重叠独特克隆位点设计PCR的寡聚核苷酸。然后将扩增的PCR片段克隆至携带LR-2cDNA最初变体的双元质粒，以用源自葡萄树中存在病毒的片段代替现有的部分。对各片段，测序至少4个克隆以推导共有序列，该共有序列相当于葡萄树中存在的LR2基因组的主要和全部生物活性变体。再次重新组装由共有片段组成的完整基因组cDNA。新双元质粒命名为LR2-Vitis，其携带葡萄树源病毒的cDNA，该病毒源于黑比诺且从未给烟草本塞姆氏传代。

该葡萄树源LR2-Vitis表达盒的全部核苷酸序列示于SEQ ID NO：7。该序列包含74个不同于最初烟草本塞姆氏源病毒盒的核苷酸(图14)。似乎很可能这些差异反映了病毒为系统性感染天然(葡萄树)或实验性(烟草本塞姆氏)宿主植株所作的适应。因此，可预期到葡萄树源LR2-Vitis载体在葡萄树中将具有增加的繁殖能力。

欧洲葡萄韧皮部特异性启动子的利用。利用在农杆菌接种时启动病毒RNA转录的CaMV 35S RNA聚合酶II(POL II)启动子启动LR-2载体和LR2-Vitis载体。尽管35S启动子通常用于这种目的，但对使用LR-2载体感染葡萄树其可为次优的。确实，LR-2天然感染葡萄树并限于韧皮组织，相反35S启动子对葡萄树或韧皮部没有特异性。因此，我们利用生物信息学鉴定候选葡萄树韧皮部特异性启动子，该启动子可用于代替35S启动子以便提高LR2-Vitis的葡萄树感染。g/鉴定出三种高表达型韧皮部特异性拟南芥(A.thaliana)基因，并使用相应的蛋白序列和BLASTP搜索鉴定明显的欧洲葡萄直向同源物。建议相应蛋白编码序列(SEQ ID NO：8-10)上游的欧洲葡萄基因组序列用作韧皮部特异性启动子，代替在LR2-Vitis盒中的范例35s启动子。欧洲葡萄启动子的具体性质和特征在下面略述。

1.拟南芥蔗糖转运蛋白2(SUC2蔗糖-H⁺协同转运物)基因(At1g22710)的启动子最先由Truernit和Sauer鉴定出(Planta196：564-570，1995)。在拟南芥中，该启动子在充分发育叶的整个叶脉网络中调节韧皮部伴胞特异性AtSUC2蔗糖-H⁺协同转运物基因的表达(Imlau等，Plant Cell 11：309-322，1999)。Imlau等也发现该启动子的939个核苷酸的3′片段足以启动报道基因的韧皮部特异性高水平表达。

2.拟南芥基因At5g57350编码质膜H(⁺)-ATP酶3(质子泵)并遍及植株在韧皮部表达(DeWit等，Plant J.1，121-128，1991)。该ORF的2，467-kb启动子片段足以启动存在于叶、茎和根的韧皮部伴胞中的基因表达(HongYu等，Chinese Science Bulletin，52：1949-1956，2007)。

3.拟南芥蔗糖合酶1基因(At5g20830)。该ORF的2kb启动子区域与报道基因融合，指导其在成熟叶韧皮部的表达(Bieniawska等，ThePlant Journal 49，810-828，2007)。所述mRNA 5’-末端以很接近于LR-25’-末端序列的ATCTTA为起点(Martin等，Plant J 4：367-377.1993)，使得该启动子成为提高LR2-Vitis在葡萄树中感染性的极有吸引力的候选者。

位于葡萄树ORF上游的葡萄树启动子的核苷酸序列编码拟南芥基因At1g22710、At5g57350和At5g57350的明显直向同源物，该核苷酸序列随同提供它们各自在葡萄科葡萄(V.vitis)基因组中位置的数据库标识一起示于SEQ ID NO：8-10(分别地)。

前导蛋白酶对复制影响的鉴定。

通过插入荧光、酶和表位报道基因而标记的GLRaV-2复制子的产生

产生GLRaV-2的克隆以确定L1和L2的功能分布图。测序完整的16,486核苷酸长的GLRaV-2基因组(GenBank登记号FJ436234；基因标识为：gi：213958313；2009年1月26号，通过引用结合于本文中)并与该病毒其它分离群比较，揭示与分离群94/970(Meng等，VirusGenes 31，31-41，2005)具有最近亲缘关系(99.6％核苷酸一致)。使用双元载体和初代常规的cDNA克隆组装最初的全长克隆，以避免引入PCR产生的突变，并测序以确认其与病毒基因组的共有核苷酸序列的对应。为了促进通过农杆菌接种引起的病毒感染，分别将核酶序列和花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S RNA聚合酶启动子插入GLRaV-2序列的下游和上游。

进一步修饰所得的全长GLRaV-2克隆，以在CP开放阅读框紧接上游容纳报导基因表达盒。所述盒包含GFP开放阅读框，该阅读框后面为BYV CP亚基因RNA启动子。结果是，后面的启动子指导GLRaV-2CP的表达，而真正GLRaV-2CP启动子表达GFP报道基因。该标记的全长GLRaV-2复制子命名为LR-GFP(图10A，中图)。

在个体细胞中缺失对病毒RNA扩增非必须的基因促进实验编码前导蛋白酶、RNA复制酶和RNAi阻抑基因的剩余基因。就GLRaV-2而言，通过缺失从p6跨越至p19开放阅读框基因区域的基因块并保留报导基因，产生这种微复制子。为了表达GFP和b-葡糖醛酸糖苷酶的融合体，进一步修饰所述报道基因表达盒以产生标记的GLRaV-2微复制子，其命名为mLR-GFP/GUS(图10A，下图)。

为了允许使用市售HA特异性单克隆抗体去免疫化学检测L2_HA，通过插入三重的血凝素表位(HA)标记至L2的N端结构域修饰LR-GFP和mLR-GFP/GUS两者(图10B和11A)。使用烟草本塞姆氏GLRaV-2的系统性实验性宿主的叶农杆菌渗入，测试全长变体和微复制子变体的感染性(Goszczynski等，Vitis 35，133-133，1996)。对于mLR-GFP/GUS，这种农杆菌渗入导致在最初接种细胞中微复制子RNA的积累和发荧光、酶促活性GFP/GUS报道基因的高效表达(图10B)。重要的是，在HA标记的变体中GUS活性水平约为最初mLR-GFP/GUS中的85％。因为该略微减少在统计上仅略微显著(p值约0.001)，所以推断HA标记插入至L2中不明显影响病毒基因组的扩增。插入HA标记到L1中的尝试产生非传染性的复制子，放弃了该尝试。

全长LR-GFP的最初变体和HA标记变体在烟草本塞姆氏都为系统性感染的；农杆菌渗入底叶3周后，在非接种上叶检测到病毒感染的典型症状和GFP荧光(图10A)。因此，产生了一系列侵染性标记的GLRaV-2复制子，其可被发送至烟草本塞姆氏并用于指明L1和L2在病毒感染周期中的功能。

L1和L2在烟草本塞姆氏最初接种细胞中的蛋白质加工功能和RNA积累功能的变异分析。

为了指明L1和L2的功能，引入七个点突变和缺失至相应编码区(图10B)。具体地说，为了确定在L1和L2各自C端对自加工的需求，用丙氨酸残基代替各蛋白酶的预测催化性半胱氨酸残基(Cys₄₉₃和Cys₇₆₇)，以分别产生M1和M2变体(图10B)。利用加帽mRNA(包括5’-末端非翻译区、整个L1-L2开放阅读框和编码部分甲基转移酶功能域的短下游区域)的体外翻译，研究各变体的加工能力(图10B)。使用免疫印迹和HA特异性抗体(图11A)或³⁵S-甲硫氨酸标记(图11B)分析所得的翻译产物。正如所料，标记的非突变型变体产生单一HA阳性条带，对应于完全加工的HA标记的L2(图10B和图11A，道L2_HA)以及还有同位素标记的完全加工的L1(图10B和图11B，道L2_HA)。

相反，M1变体的翻译导致相当于L1-L2融合体的单一主要产物的积累(图1B；图2A和2B，道M1)。类似的，L2中预测的催化半胱氨酸的突变取代导致L2自加工的缺失，但并不影响自催化释放L1(图10B；图11A和11B，道M2)。因为预测的活性位点残基的突变的确使各前导蛋白酶自体蛋白水解失活，所以推断L1和L2确实为具催化活性的木瓜蛋白酶样蛋白酶。

为了确定L1和L2的加工是否为病毒RNA扩增所必需，将mLR-GFP/GUS的M1和M2变体用于农杆菌渗入烟草本塞姆氏叶，并确定所得的GUS活性。正如以前BYV微复制子表明的，GUS活性为测定病毒RNA在感染细胞中的积累提供了可靠的替代标记(Peng &Dolja，J.Virol.74，9766-9770，2000)。使用该标记，意外地发现L1切割的失活导致更有效的GUS表达；在三个独立的实验中检测到GUS活性几乎增加至2倍(图10B)。相反，L2切割的失活实质上消除了微复制子感染力：相应的GUS表达水平少于亲本mLR-GFP/GUS的0.5％(图10B)。该结果与BYV微复制子感染性对L-Pro切割的严格要求是一致的(Peremyslov等，J.Virol.72，5870-5876，1998)；的确L-Pro或L2与复制酶的融合很可能干扰病毒RNA的合成。

为了确定L1和L2在RNA积累中各自的作用，产生缺失L1、L2或两者的编码区的突变体。有意思的是，尽管相应的GUS活性水平约为亲本mLR-GFP/GUS变体的1/5，但无L1的突变体DL1能复制(图10B)。出乎意料的是，在DL2变体中缺失L2导致GUS表达的轻微增加，表明L2对在分离的烟草本塞姆氏细胞中积累微复制子为非必需的(图10B)。然而，同时缺失L1和L2得到微复制子DL1/2，其仅表达亲本mLR-GFP/GUS变体中观测到的1％GUS活性(图10B)。总之，这些结果表明，尽管L1在病毒RNA扩增中的作用比L2的更显著，但后者蛋白酶能拯救L1缺陷突变体的RNA积累，因此L1和L2在这个过程中具有部分重叠的功能。

L1和L2都具有C端木瓜蛋白酶样蛋白酶结构域(分别为Pro1和2)和N端结构域(分别为NTD1和NTD2；图10B)。为了确定NTD1和Pro1在L1功能中的相对作用，缺失这些结构域产生DNTD1和DPro1变体(图10B)。这些微复制子的前者显示在GUS积累上减少了2/3，而后者却产生比亲本变体更多的GUS(图10B)。这些数据表明是L1的非蛋白水解结构域而不是蛋白酶区域对烟草本塞姆氏细胞中病毒RNA积累提供主要的贡献。应该强调的是，最佳RNA积累对NTD1的表观需求可反映蛋白结构域的作用、或在RNA水平相应编码区域的作用、或两者。

L1和L2在病毒体感染力和在烟草本塞姆氏中系统性传播GLRaV-2的作用

为了明确L1和L2在病毒的细胞间移动和长距离转运中的潜在作用，将DL1和DL2缺失体引入全长LR-GFP变体的本底中。在农杆菌渗入之后，从接种叶中分离出病毒体，将等浓度的病毒体悬浮液用于人工接种烟草本塞姆氏叶，并在接种8天后用GFP荧光鉴定所得感染灶。对亲本LR-GFP变体，接种率为每片叶9.9±5.6感染灶，平均直径为4.3±1.4个细胞。对LR-GFPDL2得到极相似的结果(每片叶8.2±4.8病灶；平均直径4.1±1.3个细胞)，表明在烟草本塞姆氏中L2对GLRaV-2的感染性和细胞间移动是非必需的。惊奇的是，L1的缺失导致LR-GFPDL1变体的特异性感染性显著地减少至1/25(每片叶0.4个细胞)。此外，所述极少检测到的GFP阳性病灶为单细胞，表明L1或相应的编码区域对病毒体在最初接种细胞中建立感染和移至临近细胞的能力是必需的。

为了确定L1和L2是否涉及GLRaV-2的系统性转运，在使用农杆菌渗入法将全长LR-GFP发送至烟草本塞姆氏植株的前提下，测试六种复制型变体。接种3、4和5周后，筛选有症状、GFP和CP表达的接种植株。有意思的是，多数或全部用M1和DL2变体接种的植株变为系统性感染，表明L2或L1、L2间切割对病毒在烟草本塞姆氏中的长距离转运都不是必需的(图10B和图12A)。在DPro1突变体的情况中发现类似的系统性传播能力。然而，缺失L1或其N端结构域导致复制子建立系统性感染能力的完全丢失(图10B和12A)。

对系统性感染叶片的观察揭示了实验性变体间在GFP积累上的明显差异(图10A)。为了进一步评估这些差异，评估在非接种上叶中GLRaV-2CP的积累。显著的是，发现仅DPro1突变体能积累到与亲本变体相当的水平(图12B)。剩下的两种突变型变体M1、尤其是DL2各自在接种3和4周后积累的水平明显都比亲本LR-GFP变体低(图3B)。总之，这些结果表明L2本身和L1、L2间切割对GLRaV-2在烟草本塞姆氏中的最佳系统性传播是必需的。另外，因为甚至在接种五周后在用DNTD1或DL1变体接种的植株上叶中都没检测到GFP或病毒的CP(图12C和12D)，所以L1和其N端非蛋白水解结构域或相应编码区对GLRaV-2建立系统性感染的能力是不可缺少的。

在BYV中，p20和L-Pro都涉及病毒的系统性传播(Peng等，J.Virol.77，2843-2849，2003；Prokhnevsky等，J.Virol.76，11003-11011，2002)。其中，p20是病毒体尾部必需的成分(Peremyslov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101，5030-5035，2004)，然而由于无法获得L-Pro特异性抗体，不清楚L-Pro是否存在于病毒体中。由于产生了有功能的HA标记L2变体，所以其用于确定该蛋白酶是否关联病毒体。从系统性感染的叶中分离GLRaV-2病毒体，并用蔗糖浓度梯度分级。使用CP特异性抗体在级分12-14中检测到病毒体的峰(图13)。然而，使用HA特异性抗体对相同梯度级分的免疫印迹分析显示L2的峰在级分15-17中，表明存在于病毒体悬浮液的L2并不是物理上结合病毒体(图13)。用于检测存在于L2的HA表位的免疫金特异性电镜法进一步支持该结论。实际上，在含大量病毒体的级分12-14中仅发现很微弱的金标记。此外，在这些级分中检测到的少量金微球为非直接结合该病毒体的(图13，上图)。L2峰的级分15-17包含更大量的金微球，但实际上没有病毒体(图13，下图)，表明L2并不直接关联GLRaV-2病毒体。

L1和L2对欧洲葡萄的微复制子感染是关键的

普遍认为烟草本塞姆氏也许是各种植物病毒最混杂的宿主。为了确定由L1和L2在该实验性宿主的GLRaV-2感染中所起的表面上非必需的和很大程度上多余的作用是否如实地反映它们在葡萄树感染中的作用，将四种微复制子变体农杆菌渗入至欧洲葡萄(Grenache)叶(表1)。用亲本mLR-GFP/GUS变体接种8天后，观察到每片叶约300个单细胞的GFP荧光感染灶。惊奇的是，使用DL1和DL2变体渗入导致病灶数量分别降至1/100和1/7，表明各前导蛋白酶对微复制子在葡萄树细胞中建立感染的能力是必需的(表1)。然而，与烟草本塞姆氏中观察到的类似，M1变体的感染性与亲本变体没有显著差异。

引人注目的是，在渗入叶中测量到的GUS活性与感染细胞数量的数据很相关(表1)，表明前导蛋白酶的主要功能为帮助病毒感染的建立而不是在感染细胞中增加病毒RNA的积累。因为与烟草本塞姆氏中的相比，缺失L1和L2在欧洲葡萄中的影响更显著得多，所以推断各蛋白酶为GLRaV-2感染其天然宿主植物提供显著的和特异的贡献。表1.mLR-GFP/GUS微复制子变体在欧洲葡萄中的感染性和GUS表达

讨论

不囿于任何特定的理论，提供下列讨论。本公开内容允许描述L1和L2在GLRaV-2感染周期中的三个主要功能：i)多蛋白加工；ii)病毒在初始感染细胞中的积累；和iii)感染的系统性转运。

具体地说，发现L1和L2都是活性蛋白酶，具有保守的催化半胱氨酸(图10B和11)。对病毒RNA复制酶多蛋白的甲基转移酶结构域上游的切割对GLRaV-2生存力是必不可少的(图10B)。令人惊讶的是，尽管L1确实在体外(图11)和体内(图13)都切割其C端，但由来自M1和DPro1变体表型的证据，该切割和L1蛋白酶结构域本身在烟草本塞姆氏中的系统性感染都不是不可缺少的(图10B和12)。然而，这些突变体在非接种叶中较慢的病毒积累(图12A和12B)暗示L1介导的切割对系统性感染的最优发展是必需的。

缺失分析表明L1和L2在初始接种细胞中的病毒RNA积累中起部分重叠的作用。当通过农杆菌渗入法发送病毒微复制子时，完全缺失L1导致RNA的积累和表达降至1/5。缺失L1的非蛋白水解N端结构域时观察到类似的结果，表明其在L1功能中的主要作用(图10B)。尽管缺失L2不会影响RNA积累，但组合缺失L1和L2导致实际上非成活的微复制子，表明L2在缺失L1时为病毒感染性提供显著的贡献。

有意思的是，当将含全长基因组的分离病毒体用于植物接种时，DL2变体的感染性和细胞间移动与亲本变体没有区别，而DL1变体的病毒体已丧失感染性。缺失L1编码区但保留L2编码区可影响病毒体结构、稳定性和感染性。因此，有可能除由微复制子农杆菌接种揭示的L1在RNA积累上的功能外，相应编码区也在RNA水平起作用，以促进形成能局部和系统性转运的有尾病毒体。

与后者假设一致，在使用全长复制子的农杆菌渗入时，DL1和DNTD1突变体不能建立系统性感染(图12C)。相反，DPro1变体中蛋白酶结构域的缺失不会影响系统性感染，表明病毒体尾部形成可能未受影响。缺失L2产生系统性感染的DL2变体，然而其显示在上叶中慢得多的积累(图11A和11B)。该结果表明L2对烟草本塞姆氏中有效地系统性传播GLRaV-2是必需的。

当将微复制子变体农杆菌接种至GLRaV-2的天然宿主葡萄树的叶上时，得到可能是本研究最有意义的结果。与许可的实验性宿主烟草本塞姆氏(其中L2对微复制子感染性是多余的)形成强烈对比，在以农杆菌渗入欧洲葡萄叶时，DL2变体显示RNA积累降至1/10(表1)。DL2变体的特异感染性(以每片叶中的GFP荧光感染细胞中值数来衡量)也降至1/10。微复制子RNA的积累和感染细胞数量的这种相关性明显指出L2在病毒的侵袭力(即在接种细胞中建立感染的能力)中的关键作用。在L1的情形中，其在GLRaV-2侵袭葡萄树中的作用更为显著。的确，L1缺失导致DL1变体的RNA积累和特异感染力降至约1/100(表1)。推断L1和L2都对葡萄树最佳的GLRaV-2感染是必不可少的。

前导蛋白酶在GLRaV-2中重复和多样化的特殊功能性意义是什么？看来该答案，至少部分答案，在于L1和L2的宿主特异性作用，它们的功能协作在感染葡萄树而不是烟草本塞姆氏时是必需的。换言之，串联的病毒蛋白酶可能已进化为促进单一蛋白酶的功能，以破坏多年生木本宿主对病毒感染潜在的顽拗作用。该假设与以下事实是一致的：除GLRaV-2外，在各自感染木本和/或多年生宿主的CTV(Karasev等，Virology 208，511-520，1995)、悬钩子斑驳病毒(Raspberry mottle virus)(Tzanetakis等，Virus Res.127，26-33，2007)和草莓褪绿斑点病毒(Strawberry chlorotic fleck virus)(Tzanetakis & Martin，Virus Res.124，88-94，2007)中发现了蛋白酶重复，却没在感染草本年生宿主的BYV、薄荷病毒1(Tzanetakis等，Virus Res.127，26-33，2007)或香石竹黄点病毒中发现。

L1和L2促进GLRaV-2感染的可能机理是什么？这些前导蛋白酶各自以宿主特异性方式起促进病毒感染力的作用，该事实表明L1和L2可能涉及抑制抗病毒的防御反应。一种可能性是L1和L2独立或协同RNAi阻抑基因p24涉及RNA干扰(RNAi)的抑制(图1A)(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。然而，在几个模型系统中鉴定GLRaV-2L1和L2或BYV L-Pro对RNAi反应作用的尝试都失败了。此外，发现L-Pro与报导基因的异位共表达减少了后者的积累，表明前导蛋白酶可能在RNA或蛋白水平涉及基因调节。

通过类比冠状病毒的木瓜蛋白酶样蛋白酶(Lindner，Virology 362，245-256，2007)，可假定线形病毒的蛋白酶充当脱遍在蛋白酶(DUB)，由此影响植物防御的调节。唯一与DUB假设不一致的事实为，在M1变体中L1蛋白水解活性的失活对病毒感染具有很小的影响。如果L1介导结合而非切割宿主防御相关的蛋白就足以发挥L1的功能，则可解析该明显矛盾。

通过插入报导基因或表位标记产生GLRaV-2的全长复制子或微复制子，突出了该病毒作为葡萄树基因表达载体的潜能。通常，线形病毒组源载体具备相对大的遗传容量和稳定性的强烈优点(Dolja等，Virus Res.117：38-51，2006；Folimonov et al.，Virology 368(1)：205-216，2007)。通过共表达同源RNAi阻抑基因(其中GLRaV-2的p24看来是最强的)显著增加载体的感染力，这进一步增加了线形病毒载体的用途(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。全面实现GLRaV-2载体的潜能要求开发有效的葡萄树接种技术。

材料与方法

GLRaV-2的GFP标记全长cDNA克隆的产生

如较早描述，在烟草本塞姆氏植株上繁殖得自俄勒冈州本地葡萄园的GLRaV-2分离群(Goszczynski等，Vitis 35，133-133，1996)。将病毒体分离(Napuli等，Virology 274(1)，232-239，2000)并根据制造商的方案使用TRIzol试剂(Invitrogen)得到病毒RNA。病毒基因组的核苷酸测序及中间体和全长病毒cDNA克隆产生的策略如对BYV的描述(Peremyslov & Dolja，Curr.Protocols Microbiol.(Suppl.7)，16F.1.1-16F.1.26，2007)。将所得GLRaV-2RNA序列保存于GenBank(登记号FJ436234；2009年1月26日，通过引用结合到本文中)。各种用于克隆方法中的引物可根据请求提供。

总之，使用pCB301微双元载体组装GLRaV-2的全长cDNA克隆(Xiang等，Plant Mol.Biol.40：711-717.1999)，而使用逆转录和常规双链(ds)cDNA合成法或PCR扩增完成cDNA克隆。利用Sac I和KpnI单一位点将NOS终止子加入pCB301并将含Sac I、Bam HI、AatI I、Bbvc I、Rsr II、Bst EII和SmaI限制位点的多位点接头插入到SacI位点和NOS终止子间，以得到pCB301-NOS-PL。为了加入融合至病毒cDNA 5’-片段(核苷酸1-2,034)的CaMV 35S RNA聚合酶启动子，使用PCR介导的DNA剪接技术。进行单独的PCR以扩增35S启动子和GLRaV2cDNA的5’末端并产生有重叠末端的产物。合并这些产物并用作另一轮RCR的模板，该PCR使用互补于全长产物5’-末端和3’-末端的引物。利用Sac I(加至35S启动子5’末端的)和BamHI(核苷酸2034)将后一产物克隆进pCB301-NOS-PL以产生p35S5’LR。

为了将核酶加入到病毒cDNA的3’末端，将具有互补于病毒cDNA 3’-末端的病毒特异性部分的大引物与常规引物联合用于扩增GLRaV-2cDNA的3’-末端区域(核苷酸14,842-16,486)，该大引物后接如(Prokhnevsky等，J.Virol.76，11003-11011，2002)中所述设计的核酶序列和Sma I位点。利用限制位点BstE II(核苷酸14,842)和Sma I(在大引物3’末端加入)将所得PCR产物克隆进p35S5’LR以产生p35S5’3’LR-Rib。

为克隆病毒cDNA的内部区域(核苷酸2,029-10,827)，使用常规cDNA克隆和SuperScript II逆转录酶的Gibco-BRL方案得到三个部分重叠的ds cDNA片段。使用限制位点Bam HI(核苷酸2,029)、Aat II(核苷酸3,394)、Bbv CI(核苷酸6,281)和Rsr II(核苷酸10,821)将这些片段插入p35S5’3’LR-Rib以产生p35S-5’BR3’LR-Rib。将病毒cDNA剩余部分(核苷酸10,821-14,848)PCR扩增并克隆至中间载体pGEM-3Zf(+)(Promega)。将编码内质网靶向型GFP(Haseloff等，Proc Natl Acad Sci USA 94(6)，2122-2127，1997)的核苷酸序列(后接BYVCP启动子)插入GLRaV-2CP ORF的5’-末端上游。利用Rsr II(核苷酸10,821)和Bst EII(核苷酸14,842)位点将所得cDNA片段克隆入p35S5’-BR-3’LR-Rib，以产生全长GLRaV-2cDNA克隆p35S-LR-GFP或简称LR-GFP。

修饰和突变GLRaV-2变体的产生

通过缺失从p6ORF的起始密码子(图1A)至核苷酸14,185，和从GFP ORF 3’-末端Fse I位点至核苷酸15,285(核苷酸编号与原始GLRaV-2cDNA相对应)，修饰LR-GFP cDNA，改造所述微复制子变体mLR-GFP/GUS。结果，编码p6、Hsp70h、p63、CPm、CP和p19的GLRaV-2ORF缺失了(图1A)。然后利用在GFP ORF 5’-末端的PacI和在GUS ORF 3’-末端的Fse I，用较早描述于(Peng等，Virology 294，75-84，2002)的杂合GFP/GUS ORF代替所述GFP ORF。

通过克隆相应PCR-扩增片段(图1B)至pGEM-3Zf(+)，产生包含整个L1和L2编码区和甲基转移酶编码区片段(核苷酸1-3,071)的两种质粒，pGEM-35SLR-Pro和pGEM-SP6LR-Pro。通过将三拷贝的血凝素表位(HA)标记(YPYDVPDYA；SEQ ID NO：11)编码序列插入至L2编码区内密码子663的下游，将pGEM-35SLR-Pro和pGEM-SP6LR-Pro都用于产生pGEM-35SLR-L2_HA和pGEM-SP635SLR-L2_HA。这些质粒每种都用于引入下列突变至L1或L2。

通过利用定点诱变将L1的催化Cys₄₉₃残基用Ala代替产生突变1(M1)。类似地，通过将L2 Cys₇₆₇用Ala代替得到的突变2(M2)。在DL2突变中，将整个L2编码区缺失并将L2易断键下游的Lys₈₄₈残基用Gly代替，以再生真正L1切割位点。通过缺失除5’-末端起始密码子外的整个L1编码区得到突变DL1。在突变DNTD1中，同样除起始密码子外，L1的整个N端非蛋白水解区被缺失。在突变DPro1中，L1的C端蛋白酶结构域被缺失了，而L1的N端区域则与L2的N端区域融合。在最后的突变DL1/2中，除与GLRaV-2复制酶的首个Lys密码子融合的起始密码子外，L1和L2都被缺失了，导致形成的复制酶仅因存在N端Met而不同于蛋白水解加工的野生型复制酶。所有突变的图示于图1B。

所述pGEM-SP6LR-L2_HA变体用于在体外分析突变蛋白酶的蛋白水解活性。利用Sbf I(位于质粒的载体部分)和Stu I(核苷酸3,063)位点将来自pGEM-35SLR-L2_HA突变衍生物的DNA片段克隆进mLR-GFP/GUS。利用Sfi I(位于质粒的载体部分)和Bbv CI(核苷酸6,282)将来自p35S-miniV94-GFPGUS突变衍生物的DNA片段克隆进全长cDNA克隆LR-GFP。

L1和L2蛋白水解活性的变异分析

使用Sma I线性化pGEM-SP6LR-L2_HA变体，使用mMessage Machine试剂盒(Ambion)产生相应的体外RNA转录物。为了测定前导蛋白酶的蛋白水解活性，使用麦芽提取物(Promega)和[³⁵S]-Met(Amersham/Pharmacia Biotech)或未标记氨基酸混合物翻译所得加帽RNA转录物。在25℃接种1小时后，将产物通过PAGE分离、电转染到PROTRAN硝酸纤维膜上，用于放射自显影或免疫印迹(使用抗HA大鼠单克隆抗体(Roche)作为第一抗体，山羊抗大鼠-过氧化物酶作为第二抗体)。

在RNA积累中L1和L2作用的变异分析

通过电穿孔法用各mLR-GFP/GUS变体转化根癌农杆菌菌株C58GV2260。将相应培养物在28℃振荡培养过夜，离心沉淀和重悬于含10mM MES-KOH(pH 5.85)、10mM MgCl₂和150mM乙酰丁香酮的缓冲液中。将各变体的细菌悬浮液与相应的转化为表达芜菁花叶病毒RNAi阻抑基因P1/HC-Pro的培养物混合，以增强微复制子感染力(Chiba等，Virology 346：7-14，2006)。微复制子表达型变体的最终细菌浓度为1.0OD₆₀₀，P1/HC-Pro表达型变体的为0.1OD₆₀₀。将诱导的细菌培养物利用无针头注射器渗入烟草本塞姆氏叶的底面或真空渗入葡萄树叶。在接种8天后，使用表面荧光立体显微镜Leica MZ16F(Deerfield，IL)显示GFP荧光叶细胞。制备GUS测定的样品，如先前所述(Dolja等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10208-10212，1992)，使用Hoefer TKO100DNA荧光计(Hoefer Scientific Instruments)测量GUS活性。

局部和系统性病毒转运的分析

为测定GFP标记的病毒变体的细胞间移动，接种2周后从烟草本塞姆氏的农杆菌渗入叶分离病毒体(Napuli等，Virology 274(1)，232-239，2000)，重悬于含20mM磷酸钠(pH 7.4)和1mM Na₂-EDTA的缓冲液中，人工接种至烟草本塞姆氏叶。在接种8天后使用表面荧光立体显微镜分析有荧光的感染灶。

为了研究在烟草本塞姆氏中的系统性传播，在LR-GFP本底下将带有相应变体的质粒转移至根癌农杆菌中，将所得细菌悬浮液与如上述的改造用于表达P1/HC-Pro的细菌悬浮液混合，然后渗入年幼的烟草本塞姆氏植株(6-8片叶阶段)。3、4或5周后，筛选形成症状的这些植株的上叶，而将表面荧光显微镜和点片照相机MicroPublisher3.3RTV(QImaging)用于记录病毒表达的GFP的积累。将免疫印迹法和以1∶5,000稀释的定制GLRaV-2特异性抗血清用于记录CP的积累。病毒体分析

为了确定HA标记的L2是否与病毒体相关联，使用蔗糖梯度分级法，然后是免疫印迹法。将如上述分离的病毒体重悬于含20mM磷酸钠(pH 7.4)和1mM Na₂-EDTA的缓冲液，加至制备于同样缓冲液中的10-40％蔗糖梯度顶部，并在Beckman SW40转子中4℃25,000RPM离心4小时。梯度被分离为25个级分，分别使用抗HA大鼠单克隆抗体(Roche)和GLRaV-2特异性抗体进行免疫印迹分析以检测L2_HA和CP。基本如(Medina等，Virology 260(1)，173-181，1999)所述，进行免疫金特异性电镜法以检测L2_HA。

显而易见的是，所描述的方法和组合物的精确细节可变化或修改，而不会背离所述发明的精神。我们要求保护所有落入下面权利要求范围和精神内的这种修改和变化。