ES2478041T3 - Vectores de closterovirus y métodos - Google Patents

Abstract

Un vector de transferencia génica de plantas para silenciamiento génico inducido por virus, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica: a) genes virales de virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que comprenden metiltransferasa, ARN helicasa y ARN polimerasa dependiente de ARN; b) un supresor de ARNi; c) proteasas líder L1 y/o L2; y d) un polinucleótido heterólogo unido operativamente a un promotor, en el que el polinucleótido heterólogo se expresa en una célula vegetal, en donde el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal, y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, o en donde el vector de transferencia génica de plantas replica de forma condicionada y en donde al menos una proteasa líder seleccionada de L1 y L2 está inactivada de modo que el vector no pueda replicarse de forma infecciosa independientemente.

Description

Vectores de closterovirus y métodos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 61/063.305, presentada el 31 de enero de 2008 y Nº 61/083.504, presentada el 24 de Julio de 2008.

Campo

La presente divulgación se refiere al campo de los closterovirus y su uso como vehículos de suministro génico para plantas.

Antecedentes

Las vides (Vitis) son un cultivo frutal global importante con enorme importancia económica y cultural, particularmente Vitis vinifera, que se usa para el cultivo del vino. Se usan comercialmente un número relativamente pequeño de cultivares de V. vinifera para mantener la uniformidad en el fruto dado que las plantas son heterocigotas y no de pura cepa. Por lo tanto, debido a que gran parte del cultivo de uva comercial depende de estos cultivares, que tienen diversidad limitada; la resistencia a enfermedad es una preocupación importante. Las técnicas de cultivo clásicas para aumentar la resistencia a enfermedad generalmente merman la igualdad del fruto, haciendo a las vides un candidato perfecto para la manipulación genética para mejorar la resistencia a enfermedad. Sin embargo, la producción de vides transgénicas ha resultado ser difícil, ya que se sabe que las especies perennes leñosas, tales como las vides, son resistentes a transformación, y el proceso de selección requerido por transformación mediada por Agrobacterium es significativamente más riguroso debido a la competición por las células no transformadas, lo que conduce a tasas de éxito altamente variables (Mullins et al., Meth. Mol. Bio. 344: 273-285. 1990); Bouquet et al., Methods Mol. Biol. 344: 273-285, 2006). Por lo tanto, existe la necesidad de un método fiable, eficaz, para el suministro de genes a vides para tratamientos de enfermedades y la modificación de vides para características deseadas.

Durante las últimas dos décadas, los vectores virales para la expresión de resistencia de las proteínas en plantas y animales se han convertido en herramientas indispensables de la biología molecular y la biomedicina (Pogue et al., Annu. Rev. Phytopathol. 40: 45-74, 2002; Gleba et al., Curr Opin Biotechnol 18: 134-141, 1007). Con la aparición de la interferencia de ARN (ARNi) o silenciamiento de ARN, también se han desarrollado vectores virales para silenciamiento de genes inducido por virus o VIGS (Godge et al., Plant Cell Rep 27(2): 209-219, 2008; e-pub antes de la impresión, 2007). Tomadas juntas, una capacidad para sobreexpresar rápidamente o silenciar genes de interés ha hecho a los vectores virales herramientas importantes en la genómica funcional.

Se han introducido por ingeniería genética varios virus vegetales en vectores virales, cada uno con limitaciones y especificidad vegetal. La mayoría son adecuados solamente para su uso en plantas herbáceas dicotiledóneas. En su mayoría, los virus icosaédricos no están bien adaptados para acomodar genes ajenos principalmente debido al tamaño limitado de sus cápsidas. En general, los virus elongados han mostrado una mejor capacidad para tolerar genes recombinantes y expresarlos hasta niveles muy altos. En la actualidad, los vectores más habitualmente usados son los basados en el virus del mosaico del tabaco en forma de bastón (TMV, género Tobamovirus) (Pogue et al., Annu. Rev. Phytopathol. 40: 45-74, 2002; Gleba et al., Curr Opin Biotechnol 18: 134-141, 1007). Estos vectores se caracterizan por altos niveles de expresión pero estabilidad genética relativamente baja, especialmente en lo que se refiere a insertos ajenos grandes.

Otra serie de vectores se basa en el virus del rayado del tabaco con forma de bastón (TRV, género Tobravirus) (Godge et al., Plant Cell Rep 27(2): 209-219, 2008; e-pub antes de la impresión, 2007). Los vectores derivados de virus filamentosos se basan habitualmente en el virus X de la patata (PVX, género Potexvirus) (Chapman et al., Plant J 2: 549-557, 1992) y virus del marcado del tabaco (TEV, género Potyvirus) (Dolja et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10208-10212, 1992). Los vectores de TMV, TRV y PVX contienen un casete de expresión con un promotor de ARN subgenómico, mientras que los vectores de TEV usan un principio alternativo de expresión proteica basado en procesamiento de poliproteínas. Esta última característica proporciona a los vectores potyvirales una estabilidad genética mucho mayor que la hallada en vectores que contienen promotores (Dolja et al., Virology 252: 269-274, 1998).

Se han desarrollado vectores de expresión génica basados en el virus del amarilleo de la remolacha (BYV, género Closterovirus) (Hagiwara et al., J. Virol. 73: 7988-7993, 1999; Peremyslov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96, 14771-14776, 1999). Aunque los niveles de expresión proteica que pueden conseguirse para vectores closterovirales pueden ser menores que los de TMV o TRV, se ha demostrado que estos vectores son muy estables genéticamente y capaces de acomodar varios casetes de expresión basándose en promotores de ARN subgenómico heterólogos adicionales o procesamiento de poliproteínas. Dicha versatilidad de vectores closterovirales se debe más probablemente al gran tamaño de genomas closterovirales y presencia de genes que

aumenta drásticamente la replicación genómica y capacidad de expresión génica y posiblemente proporcionan una mayor fidelidad de copia de ARN (Dolja et al., Virus Res. 117: 38-51, 2006). Los supresores fuertes de ARNi (Reed et al., Virology 306: 203-209, 2003; Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006) y proteinasas líder de closterovirus (Peng et al., J. Virol. 75(24), 12153-12160, 2001) están entre los genes que aseguran alto rendimiento genético y evolutivo de closterovirus y precondicionan sus genomas para acomodar genes adicionales, virales o ajenos.

Una de las características más críticas del vector viral es su serie de hospedadores que limita gravemente su utilidad potencial para las plantas de cultivo deseadas. Todos los vectores descritos anteriormente son capaces de infectar solamente plantas herbáceas dicotiledóneas. En otras palabras, la necesidad de generar un vector viral para monocotiledóneas o para cultivos leñosos tales como la vid dicta la necesidad de usar virus que infectan de forma natural a dichas plantas como una plataforma para el desarrollo de vectores.

Hasta la fecha, se han desarrollado muy pocos vectores virales potencialmente adecuados para plantas leñosas, y los datos muestran que la expresión se ha limitado normalmente a una serie estrecha de plantas modelo. Uno de estos vectores se basa en el ARN 2 de virus esférico latente de manzana (ALSV, familia Sequiviridae) (Li et al., Arch. Virol. 149: 1541-1558, 2004). Aunque los autores reivindican que el vector de ALSV fue capaz de expresar la proteína verde fluorescente (GFP) por procesamiento de poliproteínas tras inoculación mecánica a plántulas de manzana, no se han presentado en el artículo pruebas experimentales convincentes de dicha capacidad. De forma similar, no están disponibles datos para apoyar reivindicaciones recientes de un vector “universal” basado en el geminivirus de la rizadura amarilla del tomate, que supuestamente es capaz de infectar de forma sistémica a una amplia diversidad de plantas de dicotiledóneas a monocotiledóneas a árboles y vides (Peretz et al., Plant Physiol. 145(4): 1251-1263, 2007). Se ha desarrollado otro vector usando el virus A de la vid (GVA, un Vitivirus). Su capacidad para expresar una proteína ajena se ha demostrado en tabaco (Haviv et al., J. Virol. Meth. 132: 227-231, 2006) y aún no se ha demostrado para la vid. Otro vector se basa en el virus de Citrus tristeza (CTV), un closterovirus estrechamente relacionado con BYV (Folimonov et al., Virology 368(1): 205-216, 2007). Sin embargo, el CTV solamente es útil en especies de Citrus, y su propagación implica un proceso incómodo de ciclos en protoplastos antes de la inoculación por corte de árboles cítricos con viriones aislados. En consecuencia, existe una fuerte necesidad de vectores virales adecuados para transformar plantas leñosas, particularmente vides.

Sumario

La presente invención proporciona vectores de transferencia de genes vegetales, células vegetales, plantas y métodos como se exponen en las reivindicaciones.

La presente divulgación se refiere a vectores de transferencia de genes vegetales competentes para replicación que comprenden un ácido nucleico que codifica genes virales para virus asociados al enrollamiento de la vid 2 (LR-2) seleccionados del grupo que consiste en metiltransferasa, ARN helicasa, ARN polimerasa dependiente de ARN y p24; proteasas líder L1 y L2; y un polinucleótido heterólogo unido operativamente con un promotor, en el que el polinucleótido heterólogo se expresa en una célula vegetal y en el que el vector tiene capacidad de replicación infecciosa en la célula vegetal.

La presente divulgación abarca además vectores de transferencia de genes vegetales que se replican de forma condicional que comprenden un ácido nucleico que codifica genes virales del virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) seleccionados del grupo que consiste en metiltransferasa, ARN helicasa, ARN polimerasa dependiente de ARN y p24; proteasas líderes L1 y L2, en las que al menos una proteasa líder está inactivada de modo que el vector no puede replicar de forma infecciosa independientemente; y un polinucleótido heterólogo unido operativamente con un promotor, en el que el polinucleótido heterólogo se expresa en una célula vegetal.

Opcionalmente, los vectores proporcionados en el presente documento también pueden incluir uno o más genes virales del virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que están implicados en el ensamblaje de viriones y/o transporte dentro de plantas. Dichos genes incluyen por ejemplo p6, Hsp70h, p63, CPm, CP y p19. En realizaciones particulares, todos estos genes se incluyen en un vector, facilitando de este modo la infección sistémica. Dicho vector puede denominarse vector de longitud completa; se describen en el presente documento ejemplos de estos.

El polinucleótido heterólogo en los vectores descritos puede codificar uno o más de una molécula indicadora, un marcador seleccionable o un gen terapéutico, que puede codificar una proteína deseada, tal como para mejorar las propiedades nutricionales o estéticas de la planta o un gen de resistencia a enfermedad, que puede ser antifúngico, antibacteriano o antiviral. El gen terapéutico puede ser para el tratamiento de enfermedad de Pierce, tal como un polinucleótido que desencadena el silenciamiento génico inducido por virus o codifica un polipéptido de lisozima.

Las proteasas líderes pueden ser L1 y/o L2 de LR-2. Las proteasas líder (por ejemplo, SEC ID Nº: 4 o 6) pueden codificarse por SEC ID Nº: 3 y/o SEC ID Nº: 5. Una o ambas de las proteasas líder puede inactivarse por sustitución, inserción, deleción parcial o alteración completa de la secuencia codificante para la proteasa líder en el vector.

El vector puede comprender además una secuencia de ADN T para la transformación de una célula vegetal. El vector puede comprender un virus del amarilleo de la remolacha u otro promotor de closterovirus relacionado o un promotor de LR-2 nativo. Puede introducirse más de un vector en la planta, tal como un vector que codifique un gen terapéutico y un vector que codifique el supresor de ARNi p24.

También se contempla una célula vegetal o planta que comprende un vector descrito en el presente documento, tal como una célula de vid o una vid.

También se proporcionan métodos para producir los vectores descritos, que comprenden cultivar una célula que comprende el vector y recuperar el vector de la célula o medio en el que se cultiva la célula. El vector puede opcionalmente estar en un plásmido, tal como un plásmido adecuado para amplificación bacteriana y/o un plásmido binario adecuado para agroinoculación.

Otra realización es un método para expresar un gen heterólogo en una célula vegetal que comprende introducir el vector de la presente invención en la célula vegetal. En una realización, la célula vegetal es una célula de vid. En otra realización, el vector se introduce por agroinoculación.

Otra realización es un método para expresar un gen heterólogo en una célula vegetal que comprende introducir un vector competente para replicación en la célula vegetal de modo que el vector se replique posteriormente e infecte al menos una célula vegetal adicional. El método comprende además la infección sistémica de una estructura vegetal seleccionada del grupo que consiste en tejido, hoja, tallo, raíz, fruto, semilla o planta completa.

Otra realización es un método para inducir resistencia a enfermedad que comprende introducir el vector de la presente invención en una célula vegetal. El vector puede introducirse más de una vez. El vector puede comprender un polinucleótido heterólogo que codifica un gen que confiere resistencia a la enfermedad. Dicho polinucleótido heterólogo puede ser, por ejemplo, un polinucleótido que desencadene el silenciamiento génico inducido por virus, un polinucleótido de Run1 o que codifique un polipéptido de lisozima.

Otra realización es un método para tratar o prevenir la enfermedad de Pierce u oídio en una vid que comprende introducir en una célula de vid un vector de la presente invención. El vector puede introducirse por agroinoculación y puede introducirse más de una vez.

Otra realización es un método para modificar las propiedades estéticas, tales como sabor y aroma del jugo, o potenciar la característica nutricional u otra agrícola de una planta que comprende introducir el vector de la presente invención en una célula vegetal.

Otra realización es un método para realizar una planta transgénica que comprende introducir el vector de la presente invención en una célula vegetal, cultivar la célula vegetal en condiciones que promueven el crecimiento de una planta, en el que el gen heterólogo se expresa en la planta transgénica. La planta transgénica puede ser un vid.

Las anteriores y otras características y ventajas resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias realizaciones, que se desarrolla con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1C son mapas genéticos del genoma de GLRaV-2 que indican las funciones de los genes virales (Figura 1A), casete para expresión génica recombinante (Figura 1B) y vector binario que contiene el genoma de GLRaV-2 de longitud completa con inserto de ER-GFP (Figura 1C). (Figura 1A) los genes se diseñan de acuerdo con las proteínas codificadas: (Figura 1B) promotor de LR-2 CP, un promotor de LR-2 natural que conduce la expresión del gen de CP; ER-GFP, proteína verde fluorescente dirigida a retículo endoplásmico; promotor de BYV CP, un promotor heterólogo modificado por ingeniería genética derivado de virus del amarilleo de la remolacha donde conduce a la expresión de un gen de CP; Pac I y Fse I, sitios introducidos por ingeniería genética para endonucleasas de restricción correspondientes. (Figura 1C) Desde la izquierda, en sentido de las agujas del reloj: 35S, promotor de ARN polimerasa II 35S derivado de virus del mosaico de la coliflor (flecha); ~17.500 nt, el clon de ADNc de longitud completa, de ~17.500 nucleótidos de longitud, de LR-2 marcado por inserción de ER-GFP (rectángulo, marcado ~17.500 nt); RZ, una ribozima de diseño adaptado que promueve la liberación autocatalítica del extremo 3’ de ARN r-LR tras la transcripción del ADN insertado en el núcleo de la célula vegetal (rectángulo con una flecha, marcado RZ); terminador NOS de la ARN polimerasa II; extremo derecho, secuencia de reconocimiento donde el ADN plasmídico se escinde por Agrobacterium para transferencia a la célula vegetal (flecha curvada); Ori, origen de replicación de plásmido (flecha); KanR, gen para resistencia a kanamicina; extremo izquierdo, secuencia de reconocimiento donde el ADN plasmídico se escinde por Agrobacterium para transferencia a la célula vegetal (flecha curvada). La Figura 2 muestra células N. benthamiana infectadas con GLRaV-2/ER-GFP tras la agroinoculación a dos escalas diferentes usando microscopía de barrido con láser confocal. El color verde marca el retículo endoplásmico de la célula infectada por virus debido a la expresión del marcador de ER-GFP por virus. El fondo rojo se debe a la autofluorescencia de los cloroplastos. Barras, 50 mm.

La Figura 3 muestra imágenes tomadas por microscopía epifluorescente de tejidos de plantas de N. benthamiana infectadas de forma sistémica con GLRaV-2/ER-GFP tras la agroinoculación (fila inferior) en comparación con plantas de control, no infectadas (fila superior). El color verde destaca predominantemente células del floema infectadas por virus y que expresan ER-GFP. Los tallos y los petiolos se seccionaron transversalmente de forma manual antes de la captura de imágenes microscópicas. El fondo rojo se debe a la autofluorescencia de cloroplastos. Figura 4 (Figura 4A) análisis de inmunotransferencia de los extractos de plantas infectadas con el virus de tipo silvestre y virus modificado para expresar ER-GFP usando anticuerpos específicos de CP como se muestra debajo de la imagen. Las diluciones de los extractos de hoja originales se muestran en la parte superior. (Figura 4B) análisis de RT-PCR de los ARN aislados de plantas de N. benthamiana infectadas con el virus de tipo silvestre y virus modificado para expresar ER-GFP. Los productos de RT-PCR se separaron en gel de agarosa al 1 % y se tiñeron con bromuro de etidio. M, marcadores de tamaño de ADN; las bandas correspondientes a ADN de 1 y 2 kb se marcan por flechas. Figura 5. Parte superior, un diagrama que muestra el diseño de un vector binario que expresa p24, un supresor de LR-2 de 24 kDa de silenciamiento de ARN clonado en un vector binario pCB302. Líder de TEV, secuencia de ADNc correspondiente a la región no traducida 5’ del virus del marcado del tabaco y usado para potenciar la traducción del p24. Parte inferior, imágenes confocales de la célula poco habitual infectada por miniBYV-GFP solamente (panel izquierdo) y miniBYV-GFP con coexpresión de p24 (panel derecho). La imágenes son de Chiba et al. (Virology 346: 7-14, 2006). Figura 6. Silenciamiento del transgén de GFP por el vector viral LR-GFP en N. benthamiana línea 16c. En el control, todas las células son verdes debido a la producción de GFP transgénico. En las plantas infectadas, las células verdes brillantes son en las que el virus realiza GFP adicional. Las áreas rojas contienen células en las que se silenció GFP transgénico debido a interferencia de ARN inducida por virus. Figura 7. (Figura 7A) Expresión maximizada de GFP usando Agrobacterium introducida por sonicación en una hoja de Cabernet franc micropropagada. (Figura 7B) Una hoja menos susceptible que, sin embargo, muestra expresión de GFP en la vena. La GFP se expresa directamente a partir de un vector binario realizado por ingeniería genética como se muestra en (Figura 7C). Figura 8. Infección de vid con miniLR-2-GFP introducida por agroinfiltración que muestra imágenes de la hoja inoculada y células verdes que expresan GFP individuales (fila superior) y un mapa genético del replicón de miniLR-GFP. L1 y L2, proteinasas líder; MET, dominio de metiltransferasa; HEL, dominio de ARN helicasa; POL, ARN polimerasa dependiente de ARN; GFP, proteína verde fluorescente; p24, una proteína de 24 kDa. Figura 9. Infección de vid con el LR-2-GFP de longitud completa introducido por agroinfiltración que muestra imágenes de la hoja inoculada y células verdes que expresan GFP individuales. Figura 10. (Figura 10A) Esquema del virus GLRaV-2, el vector de longitud completa (LR_GFP) y minivector (mLR-GFP/GUS). (Figura 10B) Dominios de las proteasas líder L1 y L2 con resultados de procesamiento proteolítico, expresión génica e infección en N. benthamiana indicados. Figura 11. Procesamiento de vectores como se muestra por marcaje con HA (Figura 11A) y radiomarcaje (Figura 11B). Figura 12. (Figura 12A) Transporte a larga distancia e infección sistémica de hojas de N. benthamiana con vectores. (Figura 12B) acumulación de GFP en hojas de N. benthamiana. (C) Ausencia de expresión génica en hojas superiores de N. benthamiana después de inoculación. Figura 13. Análisis de inmunotransferencia de gradiente de fraccionamiento de sacarosa de viriones aislados de hojas de N. benthamiana infectadas. Figura 14. Alineamiento de las secuencias de nucleótidos de las variantes derivadas de N. benthamiana (Nb; carriles superiores) y derivadas de V. vinifera (Vv, carriles inferiores) del vector GLRaV-2. Los nucleótidos diferentes en dos aislados se muestran en negrita y subrayados.

LISTA DE SECUENCIAS

Las secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos enumeradas en el presente documento y/o en la lista de secuencias adjunta se muestran usando abreviaturas de letras convencionales para bases nucleotídicas, y el código de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. §1.822. Se muestra solamente una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria se incluye por cualquier referencia a la cadena presentada. En la lista de secuencias adjunta:

SEC ID Nº: 1 es la secuencia de ácido nucleico de p35S-LR-2/ERGFP, un vector de silenciamiento y de expresión génica derivado de virus de enrollamiento de la vid 2, de longitud completa, que contiene un gen recombinante que codifica el indicador de GFP dirigido a ER. La secuencia incluye el vector binario pCB301 (13305), y el casete de expresión viral completo (3306-21957). Los siguientes elementos que se muestran en la Figura 1C también se reflejan en la secuencia: promotor 35S (3306-4063), secuencia viral (4064-21643) incluyendo el casete de expresión de indicador-GFP (18648-19439), promotor de BYV CP heterólogo (1844019723), ribozima (21644-21698) y terminador de NOS (21705-21957). SEC ID Nº: 2 es la secuencia de ácido nucleico de MiniLR-GFP/GUS. SEC ID Nº: 3 y 4 son las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de proteasa L1. SEC ID Nº: 5 y 6 son las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de proteasa L2. SEC ID Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos de vector de silenciamiento y expresión de gen derivado de virus

asociado con enrollamiento de la vid 2, de longitud completa, que contiene un gen recombinante que codifica indicador GFP dirigido a ER (LR2-Vitis). Toda la secuencia de nucleótidos de virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 se corresponde con una secuencia consenso del aislado viral presente de forma natural en la vid Pinot Noir. Los nucleótidos distintos de los presentes en el virus de N. benthamiana, original (SEC ID Nº: 1) se destacan en la Figura 14. La secuencia de nucleótidos fuera del casete de expresión viral son iguales que en SEC ID Nº: 1. SEC ID Nº: 8 es una secuencia genómica de cromosoma de V. vinifera representativa que abarca un promotor específico de floema potencial, promotor ortólogo de AtSUC2 (GSVIVT00002302001_VvSUC27_AF021810_Genomic), adecuado para expresión específica de floema de los vectores de LR-2. SEC ID Nº: 9 es una secuencia genómica de cromosoma de V. vinifera representativa que abarca un promotor específico de floema potencial, promotor ortólogo de AtAHA3 (VV78X258876_VITISV_014422_AM487422_CAN64375_Genomic), adecuado para expresión específica de floema de los vectores de LR-2. SEC ID Nº: 10 es una secuencia genómica de cromosoma de V. vinifera representativa que abarca un promotor específico de floema potencial, promotor ortólogo de AtAsus1 (VV78X051063_CAN82840_VITISV_024563_GI147856448_Genomic), adecuado para expresión específica de floema de los vectores de LR-2. SEC ID Nº: 11 es la secuencia de aminoácidos del marcador del epítopo de hemaglutinina (HA).

Descripción detallada

A no ser que se indique de otro modo, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la invención, se proporcionan en el presente documento explicaciones de términos específicos.

La expresión “vid”, “planta de la uva” o “planta de vid” se refiere a cualquier planta del género Vitis, por ejemplo V. vinifera, V. labrusca, V. riparia, V. rotundifolia, V. aestivalis, o del género Muscadinia, y especies del mismo. La vid puede ser un vástago, rizoma, cultivares o una planta híbrida. El término “uva” es la baya o fruto de la vid, que puede comerse completa o de la que puede extraerse el jugo para beber y/o para fermentación dando vino. Otras partes comestibles de una vid incluyen las hojas y las semillas.

A no ser que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Los términos singulares “un” y “el” incluyen referentes plurales a no ser que el contexto claramente indique otra cosa. De forma similar, se entiende que la palabra “o” incluye “y” a no ser que el contexto claramente indique otra cosa. Por lo tanto, “que comprende A o B” significa que incluye A o B, o A y B. Debe entenderse además que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, proporcionados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para descripción. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo cualquier explicación de términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Visión de conjunto de varias realizaciones

La presente divulgación proporciona vectores de transferencia génica que comprenden al menos los genes de replicación de virus asociado con enrollamiento de la vid 2 (LR-2). LR-2 se ha secuenciado (Meng et al., Virus Genes 31: 31-41, 2005) y se ha comparado funcionalmente con otros closterovirus conocidos (Dolja et al, Virus Res. 117(1): 38-51, 2006). Los genes virales del núcleo de LR-2 incluyen Met (metiltransferasa), Hel (ARN helicasa) y Pol (ARN polimerasa dependiente de ARN), mientras que L1, L2 y p24, por comparación con genes homólogos de BYV, desempeñan papeles accesorios en la replicación del genoma. Otros genes también pueden incluirse en el presente vector, tales como p6, Hsp70h, p63, CPm, CP y p19 (véase, por ejemplo, Peremyslov et al., J. Virol. 72: 5870-5876, 1998).

La presente divulgación se refiere a vectores que comprenden las proteasas líder, L1 y L2, y vectores con una o ambas proteasas líder inactivadas. Un experto en la materia reconocerá inmediatamente que hay múltiples maneras en las que puede inactivarse una proteasa, y todos estos métodos se contemplan en el presente documento. Se ha mostrado previamente que para un closterovirus relacionado, BYV, se requiere la proteasa líder correspondiente L-Pro para amplificación de ARN eficaz y transporte a larga distancia del virus (Peng et al., J. Virol. 77, 2843-2849, 2003; Peng & Dolja, J. Virol. 74, 9766-9770, 2000). Resulta interesante que el reemplazo de L-Pro por las proteasas

de otros closterovirus (Peng et al., J. Virol. 75(24), 12153-12160, 2001) o incluso de un arterivirus animal (Peng et al., Virology 294, 75-84, 2002) puede rescatar la amplificación de ARN, pero no la función de transporte de la proteasa líder. El virus asociado con enrollamiento de la vid 2 (GLRaV-2) es un pariente cercano de BYV en el género Closterovirus cuya organización genética es casi idéntica a la de BYV (Zhu et al., J. Gen. Virol. 79: 12891298, 1998). Sin embargo, a diferencia de BYV que posee una proteasa líder GLRaV-2 codifica dos proteasas líder, L1 y L2 (Meng et al., Virus Genes 31, 31-41, 2005; Peng et al., J. Virol. 75(24), 12153-12160, 2001) (Figura 1A, diagrama superior). Se muestra en el presente documento por primera vez que L1 y L2 tienen funciones complementarias en el establecimiento de la infección por GLRaV-2 en las células inoculadas inicialmente y el transporte sistémico. Sorprendentemente, la contribución global de L1 y L2 a la infección de virus es mucho más crítica en un hospedador de virus natural, la vid, en comparación con un hospedador herbáceo experimental, N. benthamiana. Por lo tanto, usando las propiedades de L1 y L2, pueden reconstruirse vectores para la introducción de genes heterólogos en vides como competentes para replicación (que comprenden tanto L1 como L2) o de replicación condicionada (con una o ambas proteasas líder inactivadas).

Son vectores competentes para replicación los vectores que son capaces de producir viriones infecciosos sin necesitar factores adicionales aportados en trans. Dichos vectores, después de inoculación o transducción en una célula vegetal pueden producir viriones infecciosos e infectar otras células. Dichos vectores pueden ser útiles cuando se desee la infección sistémica de una planta, dado que el vector puede proliferar más allá de la célula originalmente transducida y aumentar la transducción global. Por ejemplo, el vector puede propagarse dentro de un tejido, entre tejidos, en toda la planta o incluso entre plantas. Por ejemplo, el vector puede infectar una hoja entera, más de una hoja, una o más hojas y el tallo o fruto de la planta, así como las raíces.

Los vectores de replicación condicionada carecen de factores virales necesarios para la producción de viriones infecciosos de forma independiente. La presente divulgación abarca vectores que tienen una o ambas proteasas líder inactivadas de modo que el vector no es capaz de producir viriones infecciosos y no pueden infectar células adicionales después de inoculación o transducción. Dichos vectores pueden ser útiles cuando no se desee la proliferación del vector, o cuando sea beneficiosa la proliferación limitada. Dichos vectores pueden tener seguridad aumentada dado que la proliferación del vector así como la expresión del gen heterólogo no va más allá de la transducción original.

En realizaciones específicas, los vectores de transformación de plantas proporcionados en el presente documento incluyen uno o más genes virales del virus asociado con enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que están implicados en el ensamblaje de viriones y/o transporte dentro de plantas. Dichos genes incluyen por ejemplo p6, Hsp70h, p63, CPm, CP y p19. En realizaciones particulares, todos estos genes están incluidos en el vector, facilitando de este modo la infección sistémica. Dicho vector puede denominarse vector de longitud completa.

El genoma de LR-2 completo (o esencialmente todo el genoma, o el equivalente del mismo) puede incluirse en el vector. El vector puede comprender secuencias heterólogas adicionales, tales como secuencias que faciliten la propagación o transformación. Dichas secuencias pueden ser elementos de control para la agroinfección, tales como un vector binario, que se conoce bien en la técnica. El vector puede tener la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2, bien como se proporciona en el presente documento o con diferentes secuencias heterólogas que reemplazan los genes indicadores proporcionados como los ejemplos (GFP y GUS). Las proteasas líder del vector pueden ser L1 (SEC ID Nº: 4) y/o L2 (SEC ID Nº: 6) de LR-2 y pueden codificarse por SEC ID Nº: 3 y 5, respectivamente. Además, puede introducirse también un supresor de silenciamiento de ARN con el vector. Dicho supresores pueden ser LR-2 p24 o p21 del virus del amarilleo de la remolacha (Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006).

El vector incluye un polinucleótido heterólogo unido operativamente con un promotor. El promotor puede ser un promotor de LR-2 nativo, por ejemplo promotor de CP LR-2, o puede ser un promotor heterólogo, tal como un promotor de otros virus que pertenecen al género Closterovirus, tales como virus del amarilleo de la remolacha, por ejemplo promotor de CP BYV, virus de malformación del amarilleo de la remolacha, virus de moteado amarillo del clavel, virus de la tristeza de los cítricos, virus de la menta 1, etc. Aunque el promotor de CP de estos virus normalmente proporciona mayor niveles de expresión, podrían ser útiles varios promotores adicionales de estos virus. Se conocen en la técnica muchos promotores adecuados. El polinucleótido heterólogo puede codificar una molécula indicadora, un marcador seleccionable y/o un gen terapéutico. Los ejemplos de moléculas indicadoras incluyen proteínas fluorescentes, tales como proteína verde fluorescente, luciferasa, beta-galactosidasa, betaglucuronidasa y otras moléculas indicadoras conocidas en la técnica. Los ejemplos de marcadores seleccionables también incluyen marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores epitópicos útiles para purificación de afinidad y similares. Los ejemplos de genes terapéuticos incluyen los que confieren resistencia a una patología o enfermedad.

La presente divulgación abarca métodos para inducir resistencia a enfermedad en una planta o célula vegetal introduciendo el vector de expresión génica vegetal de la presente divulgación en la célula. Dichas enfermedades de plantas de la uva incluyen, pero sin limitación, agentes fúngicos, agentes bacterianos, agentes virales, parásitos y tensión ambiental. Los ejemplos de enfermedades fúngicas incluyen Guignardia bidwellii (podredumbre negra), Plasmopara viticola (mildiú algodonoso), Erysiphe necator (oídio, previamente Uncinula necator), Botrytis cinerea

(podredumbre peduncular), Sclerotinia sclerotiorum (podredumbre de los brotes de Sclerotinia), Eutypia armenicae (degeneración de Eutypia), Elsinoe ampelina (antracnosis), Alternaria alternata (podredumbre de alternia), Pseudopezicula tetraspora, Cercospora brachypus, Sphacelorna ampelinum, Ascochyta sp. Aspergillus aculeatus, Cladosporiurn spp., Fusarium spp., Helminthosporium spp., Monilia sp., Stemphylium botryosum, Pleospora tarda, Torula sp., Greeneria uvicola, Botryosphaeria stevensii, Diplodia mutila, Penicillium spp., Botryotinia fuckeliana, Anthostomella pullulans, Clostridium spp., Libertella blepharis, Lasiodiplodia theobromae, Rosellinia necatrix. Dematophora necatrix, Roesleria subterranea, Mycosphaerella personata, Pseudocercospora vitis, Isariopsis clavispora, Briosia ampelophaga, Phymatotrichopsis omnivora, Dematophora necatrix, Cristulariella moricola, Grovesinia pyramidalis, Cephalosporium spp., Phellinus igniarius, Stereum hirsutum, Physopella ampelopsidis y Phomopsis viticola (enfermedad de manchas de la caña y hoja de Phomopsis).

Los ejemplos de enfermedades bacterianas incluyen Xylella fastidiosa (enfermedad de Pierce), Agrobacterium tumefaciens (agalla de corona), Pseudomonas syringae y Xylophilus ampelinus (roya bacteriana).

Los ejemplos de enfermedades virales incluyen virus asociados con enrollamiento de la vid, virus del raquitismo de la vid, virus de la vid A, virus de la vid B, mosaico anular del tomate, virus asociado con erosión del tallo de Rupestris, mosaico anular del tabaco, virus del mosaico de Arabis, virus latente italiano de la alcachofa, virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico de Bratislava, virus del marchitamiento del haba, virus del mosaico anular latente del fresal de vid, virus de necrosis del tabaco, virus del mosaico del tabaco, virus del mosaico amarillo de la vid, virus del mosaico en asteroide de la petunia y virus de la mancha anular negra del tomate.

Los ejemplos de plagas incluyen Daktulosphaira vitifoliae, Lepidoptera, Otiorhynchus sulcatus, Tylenchulus semipenetrans, Xiphinema spp., Praylenchus spp., Longidorus spp., Paratylenchus hamatus, Paratylenchus hamatus, Rotylenchulus spp., Criconemella xenoplax, Meloidogyne spp., Helicotylenchus spp., Paratrichodorus christiei, y Tylenchorhynchus spp.

Los ejemplos de tensión ambiental incluyen sequía, tensión por calor, tensión salínica, deficiencia de hierro, deficiencia de cinc, ozono y toxinas ambientales. Como alternativa, el presente vector puede usarse para conferir resistencia a herbicidas, fungicidas, pesticidas y viricidas.

La enfermedad de Pierce (PD), provocada por una infección por la bacteria Xylella fastidiosa, es particularmente importante para cultivadores de cultivares de uva. Las bacterias se multiplican en el xilema de la planta, provocando el bloqueo del movimiento y la roya o necrosis de la hoja característica, particularmente durante tensión por calor o agua. El tratamiento se centra en la actualidad en la prevención de la infección dirigiendo el vehículo de insecto que transmite las bacterias de planta a planta durante la alimentación. Se conocen varios vectores de insecto, incluyendo varios proconinos, tales como el Homalodisca vitripennis. Muchos cultivares comercialmente importantes son susceptibles de PD, haciendo de este modo urgentemente necesario combatir esta enfermedad.

Los tratamientos para dichas enfermedades pueden incluir la expresión de proteínas terapéuticas, tales como los genes de organismos patógenos o infecciosos o represión de genes de hospedadores para mitigar una respuesta no deseada. Los ejemplos de proteínas terapéuticas incluyen proteínas que se dirigen al organismo patógeno o agente directamente, tales como quitinasas, que degradan las paredes fúngicas protectoras (por ejemplo, Adams, Microbiology 150: 2029-2035, 2004), replicasas, que inhiben la replicación (por ejemplo, documento WO 98/052964), lisozimas, que atacan a las paredes bacterianas, o genes que se han descubierto en plantas resistentes a enfermedad. Se ha mostrado que las lisozimas tienen propiedades antibacterianas y pueden ser eficaces contra Xyllela. La Solicitud de Estados Unidos Nº 20020104126 muestra que la lisozima bovina, que está activa a un pH muy bajo, puede expresarse en plantas del tabaco y conserva actividad en ensayos in vitro. Sin embargo, la viabilidad de expresar lisozima en plantas leñosas, concretamente vides, o su eficacia contra Xyllela o tratamiento de PD no se ha ensayado. Se ha mostrado que el gen de resistencia a oídio de la vid, Rnn1 confiere resistencia a V. vinifera susceptible cuando se transfiere mediante una estrategia de pseudo-retrocruzamiento y se suministra usando un cromosoma artificial de bacteria (Barker et al., Theor. Appl. Genet. 111: 370-377, 2005). Por lo tanto, Run1 y otros genes asociados con la resistencia a enfermedad son adecuados para su uso en los métodos y construcciones/vectores descritos en el presente documento.

Como alternativa, el presente vector puede usarse para inducir silenciamiento de ARN (silenciamiento génico inducido por virus o VIGS) para reprimir la expresión génica no deseada, tal como expresión de genes de organismos patógenos o genes de hospedadores no deseados. El VIGS es un fenómeno bien conocido en la técnica como un mecanismo usado para examinar las funciones de genes vegetales (Godge et al., Plant Cell Rep 27(2): 209-219, 2008; e-pub antes de la impresión, 2007). Para inducir el VIGS, el vector puede codificar una parte de una secuencia de nucleótidos del gen diana. La secuencia de nucleótidos puede ser de cualquier parte del transcrito expresado a partir del gen, incluyendo una región codificante de proteína o secuencias no traducidas.

Otra realización de la presente divulgación es el uso del vector de la invención para introducir genes que están implicados en la modificación estética de las partes comestibles de la planta transducida o transgénica, tal como sabor o aroma del jugo. Dichas partes comestibles incluyen las raíces, tallos, hojas, flores, semillas y/o fruto de la planta, o cualquier sustancia comestible derivada de las mismas. En particular, las uvas, o el jugo derivado de las

mismas, puede modificarse de modo que los agentes que interaccionan con los receptores del sabor bloqueen o potencien ciertos sabores, tales como amargo, dulce, agrio y similares. Como alternativa, los agentes potencian los compuestos aromáticos hallados en las uvas o el jugo. Dichos agentes pueden ser proteínas, tales como monelina, taumatinas, gustducina, terpenoides y otras de dichas proteínas conocidas en la técnica. Para modificación estética, el vector de la presente divulgación puede modificarse por ingeniería genética para codificar una molécula modificadora de la estética, tal como una proteína, y usarse después el vector para transformar una célula vegetal, que después expresa la molécula.

Los métodos y vectores de la presente divulgación también pueden usarse para introducir genes que están implicados en las rutas metabólicas de uvas (metabolómicas) para la mejora de las características nutricionales. Por ejemplo, se ha descubierto que el resveratrol, un compuesto polifenólico (3, 4’, 5-trihidroxiestilbeno) hallado en uvas, tiene ciertos beneficios para la salud, tales como propiedades antineoplásicas y asociación con una reducción en enfermedad cardiovascular. Otros compuestos hallados en uvas con beneficios para la salud potenciales incluyen fitonutrientes tales como quercetina, catequinas, antocianinas y proantocianidinas. La secuenciación de la variedad de uva pinot noir así como el desarrollo de técnicas de realización de perfiles metabólicos, tales como técnicas espectroscópicas de resonancia magnética nuclear, proporcionan información valiosa para desarrollar genes adecuados para su uso con los vectores y sistemas de expresión descritos en el presente documento. Genes adicionales de interés están implicados en la maduración, tales como el gen flb, así como cualquier aspecto del cultivo de plantas, desarrollo y producción agrícola que pueda desearse.

La presente divulgación abarca métodos para expresar un gen heterólogo en una célula vegetal introduciendo un vector de expresión génica vegetal descrito en la célula. El vector de transferencia génica vegetal puede introducirse en la célula vegetal por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por infiltración de vacío, sonicación, de forma balística, precipitación con fosfato cálcico, electroporación, fusión de polietilenglicol, transformación directa (Lorz et al, Mol. Genet. 199: 179-182, 1985) y otros métodos. El vector puede introducirse como una partícula viral infecciosa o como un nucleótido no infeccioso. Un método es la agroinoculación, por ejemplo, incorporando el vector en un plásmido binario con elementos de control adecuados para expresar el vector en una especie de Agrobacterium, tal como A. tumefaciens, A rhizogenes y A. vitis. Dichos métodos se conocen en la técnica, tales como los descritos en Leiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9136-9140, 1992 y Bouquet et al, Methods in Mol. Bio. 344: 273-285, Agrobacterium Protocols, 2ª ed. vol. 2, Wang ed (2006). Puede introducirse Agrobacterium en plantas de vid micropropagadas por medio de infiltración de vacío o sonicación. Las cepas de Agrobacterium modificadas por ingeniería genética para expresar el vector viral pueden mezclarse con otra cepa modificada por ingeniería genética para expresar el supresor viral de ARNi para aumentar la infecciosidad del vector (Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006).

El vector puede introducirse para expresión estable o expresión transitoria. Puede conseguirse expresión estable por varios métodos conocidos, tales como cocultivo de tejido de uva embrionario con Agrobacterium que contiene el vector usando los métodos de Bouquet et al. (Methods Mol. Biol. 344: 273-285, 2006). También puede conseguirse expresión transitoria por métodos conocidos, tales como los métodos descritos en los ejemplos de la presente solicitud. Otros métodos incluyen, pero sin limitación, infiltración de hojas, infiltración de vacío y bombardeo de tejidos diana con partículas recubiertas de ADN.

El vector también puede aplicarse a la vid o a cualquier parte de la misma mediante aplicación de una solución que contiene el vector, tal como por pulverización. Dichas soluciones contienen el vector como ADN, partículas recubiertas de ADN o contenidas en Agrobacterium, así como sales y tampones. La solución puede contener, por ejemplo, un tampón fosfato a 0,1 M, pH 7 o puede contener nicotina. Dichas formulaciones se conocen bien en la técnica y pueden usarse según sea adecuado para los presentes métodos. La solución puede contener además un abrasivo, tal como carborundum, por ejemplo carborundum de malla 500, caolín o tierra diatomea Celite. La solución puede comprender también un tensioactivo, tal como Triton o Tween, que se conocen bien en la técnica. La solución puede aplicarse a la planta mediante frotado, goteo, inmersión, pulverización u otros medios. Véase, por ejemplo, enfermedades transmisibles por injerto de vides. Martelli ed. 1993, Roma, Italia, Food and Agriculture Organization of the United Nations publ.

La presente divulgación incluye además composiciones que comprenden el vector o los vectores descritos en el presente documento. Además del vector y opcionalmente otros ingredientes funcionales tales como abrasivos y/o tensioactivos, dichas composiciones pueden incluir excipientes adecuados para introducir el vector en una célula vegetal, tales como sales, por ejemplo, cloruro de magnesio y tampones, tales como MES o fosfato, y son normalmente soluciones acuosas. Véase, por ejemplo, enfermedades transmisibles por injerto de vides. Martelli ed. 1993, Roma, Italia, Food and Agriculture Organization of the United Nations publ.

El vector puede aplicarse diariamente, mensualmente, por temporadas o anualmente. El vector puede aplicarse durante o después de la aparición de enfermedad o la infestación de los vehículos de enfermedad. Por ejemplo, los síntomas de la enfermedad pueden leerse dos veces al año: al final de la primavera para deformaciones de la hoja y la caña y necrosis y en otoño para pigmentación anómala y otras deformidades ((Graft transmissible diseases of grapevines. Martelli ed. 1993, Roma, Italia, Food and Agriculture Organization of the United Nations publ). Tras la identificación de los síntomas, el vector puede aplicarse, tal como pulverización con una solución que contiene un

abrasivo. Como alternativa, las plantas pueden pulverizarse tras la infestación con un vehículo conocido de una enfermedad, tal como ciertos nematodos o cicadas de vides, o en ciertas condiciones climáticas o estaciones que se sabe que inducen condiciones favorables a una enfermedad, tales como clima húmedo y oídio. Se conocen bien en la técnica directrices e índices para dichas condiciones, tales como las Directrices del Control de Plagas de la Universidad de California, los Sistemas de Control de Plagas Integrados Estatales, disponibles en internet en at.ipim.ucdavis.edu/PMG/r302101211.html (accedida por última vez el 27 de enero de 2008). Además, el presente vector puede aplicarse con otros agentes antienfermedad conocidos, tales como aceites, fungicidas y similares.

La presente divulgación incluye un método para transformar una planta que comprende introducir la transferencia génica vegetal descrita en la planta una vez o más de una vez. El vector puede introducirse dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez veces en la planta. La planta puede expresar el polinucleótido heterólogo de forma sistémica o local.

La célula vegetal puede cultivarse en una planta transgénica, tal como usando los métodos de Bouquet et al. (Methods Mol. Biol. 344: 273-285, 2006). Como alternativa, la célula vegetal puede ser parte de una planta multicelular de modo que se transforme solamente una parte de la planta. Por ejemplo, puede transformarse el rizoma, el tallo o las hojas. El vector puede introducirse antes de la aparición de enfermedad para conferir resistencia, o puede introducirse después de observar la enfermedad para reducir o aliviar la enfermedad, para proteger las partes no infectadas restantes de la planta o para prevenir la propagación de la enfermedad a otras plantas.

Referencias adicionales

Agranovsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92(7), 2470-2473, 1995 Alzhanova et al., Virology 268(1), 192-200, 2000 Alzhanova, EMBO J. 20, 6997-7007, 2001 Alzhanova et al., Virology 359, 220-226, 2007 Barrett y Rawlings, Biol. Chem. 382, 727-733, 2001 Boyko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 89, 9156-9160, 1992 De los Santos et al., J. Virol. 80, 1906-1914, 2006 Ding y Voinnet, Cell 130, 413-426, 2007 Donson et al., Proc Natl Acad Sci U S A 88: 7204-7208, 1991 Dougherty y Semler, Microbiol. Rev. 57(4), 781-822, 1993 Gabrenaite-Verkhovskaya et al., J. Gen. Virol. 89, 829-838, 2008 Gorbalenya et al, FEBS Lett 243, 103-114, 1989 Gorbalenya et al., Virus Res., 117(1):17-37,006 Gorbalenya et al., FEBS Lett. 288(1-2), 201-5, 1991 Karasev, Annu. Rev. Phytopathol. 38, 293-324, 2000 Kasschau et al., Virology 228(2), 251-62, 1997 Koonin y Dolja, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28(5), 375-430, 1993 Koonin y Dolja, Virus Res 117, 1-4, 2006 Lakatos et al., EMBO J. 25, 2768-2780, 2006 Lu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101, 15742-15747, 2004 Marillonnet et al., Nat. Biotechnol. 23: 718-723, 2005 Napuli et al., J. Virol. 77, 2377-2384, 2003 Ng y Falk, Annu. Rev. Phytopathol. 44, 183-212, 2006 Satyanarayana et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101, 799-804, 2004 Satyanarayana et al., Virology 278(1), 253-265, 2000 Segers et al., Eukaryot. Cell 5, 896-904, 2006 Susaimuthu et al., Virus Res. 131, 145-151, 2008 Tian et al., J. Gen. Virol. 80, 1111-1117, 1999 Tijms et al., J. Virol. 81, 10496-10505, 2007 Torrance et al., J. Mol. Biol 357, 1-8, 2005 Valli et al., J. Virol. 80, 10055-10063, 2006 Ziebuhr et al., J. Virol 81, 3922-3932, 2007 Ziebuhr et al., J. Gen. Virol. 81, 853-879, 2000

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características y/o realizaciones particulares. No debería interpretarse que estos ejemplos limiten la invención a las características o realizaciones particulares descritas.

Ejemplos

Búsqueda de un aislado de virus local. Se realizó un estudio de vides locales para determinar si LR-2 está presente de forma natural en Oregón, y se descubrieron vides que mostraban síntomas de tipo LR-2 de enrojecimiento de la hoja temprana. Se realizó análisis de inmunotransferencia con el kit de inmunodetección de LR

2 disponible en el mercado (Bioreba AG, Reinach, Suiza; Cat. Nº 120775) y se generaron anticuerpos adaptados usando los viriones de LR-2 aislados de N. benthamiana como se describe posteriormente. El análisis de RT-PCR usando los cebadores diseñados para amplificar una región de aproximadamente 2 kb del genoma de LR-2 que contenía el gen de proteína de cápsida viral también demostró que las vides contenían de hecho el virus.

Clonación molecular y secuenciación de nucleótidos. Para facilitar la acumulación y aislamiento de LR-2, se usó material de vides infectadas para inocular mecánicamente N. benthamiana. Se usaron partículas de virus purificadas para obtener ARN viral, amplificarlo por RT-PCR y clonar los productos de ADNc en el plásmido del vector pBlueScript. Las secuencias terminales del genoma viral se clonaron usando RLM-RACE. Se secuenció un gran número de clones independientes para proporcionar cobertura múltiple del genoma viral. La secuencia de nucleótidos consenso resultante por primera vez incluyó el genoma viral completo y contenía regiones terminal 5’ y terminal 3’ exactas. El análisis comparativo de esta secuencia reveló 99,9 % de identidad con la secuencia incompleta publicada previamente del aislado del LR-2 de Nueva York sobre las regiones de solapamiento (Zhu et al., J. Gen. Virol. 79: 1289-1298, 1998). Se muestra un mapa funcional del genoma de LR-2 de ~16.500 nucleótidos de longitud en la Figura 1A.

El inóculo inicial de N. benthamiana con LR-2 se realizó como se describe en Goszczynski et al. (Vitis 35: 133-135, 1996). Posteriormente, se usaron hojas infectadas de N. benthamiana para realizar un inóculo para propagación de virus en este hospedador de virus experimental. De forma rutinaria, se molió 1 g de tejido infectado en 5 ml de tampón de Na-fosfato 0,05, pH 7,0, y se usó para inoculación manual de las nuevas plantas con ayuda de carborundum.

Se realizó amplificación por RT-PCR, clonación y ensamblaje del clon de ADNc de longitud completa como se describe en Peremyslov y Dolja (Curr. Protocols Microbiol., “Cloning of Large Positive-Strand RNA Viruses” Supl. 7., Coico, ed., noviembre, 2007).

Inserción del casete de expresión génica. Se clonó un promotor de ARN subgenómico fuerte que conduce la expresión de la proteína de cápsida principal en el pariente de LR-2, virus del amarilleo de la remolacha (BYV), y se insertó cadena abajo del promotor de LR-2 análogo junto con sitios de restricción únicos Pac I y Fse I en uno de los clones de ADNc de LR-2 parciales. Se insertó un gen indicador que codificaba proteína verde fluorescente dirigida a retículo endoplásmico (ER-GFP) entre los dos promotores (Figura 1B). Se esperaba que este diseño diera como resultado una producción de alto nivel de ER-GFP de promotor de LR-2 auténtico y proteína de la cápsida de LR-2 de un promotor de BYV recombinante descrito en (Agranovsky et al., J. Gen. Virol. 72: 15-23, 1991) e ilustrado en la SEC ID Nº: 1.

Generación de un clon de ADNc de longitud completa de LR-2. Usando clones de ADNc parciales solapantes, se ensamblaron varios clones de LR-2 de longitud completa prototípicos que contenían casete de expresión en pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA) bajo el control del promotor de ARN polimerasa SP6 de fago. Se obtuvieron transcritos de ARN de extremos recubiertos correspondientes in vitro y se usaron para transfectar protoplastos de cultivo en suspensión del tabaco e inocular plantas de N. benthamiana. Debido a que ninguno de estos experimentos dio como resultado multiplicación e infección de virus, se volvió a secuenciar el genoma viral clonado. Se detectaron múltiples mutaciones perjudiciales en todo el genoma lo que sugiere que se introdujeron errores durante la amplificación por RT-PCR de fragmentos genómicos. Para superar este importante obstáculo, se volvió a ensamblar el genoma de LR-2 completo a partir de los fragmentos de ADNc obtenidos usando transcripción inversa y ADN polimerasa de Klenow en lugar de PCR. Aunque este enfoque dio como resultado una reducción drástica del número de mutaciones letales, ninguno de los clones resultantes estaba completamente libre de ellas. Estos resultados indicaron que el ADNc de LR-2 en forma sin mutaciones, funcional, era probablemente tóxico para E. coli usada para clonación.

Uno de los enfoques que pueden aliviar la toxicidad de ADN recombinante es usar un número de copias de plásmido para la clonación. Para ensayar esta posibilidad, se usó pCB-302 (Xiang et al., Plant Mol. Biol. 40: 711-717, 1999), un mini-vector binario adecuado para clonar tanto en E. coli como en A. tumefaciens. Este vector se ha modificado para acomodar todos los elementos de control requeridos para expresión posterior del genoma de LR-2 en plantas usando agroinoculación. Estos elementos incluyeron el promotor de ARN polimerasa de 35S, terminador de NOS y una ribozima diseñada a medida para una liberación de un extremo 3’ auténtico de ARN de LR-2 tras su transcripción. Este último acontecimiento de procesamiento es crítico para la capacidad del ARN viral para replicar en la planta. Después de estas modificaciones, se clonó el ADNc de LR-2 de longitud completa en pCB-302 y se designó el plásmido pCB-LR-GFP (SEC ID Nº: 1).

El ADNc de LR-2 se clonó entre los extremos derecho e izquierdo de ADN-T del plásmido pCB-302. Se muestra un mapa del plásmido resultante en la Figura 1C. La secuenciación de nucleótidos del genoma viral clonado completo no reveló ninguna mutación perjudicial.

Ensayos de infecciosidad en N. benthamiana. Se transformó pCB-LR-GFP en agrobacterium y la cepa resultante se cultivó, se indujo y se usó para agroinfiltración de las plantas de N. benthamiana. De media a las 2-3 semanas después de la inoculación, algunas de las plantas mostraron síntomas de infección típicos. La microscopía de

barrido de láser confocal detectó fuerte expresión de GFP en las células epidérmicas de las hojas infiltradas. Como se esperaba, la fluorescencia de GFP se limitó a una red característica del retículo endoplásmico (ER) y complejos de replicación de viral derivados de ER (Fig. 2). El examen de las hojas superiores, tallos y peciolos de las plantas sintomáticas reveló altos niveles de acumulación de ER-GFP en los tejidos del floema por toda la planta que son típicos de LR-2 y otros closterovirus (Fig. 3). El análisis ultraestructural del tejido infectado confirmó la acumulación de las grandes cantidades de viriones de LR-2 filamentosos en las células de floema, especialmente en las células de la vaina de haz que rodean al xilema y elementos de tamiz. Además, el análisis de inmunotransferencia confirmó la acumulación eficaz de proteína de la cápsida de LR-2 (Fig. 4A). Estos experimentos demuestran que el LR-2 clonado, recombinante es altamente infeccioso, es capaz de proliferar de forma sistémica y expresar un proteína recombinante en un hospedador experimental N. benthamiana.

Mejora del eficacia de agroinfección. Aunque se produjo uniformemente infección por LR-2 tras la agroinoculación, el número de células infectadas de forma primaria en las hojas inoculadas fue baja y solamente una fracción de las plantas inoculadas desarrolló infección sistémica. Para potenciar la capacidad del virus recombinante para establecer la infección, se usó un método basado en la expresión de supresores virales de ARNi en el momento de la inoculación (Chiba et al. Virology 346: 7-14, 2006). Además, se demostró que LR-2 codifica un supresor muy potente de ARNi, p24. Por lo tanto, se añadió agrobacterium que se había modificado por ingeniería genética para expresar p24 a inóculo. Esta técnica dio como resultado un aumento de aproximadamente 5000 veces en la infecciosidad específica del virus introducido por agrobacterium (Fig. 5) (Chiba et al. Virology 346: 7-14, 2006). En la actualidad se obtiene rutinariamente 100 % de infección de las plantas agroinoculadas N. benthamiana.

Estabilidad genética del vector de expresión génica de LR-2. Para ensayar si el vector de LR-2 es capaz de conservar un inserto ajeno intacto que codifique proteína indicadora, se han aislado ARN de las hojas superiores de las cuatro plantas individuales de N. benthamiana infectadas. Se ha realizado RT-PCR usando estos ARN y cebadores localizados cadena arriba y cadena abajo del casete de expresión de ER-GFP. Los productos de PCR resultantes eran del tamaño esperado lo que indica conservación del casete completo en cada una de las plantas ensayadas (Fig. 4B). Resulta importante que no se detectaron productos más cortos que podrían originarse de pérdida completa o parcial del casete. Estos datos confirmaron que el vector modificado por ingeniería genética es genéticamente estable y puede usarse para la expresión eficaz de las proteínas recombinantes.

Desarrollo del vector de silenciamiento génico para genómica funcional y control de virus. Para ensayar un potencial del vector de LR-2 para silenciamiento génico inducido por virus (VIGS), se usó la línea de N. benthamiana transgénica para GFP 16c y LR-2 que expresaba GFP. Se observó el silenciamiento de GFP fuerte en las hojas infectadas de forma sistémica de plantas 16c después de inoculación con LR-2 GFP (Fig. 6). Este experimento demostró que LR-2-GFP actúa de forma similar a vectores de VIGS conocidos induciendo ARNi del transgén en respuesta a sobreexpresión del gen afín por virus, proporcionando prueba de concepto para la utilidad del vector de LR-2 para VIGS.

Micropropagación de vid y transferencia a suelo. Se desarrolló un aporte fiable de plantas de vides experimentales en todo el año para ensayar los nuevos vectores usando una técnica para micropropagación de vid en condiciones estériles en cajas de plástico usando medio de cultivo basado en agar. Dichas plantas pueden usarse para ensayos de infecciosidad directamente. Además, hay informes anecdóticos que indican que las plantas micropropagadas han aumentado la susceptibilidad a infección viral. Como alternativa, pueden transferirse plantas micropropagadas a suelo y cultivarse en el invernadero para obtener plantas leñosas que son más similares en su susceptibilidad a plantas cultivadas en el suelo abierto. Las condiciones se optimizaron para dicha transferencia y se obtuvo aporte constante de las plantas de vides micropropagadas y de invernadero.

Brevemente, se agruparon recortes de 30,48 centímetros con al menos dos brotes en grupos de 20-30 y se empaparon en una solución de lejía al 10 % durante 10 minutos, se aclararon tres veces en agua, después se sumergieron en agua durante 12-24 horas. Los haces se sumergieron después en solución de arraigo (Dip’N Grow, Dip’N Grow Inc., Clackamas, OR) y se plantaron en vermiculita húmeda calentada a 29,44 ºC. El arraigo se produjo en 3-4 semanas. Los recortes se plantaron después a 10,16-15,24 centímetros de profundidad en suelo de maceta bajo un lecho de nebulización ajustado para 3 segundos cada ocho unidades solares (día) y 3 segundos cada 2 horas (noche): una vez que las hojas aparecieron en aproximadamente dos semanas, se redujo la nebulización para evitar el crecimiento de moho y mildiú.

Para establecer vides en cultivo tisular, se retiraron nuevos brotes y se retiraron todas excepto una hoja de la punta del brote. Los brotes se incubaron en jabón líquido Ivory al 0,05 % (Proctor and Gamble, Cincinnati, OH) durante 10 minutos, se aclararon en agua durante una hora, después se sonicaron durante diez minutos en un baño de agua de sonicación. Los brotes se esterilizaron en superficie en una solución de lejía al 5 % durante seis minutos y se movieron a una campana de flujo laminar para manipulación estéril. Los brotes se aclararon en agua desionizada estéril, se recortaron en la base y se plantaron en medio de agar OH. Los brotes se incubaron en una campana de cultivo durante dos semanas; se añadió líquido GS1, se incubó durante otras dos semanas, y después se transfirieron a medio de agar GS1. Cada dos semanas, se añadió medio nuevo, a continuación después de un mes, los brotes se cambiaron al medio del siguiente estadio (GS2, GS3). Las raíces se desarrollaron en medio GS3.

Medio OH de uva

Ingrediente Concentración g/l

Sales M y S 3,22 g Tiamina reserva de 0,8 ml () Inositol 0,100 g 0,5 ng/ml Sacarosa 7 g NaH2PO4 0,170 g Sulfato de adenina 0,08 g Ajustar pH a 5,7 Agar 3 g

5 Esterilizar por autoclave durante 20 minutos, enfriar en baño de agua a 50 ºC durante 30 minutos, después añadir antibiótico: Cefotaxima 0,2 g. Esterilizar por filtración en medio frío y mezclar. Distribuir a tubos de ensayo estériles.

Medio de estadio de uva 1 (GS1)

Ingrediente Concentración g/l

Sales M y S 3,22 g Tiamina reserva de 0,8 ml (0,5 mg/ml) Inositol 0,1 g Sacarosa 20 g BAP reserva de 2 ml (0,5 mg/ml))

10 Esterilizar por autoclave durante 20 minutos, enfriar en baño de agua a 50 ºC durante 30 minutos, después añadir antibiótico: Cefotaxima 0,2 g. Esterilizar por filtración en medio frío y mezclar. Distribuir en 24 cajas Magenta estériles.

15 Medio de estadio de uva 2

Ingrediente Concentración g/l

Sales M y S 3,22 g Tiamina reserva de 0,8 ml (0,5 mg/ml) Inositol 0,25 g Sacarosa 15 g NaH2PO4 0,05 g BAP reserva de 4 ml (0,5 mg/ml) IAA reserva de 0,5 ml de IAA (1 mg/ml) Ajustar pH a 5,3 Agar 2 g Goma gellan Gelrite 1,2 g

Esterilizar por autoclave durante 20 minutos, enfriar en baño de agua a 50 ºC durante 30 minutos, después añadir antibiótico: Cefotaxima 0,2 g. Esterilizar por filtración en medio frío y mezclar. Distribuir en 24 cajas Magenta 20 estériles.

Medio de estadio de uva 3 (GS3)

Ingrediente Concentración g/l

Sales M y S 3,22 g Tiamina reserva de 0,8 ml (0,5 mg/ml) Inositol 0,025 g Sacarosa 15 g NaH2PO4 0,05 g IAA reserva de 1 ml (1 mg/ml) Ajustar pH a 5,3 Agar 1 g Goma gellan Gelrite 1 g

25 Esterilizar por autoclave durante 20 minutos, enfriar en baño de agua a 50 ºC durante 30 minutos, después añadir antibiótico: Cefotaxima 0,2 g. Esterilizar por filtración en medio frío y mezclar. Distribuir a 24 cajas Magenta estériles

o 12 cajas Magenta de dos pisos.

Se están micropropagando y examinando numerosas variedades de uva con respecto a su susceptibilidad a la 30 agroinfiltración y expresión de proteínas ajenas. Las variedades Carbernet franc y Sirah han demostrado

propiedades deseables. Además, se ha descubierto preliminarmente que las plantas estériles transferidas a medios sin antibióticos son más susceptibles a agroinfiltración.

Preparación de agrobacterium. Para preparar el Agrobacterium, la construcción de agro se sembró en estrías en placa de agar LB Kan (50 g/ml) y se incubó a 28 ºC durante tres días. Se seleccionaron colonias individuales y se añadieron a un cultivo de 5 ml en LB Kan (50 g/ml), MES (10 mM) y acetosiringona (20 M) y se agitó a 220 rpm y 28 ºC. Se añadió rifampicina (50 g/ml) si se usó la cepa de Agro C58 GV2260. Los cultivos de partida se transfirieron a 500 ml de LB Kan (50 g/ml), MES (10 mM) y acetosiringona (20 M) y se agitaron durante una noche (1-20 horas) a 28 ºC. El cultivo se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y el sedimento celular se suspendió en 20 ml en tampón de inducción para una concentración final de DO600 2,0 para construcciones de virus completo o DO600 0,7 para construcciones solamente con marcador de GFP combinando con DO600 0,1-0,14 para p24 supresor y añadiendo tampón de inducción adicional.

Para preparar la construcción de p24 supresora, se preparó la reserva de Agro como anteriormente, después se suspendió en 20 ml de tampón de inducción a una concentración final de DO600 0,1 para combinar con la suspensión de construcción de virus completo o DO600 0,14 para combinar con suspensión solamente con marcador de GFP.

Tampón de inducción

MgCl2 10 mM = 2 ml de MgCl2 0,5

MES 10 mM pH 5,85 = 2 ml de MES 0,5 M pH 5,85 por 100 ml

acetosiringona 150 M = 100 l de acetosiringona 150 mM

Infiltración por agrobacterium de hojas de vid micropropagadas o plantas completas. Se hirieron hojas sanas de plantas micropropagadas con aguja de 31 g agujereando las venas grandes y la superficie de la hoja. Se colocaron hojas individuales en tubos con 5-10 ml de suspensión de inducción, o la planta completa se soltó en un vaso de precipitados grande con 200 ml de suspensión de inducción. Las suspensiones de vid/agro se sonicaron durante 10 minutos en un baño de agua de sonicación Branson 3510, después se empaparon en suspensión de inducción durante 2-3 horas después de la sonicación. Las hojas o plantas de vid se secaron en toallas de papel estériles, después las hojas se colocaron en placas de agar con agua (7 g de agar/1 l de agua) y se sembraron plantas completas en macetas de 10,16 centímetros que contenían mezcla de macetas y se regaron abundantemente. Se colocaron vasos de plástico estrechamente sobre las plantas para reducir la transpiración en la cámara de cultivo. El aire ambiental se introdujo gradualmente en plantas sembradas inclinando el ángulo de los vasos durante un periodo de dos semanas hasta retirar con el tiempo los vasos de plástico.

Las hojas se controlaron con respecto a expresión de GFP por microscopio después del día 4 para construcciones solamente con el marcador de GFP y después del día 12-14 para construcciones de GFP/virales completas.

Pueden usarse técnicas similares con otras partes de la planta, tales como el rizoma.

Expresión de GFP en vid usando agrobacterium. De forma paralela a los intentos de generar un clon infeccioso de LR-2, se realizaron experimentos dirigidos a desarrollar tecnologías para la expresión transitoria mediada por agrobacterium de genes recombinantes en la vid. Estos experimentos se diseñaron para facilitar ensayos de infecciosidad futuros en la vid. Usando agrobacterium modificada por ingeniería genética para expresar indicador de GFP libre (Fig. 7C) y una técnica de infiltración de vacío de suspensión bacteriana en hojas o plantas completas, se demostró la acumulación de GFP en plantas micropropagadas. Para este fin, se dejaron hojas agroinfiltradas separadas en placas de Petri sobre agar con agua en una cámara de cultivo de plantas a 22 ºC durante 4 días y se exploró con respecto a expresión de GFP usando el estereoscopio epifluorescente Leica MZ 16F equipado con un filtro de GFP2 y cámara digital (como se muestra en la Fig. 7A y B) o microscopio de láser confocal. Se realizó microscopía de exploración de láser confocal usando el microscopio Zeiss LSM 510 META (Zeiss, Alemania) equipado con los filtros de excitación a 488 nm y emisión a 508 nm. El paquete de software proporcionado por el fabricante se usó para procesamiento de imágenes.

También se ensayó una técnica alternativa de agroinoculación usando inmersión de las plantas en baño ultrasónico con suspensión bacteriana como se ha descrito anteriormente. Este enfoque demostró ser tan exitoso como la infiltración con el beneficio adicional de la simplicidad (Fig. 7A). Además, la sonicación dio como resultado una expresión frecuente de GFP en el tejido de hoja vascular (Fig. 7B). Debido a que LR-2 está asociado preferentemente con el floema, se espera que esta técnica facilite la infección.

Se realizan ensayos adicionales utilizando aislados de Agrobacterium vitis y A. rhizogenes para determinar si estas bacterias pueden proporcionar mejor eficacia de agroinoculación en uvas en comparación con A. tumefaciens tradicional. Además, está en curso para mejorar la transformación la optimización de los protocolos para agroinfiltración y sonicación, ensayo de la utilidad de agroinfección combinada con injertos (cortes injertados Omega tratados con suspensión bacteriana) y una técnica de agroinoculación de pelar-curar por la que se aplica suspensión bacteriana al floema expuesto pelando la corteza.

Ensayos de infecciosidad en vid. Se usaron dos clones de LR-2 diferentes para agroinoculación: i) miniLR-GFP/GUS (este mini-genoma incluye solamente los genes requeridos para replicación más un gen indicador GFP/GUS y carece de genes requeridos para el ensamblaje de viriones y transporte en plantas; SEC ID Nº: 2). El indicador GFP/GUS representa una fusión de GFP que puede detectarse por microscopía epifluorescente y GUS (glucoronidasa) que posee actividad enzimática que proporciona ensayos sensibles in situ e in vitro. El papel de miniLR-GFP/GUS se muestra en la Fig. 8; la secuencia de nucleótidos correspondiente se proporciona como SEC ID Nº: 2; y ii) LR-2-GFP de longitud completa (SEC ID Nº: 1). Cuando se exploraron las plantas micropropagadas agroinoculadas con miniLR-2GFP/GUS mezclado con plásmido que expresa p24, se observaron grandes números de células infectadas que expresaban indicador de ER-GFP en el ER (Fig. 8) lo que demuestra la capacidad del mini-vector para replicar y expresar proteína indicadora en las células de hojas de la vid. Por lo tanto, cada célula positiva para GFP detectada por microscopía de barrido de láser confocal o epifluorescente representa un acontecimiento exitoso de la introducción del vector viral y obtención de expresión del indicador por el vector viral en este caso presentado por el minirreplicón.

Sin embargo, experimentos similares con el vector de longitud completa dieron como resultado infección del número limitado de células (Fig. 9). De hecho, en trabajos anteriores con BYV, se ha descubierto que el nuni-genoma tenía infecciosidad muy superior tras agroinfección (Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006).

Desarrollo adicional del vector de LR-2 de longitud completa. El clon de LR-2 de longitud completa original se generó usando ARN genómico de LR-2 aislado del virus que se propagó en N. benthamiana. Para mejorar la infecciosidad de la vid y reducir la posible mutación debido a la adaptación de virus a un hospedador experimental, el clon de longitud completa se reensambló de fragmentos de ADNc derivados directamente de vid infectada por LR2 de Pinot Noir obtenida de un viñedo de Oregón local.

Se purificó ARN total de hojas usando un kit RNeasy Vegetal (QIAGEN) y se usó como un molde para construcción de ADNc de cebadores aleatorios. Después se amplificaron por PCR fragmentos contiguos de 2 a 4 kb a partir de este ADNc. Se diseñaron oligonucleótidos para las PCR basándose en la secuencia publicada de los sitios de clonación únicos solapados y de GRLaV-2 presentes en el ADNc de este virus. Los fragmentos de PCR amplificados se clonaron después en un plásmido binario que portaba la variante original del ADNc de LR-2 para reemplazar partes existentes con las derivadas de un virus presente en la vid. Para cada uno de los fragmentos se secuenciaron al menos cuatro clones para deducir secuencias consenso que corresponden a la variante predominante y completamente biológicamente activa del genoma de LR2 presente en la vid. El ADNc genómico completo que comprende los trozos consenso se reensambló de novo. El nuevo plásmido binario que portaba el ADNc para el virus derivado de la vid derivado de la Pinot Noir y que no había pasado nunca a través N. benthamiana se designó LR2-Vitis.

La secuencia de nucleótidos completa de este casete de expresión LR2-Vitis derivado de la vid se muestra en SEC ID Nº: 7. Esta secuencia contiene 74 diferencias de nucleótidos de un casete viral derivado de N. benthamiana original (FIG. 14). Parece probable que estas diferencias reflejen adaptaciones del virus a la infección sistémica de la planta hospedadora natural (vid) o experimental (N. benthamiana). Por lo tanto, se espera que el vector LR2-Vitis derivado de la vid posea una capacidad aumentada de propagación en la vid.

Utilización de los promotores específicos del floema de V. vinifera. Los vectores LR-2 y LR2-Vitis se introducen usando el promotor de ARN polimerasa II de 35S de CaMV (POL II) que conduce la transcripción de ARN viral tras la agroinoculación. Aunque el promotor de 35S se usa rutinariamente para dichos fines, podría ser subóptimo para la infección de la vid usando vectores LR-2. De hecho, el LR-2 infecta de forma natural la vid y se limita al tejido del floema, mientras que el promotor de 35S no es específico ni de la vid ni del floema. Por lo tanto, los inventores usaron bioinformática para identificar los promotores específicos de floema de la vid candidatos que pueden usarse para el reemplazo del promotor de 35S para mejorar la infección de la vid por LR2-Vitis.

Se identificaron tres genes de A. thaliana específicos de floema, altamente expresados, y se usaron las secuencias proteicas correspondientes y búsqueda de BLASTP para identificar ortólogos de V. vinifera aparentes. Se propone que las secuencias genómicas de V. vinifera cadena arriba de secuencias codificantes de proteínas correspondientes (SEC ID Nº: 8-10) son útiles como promotores específicos del floema en lugar del promotor de 35S ejemplificado en un casete de LR2-Vitis. La naturaleza y propiedades específicas de los promotores de V. vinifera se perfilan a continuación.

1.

El promotor del gen de TRANSPORTADOR SACAROSA 2 de A. thaliana (simportador SUC2 de sacarosa-H+) (At1g22710) se caracterizó en primer lugar por Truernit y Sauer (Planta 196: 564-570, 1995). En Arabidopsis, este promotor regula la expresión del gen de simportador de sacarosa-H+ AtSUC2 específico de célula compañera de floema en la red venosa completa de hojas completamente desarrolladas (Imlau et al., Plant Cell 11: 309-322, 1999). Imlau et al. también descubrió que un fragmento de 939 nt 3’ de este promotor es suficiente para conducir la expresión de alto nivel, específica del floema, de un gen indicador.

2.

El gen de Arabidopsis At5g57350 codifica una H(+)-ATPasa 3 de membrana plasmática (bomba de protones) y se expresa en el floema en toda la planta (DeWit et al., Plant J. 1, 121-128, 1991). El fragmento promotor de 2.467 kb de esta ORF fue suficiente para conducir la expresión génica en células compañeras del floema presentes en

hojas, tallos y raíces (Hong Yu et al., Chinese Science Bulletin, 52: 1949-1956, 2007).

3. Gen de Sacarosa sintasa 1 de Arabidopsis (At5g20830). Una región promotora de 2 kb de esta ORF fusionada con un gen indicador dirige su expresión en el floema de hojas maduras (Bieniawska et al., The Plant Journal 49, 810-828, 2007). El extremo 5’ del ARNm comienza con ATCTTA (Martin et al., Plant J 4: 367-377. 1993) que está muy cerca de la secuencia 5’ terminal de LR-2 que hace a este promotor un candidato muy atractivo para la mejora de la infecciosidad de LR2-Vitis en la vid.

Las secuencias de nucleótidos de los promotores de la vid localizados cadena arriba de las ORF de la vid que codifican ortólogos aparentes de los genes de Arabidopsis Atlg22710, At5g57350 y At5g57350 se muestran en SEC ID Nº: 8-10 (respectivamente), junto con identificadores de base de datos que proporcionan sus posiciones respectivas en el genoma de V. vitis.

Caracterización de los efectos de proteasas líder en replicación

Generación de replicones de GLRaV-2 marcados por inserción de los indicadores fluorescentes, enzimáticos y epitópicos

Se generaron clones para GLRaV-2 para determinar perfiles funcionales de L1 y L2. Se secuenció el genoma de GLRaV-2 de 16.486 nt de longitud, completo (GenBank número de referencia FJ436234; el gen ID es: gi:213958313) y se comparó con los otros aislados de este virus para revelar la relación más estrecha (identidad de nt del 99,6 %) con el aislado 94/970 (Meng et al., Virus Genes 31, 31-41, 2005). El clon de longitud completa inicial se ensambló usando un vector binario y principalmente clonación de ADNc convencional para evitar la introducción de las mutaciones generadas por PCR, y se secuenció para confirmar su correspondencia con la secuencia de nucleótidos consenso del genoma viral. Para facilitar la introducción de la infección viral por agroinoculación, se insertaron promotor de ARN polimerasa 35S del virus del mosaico de la Coliflor (CaMV) y una secuencia de ribozima cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de GLRaV-2, respectivamente.

El clon de GLRaV-2 de longitud completa resultante se modificó adicionalmente para acomodar un casete de expresión de gen indicador inmediatamente cadena arriba de la fase abierta de lectura de CP. Este casete contenía la fase abierta de lectura de GFP seguida del promotor de ARN sub-genómico de BYV CP. Como resultado, éste último promotor dirigió la expresión del GLRaV-2 CP, mientras que el auténtico promotor de GLRaV-2 CP expresó el indicador de GFP. Este replicón de GLRaV-2 de longitud completa marcado se designó LR-GFP (Fig. 10A, diagrama medio).

La deleción de los genes que no se requieren para la amplificación de ARN viral en las células individuales facilita la experimentación con los genes restantes que codifican la proteasa líder, ARN replicasa y supresor de ARNi. En el caso de GLRaV-2, dicho minirreplicón se generó por deleción de la región de genoma que abarca el bloque génico de las fases abiertas de lectura de p6 a p19 y la retención del gen indicador. El casete de expresión indicador se modificó adicionalmente para expresar una fusión de GFP con b-glucuronidasa para dar como resultado el minirreplicón GLRaV-2 marcado designado mLR-GFP/GUS (Fig. 10A, diagrama inferior).

Para permitir la detección inmunoquímica de L2HA usando anticuerpo monoclonal específico de HA comercial, se modificaron tanto LR-GFP como mLR-GFP/GUS por una inserción del marcador de epítopo de hemaglutinina (HA) triple en el dominio N-terminal de L2 (Fig. 10B y 11A). Se ensayó la infecciosidad de las variantes de longitud completa y minirreplicón usando agroinfiltración de hojas de N. benthamiana, un hospedador experimental sistémico de GLRaV-2 (Goszczynski et al., Vitis 35, 133-133, 1996). Para mLR-GFP/GUS, dicha agroinfiltración dio como resultado la acumulación de ARN de minirreplicón y expresión eficaz del indicador de GFP/GUS fluorescente y enzimáticamente activo en las células inoculadas inicialmente (Fig. 10B). Resulta importante que el nivel de la actividad GUS en una variante marcada con HA fue de 85 % de la del mLR-GFP/GUS original. Debido a que esta reducción modesta era solo marginalmente estadísticamente significativa (p valor 0,001), se concluyó que la inserción de marcador HA en L2 no afectaba significativamente a la amplificación del genoma viral. Los intentos de insertar un marcador HA en L1 dio como resultado replicones no infecciosos y se abandonaron.

Tanto el original como las variantes marcadas con HA del LR-GFP de longitud completa eran sistémicamente infecciosos en N. benthamiana; se detectaron síntomas típicos de la infección viral y fluorescencia de GFP en las hojas no inoculadas superiores a las 3 semanas después de la agroinfiltración de las hojas inferiores (Fig. 10A). Por lo tanto, se generó una serie de los replicones de GLRaV-2 marcados infecciosos que podían introducirse en N. benthamiana y usarse para abordar las funciones de L1 y L2 en el ciclo de infección viral.

Análisis de mutación de las funciones de L1 y L2 en el procesamiento de proteínas y acumulación de ARN en las células inoculadas inicialmente de N. benthamiana

Para abordar las funciones de L1 y L2, se introdujeron siete mutaciones puntuales y deleciones en la región codificante correspondiente (Fig. 10B). En particular, para determinar los requisitos para el autoprocesamiento en los extremos C respectivos de L1 y L2, se reemplazaron los restos de cisteína catalíticos predichos de cada proteasa (Cys493 y Cys767) por restos de alanina para dar como resultado variantes de M1 y M2, respectivamente (Fig. 10B).

Se investigó la competencia de procesamiento de cada variante usando traducción in vitro del ARNm recubierto en el extremo que abarca la región no traducida 5’ terminal, la fase abierta de lectura L1-L2 completa y una región cadena abajo corta que codifica una parte del dominio de metiltransferasa (Fig. 10B). Los productos de traducción resultantes se analizaron usando inmunotransferencia y anticuerpo específico de HA (Fig. 11A), o marcaje con 35Smetionina (Fig. 11B). Como se esperaba, una variante no mutante marcada produjo banda positiva para HA individual correspondiente al L2 marcado con HA, completamente procesado (Fig. 10B y Fig. 11A, carril L2HA) y, además, L1 completamente procesado, marcado con isótopo (Fig. 10B y Fig. 11B, carril L2HA).

En cambio, la traducción de la variante de M1 dio como resultado la acumulación de un único producto principal correspondiente a una fusión L1-L2 (Fig. 1B; Fig. 2A y 2B, carriles M1). De forma análoga, el reemplazo mutacional de la cisteína catalítica predicha en L2 dio como resultado una falta de autoprocesamiento de L2, pero no afectó a la liberación autocatalítica de L1 (Fig. 10B; Fig. 11A y 11B, carriles M2). Debido a que la mutación de los restos de sitio activos predichos sí inactivó la autoproteólisis por cada proteasa líder, se concluyó que L1 y L2 son de hecho las proteasas de tipo papaína, catalíticamente activas.

Para determinar si el procesamiento por L1 y L2 se requería para amplificación de ARN viral, se usaron las variantes M1 y M2 de mLR-GFP/GUS para agroinfiltrar hojas de N. benthamiana y para determinar la actividad GUS resultante. Como se ha mostrado previamente para el minirreplicón de BYV, la actividad GUS proporciona un marcador sustituido fiable para medir la acumulación de los ARN virales en las células infectadas (Penga y Dolja, J Virol. 74, 9766-9770, 2000). Usando este marcador, se descubrió que, inesperadamente, la inactivación de la escisión de L1 dio como resultado expresión de GUS más eficaz; se detectó un aumento de casi 2 veces en la actividad GUS en tres experimentos independientes (Fig. 10B). Por el contrario, la inactivación de la escisión de L2 prácticamente anuló la infecciosidad del minirreplicón: el nivel de expresión de GUS correspondiente fue menor del 0,5 % el del mLR-GFP/GUS parental (Fig. 10B). Este resultado está de acuerdo con el requisito estricto de la escisión por L-Pro para infecciosidad del minirreplicón BYV (Peremyslov et al., J. Virol. 72, 5870-5876, 1998); de hecho la fusión de L-Pro o L2 con la replicasa probablemente interfiera con la síntesis de los ARN virales.

Para determinar los papeles individuales de L1 y L2 en la acumulación de ARN, se generaron los mutantes en los que las regiones codificantes de L1, L2, o ambas, estaban suprimidas. Resulta interesante que el mutante nulo para L1 DL1 tenía capacidad de replicación, aunque un nivel correspondiente de actividad GUS era aproximadamente 5 veces menor que la de la variante de mLR-GFP/GUS parental (Fig. 10B). Inesperadamente, la deleción de L2 en la variante de DL2 dio como resultado un ligero aumento de la expresión de GUS lo que sugiere que L2 no es esencial para la acumulación de minirreplicón en las células de N. benthamiana aisladas (Fig. 10B). Sin embargo, la deleción simultánea de L1 y L2 produjo el minirreplicón de DL1/2 que expresó solamente 1 % de la actividad GUS observada en una variante de mLR-GFP/GUS parental (Fig. 10B). Tomados juntos, estos resultados indicaron que aunque el papel de L1 en la amplificación de ARN viral es más prominente que la de L3, esta última proteasa puede rescatar la acumulación de ARN del mutante deficiente L1, y por lo tanto L1 y L2 tienen funciones parcialmente solapantes en este proceso.

Tanto L1 y L2 poseen los dominios proteasa de tipo papaína C terminales (Pro1 y 2, respectivamente) y los dominios N terminales (NTD1 y NTD2, respectivamente; Fig. 10B). Para determinar las contribuciones relativas de NTD1 y Pro1 en la función de L1, se generaron variantes de DNTD1 y DPro1 en las que esos dominios estaban suprimidos (Fig. 10B). La primera de estas variantes de minirreplicón mostró una reducción de 3 veces en la acumulación de GUS, mientras que la última produjo aún más GUS que en la variante parental (Fig. 10B). Estos datos indicaron que el dominio no proteolítico más que el proteasa de L1 proporcionaba una contribución importante a la acumulación de ARN viral en células de N. benthamiana. Debería enfatizarse que el requisito observado para NTD 1 para acumulación de ARN óptima puede reflejar un papel de un dominio proteico, o de una región codificante correspondiente al nivel de ARN, o ambas.

Papeles de L1 y L2 en la infecciosidad del virión y propagación sistémica de GLRaV-2 en N. benthamiana

Para definir las funciones potenciales de L1 y L2 en el movimiento de célula-a-célula viral y transporte a larga distancia, se introdujeron las deleciones de DL1 y DL2 en el fondo de la variante de LR-GFP de longitud completa. Después de la agroinfiltración, se aislaron viriones de las hojas inoculadas y se usaron las suspensiones de virión de las concentraciones iguales para inocular manualmente hojas de N. benthamiana y para caracterizar los focos de infección resultantes usando fluorescencia de GFP a los 8 días después de la inoculación. Para la variante de LR-GFP parental, la inoculación produjo 9,9  5,6 focos de infección por hoja con el diámetro medio de 4,3  1,4 células. Se obtuvieron resultados muy similares (8,2  4,8 focos por hoja; diámetro medio de 4,1  1,3 células) para la variante de LR-GFPDL2 lo que indica que L2 es prescindible tanto para la infecciosidad como para el movimiento de célula-a-célula del GLRaV-2 en N. benthamiana. Sorprendentemente, la deleción de L1 dio como resultado una reducción de 25 veces, drástica, en la infecciosidad específica de la variante de LR-GFPDL1 (0,4 células por hoja). Además, los muy pocos focos positivos para GFP detectados fueron unicelulares lo que sugiere que L1 o la región codificante correspondiente es esencial para la capacidad del virión para establecer infección en las células inoculadas inicialmente y moverse a las células cercanas.

Para determinar si L1 y L2 están implicados en el transporte sistémico de GLRaV-2, se ensayaron seis variantes competentes para replicación en un contexto del LR-GFP de longitud completa introducido en plantas de N. benthamiana usando agroinfiltración. Las plantas inoculadas se exploraron con respecto a síntoma, GFP y expresión de CP a las 3, 4 y 5 semanas después de la inoculación. Resulta interesante que la mayoría o todas las plantas inoculadas con variantes M1 y DL2 se infectaron sistémicamente lo que indica que ni L2 ni la escisión entre L1 y L2 son necesarios para el transporte a la distancia del virus en N. benthamiana (Fig. 10B y Fig. 12A). Se encontró competencia similar para la proliferación sistémica en el caso de mutante de DPro1. Sin embargo, la deleción del dominio L1 o su N terminal dio como resultado la pérdida completa de la capacidad del replicón para establecer infección sistémica (Fig. 10B y 12A).

La observación de las hojas infectadas de forma sistémica reveló aparentes diferencias en la acumulación de GFP entre las variantes experimentales (Fig. 10A). Para evaluar adicionalmente estas diferencias, se evaluó la acumulación de GLRaV-2 CP en las hojas superiores no inoculadas. Visiblemente, se descubrió que solamente el mutante de DPro1 se acumulaba hasta los niveles comparables a los de la variante parental (Fig. 12B). Las dos variantes mutantes restantes, M1, y especialmente DL2, se acumularon cada una hasta niveles significativamente más bajos que los de la variante de LR-GFP tanto a las 3 como a las 4 semanas después de la inoculación (Fig. 3B). Colectivamente, estos resultados demostraron que el L2 por sí solo y la escisión entre L1 y L2 eran necesarios para la propagación sistémica óptima de GLRaV-2 en N. benthamiana. Además, L1 y su domino no proteolítico N terminal

o las regiones codificantes correspondientes son esenciales para la capacidad de GLRaV-2 para establecer infección sistémica dado que ni GFP ni CP viral eran detectables en las hojas superiores de las plantas inoculadas con las variantes de DNTD1 o DL1 incluso a las cinco semanas después de la inoculación (Fig. 12C y 12D).

En BYV, tanto p20 como L-Pro están implicados en la proliferación sistémica viral (Peng et al., J. Virol. 77, 28432849, 2003; Prokhnevsky et al., J. Virol. 76, 11003-11011, 2002). De éstos, p20 es un componente integral de la cola del virión (Peremyslov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101, 5030-5035, 2004), mientras que no se sabe si L-Pro está presente en los viriones debido a la no disponibilidad del anticuerpo específico de L-Pro. Debido a que se generaron variantes marcadas con HA, funcionales, de L2, se usó para determinar si esta proteasa está asociada con los viriones. Los viriones de GLFRaV-2 se aislaron de hojas infectadas de forma sistémica y se fraccionaron usando gradiente de densidad de sacarosa. El pico de los viriones se detectó en las fracciones 12-14 usando anticuerpo específico para CP (Fig. 13). Sin embargo, el análisis de inmunotransferencia de las fracciones del mismo gradiente usando anticuerpos específicos de HA mostró el pico de L2 en las fracciones 15-17, lo que sugiere que L2 presente en la suspensión de virión no se asocia físicamente con los viriones (Fig. 13). Esta conclusión se vio apoyada adicionalmente por la microscopía electrónica específica de inmuno-oro usada para detectar epítopos de HA presentes en L2. De hecho, solamente se encontró marcaje de oro muy débil en las fracciones 12-14 que contenían el volumen de los viriones. Además, algunas microesferas de oro detectadas en estas fracciones no estaban asociadas directamente con los viriones (Fig. 13, inserto superior). Las fracciones máximas de L2 15-17 contenían números mucho mayores de microesferas de oro, pero prácticamente ningún virión (Fig. 13, inserto inferior), lo que sugiere que L2 no está asociado directamente con viriones GLRaV-2.

L1 y L2 son críticos para la infección de minirreplicón de la V. vinifera

Se acepta en general que N. benthamiana es, quizás, el hospedador más promiscuo para una gran diversidad de virus vegetales. Para determinar si los papeles aparentemente no esenciales y principalmente redundantes desempeñados por L1 y L2 en la infección de GLRaV-2 en este hospedador experimental reflejan fielmente sus papeles en una infección de vid, se agroinfiltraron cuatro variantes de minirreplicón en hojas de V. vinifera (Garnacha) (Tabla 1). A los 8 días después de inoculación con la variante de mLR-GFP/GUS parental, se observaron 300 focos de infección fluorescentes para GFP, unicelulares, por hoja. Sorprendentemente, la infiltración usando variantes de DL1 y DL2 dio como resultado una reducción de 100 veces y 7 veces en los números de focos, respectivamente, lo que indica que cada una de las proteasas líder se requiere para la capacidad del minirreplicón para establecer infección en células de vid (Tabla 1). Sin embargo, de forma similar a lo observado en N. benthamiana, la infecciosidad de la variante M1 no fue significativamente diferente de la de la variante parental.

Notablemente, las mediciones de la actividad GUS en las hojas infiltradas se correlacionó bien con los datos sobre los números de las células infectadas (Tabla 1) lo que sugiere que la función principal de las proteasas líder es ayudar al establecimiento de infección viral en lugar de aumentar la acumulación de ARN viral en las células infectadas. Debido a que los efectos de la deleción de L1 y L2 en V. vinifera fueron muchos más drásticos en comparación con los de N. benthamiana, se concluyó que cada proteasa proporciona una contribución significativa y específica en infección de GLRaV-2 en su planta hospedadora natural.

Tabla 1. Infecciosidad y expresión de GUS por variantes de minirreplicón mLR-GFP/GUS en V. vinifera 5

Experimento

Variante Número medio de los focos de infección (% de los de la varianteparental) Actividad GUS media (% del nivel en la variante parental)

1

mLR-GFP/GUS 100,00 100,00

1

L1 1,03 4,16

1

L2 14,96 10,03

1

M1 104,44 103,11

1

mLR-GFP/GUS 100,00 100,00

2

L1 1,58 2,93

2

L2 10,44 10,87

2

M1 133,43 118,08

Análisis

Sin quedar ligado a ninguna teoría particular, se proporciona el siguiente análisis. La presente divulgación permitió la delimitación de tres funciones principales de L1 y L2 en el ciclo de infección de GLRaV-2: i) procesamiento de poliproteínas; ii) acumulación de virus en las células infectadas inicialmente; y iii) transporte sistémico de la infección.

En particular, se descubrió que tanto L1 como L2 son proteasas activas con las cisteínas catalíticas conservadas (Figs. 10B y 11). La escisión cadena arriba del dominio metiltransferasa de la poliproteína de ARN replicasa viral es esencial para la viabilidad de GLRaV-2 (Fig. 10B). Sorprendentemente, aunque L1 sí escinde en su propio extremo C terminal tanto in vitro (Fig. 11) como in vivo (Fig. 13), ni esta escisión ni el dominio proteasa de L1 en sí mismo son esenciales para la infección sistémica en N. benthamiana como resulta evidente a partir de los fenotipos de las variantes M1 y DPro1 (Fig. 10B y 12). Sin embargo, la acumulación de virus más lento en las hojas no inoculadas en estos mutantes (Fig. 12A y 12B) sugiere que se requiere la escisión mediada por L1 para el desarrollo óptimo de infección sistémica.

El análisis de deleción indicó que L1 y L2 desempeñan papeles parcialmente solapantes en la acumulación de ARN viral en las células inoculadas inicialmente. Cuando se introdujo minirreplicón viral por agroinfiltración, la deleción completa de L1 dio como resultado una reducción de 5 veces de la acumulación y expresión de ARN. Se observó un efecto similar tras la deleción del dominio N terminal no proteolítico de L1 lo que indica su papel principal en la función de L1 (Fig. 10B). Aunque la deleción de L2 no afectó a la acumulación de ARN, la deleción combinada de L1 y L2 dio como resultado un minirreplicón prácticamente no viable lo que indica que L2 proporcionó una contribución significativa a la infecciosidad viral en ausencia de L1.

Resulta interesante que, cuando se usaron viriones aislados que contenían genoma de longitud completa para inoculación vegetal, la infecciosidad y el movimiento de célula a célula de la variante DL2 eran indistinguibles de los de la variante parental, mientras que los viriones de la variante DL1 han perdido su infecciosidad. La deleción de L1 pero no la región codificante de L2 podría afectar a la estructura, estabilidad e infecciosidad del virión. Por lo tanto, es posible que además de la función de L1 en la acumulación de ARN revelada por la agroinoculación con minirreplicón, la región codificante correspondiente también actúe al nivel de ARN para facilitar la formación de los viriones con cola con capacidad de transporte local y sistémico.

De acuerdo con esta última suposición, los mutantes DL1 y DNTD1 fueron incapaces de establecer una infección sistémica tras la agroinfiltración usando replicones de longitud completa (Fig. 12C). Por el contrario, la deleción del dominio proteasa en la variante DPro1 no afectó a la infecciosidad sistémica lo que indica que la formación de la cola del virión probablemente no se vio afectada. La deleción de L2 dio como resultado una variante DL2 sistémicamente infecciosa que, sin embargo, mostró una acumulación mucho más lenta en las hojas superiores (Fig. 11A y 11B). Este resultado indicó que se requiere L2 para la proliferación sistémica eficaz de GLRaV-2 en N. benthamiana.

Quizás los resultados más significativos de este estudio se obtuvieron cuando las variantes de minirreplicón se agroinocularon en las hojas del hospedador natural de GLRaV-2, la vid. En claro contraste con un hospedador experimental permisivo N. benthamiana en el que L2 era superfluo para la infecciosidad por minirreplicón, la variante DL2 mostró una reducción de 10 veces en la acumulación de ARN tras agroinfiltración en hojas de V. vinifera (Tabla 1). La infecciosidad específica de la variante DL2 medida como un número medio de las células infectadas con fluorescencia de GFP por hoja también se redujo 10 veces. Esta correlación en la acumulación del ARN del minirreplicón y los números de las células infectadas claramente apunta al papel crítico de L2 en la invasividad del virus, es decir, la capacidad para establecer infección en las células inoculadas. Un papel en la invasividad de GLRaV-2 en la vid es aún más drástico en el caso de L1. De hecho, la deleción de L1 dio como resultado una reducción de 100 veces en la acumulación de ARN e infecciosidad específica de la variante DL1 (Tabla 1). Se concluyó que tanto L1 como L2 son esenciales para la infección por GLRaV-2 de la vid.

¿Cuál es una significación funcional específica de la duplicación y diversificación de las proteasas líder en GLRaV2? Parece que la respuesta, al menos en parte, yace en los efectos específicos de hospedador de L1 y L2 cuya cooperación funcional se requiere para la infección de la vid pero no de N. benthamiana. En otras palabras, podría haber evolucionado un tándem de proteasas virales para reforzar la función de una única proteasa para trastornar a

un hospedador leñoso perenne potencialmente resistente a infección por virus. Esta hipótesis es compatible con el hecho de que además de GLRaV-2, se encuentra duplicación de proteasa en CTV (Karasev et al., Virology 208, 511-520, 1995), virus del moteado de la frambuesa (Tzanetakis et al., Virus Res. 127, 26-33, 2007), y virus de manchas cloróticas de la fresa (Tzanetakis & Martin, Virus Res. 124, 88-94, 2007), cada uno de los cuales infecta hospedadores leñosos y/o perennes, pero no en BYV, virus de la menta 1 (Tzanetakis et al., Virus Res. 127, 26-33, 2007), o virus de las manchas amarillas del clavel que infectan hospedadores anuales herbáceos.

¿Cuál es el posible mecanismo por el que L1 y L2 facilitan la infección por GLRaV-2? El hecho de que cada una de estas proteasas líderes actúe de una manera específica de hospedador para reforzar la infecciosidad viral sugiere que L1 y L2 podrían estar implicados en la supresión de la respuesta de defensa antiviral. Una posibilidad es que L1 y L2 estén implicados en la supresión de la interferencia de ARN (ARNi) bien de forma independiente de o en comparación con el supresor de ARNi p24 (Fig. 1A) Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006). Sin embargo, los intentos de identificar efectos de GLRaV-2 L1 y L2 o BYV L-Pro en la respuesta de ARNi en varios sistemas modelo invariablemente han fracasado. Además, se descubrió que la coexpresión ectópica de L-Pro con el indicador reducía la acumulación de este último, lo que sugiere la posible implicación de las proteasas líder en la regulación génica al nivel de ARN o proteico.

Por analogía con las proteasas de tipo papaína de coronavirus (Lindner, Virology 362, 245-256, 2007), se puede plantear la hipótesis de que las proteasas closterovirales actúan como enzimas de desubiquitinación (DUB) por lo que afectan a la regulación de la defensa de la planta. El único hecho que está en desacuerdo con la hipótesis de DUB es que la inactivación de la actividad proteolítica de L1 en la variante M1 tiene poco efecto en la infección viral. Esta aparente discrepancia puede explicarse si la unión mediada por L1 en lugar de la escisión de las proteínas relacionadas con la defensa del hospedador es suficiente para ejercer la función de L1.

La generación del tamaño completo y minirreplicones de GLRaV-2 marcados mediante inserción de los genes indicadores o epítopos destaca un potencial de este virus como un vector de expresión génica para la vid. En general, los vectores derivados de closterovirus proporcionan fuertes ventajas de capacidad y estabilidad genética relativamente grandes (Dolja et al., Virus Res. 117: 38-51, 2006; Folimonov et al., Virology 368(1): 205-216, 2007). La utilidad de los vectores closterovirales se potencia además por un aumento drástico de la infecciosidad del vector por coexpresión de los supresores de ARNi homólogos de los que p24 de GLRaV-2 parece ser el más fuerte (Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006). La realización completa del potencial del vector GLRaV-2 requiere el desarrollo de la técnica de inoculación eficaz para la vid.

Materiales y métodos

Generación del clon de ADNc de longitud completa, marcado con GFP, de GLRaV-2

El aislado de GLRaV-2 obtenido de un viñedo de Oregón local se propagó en plantas de N. benthamiana como se ha descrito anteriormente (Goszczynski et al., Vitis 35, 133-133, 1996). Se aislaron viriones (Napuli et al., Virology 274(1), 232-239, 2000) y el ARN viral se obtuvo usando reactivo de TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una estrategia para secuenciación de nucleótidos del genoma viral y la generación del intermedio y clones de ADNc viral de longitud completa fue como se ha descrito para BYV (Peremyslov y Dolja, Curr. Protocols Microbiol. (Sup. 7), 16F.1.1-16F.1.26, 2007). La secuencia resultante de ARN de GLRaV-2 se depositó en GenBank (Nº de Referencia FJ436234). Las secuencias de los numerosos cebadores usados en procedimientos de clonación están disponibles bajo demanda.

Brevemente, se ensambló un clon de ADNc de longitud completa de GLRaV-2 usando el mini-vector binario pCB301 (Xiang et al., Plant Mol. Biol. 40: 711-717. 1999), mientras que la clonación de ADNc se realizó usando transcripción inversa y síntesis convencional de un ADNc bicatenario (bc) o amplificación por PCR. Se añadió terminador de NOS al pCB301 usando sitios únicos Sac I y Kpn I y se insertó un polienlazador que contenía los sitios de restricción Sac I, Bam HI, AatI I, Bbvc I, Rsr II, Bst EII y SmaI entre el sitio SacI y el terminador NOS para producir pCB301-NOS-PL. Para añadir un promotor de ARN polimerasa de 35S de CaMV fusionado con el fragmento 5’ del ADNc viral (nt 12.034), se usó una técnica de corte y empalme de ADN mediada por PCR. Se realizaron PCR separadas para amplificar el promotor de 35S y el extremo 5’ de ADNc de GLRaV2 y para generar productos con extremos solapantes. Estos productos se combinaron y se usaron como moldes para otro ciclo de PCR usando los cebadores complementarios de los extremos 5’ y 3’ del producto de longitud completa. Este último producto se clonó en pCB301-NOS-PL usando Sac I (añadido al extremo 5’ del promotor 35S) y BnmH I (nt 2034) para producir un p35S5’LR.

Para añadir una ribozima en el extremo 3’ del ADNc viral, se usó con megacebador con una parte específica de virus complementaria del extremo 3’ del ADNc viral seguido de una secuencia de ribozima diseñada como se ha descrito (Prokhnevsky et al., J. Virol. 76, 11003-11011, 2002) y un sitio Sma I en combinación con un cebador regular para amplificar la región 3’ terminal del ADNc de GLRaV-2 (nt 14.842-16.486). Se clonó el producto de PCR resultante en p35S5’LR usando los sitios de restricción BstE II (nt 14.842) y Sma I (añadido al extremo 3’ del megacebador) para producir un p35S5’3’LR-Rib.

Para clonar la región interna de ADNc viral (nt 2.029-10.827), se obtuvieron tres fragmentos parcialmente solapantes de ADNc bc usando clonación de ADNc convencional y el protocolo de Gibco-BRL para transcriptasa inversa SuperScript II. Estos fragmentos se insertaron en p35S5’3’LR-Rib usando los sitios de restricción Bam HI (nt 2.029), Aat II (nt 3.394), Bbv CI (nt 6.281) y Rsr II (nt 10.821) para generar p35S-5’BR3’LR-Rib. La parte restante del ADNc viral (nt 10.821-14.848) se amplificó por PCR y se clonó en un vector intermedio pGEM-3Zf(+) (Promega). Se insertó una secuencia de nucleótidos codificante de una GFP dirigida a retículo endoplásmico (Haseloff et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94(6), 2122-2127, 1997) seguido de un promotor de BYV CP cadena arriba del extremo 5’ de ORF de GLRaV-2 CP. El fragmento de ADNc resultante se clonó en p35S5’-BR-3’LR-Rib usando sitios Rsr II (nt 10.821) y Bst EII (nt 14.842) para generar el clon de ADNc de GLRaV-2 de longitud completa p35S-LR-GFP o LR-GFP para mayor brevedad.

Generación de las variantes de GLRaV-2 modificadas y mutantes

Se obtuvo por ingeniería genética la variante de minirreplicón mLR-GFP/GUS modificando el ADNc LR-GFP mediante deleción de los fragmentos de ADNc del codón de inicio de la ORF p6 (Fig. 1A) al nt 14.185 y del sitio Fse I en el extremo 3’ de la ORF de GFP al nt 15.285 (los números de nt corresponden al ADNc de GLRaV-2 original). Como resultado, se suprimieron las ORF de GLRaV-2 que codificaban p6, Hsp70h, p63, CPm, CP y p19 (Fig. 1A). La ORF de GFP se reemplazó después con una ORF híbrida de GFP/GUS descrita anteriormente (Peng et al., Virology 294, 75-84, 2002) usando Pac I en el extremo 5’ de la ORF de GFP y Fse I en el extremo 3’ de la ORF de GUS.

Se generaron dos plásmidos, pGEM-35SLR-Pro y pGEM-SP6LR-Pro, que contenían la región codificante de L1 y L2 completa y un fragmento de la región codificante de metiltransferasa (nt 1-3.071) clonando los fragmentos amplificados por PCR correspondientes (Fig. 1B) en pGEM-3Zf(+). Tanto pGEM-35SLR-Pro como pGEM-SP6LR-Pro se usaron para generar pGEM-35SLR-L2HA y pGEM-SP635SLR-L2HA insertando tres copias de la secuencia codificante de marcador de epítopo de hemaglutinina (HA) (YPY-DVPDYA; SEC ID Nº: 11) cadena abajo del codón 663 dentro de la región codificante de L2. Cada uno de estos plásmidos se usó para introducir las siguientes mutaciones en el L1 o L2.

La mutación 1 (M1) se generó reemplazando el resto de Cys493 catalítico de L1 con Ala usando mutagénesis dirigida. De forma análoga, la mutación 2 (M2) se obtuvo mediante sustitución con Ala de Cys767 de L2. En la mutación de DL2, la reacción codificante de L2 completa se suprimió y se reemplazó el resto Lys848 cadena debajo del enlace escindible de L2 con Gly para regenerar un auténtico sitio de escisión de L1. Se realizó una mutación de DL1 suprimiendo la región codificante de L1 completa excepto por el codón de inicio 5’ terminal. En la mutación DNTD1, se suprimió la región no proteolítica, N terminal completa de L1, de nuevo excepto por el codón de inicio. En la mutación DPro1, se suprimió el dominio proteinasa C terminal de L1 mientras que la región N terminal de L1 se fusionó con la región N terminal de L2. En la última mutación DL1/2, tanto L1 como L2 se suprimieron excepto por el codón de inicio que se fusionó con el primer codón de Lys de la replicasa de GLRaV-2, dando como resultado la formación de una replicasa que difería de la replicasa de tipo silvestre, procesada proteolíticamente solamente por la presencia de la Met N terminal. Los diagramas de todas las mutaciones se muestran en la Fig. 1B.

Las variantes de pGEM-SP6LR-L2HA se usaron para analizar la actividad proteolítica de las proteasas mutadas in vitro. Los fragmentos de ADN de los derivados mutantes de pGEM-35SLR-L3HA se clonaron en mLR-GFP/GUS usando sitios Sbf I (localizado en la parte de vector del plásmido) y Stu I (nt 3.063). Los fragmentos de ADN de derivados mutantes de p35S-miniV94-GFPGUS también se clonaron en el clon de ADNc de longitud completa LR-GFP usando Sfi I (localizado en la parte de vector del plásmido) y Bbv CI (nt 6.282).

Análisis de mutación de la actividad proteolítica de L1 y L2

Las variantes de pGEM-SP6LR-L2HA se linealizaron usando Sma I y los transcritos de ARN in vitro correspondientes se generaron usando el kit mMessage Machine (Ambion). Para ensayar la actividad proteolítica de las proteasas líder, los transcritos de ARN con extremo recubierto resultantes se tradujeron usando los extractos de germen de trigo (Promega) y [35S]-Met (Amersham/Pharmacia Biotech) o una mezcla de aminoácidos no marcados. Después de 1 h de incubación a 25 ºC, los productos se separaron por PAGE, se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa PROTRAN y se usaron para autorradiografía o para inmunotransferencia usando anticuerpo monoclonal de rata anti-HA (Roche) como primer anticuerpo y anti-peroxidasa de rata de cabra como anticuerpo secundario.

Análisis de mutación de los papeles de L1 y L2 en la acumulación de ARN

Se transformó la cepa de Agrobacterium tumefaciens C58 GV2260 por cada una de las variantes de mLR-GFP/GUS por electroporación. Los cultivos correspondientes se dejaron crecer durante una noche a 28 ºC con agitación, se centrifugaron y se resuspendieron en un tampón que contenía MES-KOH 10 mM (pH 5,85), MgCl2 10 mM y acetosiringona 150 mM. Se mezclaron suspensiones bacterianas de cada variante con cultivos correspondientes transformados para expresar un supresor de ARNi P1/HC-Pro de virus del mosaico del nabo para potenciar la infecciosidad del minirreplicón (Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006). Las concentraciones bacterianas finales

fueron DO600 1,0 para variantes que expresan minirreplicón y DO600 0,1 para la variante que expresa P1/HC-Pro. Los cultivos bacterianos inducidos se infiltraron en la superficie inferior de las hojas de N. benthamiana usando una jeringa sin una aguja o se infiltraron por vacío en las hojas de la vid. Las células de hojas fluorescentes por GFP se visualizaron usando el estereomicroscopio epifluorescente Leica MZ 16F (Deerfield, IL) a los 8 días después de la infiltración. Se prepararon muestras para ensayos de GUS y se midió la actividad de GUS usando un fluorímetro de ADN Hoefer TKO100 (Hoefer Scientific Instruments) como se ha descrito previamente (Dolja et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10208-10212, 1992).

Análisis de transporte de virus local y sistémico

Para ensayar el movimiento de célula a célula de las variantes de virus marcadas con GFP, se aislaron viriones de las hojas agroinfiltradas de N. benthamiana a las 2 semanas después de la inoculación (Napuli et al., Virology 274(1), 232-239, 2000), se resuspendieron en un tampón que contenía fosfato sódico 20 mM (pH 7,4) y Na2-EDTA 1 mM y se inocularon manualmente a hojas de N. benthamiana. Los focos de infección fluorescentes se analizaron usando el estereomicroscopio epifluorescente a los 8 días después de la inoculación.

Para investigar la proliferación sistémica en N. benthamiana, se movilizaron plásmidos que portaban las variantes correspondientes en un contexto de LR-GFP en A. tumefaciens, se mezclaron las suspensiones bacterianas resultantes con las modificadas por ingeniería genética para expresar P1/HC-Pro como se ha descrito anteriormente, y se infiltraron en hojas de plantas N. benthamiana jóvenes (estadio de 6-8 hojas). Después de 3, 4 o 5 semanas, las hojas superiores de estas plantas se exploraron con respecto al desarrollo de síntomas, mientras que se usó microscopía de epifluorescencia y una cámara de puntos MicroPublisher3.3 RTV (QImaging) para documentar la acumulación de la GFP expresada por virus. Se usaron inmunotransferencia y antisuero específico de GLRaV-2 realizado a medida en una dilución 1:5.000 para documentar la acumulación de CP.

Análisis de viriones

Para determinar si L2 marcado con HA estaba asociado con los viriones, se usó el fraccionamiento de gradiente de sacarosa seguido de inmunotransferencia. Se resuspendieron viriones aislados como se ha descrito anteriormente en un tampón que contenía Na-fosfato 20 mM (pH 7,4) y Na2-EDTA 1 mM, cargado hasta la parte superior de los gradientes de sacarosa 10-40 % preparados en el mismo tampón, y se centrifugó a 25.000 RPM durante 4 horas en un rotor Beckman SW40 a 4 ºC. Los gradientes se separaron en 25 fracciones y el análisis de inmunotransferencia se realizó usando anticuerpo monoclonal de rata anti-HA (Roche) y anticuerpo específico de GLRaV-2 para detectar L2HA y CP, respectivamente. Se realizó la microscopía electrónica específica de inmuno-oro para detectar L2HA esencialmente como se ha descrito (Medina et al. Virology 260(1), 173-181, 1999).

LISTA DE SECUENCIAS

<110> > El Estado de Oregón actuando por y a través del Comité Estatal de Educación Superior en representación de la Universidad del Estado de Oregón Dolja, Valerian M Peremyslov, Valera V

<120> VECTORES Y MÉTODOS DE CLOSTEROVIRUS

<130> 245-79793-03

<150> US 61/063.305

<151>

<150> US 61/083.504

<151>

<160> 11

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 22166

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector viral obtenido por ingeniería genética

<220>

<221 > misc_feature

<222> (1)..(3305)

<223> Secuencia de vector binario pCB301

<220>

<221> misc_feature 5 <222> (3306)..(21957)

<223> Casete de expresión viral

<220>

<221 > promotor 10 <222> (3306)..(4063)

<223> Promotor 35S

<220>

<221>

misc_feature 15 <222> (4064)..(21643)

<223> Secuencia viral

<220>

<221>

misc_feature 20 <222> (18648)..(19439)

<223> Casete de expresión indicador de GFP

<220>

<221 > promotor 25 <222> (19440)..(19723)

<223> promotor BYV CP heterólogo

<220>

<221> misc_feature 30 <222> (21644)..(21698)

<223> ribozima

<220>

<221 > terminador 35 <222> (21705)..(21957)

<223> terminador NOS

<400> 1

<210>2

<211> 14508 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector viral obtenido por ingeniería genética 10

<400> 2

<210>3

<211> 1716 5 <212> ADN

<213> Virus del enrollamiento de la vid 2

<220>

<221 > CDS 10 <222> (1)..(1716)

<400>3

<210>4

<211> 572

<212> PRT

<213> Virus del enrollamiento de la vid 2

<400> 4

<210>5

<213> Virus del enrollamiento de la vid 2

<220>

<221 > CDS 10 <222> (1)..(825)

<400> 5

<210>6

<211> 275

<212> PRT

<213> Virus del enrollamiento de la vid 2

<400> 6

<210>7

<211> 17588 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Vector viral obtenido por ingeniería genética 10

<400> 7

<210>8

<211> 1276

<212> ADN

<400> 8

<210>9

<211> 2908 5 <212> ADN

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (728)..(739)

<223> n es a, c, g o t

<400> 9

<210> 10

<211> 2107

<212> ADN

<400> 10

<210> 11

<211>9 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Marcador de epítopo de hemaglutinina 10

<400> 11

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un vector de transferencia génica de plantas para silenciamiento génico inducido por virus, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica:

   a) genes virales de virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que comprenden metiltransferasa, ARN helicasa y ARN polimerasa dependiente de ARN; b) un supresor de ARNi; c) proteasas líder L1 y/o L2; y d) un polinucleótido heterólogo unido operativamente a un promotor, en el que el polinucleótido heterólogo se expresa en una célula vegetal,

   en donde el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal, y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, o en donde el vector de transferencia génica de plantas replica de forma condicionada y en donde al menos una proteasa líder seleccionada de L1 y L2 está inactivada de modo que el vector no pueda replicarse de forma infecciosa independientemente.

2. 2.

   El vector de la reivindicación 1, que comprende además genes virales del virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que están implicados en el ensamblaje de viriones y/o el transporte dentro de plantas.

3. 3.

   El vector de la reivindicación 2, en el que los genes virales se seleccionan del grupo que consiste en p6, Hsp70h, p63, CPm, CP y p19 del virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2).

4. 4.

   El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polinucleótido heterólogo codifica uno o más de una molécula indicadora, un marcador seleccionable o un gen terapéutico.

5. 5.

   El vector de la reivindicación 4, en el que el gen terapéutico es antifúngico, antibacteriano, antiviral o un modificador del sabor.

6. 6.

   El vector de la reivindicación 5, en el que el gen terapéutico es para el tratamiento de la enfermedad de Pierce o del oídio.

7. 7.

   El vector de la reivindicación 6, en el que el gen terapéutico es un polinucleótido que desencadena el silenciamiento génico inducido por virus, un polinucleótido Run1, o codifica un polipéptido de lisozima.

8. 8.

   El vector de la reivindicación 1, en el que las proteasas L1 y L2 son de LR-2.

9. 9.

   El vector de la reivindicación 1, en el que el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, y en donde la proteasa L1 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 4.

10. 10.

    El vector de la reivindicación 1, en el que el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, y en donde la proteasa L2 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 6.

11. 11.

    El vector de la reivindicación 1, en el que el vector de transferencia génica de plantas replica de forma condicionada y en donde al menos una proteasa líder seleccionada de L1 y L2 está inactivada de modo que el vector no puede replicar de forma infecciosa independientemente, en donde la proteasa líder inactivada se selecciona de L1, L2 o tanto L1 como L2.

12. 12.

    El vector de la reivindicación 1, en el que el supresor de supresor de ARNi es LR-2 p24.

13. 13.

    El vector de la reivindicación 1, en el que el supresor de ARNi es virus del amarilleo de la remolacha p21.

14. 14.

    Una célula vegetal que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. 15.

    Una planta que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

16. 16.

    Un método para expresar un gen heterólogo en una célula vegetal que comprende introducir en la célula vegetal el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

17. 17.

    El método de la reivindicación 16, en el que introducir el vector en la célula vegetal comprende agroinoculación.

18. 18.

    El método de la reivindicación 17, que comprende además injertar una parte de una planta que comprende la célula vegetal que comprende el vector en una parte de una planta que no comprende el vector.