ES2316363T3 - Metodos para administracion de rna inhibidor a las plantas y aplicaciones de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un método para la introducción de RNA inhibidor en el citoplasma de células vegetales, reduciendo o anulando dicho RNA inhibidor la expresión de un gen diana en dichas células vegetales, comprendiendo dicho método: a) introducir en dichas células vegetales un vector viral de RNA que comprende dicho RNA inhibidor o que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce dicho RNA inhibidor, en donde dicho RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana en dicha célula vegetal, y en donde dicho vector viral de RNA comprende al menos elementos cis procedentes de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; y b) introducir dicho virus adyuvante correspondiente en dicha célula vegetal.
Description
Métodos para administración de RNA inhibidor a
las plantas y aplicaciones de los mismos.
Esta invención se refiere al campo de la
genómica funcional en las plantas, refiriéndose más particularmente
a métodos para la identificación y aislamiento ulterior de un ácido
nucleico con una secuencia de nucleótidos de interés en un conjunto
de secuencias de ácido nucleico preseleccionadas correlacionadas con
un rasgo particular, preferiblemente un rasgo agronómico
importante, utilizando un kit de vectores virales de RNA, en donde
uno de los vectores virales de RNA comprende una genoteca de
constructos silenciadores de genes para las secuencias de ácido
nucleico preseleccionadas. La invención se refiere también a un
método para modular, preferiblemente reducir, y particularmente
eliminar la expresión de una secuencia de ácido nucleico
seleccionada, utilizando el kit de vectores virales, en donde uno
de los vectores comprende un constructo silenciador de genes para
la secuencia de ácido nucleico seleccionada. El último método puede
utilizarse para validar la función de una secuencia de ácido
nucleico cuya expresión está correlacionada con la presencia o
ausencia de un rasgo específico en las plantas, pero con función
desconocida por lo demás. Preferiblemente, uno de los componentes
de los vectores virales de RNA del kit es un vector derivado de un
virus satélite.
La reciente expansión rápida de información de
secuencias de ácido nucleico disponibles ha exigido el desarrollo
de métodos para identificar la función de las secuencias de ácido
nucleico, particularmente secuencias de ácido nucleico transcritas
tales como marcadores de secuencia expresados, con función
desconocida, de una manera eficiente y eficaz en costes de mano de
obra.
Para identificar el papel de los ácidos
nucleicos secuenciados a partir de plantas con función desconocida,
es necesario producir o identificar plantas en las cuales dichos
ácidos nucleicos están desactivados estructural o funcionalmente.
Plantas en las cuales secuencias de ácido nucleico predeterminadas
están desactivadas estructuralmente pueden generarse utilizando
tecnologías de recombinación tales como recombinación homóloga como
ha sido descrito por Kempin et al. (1997) o utilizando
tecnologías específicas tales como el uso de oligonucleótidos dúplex
mixtos (quimeraplastos) para generar mutaciones específicas (como
se describe en los documentos WO 96/22364 y WO 99/07865).
Alternativamente, pueden identificarse plantas con una mutación en
una secuencia de nucleótidos predeterminada por cribado de una
genoteca mutante saturada, tal como, pero sin carácter limitante,
una genoteca de inserción de T-DNA o una genoteca
de inserción del transpones (sic) (véase p.ej. Pereira y Aerts,
1998). Estas metodologías requieren todas ellas la generación de un
gran número de plantas alteradas de modo permanente, y por tanto
son menos susceptibles de aplicación en métodos de alta capacidad.
Además, la recuperación de plantas con mutaciones recesivas en
genes esenciales requiere la mejora genética, que consume mucho
tiempo, para mantener las plantas en estado heterocigótico. El
mantenimiento de mutaciones dominantes letales en genes esenciales
es prácticamente imposible.
Plantas con secuencias de nucleótidos
predeterminadas desactivadas funcionalmente pueden generarse de una
manera inmediata utilizando metodologías en las cuales se genera RNA
inhibidor, tal como RNA antisentido o RNA de sentido.
El uso de RNA inhibidor para reducir o anular la
expresión génica, conocido también como silenciación de genes, está
perfectamente establecido en la técnica y ha sido objeto de varias
revisiones (v.g. Baulcombe 1996, Stam et al. 1997, Depicker
y Van Montagu, 1997). Varias solicitudes de patente se refieren a la
explotación práctica de la silenciación de genes.
Los documentos US 5190131 y EP 0 467 349 A1
describen métodos y medios para regular o inhibir la expresión
génica en una célula por incorporación en o asociación con el
material genético de la célula de una secuencia de ácido nucleico
no natural que se transcribe para producir un mRNA que es
complementario a y capaz de fijarse al mRNA producido por el
material genético de dicha célula.
EP 0 240 208 describe un método para regular la
expresión de genes codificados en genomas de células vegetales, que
se consigue por integración de un gen bajo el control de la
transcripción de un promotor que es funcional en el hospedador y en
el cual la cadena de DNA transcrita es complementaria de la cadena
de DNA que se transcribe desde el o los genes endógenos que se
desea regular.
EP 0 223 399 A1 describe métodos para efectuar
cambios somáticos útiles en plantas por provocación de la
transcripción en las células de las plantas de cadenas negativas de
RNA que son sustancialmente complementarias a una cadena de RNA
diana. La cadena de RNA diana puede ser un transcrito de mRNA creado
en la expresión génica, un RNA viral, u otro RNA presente en las
células de la planta. La cadena de RNA negativa es complementaria
para al menos una porción de la cadena de RNA diana a fin de
inhibir su actividad in vivo.
EP 0 647 715 A1 y las patentes US 5.034.323,
5.231.020 y 5283184 describen métodos y medios para producir
plantas que exhiben rasgos fenotípicos deseados, por selección de
transgenotes (sic) que comprenden un segmento de DNA enlazado
operativamente a un promotor, en donde los productos de
transcripción del segmento son sustancialmente homólogos a
transcritos correspondientes de genes endógenos, particularmente
genes del camino de biosíntesis de los flavonoides endógenos.
WO 93/23551 describe métodos y medios para la
inhibición de dos o más genes diana, que comprenden introducir en
la planta un solo gen de control que tiene regiones de DNA
diferenciadas homólogas a cada uno de los genes diana y un promotor
operativo en plantas adaptado para transcribir desde tales regiones
diferenciadas RNA que inhibe la expresión de cada uno de los genes
diana.
Una desventaja principal de esta tecnología, que
impide el aprovechamiento de la misma en métodos de descubrimiento
de funciones de genes de alta capacidad, es la impredecibilidad
intrínseca y la baja frecuencia de aparición del fenómeno de
silenciación de genes.
Recientemente, Waterhouse et al (1998)
han descrito métodos y medios para producir la silenciación de genes
en plantas más eficientes y predecibles, por expresión simultánea
de constructos tanto de sentido como antisentido en células de una
misma planta. Los ácidos nucleicos de sentido y antisentido pueden
encontrarse en la misma unidad de transcripción, de tal modo que se
genere después de la transcripción un transcrito de RNA simple que
tiene autocomplementariedad.
Hamilton et al. (1998) describen la
silenciación mejorada, v.g., de la expresión del gen
ACC-oxidasa del tomate utilizando un RNA de sentido
que contiene dos copias invertidas adicionales aguas arriba de su
región 5' no traducida.
WO 98/53083 describe constructos y métodos para
aumentar la inhibición de un gen diana dentro de un organismo, que
implican la inserción en el vector de silenciación del gen de una
repetición invertida de la totalidad o parte de una región
polinucleotídica dentro del vector.
Debería entenderse claramente, sin embargo, que
el uso de RNA inhibidor como instrumento en el análisis genético
invertido de la función de los genes por la vía de métodos de alta
capacidad, con lo cual el RNA inhibidor se genera a partir de
constructos de silenciación de genes que están integrados de manera
estable en el genoma de las plantas transgénicas, adolece de los
mismos inconvenientes que los métodos en los cuales las secuencias
de nucleótidos están desactivadas estructuralmente.
EP 0 194 809 y US 5.500.360 sugieren el uso de
vectores virales de RNA para producir RNA regulador tal como RNA
antisentido.
La exploración inicial del uso de vectores
virales para suministrar RNA inhibidor en células vegetales ha sido
descrita por Chapman (1991). En esta publicación, se describían
constructos de silenciación de genes que comprenden secuencias de
nucleótidos complementarias a la región traducida del gen GUS en un
vector viral derivado de PVX. Sin embargo, los experimentos no eran
concluyentes en cuanto a si la silenciación de los genes podía
provocarse utilizando vectores virales para la producción de RNA
inhibidor.
WO 93/03161 está dirigido a ácidos nucleicos
virales recombinantes de plantas y a hospedadores infectados por
ellos. La secuencia de ácido nucleico no nativa que se transcribe
puede transcribirse como un RNA que es capaz de regular la
expresión de un rasgo fenotípico por un mecanismo antisentido.
English et al., 1996, describen la
supresión de la acumulación de un vector viral que comprende una
secuencia nucleotídica extraña en plantas transgénicas que exhiben
silenciación de genes nucleares que comprenden las mismas
secuencias de nucleótidos extrañas, enlazando por tanto la
silenciación de genes y vectores virales, aunque de una manera
inversa a la contemplada en esta memoria.
Kumagai et al. 1995 (PNAS 92,
1679-1683) describen la inhibición del gen de
fitoeno-desaturasa por suministro viral de RNA
antisentido.
WO 95/34668 sugiere el uso de constructos
genéticos basados en virus de RNA que se replican en el citoplasma
de las células para proporcionar RNA inhibidor, sea RNA antisentido
o RNA co-supresor (de sentido).
Baulcombe et al. (1998) y Ruiz et
al. (1998) describen la silenciación de genes inducida por virus
del gen endógeno de fitoeno-desaturasa (PDS) o de
un transgén de la proteína fluorescente verde (GFP) en plantas,
utilizando vectores derivados del virus X de la patata que llevan
inserciones homólogas a PDS y GFP, respectivamente. Los autores
sugerían adicionalmente que la silenciación de genes inducida por
virus puede desarrollarse en un nuevo ensayo de la función de los
genes, por introducción de un fragmento del genoma de un vector
viral e inferencia de la función del gen a partir de los síntomas
de las plantas infectadas que exhiben la silenciación del gen.
Sin embargo, los métodos descritos para
identificación de la función de un gen con secuencia nucleotídica
conocida tienen inconvenientes y limitaciones. En primer lugar, la
aplicabilidad de los métodos de silenciación de genes mencionados
basados en vectores virales de RNA en mayor escala se limita en la
práctica a la identificación de genes con funciones esenciales, o
genes con fenotipos macroscópicamente visibles. En segundo lugar,
todos los métodos emplean vectores virales que son capaces de
replicación autónoma en células vegetales y movimiento
célula-a-célula, por lo cual debe
tenerse cuidado a fin de no desactivar las funciones esenciales
requeridas para estas funciones. Esto puede ser particularmente una
desventaja cuando se adaptan estos métodos a las necesidades de
plantas particulares, tales como plantas de cosecha, por desarrollo
de nuevos vectores virales más aptos para replicación y propagación
sistémica en las plantas.
La técnica anterior es por tanto deficiente en
el sentido de la carencia de métodos eficaces para identificación
en gran escala de la función de los ácidos nucleicos con secuencia
nucleotídica conocida, o para el aislamiento de los genes de
interés a partir de una agrupación de genes con secuencia
nucleotídica conocida, pero función desconocida.
La Figura 1 es una representación esquemática de
los vectores virales de RNA utilizados en los ejemplos.
MP: proteína de movimiento; CP: proteína de la
cubierta; OAS: origen del ensamblaje. Los marcos de lectura abiertos
se indican por recuadros. Cada genoma viral original se caracteriza
por un patrón específico.
La invención proporciona un método para
aislamiento de los genes implicados en la determinación de un rasgo
o un fenotipo de una especie vegetal, que comprende identificar una
serie de secuencias de ácido nucleico de genes, cuya expresión está
correlacionada con un rasgo de interés; creación de una genoteca de
constructos de silenciación de genes, que son ácidos nucleicos que,
cuando se transcriben, producen moléculas de RNA que comprenden RNA
de sentido o RNA antisentido o ambos, que comprenden una secuencia
nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de
identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de los
genes, cuya expresión está correlacionada con el rasgo de interés en
un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un
virus satélite de RNA reconocido por una replicasa a partir de un
virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula
vegetal únicamente cuando está provisto externamente de funciones
esenciales requeridas para dicha replicación; infección de un
conjunto de plantas individuales de la misma especie vegetal con la
genoteca de constructos de silenciación de genes y con un virus
adyuvante o RNA del virus adyuvante correspondiente, en donde dicha
planta se infecta con al menos un miembro de la genoteca y con el
virus adyuvante o RNA del virus adyuvante; identificación de una
planta en la cual el rasgo o fenotipo está alterado utilizando un
ensayo adaptado para dicho rasgo o fenotipo; y aislamiento del gen
implicado en la determinación del rasgo o fenotipo en la especie
vegetal, a partir de la genoteca, basándose en la secuencia de
nucleótidos para la cual se direccionó el constructo de silenciación
de genes en la planta identificada.
Preferiblemente, el virus satélite de RNA es
virus satélite del mosaico del tabaco o virus satélite de la
necrosis del tabaco, y el vector viral de RNA comprende
adicionalmente un origen de ensamblaje del virus del mosaico del
tabaco. Preferiblemente, el virus adyuvante es virus del mosaico del
tabaco o virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen
codificante de un gen de la proteína de la cubierta del virus del
mosaico del tabaco.
Constructos de silenciación de genes
comprendidos dentro del vector viral de RNA pueden comprender RNA
antisentido o RNA de sentido de al menos 100 nucleótidos de
longitud. Particularmente, los constructos de silenciación de genes
comprenden un tramo complementario de al menos 50, preferiblemente
al menos 100, nucleótidos de RNA de sentido y antisentido. Se
prefieren especialmente constructos de silenciación de genes que
comprenden al menos dos copias de parte de las secuencias de
nucleótidos de la colección de ácidos nucleicos, encontrándose las
copias en repetición invertida.
Es otro objeto de la invención proporcionar un
método para el aislamiento o la selección de un ácido nucleico con
una función específica a partir de una colección de ácidos
nucleicos, en donde la colección de ácidos nucleicos se caracteriza
por el hecho de que la variación en el patrón de expresión de los
ácidos nucleicos está correlacionada con la variación en un rasgo o
fenotipo de una planta que alberga los ácidos nucleicos que
comprenden los pasos de creación de una genoteca de constructos de
silenciación de genes, que son ácidos nucleicos que, cuando se
transcriben, proporcionan moléculas de RNA que comprenden RNA de
sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo una secuencia
nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de
identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dichos
ácidos nucleicos, estando correlacionada la variación en el patrón
de expresión de los mismos con la variación en un rasgo/fenotipo de
una planta que alberga dichos ácidos nucleicos en un vector viral
de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite de
RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante
correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal
únicamente cuando se le proporcionan externamente las funciones
esenciales requeridas para dicha replicación; infección de una
colección de plantas con la genoteca de constructos de silenciación
de genes y con un virus adyuvante correspondiente o RNA de virus
adyuvante, en donde cada planta está infectada con un miembro de la
genoteca y con el virus adyuvante o RNA de virus adyuvante;
identificación de plantas con el rasgo o fenotipo alterado
utilizando un ensayo adaptado para el rasgo o fenotipo objeto de
investigación; y, opcionalmente, aislamiento del ácido nucleico con
la función específica de la planta identificada que tiene el rasgo
o fenotipo alterado.
Es todavía otro objeto de la invención
proporcionar un método para determinar la función codificada por un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos conocida
en una planta, que comprende los pasos de proporcionar un vector
viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus
satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante
correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal
únicamente cuando está provisto externamente de funciones
esenciales requeridas para dicha replicación que comprende un
constructo de silenciación de genes que es un ácido nucleico que,
cuando se transcribe, produce moléculas de RNA que comprenden RNA
de sentido o RNA antisentido o ambos, que comprenden una secuencia
nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tienen al menos 75% de
identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos conocida;
infectar o inocular la planta con el vector viral de RNA quimérico y
un virus adyuvante correspondiente o RNA de virus adyuvante; e
identificar un rasgo o fenotipo alterado de la planta
co-infectada.
La invención proporciona adicionalmente un
método para identificar genes esenciales de una planta, que
comprende crear una genoteca de constructos de silenciación de
genes aleatorios por clonación de fragmentos aleatorios de DNA o
cDNA de al menos 100 nucleótidos de longitud, particularmente
fragmentos de cDNA duplicados de al menos 100 nucleótidos de
longitud en repetición invertida, en una copia de cDNA de un vector
viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus
satélite de RNA, preferiblemente STMV o STNV, particularmente un
vector viral de RNA que comprende un origen de ensamblaje de TMV,
reconocido por una replicasa a partir de un virus adyuvante
correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal
únicamente cuando se le proporcionan externamente las funciones
esenciales requeridas para dicha replicación; infectar una planta
con miembros individuales de la genoteca y con un virus adyuvante
correspondiente, preferiblemente virus del mosaico del tabaco o
virus de la necrosis del tabaco que comprende la proteína de la
cubierta del virus del mosaico del tabaco; identificar plantas que
desarrollan un fenotipo asociado gen-constructo de
silenciación, particularmente necrosis y, opcionalmente, aislar el
vector viral de RNA a partir del tejido que exhibe el fenotipo
gen-constructo de silenciación asociado,
particularmente el tejido necrotizado.
Es otro objeto adicional de la invención
proporcionar un método para introducción de RNA inhibidor,
preferiblemente RNA de sentido o antisentido, particularmente RNA
inhibidor que comprende un tramo complementario de al menos 50,
preferiblemente al menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y
antisentido, en células vegetales, preferiblemente en el citoplasma
de células vegetales, que comprende introducir en una célula
vegetal, un vector viral de RNA que comprende el RNA inhibidor o
que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe,
produce el RNA inhibidor, en donde el RNA inhibidor comprende un
RNA de sentido o RNA antisentido que comprende una secuencia
nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al
menos 75% de identidad de secuencia respecto a la secuencia
nucleotídica del gen diana en la célula vegetal, y en donde el
vector viral de RNA comprende al menos elementos cis de un virus
satélite de RNA, preferiblemente STMV o STNV, particularmente un
vector de RNA derivado de STMV o derivado de STNV que comprende un
origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco, reconocido
por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz
de replicarse en una célula vegetal sólo cuando se le proporcionan
externamente las funciones esenciales requeridas para dicha
replicación; e introducir en la misma célula vegetal, un virus
adyuvante correspondiente, preferiblemente virus del mosaico del
tabaco o virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la
proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
La invención proporciona adicionalmente un kit
para introducción de RNA inhibidor, preferiblemente RNA de sentido
o antisentido, particularmente RNA inhibidor que comprende un tramo
complementario de al menos 50, preferiblemente al menos 100
nucleótidos de RNA de sentido y antisentido en el citoplasma de una
célula vegetal que comprende 1) un vector viral de RNA que
comprende el RNA inhibidor o un ácido nucleico quimérico que,
cuando se transcribe, produce el RNA inhibidor, en donde el RNA
inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que
comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de
longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia respecto
a la secuencia nucleotídica del gen diana en la célula de la
planta, y en donde el vector viral de RNA comprende al menos
elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una
replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de
replicarse en una célula vegetal sólo cuando se le proporcionan
externamente las funciones esenciales requeridas para dicha
replicación; y 2) un virus adyuvante correspondiente.
Un kit particularmente preferido comprende 1) un
vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un
virus satélite del mosaico del tabaco, que comprende adicionalmente
o codifica el RNA inhibidor; y 2) un virus adyuvante
correspondiente que es un virus del mosaico del tabaco.
Otro kit particularmente preferido comprende 1)
un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis del
virus satélite de la necrosis del tabaco, especialmente
STNV-2 o STNV-C, y que comprende
adicionalmente un origen de ensamblaje del virus del mosaico del
tabaco, que comprende adicionalmente o codifica el RNA inhibidor; y
2) un virus adyuvante correspondiente que es el virus de la necrosis
del tabaco, particularmente TNV-A o
TNV-D, que comprende un gen de la proteína de la
cubierta del virus del mosaico del tabaco.
Las definiciones siguientes se aplican a lo
largo de esta solicitud, a no ser que se especifique otra cosa.
Como se utiliza en esta memoria, "que
comprende(n)" debe interpretarse como especificación de la
presencia de las características, entidades completas, pasos o
componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye
la presencia o adición de una o más características, unidades, pasos
o componentes, o grupos de los mismos. Así, v.g., un ácido nucleico
o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos,
puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los citados
explícitamente, es decir, puede estar incluido en un ácido nucleico
o proteína mayor. Un gen quimérico que comprende una región de DNA
que se define funcional o estructuralmente, puede comprender
regiones de DNA adicionales, etc.
Como se utiliza en esta memoria, "un rasgo de
una planta" indica un fenotipo que es el resultado combinado de
la expresión coordinada de cierto número de genes. Rasgos típicos
incluyen rendimiento, heterosis, resistencia a la sequía,
resistencia al estrés, resistencia a temperatura alta o baja, vigor,
rendimiento de semillas, hábitat de la planta, la arquitectura,
etc. Típicamente, un rasgo de una planta se cita después de su
aspecto propuesto.
Como se utiliza en esta memoria, un
"fenotipo" de una planta hace referencia a cualquier
característica cuantitativa o cualitativa de dicha planta, sea
morfológica (con inclusión de características macroscópicas y
microscópicas), bioquímica (con inclusión de la presencia, ausencia
o concentración de metabolitos o moléculas particulares), funcional
o de otro tipo.
El término "gen" significa cualquier
fragmento de DNA o RNA que comprende una región (la "región
transcrita") que se transcribe en una molécula de RNA (v.g., un
mRNA) en una célula, enlazado(a) operativamente a regiones
reguladoras adecuadas, v.g., un promotor expresable en la planta. Un
gen puede comprender así varios fragmentos enlazados operativamente
tales como un promotor, una secuencia conductora 5', una región
codificante, y una región 3' que comprende un sitio de
poliadenilación. Un gen de planta endógeno para una especie de
planta o virus particular (gen de planta o virus endógeno) es un
gen que se encuentra naturalmente en dicha especie de planta o
virus, o que puede introducirse en dicha especie de planta por
técnicas de reproducción tales como técnicas de reproducción
convencionales. Un gen quimérico es cualquier gen que no se
encuentra normalmente en una especie de planta o, alternativamente,
cualquier gen en el cual el promotor no está asociado en la
naturaleza con parte o la totalidad de la región de DNA transcrita o
con al menos otra región reguladora del gen.
El término "expresión de un gen" hace
referencia al proceso por el cual una región de DNA o RNA que está
enlazada operativamente a regiones reguladoras apropiadas,
particularmente a un promotor, se transcribe en un RNA que es
biológicamente activo, es decir, que es capaz de interacción con
otro ácido nucleico, o que es capaz de traducirse en un polipéptido
o proteína biológicamente activo. Se dice que un gen codifica un RNA
cuando el producto final de la expresión del gen es RNA
biológicamente activo, tal como v.g. un RNA antisentido, una
ribozima o un compuesto intermedio replicativo. Se dice que un gen
codifica una proteína cuando el producto final de la expresión del
gen es una proteína o polipéptido biológicamente activa(o).
Además de los elementos definidos anteriormente, un gen puede
comprender adicionalmente elementos para traducción independiente de
la cápsula tales como una secuencia de entrada de ribosoma interna
o los 6 primeros y segundos elementos intensificadores de la
traducción como se definen en WO 97/49814.
Como se utilizan en esta memoria, los términos
"silenciación de genes" o "inhibidor" no deben
interpretarse con el significado de una anulación completa de la
expresión del gen o genes diana, sino que incluye también cualquier
reducción de la expresión, medida sea como una reducción en la
transcripción y/o traducción, como una reducción en la acumulación
de transcritos o productos de traducción tales como proteínas, o
como una reducción en la expresión fenotípica del gen diana.
El término "reducción de la expresión
fenotípica" se refiere a la comparación de la expresión
fenotípica del ácido nucleico de interés en la célula eucariota en
presencia del RNA inhibidor o constructos de silenciación de genes
de la invención, con la expresión fenotípica del ácido nucleico de
interés en una célula eucariota similar en ausencia del RNA
inhibidor o constructos de silenciación de genes de la invención. La
expresión fenotípica en presencia del RNA inhibidor de la invención
debería ser por tanto menor que la expresión fenotípica en ausencia
del mismo, preferiblemente ser sólo aproximadamente 25%, en
particular sólo aproximadamente 10%, de modo más particular sólo
aproximadamente 5% de la expresión fenotípica en ausencia del RNA
inhibidor, debiendo ser inhibida la expresión fenotípica
especialmente por completo para todos los propósitos prácticos por
la presencia del RNA inhibidor o el constructo de silenciación de
genes que codifica dicho RNA.
Una reducción de la expresión fenotípica de un
ácido nucleico donde el fenotipo es un rasgo cualitativo significa
que en presencia del RNA inhibidor, el rasgo fenotípico cambia a un
estado discreto o diferente cuando se compara con una situación en
la cual dicho RNA inhibidor está ausente. Una reducción de la
expresión fenotípica de un ácido nucleico puede medirse por tanto,
entre otras maneras, como una reducción en la transcripción de
(parte de) dicho ácido nucleico o reducción en el nivel de
transcrito, una reducción en la traducción de (parte de) dicho
ácido nucleico o reducción en el nivel de productos de traducción, o
una reducción del efecto que tiene la presencia del o de los
RNA(s)
transcritos o polipéptido(s) traducido(s) sobre la célula eucariota o el organismo, y conducirá finalmente a fenotipos alterados. Está claro que la reducción en la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés puede ir acompañada por o estar correlacionada con un aumento en un fenotipo o rasgo.
transcritos o polipéptido(s) traducido(s) sobre la célula eucariota o el organismo, y conducirá finalmente a fenotipos alterados. Está claro que la reducción en la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés puede ir acompañada por o estar correlacionada con un aumento en un fenotipo o rasgo.
En una realización de la invención, se produce
un método para identificar y aislar genes implicados en la
determinación de un rasgo o un fenotipo de una planta. A este fin,
se identifican secuencias de ácido nucleico cuya expresión está
correlacionada con el rasgo y/o fenotipo de interés. Están
disponibles en la técnica métodos y medios para la identificación
y/o aislamiento prácticamente simultáneos de un gran número, sino la
parte predominante, de secuencias de nucleótidos cuya expresión,
particularmente cuya transcripción, se ve influida
subsiguientemente a un estímulo correspondiente al rasgo que se
investiga, en comparación con la expresión de estas secuencias
nucleotídicas en una planta de control. Tales métodos incluyen, pero
sin carácter limitante, métodos de presentación diferencial, tales
como los métodos de presentación diferencial de RNA basados en gel
descritos por Prahasar et al. (1996). Como resultado de estos
métodos, se identifica una colección de secuencias de nucleótidos
al menos parcialmente caracterizados con expresión alterada en
respuesta a un estímulo particular. Típicamente, sin embargo, la
aplicación de tales métodos no permite discriminar entre genes cuya
expresión alterada está causada directamente por el estímulo, y
aquéllos que se encuentran adicionalmente aguas abajo en la cadena
de sucesos y se ven influenciados sólo indirectamente por el
estímulo, y se requerirá una selección ulterior entre la colección
de secuencias de nucleótidos obtenida. Y menos aún permiten estos
métodos predecir si se cumple también la relación inversa, es decir
si la influencia de la expresión de genes con secuencias de
nucleótidos particulares, identificadas de la manera arriba
mencionada, influye también en el rasgo de interés. Se requiere por
tanto una validación ulterior de las secuencias obtenidas, y
preferiblemente una que verifique inmediatamente la relación
inversa arriba mencionada. Para alcanzar esta meta de una manera
eficiente y eficaz en costes, puede crearse una genoteca de
constructos de silenciación de genes en un vector viral de RNA que
es capaz de replicación en el interior de las células vegetales. La
genoteca creada de constructos de silenciación de genes
comprendidos dentro de un vector viral de RNA se utiliza luego para
infectar un número representativo de plantas de tal manera que cada
planta esté infectada por al menos un miembro (un clon) de la
genoteca. Las plantas infectadas pueden analizarse luego para
identificar aquellas plantas que exhiben alteraciones en el rasgo
objeto de investigación, utilizando un ensayo que se adapta al rasgo
que se investiga. Está claro que esta sintonía fina de ensayo y
rasgo objeto de investigación puede ser una ventaja importante
sobre los métodos actuales para análisis de alta capacidad,
particularmente cuando se analizan rasgos y/o fenotipos que no dan
como resultado alteraciones visibles microscópicamente, tales como,
pero sin carácter limitante, modificaciones en caminos metabólicos
específicos o alteraciones que son únicamente detectables en
condiciones específicas (v.g. calor, estrés, tolerancia a la sequía,
infección por patógenos, aplicación de herbicidas o insecticidas
específicos, etc.).
El subconjunto de secuencias de ácido nucleico
puede identificarse también sobre la base de la presencia de una
huella particular característica de una clase de proteínas, tales
como, pero sin carácter limitante, un dominio específico de
quinasa, un motivo aglomerante, etc.
El constructo de silenciación de genes puede
aislarse luego de la genoteca o de la planta que exhibe el rasgo o
fenotipo alterado, y utilizarse para aislar el gen correspondiente
basado en la secuencia de nucleótidos hacia la cual se direccionó
el constructo de silenciación de genes.
Los autores de la invención han obtenido por
primera vez indicaciones de que puede conseguirse la silenciación
de genes en células vegetales tales como protoplastos, utilizando un
vector viral derivado de un virus satélite que comprende una región
codificante de
\beta-1,3-glucanasa, en un
experimento de co-infección con un virus adyuvante
del virus satélite.
En otra realización preferida, el vector viral
de RNA es capaz de replicación únicamente cuando las funciones
requeridas se proporcionan en trans. Se prefiere
particularmente el uso de un vector de RNA derivado de virus
satélite, que puede replicarse en células vegetales y propagarse en
toda la planta, cuando está presente un virus adyuvante
correspondiente.
Como se utiliza en esta memoria, "un virus
satélite" indica un virus de RNA, preferiblemente un virus de RNA
monocatenario, cuyo genoma es susceptible de replicación en una
célula vegetal y que está encapsidado por moléculas de proteína de
la cubierta para formar una partícula de virus o virión únicamente
cuando se provee externamente de cualquier número de funciones
esenciales requeridas para el mismo. Por "proporcionado
externamente" se entiende que tales funciones no están
codificadas por el genoma del virus satélite. Los virus satélites
dependen por tanto de la provisión externa de funciones esenciales,
y pueden carecer de la capacidad para codificar replicasa
funcional, proteína de movimiento, u otras funciones esenciales
requeridas para completar su ciclo de vida en el interior de una
célula vegetal. En una situación natural, tales funciones esenciales
son proporcionadas usualmente por un virus replicante autónomamente
o un denominado virus adyuvante.
Virus satélite útiles para la presente invención
pueden incluir aislados de tipo salvaje, pero están abarcados
también por esta definición variantes que dan como resultado
síntomas reducidos o mínimos cuando se infectan en una planta
hospedadora, en particular cuando se co-inoculan con
un virus adyuvante correspondiente. La definición incluye también
virus satélite sintéticos tales como virus deficientes y virus
satélite quiméricos.
Un "vector viral de RNA derivado de un virus
satélite" debería incluir al menos elementos cis de un virus
satélite que son reconocidos por una replicasa proporcionada
externamente, y un origen de ensamblaje que permite la
encapsidación por la proteína de la cubierta proporcionada.
Preferiblemente, el vector viral de RNA no comprende un gen
codifícate de una proteína funcional de la cubierta, y
particularmente no comprende la secuencia de nucleótidos que es
esencialmente similar a la secuencia de nucleótidos codificante de
un gen de proteína de la cubierta. Se prefieren particularmente
vectores virales de RNA que comprenden un origen de ensamblaje
reconocido por moléculas de la proteína de la cubierta a partir de
un virus en forma de varilla, tal como el virus del mosaico del
tabaco, dado que los virus en forma de varilla no exhiben las
limitaciones espaciales impuestas sobre el tamaño del genoma por
virus icosaédricos, permitiendo así que se incorpore un mayor número
de nucleótidos adicionales en el vector viral. Convenientemente, el
vector viral de RNA comprende cierto número de sitios de
reconocimiento de restricción singulares o de baja aparición.
El uso de receptores de RNA virales derivados de
un virus satélite resuelve adicionalmente problemas asociados con
el uso de vectores virales de RNA, tales como reducción del tamaño
de los vectores, versatilidad creciente, etc.
Particularmente adecuados para la invención son
vectores virales de RNA derivados de virus de mosaico del tabaco
satélites que comprenden el origen de ensamblaje (OAS) de TMV,
comprendiendo preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
No 2 desde el nucleótido en la posición 5443 hasta el nucleótido de
la posición 5518 o el nucleótido de SEQ ID No 5 desde el nucleótido
de la posición 5430 al nucleótido de la posición 5505 (tales como
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 12) y en donde el gen
codificante de la proteína de la cubierta se ha delecionado. Son
también particularmente adecuados para la invención vectores virales
de RNA derivados de la cepa del vector satélite de la necrosis que
comprende el OAS de TMV y en donde la mayor parte del gen de la
proteína de la cubierta se ha delecionado. Ejemplos no limitantes de
vectores virales de RNA, adecuados para la invención se describen
más adelante en esta memoria.
Un "virus adyuvante correspondiente" como
se utiliza en esta memoria, indica aquellos virus de RNA,
preferiblemente virus de RNA monocatenario, que pueden suministrar
al virus satélite o al vector derivado de RNA viral las funciones
requeridas en trans por dicho virus satélite o el vector
viral de RNA derivado, para permitir que el mismo se replique en el
citoplasma de las células vegetales, y se propague en la totalidad
de una planta infectada. Típicamente, los virus adyuvantes
correspondientes proporcionarán al virus satélite o al vector
derivado del mismo una replicasa (RNA-polimerasa
dependiente de RNA) que reconoce las secuencias cis presentes
en el RNA viral satélite, y permitirá la replicación del genoma del
virus satélite o el vector derivado. Otras proteínas que pueden ser
proporcionadas típicamente por el virus adyuvante son proteínas de
movimiento, que permiten, entre otras, la propagación mediada por
plasmodesmos de partículas virales de célula a célula. Para virus
satélites o vectores virales de RNA derivados de los mismos que
carecen de un gen codificante de la proteína de la cubierta
funcional, los virus adyuvantes correspondientes pueden proporcionar
también una proteína funcional de la cubierta. Preferiblemente, el
virus adyuvante correspondiente será capaz de propagación sistémica
autónoma en una planta infectada. Sin embargo, una propagación
sistémica de este tipo parece no ser un requisito previo para la
silenciación eficiente de los genes. Las funciones requeridas en
trans para un vector viral de RNA particular, pueden ser
suministradas en trans por virus adyuvantes correspondientes
diferentes.
Está claro que los virus adyuvantes
correspondientes pueden ser aislados de tipo salvaje de virus de
RNA, preferentemente de virus de RNA monocatenarios tales como los
tobamovirus o necrovirus. Se prefieren particularmente virus de RNA
en forma de varilla tales como tobamovirus que incluyen el virus del
mosaico del tabaco y los tobamovirus afines tales como el virus del
mosaico del alpiste, el virus de aclaramiento de los nervios del
nabo, el virus del mosaico de la colza china, y el virus del mosaico
de la colza oleaginosa.
Cuando puede utilizarse TMV como virus
adyuvante, el mismo puede reemplazarse también por uno de los
tobamovirus estrechamente afines mencionados anteriormente, en
particular cuando se utilizan los vectores virales en especies de
plantas particulares.
Se abarcan también por los métodos y medios de
la invención variantes de tales aislados de tipo salvaje,
preferiblemente variantes o mutantes que desarrollan síntomas
mínimos cuando se inoculan en plantas hospedadoras o cuando se
co-infectan con un virus satélite o vector de RNA
correspondiente derivado del mismo. Virus adyuvantes adicionales
preferidos pueden ser variantes o mutantes de aislados de tipo
salvaje que tienen una gama de hospedadores extensa tales como los
tobamovirus que pueden replicarse y propagarse en el maíz o en la
familia de las crucíferas.
Sin embargo, virus adyuvantes correspondientes
pueden ser también virus quiméricos o híbridos, en los cuales parte
del genoma viral se ha reemplazado por un ácido nucleico extraño,
particularmente en los casos en que parte del genoma viral se ha
reemplazado por un ácido nucleico derivado de otro genoma viral,
preferiblemente una parte que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína de movimiento, o una parte
que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
de la cubierta. Por ejemplo, cuando se utiliza un necrovirus tal
como TNV, puede ser ventajoso insertar una región codificante de
proteína de movimiento, preferiblemente una proteína de movimiento
derivada de un tobamovirus tal como TMV, en particular la secuencia
de nucleótidos de SEQ ID No. 2 desde el nucleótido de la posición
4903 al nucleótido de la posición 5709, a fin de asegurar la
propagación de las partículas virales más allá de la hoja infectada.
Sin embargo, la propagación del virus adyuvante o el vector viral
de RNA no es esencial para la desactivación eficiente de la
expresión de los genes diana a lo largo de la planta, como
encontraron los inventores. Asimismo, cuando se utiliza p.ej. un
necrovirus tal como TNV, puede ser adicionalmente ventajoso
reemplazar la región codificante de la proteína de la cubierta del
necrovirus por una región codificante de la proteína de la cubierta
de un virus en forma de varilla, tal como TMV, particularmente la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 desde el nucleótido de la
posición 5712 al nucleótido de la posición 6191. Es innecesario
decir que un origen de ensamblaje apropiado para la proteína de la
cubierta sustituida tiene que incorporarse en el genoma del virus
adyuvante quimérico. Sin embargo, en el ejemplo descrito
anteriormente, el OAS de TMV está localizado convenientemente
dentro de la región codificante de la proteína de movimiento.
Ejemplos no limitantes de virus adyuvantes correspondientes se
describirán más adelante en esta memoria.
Debe quedar claro que siempre que se especifica
que las plantas se co-infectan o se infectan con un
vector viral de RNA y un virus adyuvante correspondiente, es
indiferente que el virus adyuvante se inocule antes, después o
simultáneamente con el vector viral de RNA con tal, sin embargo, que
exista un límite de tiempo razonable entre la infección del vector
de DNA viral o el virus adyuvante correspondiente.
Alternativamente, las funciones requeridas en
trans para la replicación y el movimiento del vector viral
de RNA pueden ser proporcionadas por la expresión de genes
quiméricos, que codifiquen una replicasa
(RNA-polimerasa dependiente de RNA) y/o una
proteína de movimiento y/o una proteína funcional de la cubierta,
integrada en el genoma de las plantas de test.
Kits preferidos para suministrar RNA inhibidor o
constructos de silenciación de genes a células vegetales para
utilización en los métodos descritos en esta memoria comprenden un
vector viral de RNA derivado de un virus satélite de RNA ,
particularmente del virus satélite de la necrosis del tabaco (STNV)
o virus satélite del mosaico del tabaco (STMV) y un virus adyuvante
correspondiente, en particular un virus adyuvante correspondiente
con forma de varilla, en donde el vector viral de RNA comprende un
constructo de silenciación de genes.
En una realización preferida, el kit comprende
un vector viral de RNA derivado del vector satélite de la necrosis
del tabaco, comprendiendo preferiblemente los elementos cis
requeridos para replicación, comprendiendo particularmente la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3 desde el nucleótido de la
posición 1 al nucleótido de la posición 32, y la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID No 3 desde el nucleótido de la posición 738 al
nucleótido de la posición 1245, en donde se ha insertado un origen
de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco, comprendiendo
preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el
nucleótido de la posición 5443 al nucleótido de la posición 5518 o
comprendiendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el
nucleótido de la posición 5430 al nucleótido de la posición 5505, o
comprendiendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 12 y en donde
dicho virus adyuvante se deriva del virus de la necrosis del
tabaco, preferentemente con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID
No 1, y comprende un gen que codifica la proteína de movimiento del
virus del mosaico del tabaco, preferiblemente con la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido de la posición 4903
al nucleótido de la posición 5709 o con la secuencia de nucleótidos
de SEQ ID No 15 desde el nucleótido de la posición 479 al
nucleótido de la posición 1285, y un gen que codifica la proteína de
la cubierta del virus del mosaico del tabaco, preferiblemente con
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido de
la posición 5712 al nucleótido de la posición 6191 o con la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 15 desde el nucleótido de la posición 1288 al nucleótido de la posición 1767.
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 15 desde el nucleótido de la posición 1288 al nucleótido de la posición 1767.
Combinaciones preferidas son aquellos kits en
los cuales el vector viral de RNA se deriva de las cepas
STNV-1 o STNV-2 (como ha sido
descrito por Ysebaert et al. 1980; número de acceso a Genbank
M10388, o Danthinne et al., 1991, numero de acceso a Genbank
M64479) y el virus adyuvante es TNV-A (Meulewaeter
et al. 1990, SEQ ID No 1). Otras combinaciones preferidas
son aquellos kits en los cuales el vector viral de RNA se deriva de
STNV-C (Bringloe et al. (1998); número de
acceso a Genbank AJ000898) y el virus adyuvante correspondientes es
TNV-D (Coutts et al (1991); número de acceso
a Genbank D00942).
En otra realización particularmente preferida,
el kit comprende un vector viral de RNA derivado del virus satélite
del mosaico del tabaco, comprendiendo preferiblemente los elementos
cis requeridos para replicación, que comprenden particularmente la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 desde el nucleótido de la
posición 1 al nucleótido de la posición 197 y la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID No 4 desde el nucleótido de la posición 604
al nucleótido de la posición 1058, o comprendiendo la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID No 13 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
No 14; y comprendiendo adicionalmente un origen de ensamblaje del
virus del mosaico del tabaco, comprendiendo preferiblemente la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido de la
posición 5443 al nucleótido de la posición 5518, o comprendiendo la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la
posición 5430 al nucleótido de la posición 5505, o comprendiendo la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 12, y en donde dicho virus
adyuvante correspondiente es un virus del mosaico del tabaco,
particularmente TMV-U1 (SEQ ID No 2) o
TMV-U2 (SEQ ID No 5).
Estará claro para las personas expertas en la
técnica que los vectores virales de RNA pueden generarse
convenientemente por métodos de transcripción in vitro a
partir de copias de cDNA del RNA viral. Análogamente, RNA viral
infeccioso para los virus adyuvantes correspondientes puede ser
generado a partir de copias de cDNA de su genoma. Genotecas,
vectores virales y virus adyuvantes correspondientes pueden
mantenerse también por replicación en células vegetales.
Métodos para infectar o inocular plantas y
células vegetales con vectores virales de RNA, virus adyuvantes y
genotecas comprendidas dentro de vectores virales de RNA son bien
conocidos en la esfera de las personas expertas en la técnica y
pueden realizarse de acuerdo con los métodos descritos en Walkey
(1985).
En una realización de los métodos de la
invención se inoculan plantas, v.g. con una solución que contiene
las genotecas de constructos de silenciación de genes en un vector
viral, o con una solución que contiene una mixtura de constructos
de silenciación de genes en un vector viral y virus adyuvantes
correspondientes. La solución puede contener además compuestos
adicionales para mejorar la inoculación y la infección de las
plantas, tales como, pero sin carácter limitante, abrasivos,
adherentes, productos tensioactivos y análogos.
Las plantas pueden infectarse durante etapas de
desarrollo diferentes, con objeto de maximizar el fenotipo objeto
de investigación. Asimismo, pueden inocularse partes diferentes de
plantas para optimizar la observación del fenotipo esperado.
Aunque no se pretende limitar el alcance de la
invención a un modo de acción particular, se cree que el RNA
inhibidor comprendido dentro del vector viral de RNA puede ejercer
su efecto inhibidor, con tal que exista un equilibrio entre el RNA
encapsidado en un virión y el RNA libre. Se cree que el equilibrio
entre RNA encapsidado y libre puede verse influido por variación de
la secuencia y posición de un origen de ensamblaje dentro del
vector viral de RNA. Sin embargo, el efecto de silenciación de los
genes puede amplificarse poniendo el ácido nucleico codificante del
RNA inhibidor bajo control de un promotor viral, preferiblemente un
promotor de la proteína de la cubierta, o un promotor subgenómico
de tal manera que durante el ciclo vital del virus se genere o se
transcriba RNA inhibidor adicional.
La expresión "constructos de silenciación de
genes" como se utiliza en esta memoria, debe interpretarse como
un ácido nucleico, que cuando se transcribe produce "RNA
inhibidor" que comprende o está constituido por RNA de sentido o
RNA antisentido, o una combinación de ambos que comprende una
secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75%, preferiblemente al
menos 80%, particularmente al menos 85%, más particularmente al
menos 90%, y especialmente al menos 95% de identidad de secuencia
con o es idéntica a la secuencia de nucleótidos cuya expresión debe
suprimirse, o su complemento. Adicionalmente, la secuencia de
nucleótidos de la región de sentido o antisentido debería tener
preferiblemente una longitud de al menos aproximadamente 100
nucleótidos, de modo más preferible al menos aproximadamente 250
nucleótidos, y en particular al menos aproximadamente 500
nucleótidos, pero puede extenderse hasta la longitud total de la
región codificante del gen cuya expresión debe reducirse.
Para propósitos prácticos en la aplicación de
los métodos para cribado o validación de alta capacidad, el
constructo de silenciación de genes puede ser idéntico en secuencia
y longitud a los ácidos nucleicos diana, o aquéllos pueden ser
exactamente complementarios en secuencia e idénticos en longitud a
los ácidos nucleicos diana.
Para el propósito de esta invención, la
"identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o
aminoácidos afines, expresada como porcentaje, hace referencia al
número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente
que tienen residuos idénticos (x 100) dividido por el número de
posiciones comparadas. Una laguna, es decir una posición en una
alineación en la cual un residuo está presente en una secuencia pero
no en la otra se considera como una posición con residuos no
idénticos. La alineación de las dos secuencias se realiza por el
algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmanm, 1983) utilizando un
tamaño de ventana de 20 nucleótidos o aminoácidos, una longitud de
palabra de 2 aminoácidos, y una penalidad por laguna de 4. El
análisis y la interpretación de datos de secuencias asistido por
ordenador, con inclusión de la alineación de las secuencias como se
ha descrito arriba, puede realizarse convenientemente utilizando
paquetes de Software disponibles comercialmente tales como los
programas de la serie Intelligenetics^{TM} (Intelligenetics Inc.,
CA) o el paquete GCG Wisconsin.
Está claro para las personas expertas en la
técnica que los constructos de silenciación de genes pueden
comprender al mismo tiempo RNA de sentido y antisentido
direccionado hacia la misma secuencia de nucleótidos cuya expresión
debe reducirse. Preferiblemente, los RNA de sentido y antisentido
son al menos parcialmente complementarios uno a otro y capaces de
formar una estructura tronco-bucle, dado que se ha
demostrado que una configuración de este tipo aumenta la eficiencia
de la silenciación de genes, tanto en aparición como en nivel de
silenciación de los genes (Waterhouse et al 1998). En la
realización más inmediata, al menos parte del ácido nucleico diana,
preferiblemente el ácido nucleico diana completo, se clona en forma
duplicada, con lo cual las dos copias se encuentran en repetición
invertida, separadas preferiblemente por una secuencia nucleotídica
espaciadora no afín.
La invención está orientada también a
proporcionar los kits descritos en esta memoria en sus diferentes
realizaciones. Es también un objeto de la invención proporcionar
los kits que comprenden los virus adyuvantes y vectores virales de
RNA descritos sin los constructos silenciadores de genes o RNA
inhibidor así como sus copias de cDNA, donde las copias de cDNA se
encuentran bajo control de un promotor (que puede utilizarse en
métodos de transcripción in vitro disponibles en la técnica)
tales como, pero sin carácter limitante, los promotores reconocidos
por promotores de polimerasa de bacteriófago simples (los promotores
específicos de RNA-polimerasa T7, T3, SP6, y
análogos).
La invención se refiere adicionalmente a un
método para identificar genes que son esenciales en las plantas que
comprende los pasos siguientes:
- a)
- se crea una genoteca de constructos aleatorios de silenciación de genes específicos para la planta utilizando un vector viral de RNA que se deriva de un virus satélite de RNA, como se define en esta memoria, con inclusión de todas sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, la genoteca se crea en una copia de cDNA del vector viral y puede generarse por inserción de secuencias aleatorias de DNA, con preferencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, en particular al menos aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Las secuencias de DNA aleatorias pueden obtenerse a partir de DNA total de una planta o pueden representar un subconjunto del genoma de una planta, tal como DNA derivado de orgánulos (plástidos, cloroplastos, mitocondria, etc.). Alternativamente, la genoteca puede crearse por inserción de cDNAs generados por transcriptasa inversa a partir de RNA, preferiblemente mRNA obtenido a partir de dicha planta. La genoteca puede normalizarse, v.g. como se describe en Takayuki et al. (1995). La genoteca debería ser con preferencia de tamaño suficientemente grande, es decir que contuviera un número suficiente de clones independientes para abarcar el genoma de la planta, de acuerdo con los estándares conocidos en la técnica. En una realización preferida, la genoteca puede contener duplicación del ácido nucleico insertado, con lo cual las copias se encuentran en repetición invertida. El ácido nucleico insertado puede clonarse aguas abajo de un promotor viral tal como, pero sin carácter limitante, un promotor del gen de la proteína de la cubierta o un promotor subgenómico. Adicionalmente, estará claro para las personas expertas en la técnica que la orientación relativa del ácido nucleico insertado, en relación al vector de RNA tiene únicamente importancia limitada dado que se generará cualquier RNA inhibidor de sentido o antisentido.
- b)
- Las plantas de ensayo se infectan con miembros individuales de la genoteca y también con un virus adyuvante correspondiente. La infección puede tener lugar de acuerdo con cualquiera de los métodos mencionados en esta memoria. Evidentemente, la copia de DNA de la genoteca debería convertirse en una copia de RNA de acuerdo con cualquiera de lo métodos descritos en esta memoria, preferiblemente antes de la infección de las plantas de ensayo.
- c)
- Se identifican las plantas que desarrollan un fenotipo asociado al constructo de silenciación de genes. Como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que un "fenotipo asociado al constructo de silenciación de genes" indica un fenotipo que no se observa cuando se realiza una inoculación falsa con un vector viral de RNA sin constructo de silenciación de genes, en combinación con un virus adyuvante correspondiente en una planta similar. Fenotipos preferidos comprenden clorosis, necrosis o cualquier fenotipo, preferiblemente un fenotipo morfológico que indique que el tejido infectado está inhibido o moribundo o en fase de deterioro.
- d)
- Opcionalmente, aislamiento del vector de RNA viral del tejido que exhibe el fenotipo asociado al constructo de silenciación de genes de acuerdo con métodos disponibles en la técnica para aislamiento de virus. Preferiblemente, el vector viral de RNA aislado que comprende el constructo de silenciación de genes de interés debería re-ensayarse en plantas nuevas a fin de confirmar el fenotipo observado. Por supuesto, el vector viral de RNA puede recuperarse también a partir de la genoteca si la infección de las plantas se llevó a cabo de una manera conservadora de la identidad.
- e)
- El constructo de silenciación de genes o la información de la secuencia de nucleótidos del mismo puede utilizarse luego para recuperar el clon correspondiente de DNA genómico o cDNA utilizando métodos disponibles en la técnica (hibridación, PCR, etc.).
Como se define en esta memoria, "genes
esenciales" de una planta, son aquellos genes que son necesarios
durante el desarrollo normal de una planta. Como se ha definido,
los genes esenciales pueden ser esenciales para el desarrollo
normal únicamente en etapas particulares del desarrollo, o
únicamente en tejidos u órganos particulares, tales como v.g. las
flores. Típicamente, la inhibición de la expresión de genes
esenciales puede tener un efecto letal sobre una planta o parte de
una planta. Genes esenciales preferidos son aquellos genes que dan
como resultado el retardo o la muerte de las plantas jóvenes cuando
están inhibidos.
Estará claro para las personas expertas en la
técnica que si la inhibición del ácido nucleico diana da como
resultado un efecto dominante, como sucede en el caso de la
inhibición de la expresión de genes esenciales, los métodos
descritos pueden llevarse a cabo utilizando la infección de más de
un vector viral de RNA que comprende un constructo de silenciación
de genes por planta. Debe tenerse cuidado a fin de no diluir
demasiado el efecto fenotípico por infección de un número
excesivamente grande de vectores virales de RNA diferentes que
comprenden constructos diferentes de silenciación de genes en la
misma planta. Se cree que óptimamente, cualquier número comprendido
entre 1 y 5 RNAs inhibidores diferentes puede introducirse en una
sola célula de planta.
En otra realización adicional de la invención,
se produce un método para determinar la función codificada por un
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos conocida.
Esta secuencia de nucleótidos puede haber sido obtenida v.g. por un
programa de secuenciación de genoma, que incluye programas de
secuenciación de marcadores de secuencia expresados. Con objeto de
descifrar la función de dicha secuencia, un constructo de
silenciación de genes o RNA inhibidor direccionado hacia dicha
secuencia de nucleótidos, como se describe en todas sus
realizaciones en esta memoria, puede introducirse en un vector viral
de RNA derivado de un virus satélite, como se describe en esta
memoria, y utilizarse para inocular una planta o introducirse en una
célula de la planta, particularmente en un protoplasto, junto con
un virus adyuvante correspondiente, como se describe en esta
memoria.
Un gran número de las realizaciones descritas en
esta memoria se refieren así a un método para la introducción de
RNA inhibidor en células vegetales, que comprende los pasos de:
- a.)
- Introducir en una célula de la planta un vector viral de RNA que comprende RNA inhibidor o que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce el RNA inhibidor, en donde el vector viral de RNA se deriva de un virus satélite de RNA; y
- b.)
- introducir en la misma célula de la planta un virus adyuvante correspondiente.
Los métodos de la invención pueden aplicarse
esencialmente a todas las plantas para las cuales están disponibles
vectores virales y/o virus adyuvantes correspondientes. Se considera
que los métodos de la invención son particularmente adecuados para
Nicotiana spp, particularmente N. tabacum, N. sylvestris, N.
benthamiana, y otras Solanáceas, arroz (Oryza sativa),
maíz (Zea Mays), Brassica spp., algodón (Gossypium
hirsutum), trigo, Arabidopsis spp. y Petunia spp.
Se contemplan también por la presente invención
métodos para desarrollo de un producto agronómicamente útil, tal
como un herbicida o una planta transgénica utilizando los métodos y
medios descritos en esta memoria, que comprenden adicionalmente los
pasos de inserción de un ácido nucleico implicado en la
determinación de un rasgo particular de la planta, aislado por los
métodos de la invención, preferiblemente bajo control de un
promotor extraño expresable en plantas, particularmente bajo control
de un promotor controlable expresable en plantas en el genoma de
una planta, particularmente una planta de cosecha. Cuando se han
identificado genes esenciales de acuerdo con los métodos descritos
en esta memoria, estos genes esenciales o sus productos génicos
codificados, particularmente las proteínas codificadas pueden
utilizarse en ensayos in vitro para identificar compuestos
que inhiben la actividad, particularmente la actividad enzimática,
que pueden utilizarse como herbicidas. Alternativamente, puede
utilizarse como compuesto herbicida un vector viral de RNA que
codifica constructos de silenciación de genes direccionados hacia
genes esenciales.
Los ejemplos no limitantes siguientes describen
la construcción de vectores virales de RNA derivados de virus
satélites, y usos de los mismos. A no ser que se indique otra cosa
en los ejemplos, todas las técnicas de RNA recombinante se llevan a
cabo de acuerdo con protocolos estándar como han sido descritos en
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en
los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current
Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU.
Materiales y métodos estándar para trabajo molecular con plantas se
describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy,
publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino
Unido) y Blackwell Scientific Pulications, Reino Unido.
A lo largo de la descripción y los ejemplos, se
hace referencia a las secuencias siguientes:
- SEQ ID No 1:
- secuencia de nucleótidos del genoma de TNV-A
- SEQ ID No 2:
- secuencia de nucleótidos del genoma de TMV-U1 (No. de acceso a Genbank V01408).
- SEQ ID No 3:
- secuencia de nucleótidos del genoma de STNV-2
- SEQ ID No 4:
- secuencia de nucleótidos del genoma de STMV (No. de acceso a Genbank M25782).
- SEQ ID No 5:
- secuencia de nucleótidos del genoma de TMV-U2 (No. de acceso a Genbank M34077).
- SEQ ID No 6:
- secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la fitoeno-desaturasa (pds) del tomate (No. de acceso a Genbank X59948).
- SEQ ID No 7:
- secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la nitrato-reductasa (nia-2) del tabaco (No. de acceso a Genbank X14059).
- SEQ ID No 8:
- secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la nitrito-reductasa (nir-1) del tabaco (No. de acceso a Genbank X66145).
- SEQ ID No 9:
- secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la \beta-1,3-glucanasa (gn-1) de Nicotiana plumbagenifolia.
- SEQ ID No 10:
- secuencia de nucleótidos de una región codificante de proteína fluorescente verde (gfp).
- SEQ ID No 11:
- secuencia de nucleótidos de una región codificante de \beta-glucuronidasa (gus)
- SEQ ID No 12:
- secuencia de nucleótidos de un origen de ensamblaje de una cepa de TMV-U2.
- SEQ ID No 13:
- secuencia de nucleótidos de la secuencia conductora de una cepa de STMV
- SEQ ID No 14:
- secuencia de nucleótidos de la secuencia de arrastre de una cepa de STMV.
- SEQ ID No 15:
- secuencia de nucleótidos de parte del genoma de una cepa de TMV-U2 que comprende la proteína de movimiento y los genes de la proteína de la cubierta.
Se construye un vector plasmídico para la
síntesis de un RNA de virus adyuvante TMV/TNV híbrido infectivo
utilizando los elementos siguientes enlazados operativamente:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Se construye un vector plasmídico para la
síntesis de un RNA de vector viral TMV/STNV híbrido infectivo
utilizando los elementos siguientes enlazados operativamente:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Se construye un vector plasmídico para la
síntesis de un RNA de vector viral TMV/STMV híbrido infectivo
utilizando los elementos siguientes enlazados operativamente:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar la factibilidad del uso de los
kits virales descritos en el Ejemplo 1 para silenciación funcional
de genes endógenos o transgenes específicos en plantas de
Nicotiana, se inserta uno de los fragmentos de DNA
siguientes en el vector híbrido TMV/STNV o TMV/STMV, inmediatamente
aguas arriba o aguas abajo del TMV OAS:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
Se sintetizan transcritos infectivos quiméricos
in vitro, utilizando RNA-polimerasa T7 con
los DNAs plasmídicos linealizados de los vectores descritos como
moldes.
Los RNAs de TMV/STNV se inoculan mecánicamente
en hojas de plantas Nicotiana benthamiama o Nitotiana
tabacum junto con el RNA de TMV/TNV, mientras que se inoculan
los RNAs de TMV/STMV junto con partículas de virus
TMV-U2 o RNA viral.
Las plantas infectadas se registran respecto a
fenotipos, acumulación de virus, y supresión del gen de plantas
homólogo entre las semanas 1 y 4 después de la inoculación.
Las plantas infectadas con vectores que
contienen el cDNA de pds exhiben un fenotipo blanqueante en las
hojas infectadas y silenciación del transcrito endógeno de pds.
Las plantas infectadas con vectores que
contienen el cDNA nia-2 o
nir-1 exhiben un fenotipo clorótico en las
hojas infectadas y silenciación del transcrito endógeno
nia-2 o nir-1,
respectivamente.
Las plantas infectadas con vectores que
contienen el cDNA de gn-1 exhiben
silenciación del transcrito endógeno 1,3-glucanasa
básica. Después de la infección con vectores que contienen la
secuencia gfp, las plantas transgénicas que expresan
normalmente un transgén gfp exhiben silenciación del
transcrito del transgén gfp y supresión de la fluorescencia
de GFP.
Después de la infección con vectores que
contienen la secuencia gus, las plantas transgénicas que
expresan normalmente un transgén gus exhiben silenciación
del transcrito del transgén gus y supresión de la actividad
de GUS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó un sistema vector híbrido TNV/STNV
para la desactivación funcional de un gen vegetal endógeno expresado
constitutivamente. De este modo, se han construido los vectores
híbridos STNV siguientes:
pIF9 que lleva los elementos siguientes
enlazados operativamente:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
pIF12 que lleva los elementos siguientes
enlazados operativamente:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se han sintetizado transcritos infectivos
quiméricos in vitro utilizando RNA-polimerasa
T7 con los DNAs plasmídicos linealizados de los vectores híbridos
pIF9 y pIF12 descritos como moldes utilizando procedimientos
estándar. Los transcritos de control in vitro se han
sintetizado en DNAs plasmídicos linealizados de los plásmidos
precursores de pIF9 y pIF12 sin las inserciones de los fragmentos
de pds y en DNA plasmídico linealizado de un clon infectivo del
tipo salvaje STNV y de un vector STNV híbrido que lleva una
inserción del gen cat.
Los transcritos in vitro se han inoculado
mecánicamente en hojas de 4 semanas de edad de plantas de
Nicotiana benthamiama junto con el virus adyuvante TNV.
Todas las plantas infectadas se registraron
continuamente respecto a desactivación de la pds, lo cual dio como
resultado un fenotipo que mostraba blanqueo de las hojas. En todas
las inoculaciones se observaron lesiones necróticas para las hojas
inoculadas al cabo de 2 días de la inoculación (p.i.). Al cabo de
una semana, aparecían también lesiones necróticas en las hojas
superiores, lo que indicaba la propagación sistémica de los virus
en N. benthamiama. En la mayoría de las plantas infectadas,
los síntomas del virus eran severos, pero las plantas sobrevivían
durante muchas semanas.
Únicamente las plantas que han sido infectadas
con los vectores híbridos pIF9 y pIF12 que llevaban fragmentos de
pds, exhibían además de los síntomas del virus cambios fenotípicos
adicionales. Aproximadamente 4 semanas p.i., las hojas verdes
superiores, que no exhibían síntomas de virus de ningún tipo,
desarrollaron manchas blanqueadas dispersas por todas las hojas. El
blanqueo era progresivo y no iba acompañado por lesiones necróticas.
Al cabo de otras 3 semanas, el tamaño de las manchas aumentaba
constantemente y el color cambió desde verde pálido a amarillo a
blanco-amarillento pálido. Estos síntomas no se han
observado nunca en plantas en las cuales se llevaron a cabo
inoculaciones con TNV/STNV de tipo salvaje o inoculaciones de
control mutantes de deleción TNV/STNV. Así pues, este fenotipo
indica la silenciación funcional de la pds en las plantas de N.
benthamiama después de infección con vectores virales híbridos
pIF9 y pIF12.
En los análisis de transferencias en gel de RNA
realizados con preparaciones de RNA total de manchas verdes y
blanqueadas de las hojas superiores de plantas que exhibían un
fenotipo FKO no pudo detectarse RNA alguno de virus quimérico STNV
y únicamente niveles muy bajos de RNA de virus adyuvante TNV. Esto
indica que la silenciación de genes inducida por virus de pds en un
tejido específico no precisa ir acompañada por niveles altos de RNA
viral.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó un sistema vector híbrido TMV/STMV
para la desactivación funcional de un gen de plantas endógeno
expresado constitutivamente. De este modo, se han construido los
vectores híbridos STMV siguientes:
pVE293 que lleva los elementos siguientes
enlazados operativamente:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
pVE294 que lleva los elementos siguientes
enlazados operativamente:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
Se han sintetizado transcritos infectivos
quiméricos in vitro utilizando RNA-polimerasa
T7 con los DNAs plasmídicos linealizados de los vectores híbridos
pVE293 y pVE294 descritos como moldes utilizando procedimientos
estándar. Se han sintetizado transcritos de control in vitro
sobre DNAs plasmídicos linealizados de los plásmidos precursores de
pVE293 y pVE294 sin la inserción del fragmento de pds y sobre DNA
plasmídico linealizado del clon infectivo STMV-10
del tipo salvaje.
Los transcritos in vitro se han inoculado
mecánicamente sobre hojas de 3 meses de plantas de Petunia
hybrida V26 junto con el virus adyuvante
TMV-U2.
Las plantas infectadas se han registrado
continuamente respecto a desactivación de la pds, lo cual dio como
resultado un fenotipo que exhibía blanqueo de las hojas. La
infección de las plantas de petunia con TMV/STMV causó la aparición
de hojas arrugadas a partir de las ramas infectadas, pero que
progresaba rápidamente de modo sistémico en toda la planta. Las
plantas sobrevivían a las infecciones y a menudo exhibían fenotipos
de recuperación prácticamente carentes de síntomas.
Únicamente las plantas que se han infectado con
los vectores híbridos pVE293 y pVE294 que llevaban el fragmento de
pds exhibían, además de los síntomas del virus, cambios fenotípicos
adicionales. En el caso de las infecciones por TMV/pVE293, las
ramas infectadas desarrollaban hojas jóvenes con sectores
blanqueados alrededor de los nervios y en el ápice de las hojas.
Este blanqueo era progresivo e independiente de la presencia de
síntomas de virus. Algunas de las hojas se blanquearon
completamente y cambiaban progresivamente a un color prácticamente
blanco. Este fenotipo se limitaba a las hojas de las ramas
infectadas. En el caso de las infecciones TMV/pVE294, se observó un
blanqueo similar de las hojas jóvenes para todas las ramas en
desarrollo, pero no para las ramas que llevaban ya yemas terminales
de flores. El blanqueo se iniciaba de nuevo alrededor de los nervios
y en los ápices de las hojas, pero progresaba rápidamente
produciendo patrones de diversificación variable de las hojas. Este
fenotipo no se ha observado nunca en inoculaciones de control con
virus de tipo salvaje o mutantes de deleción. Por consiguiente,
este fenotipo indica la silenciación funcional de la pds en plantas
de Petunia hybrida después de infección con los vectores
virales híbridos pVE293 y pVE294.
En los análisis de transferencia en gel de RNA
con preparaciones de RNA total de manchas verdes y blanqueadas de
las hojas superiores de plantas que exhiben un fenotipo FKO no pudo
detectarse RNA quimérico alguno del virus STMV y únicamente niveles
bajos de RNA del virus adyuvante TMV. Esto indica que la
silenciación del gen de pds inducida por el virus en un tejido
específico no precisa ir acompañada por niveles elevados de RNA
viral.
Ausubel et al. (1994)
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 3684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma
de TNV-A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 6395
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia el cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma
de TMV-U1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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<210> 3
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<211> 1245
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma
de STNV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 1058
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma
de STMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 6355
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma
de TMV-U2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 2346
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la
fitoenodesaturasa (pds) del tomate
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7096
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la
nitrato-reductasa (nia-2) del
tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1839
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la
nitrito-reductasa (nir-1) del
tabaco
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: DNA de la
beta-1,3-glucanasa de Nicotina
plumbagenifolia
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Región codificante de la proteína fluorescente verde
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1809
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Región codificante de la
beta-glucuronidasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de un aparte de la región de una variante
de TMV-2 que comprende el origen del ensamblaje
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de la región conductora de STMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 455
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de la región de arrastre de STMV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1971
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Copia del cDNA de parte del genoma de una variante de
TMV-U1, que comprende los genes MP y CP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
Claims (45)
1. Un método para la introducción de RNA
inhibidor en el citoplasma de células vegetales, reduciendo o
anulando dicho RNA inhibidor la expresión de un gen diana en dichas
células vegetales, comprendiendo dicho método:
- a)
- introducir en dichas células vegetales un vector viral de RNA que comprende dicho RNA inhibidor o que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce dicho RNA inhibidor, en donde dicho RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana en dicha célula vegetal, y en donde dicho vector viral de RNA comprende al menos elementos cis procedentes de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; y
- b)
- introducir dicho virus adyuvante correspondiente en dicha célula vegetal.
2. El método de la reivindicación 1, en donde
dicho RNA inhibidor comprende RNA de sentido de al menos 100
nucleótidos de longitud.
3. El método de la reivindicación 1, en donde
dicho RNA inhibidor comprende RNA antisentido de al menos 100
nucleótidos de longitud.
4. El método de la reivindicación 1, en donde
dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al menos
50 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
5. El método de la reivindicación 1 ó 4, en
donde dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al
menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho vector viral de RNA comprende
dichos elementos cis de STMV y en donde dicho virus adyuvante es
virus del mosaico del tabaco.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho vector viral de RNA comprende
dichos elementos cis procedentes del virus satélite de la necrosis
del tabaco y comprende adicionalmente un origen de ensamblaje del
virus del mosaico del tabaco y en donde dicho virus adyuvante es un
virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la proteína
de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
8. El método de la reivindicación 7, en donde
dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del virus satélite de
la necrosis del tabaco y dicho virus TNV es
TNV-A.
9. El método de la reivindicación 7, en donde
dicho virus satélite de RNA es STNV-C y dicho virus
TNV es TNV-D.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha planta se selecciona de
Nicotiana spp, Oryza sativa, Zea mays, Brassica spp.,
Gossypium spp., Triticum spp., Arabidopsis spp. o Petunia spp.
11. Un kit para introducción de RNA inhibidor en
el citoplasma de una célula vegetal, donde dicho RNA inhibidor
reduce o anula la expresión de un gen diana en dicha célula vegetal,
comprendiendo dicho kit
- a)
- un vector viral de RNA que comprende dicho RNA inhibidor o un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce dicho RNA inhibidor, en donde dicho RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana en dicha célula vegetal, y en donde dicho vector viral de RNA comprende al menos elementos cis procedentes de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; y
- b)
- dicho virus adyuvante correspondiente.
12. El kit de la reivindicación 11, en donde
dicho RNA inhibidor comprende RNA de sentido de al menos 100
nucleótidos de longitud.
13. El kit de la reivindicación 11, en donde
dicho RNA inhibidor comprende RNA antisentido de al menos 100
nucleótidos de longitud.
14. El kit de la reivindicación 11, en donde
dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al menos
50 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
15. El kit de la reivindicación 11 ó 14, en
donde dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al
menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
16. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en donde dicho vector viral de RNA
comprende dichos elementos cis de STMV, y en donde dicho virus
adyuvante correspondiente es el virus del mosaico del tabaco.
17. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, en donde dicho vector viral de RNA
comprende dichos elementos cis del virus satélite de la necrosis
del tabaco y comprende adicionalmente un origen de ensamblaje del
virus del mosaico del tabaco y en donde dicho virus adyuvante
correspondiente es un virus de la necrosis del tabaco que comprende
un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del
tabaco.
18. El kit de la reivindicación 17, en donde
dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del vector satélite de
la necrosis del tabaco y dicho virus TNV correspondiente es
TNV-A.
19. El kit de la reivindicación 17, en donde
dicho virus satélite de RNA es STNV-C y dicho virus
TNV es TNV-D.
20. Un método para aislamiento de genes
implicados en la determinación de un tramo o fenotipo de una especie
de planta, comprendiendo dicho método
- a)
- identificar una serie de secuencias de ácido nucleico de genes cuya expresión está correlacionada con un rasgo de interés,
- b)
- crear una genoteca de constructos de silenciación de genes en un vector de RNA viral, comprendiendo dicho vector viral de RNA al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación, y siendo dichos constructos de silenciación de genes ácidos nucleicos que, cuando se transcriben, producen moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo dicho RNA de sentido o antisentido una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con dichas secuencias de ácido nucleico de dichos genes, cuya expresión está correlacionada con dicho rasgo de interés;
- c)
- infectar una colección de plantas individuales de dicha especie de planta con dicha genoteca de constructos de silenciación de genes y con un virus adyuvante o RNA de virus adyuvante correspondiente, de tal modo que cada planta se infecta con al menos un miembro de dicha genoteca y con dicho virus adyuvante o RNA de virus adyuvante;
- d)
- identificar una planta en la cual dicho rasgo o fenotipo está alterado, utilizando un ensayo adaptado para dicho rasgo o fenotipo;
- e)
- aislar dicho gen implicado en la determinación de dicho rasgo o fenotipo en dicha especie de planta, a partir de dicha genoteca basada en la secuencia de nucleótidos a la cual estaba direccionado dicho constructo de silenciación de genes en dicha planta identificada.
21. El método de la reivindicación 20, en donde
dicho virus de RNA satélite es el virus satélite del mosaico del
tabaco.
22. El método de la reivindicación 21, en donde
dicho vector viral de RNA comprende un origen de ensamblaje del
virus del mosaico del tabaco.
23. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en donde dicho virus adyuvante es el virus
del mosaico del tabaco.
24. El método de la reivindicación 20, en donde
dicho virus satélite de RNA es el virus satélite de la necrosis del
tabaco.
25. El método de la reivindicación 24, en donde
dicho vector viral de RNA comprende un origen de ensamblaje del
virus del mosaico del tabaco.
26. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 20, 24 ó 25, en donde dicho virus adyuvante es el
virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la proteína
de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
27. El método de la reivindicación 26, en donde
dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del virus satélite de
la necrosis del tabaco y dicho virus TNV es
TNV-A.
28. El método de la reivindicación 26, en donde
dicho virus satélite de RNA es TNV-C y dicho virus
STNV es TNV-D.
29. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 28, en donde dichos constructos de
silenciación de genes comprenden RNA antisentido de al menos 100
nucleótidos de longitud.
30. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 28, en donde dichos constructos de
silenciación de genes comprenden RNA de sentido de al menos 100
nucleótidos de longitud.
31. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 28, en donde dichos constructos de
silenciación de genes comprenden un tramo complementario de al
menos 50 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
32. El método de la reivindicación 31, en donde
dichos constructos de silenciación de genes comprenden un tramo
complementario de al menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y
antisentido.
33. El método de la reivindicación 31 ó 32, en
donde dichos constructos de silenciación de genes comprenden al
menos dos copias de parte de las secuencias de nucleótidos de dicha
colección de ácidos nucleicos, encontrándose dichas copias en
repetición invertida.
34. Un método para el aislamiento de un ácido
nucleico con una función específica a partir de una colección de
ácido nucleicos, caracterizándose dicha colección de ácidos
nucleicos porque dicha variación en el patrón de expresión de
dichos ácidos nucleicos está correlacionada con la variación en un
rasgo/fenotipo de una planta que alberga dichos ácidos nucleicos,
comprendiendo dicho método los pasos de
- a)
- crear una genoteca de constructos de silenciación de genes en un vector viral de RNA, comprendiendo dicho vector viral de RNA al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación, y siendo dichos constructos de silenciación de genes ácidos nucleicos que, cuando se transcriben, producen moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo dicho RNA de sentido o antisentido una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dichos ácidos nucleicos, estando la variación del patrón de expresión del mismo correlacionada con la variación en un rasgo/fenotipo de una planta que alberga dichos ácidos nucleicos;
- b)
- infectar una colección de plantas con dicha genoteca de constructos de silenciación de genes y con dicho virus adyuvante o RNA de virus adyuvante correspondiente, de tal modo que cada planta se infecta con al menos un miembro de dicha genoteca y con dicho virus adyuvante o RNA de virus adyuvante;
- c)
- identificar las plantas con el rasgo o fenotipo alterado utilizando un ensayo adaptado para dicho rasgo o fenotipo.
35. El método de la reivindicación 34, que
comprende adicionalmente el paso de aislar dicho ácido nucleico con
dicha función específica a partir de dicha planta identificada con
el rasgo o fenotipo alterado.
36. Un método para determinación de la función
codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos conocida en una planta, conteniendo dicho método
- a)
- proporcionar un vector viral de RNA, comprendiendo dicho vector viral de RNA al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa a partir de un virus adyuvante correspondiente capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando se provee externamente con las funciones esenciales requeridas para dicha replicación, que comprende un constructo de silenciación de genes que es un ácido nucleico que, cuando se transcribe, produce moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo dicho RNA de sentido o antisentido una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con dicha secuencia de nucleótidos conocida;
- b)
- infectar dicha planta con dicho vector viral de RNA y dicho virus adyuvante correspondiente;
- c)
- identificar un rasgo o fenotipo alterado de dicha planta co-infectada.
37. Un método para identificación de genes
esenciales en una planta, que comprende
- a)
- crear una genoteca de constructos aleatorios de silenciación de genes por clonación de fragmentos aleatorios de DNA o cDNA de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de longitud en una copia de cDNA de un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando se ha provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación;
- b)
- infectar una planta con al menos un miembro de dicha genoteca y con dicho virus adyuvante correspondiente;
- c)
- identificar plantas que desarrollan un fenotipo asociado con el constructo de silenciación de genes.
38. El método de la reivindicación 37, que
comprende adicionalmente el paso de aislar el vector viral de RNA
del tejido que exhibe dicho fenotipo asociado con el constructo de
silenciación de genes.
39. El método de la reivindicación 37, en el
cual dicha genoteca se crea por clonación de fragmentos de DNA
aleatorios de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de longitud
en una copia de cDNA del vector viral de RNA.
40. El método de la reivindicación 37, en donde
dicha genoteca se crea por clonación de fragmentos de cDNA
aleatorios de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de longitud
en una copia de cDNA del vector viral de RNA.
41. El método de la reivindicación 37, en donde
dicha genoteca se crea por clonación de fragmentos de cDNA
duplicados aleatorios de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de
longitud en repetición invertida.
42. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 40, en donde dicho virus satélite de RNA es
STMV, y en donde dicho virus adyuvante es el virus del mosaico del
tabaco.
43. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 37 a 40, en donde dicho virus satélite de RNA es
el virus satélite de la necrosis del tabaco y comprende un origen de
ensamblaje del virus del mosaico del tabaco y en donde dicho virus
adyuvante es el virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen
de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
44. El método de la reivindicación 42, en donde
dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del virus satélite de
la necrosis del tabaco y dicho virus TNV es
TNV-A.
45. El método de la reivindicación 42, en donde
dicho virus satélite de RNA es STNV-C y dicho virus
TNV es TNV-D.
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