ES2316363T3 - Metodos para administracion de rna inhibidor a las plantas y aplicaciones de los mismos. - Google Patents

Metodos para administracion de rna inhibidor a las plantas y aplicaciones de los mismos. Download PDF

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John Jacobs
Gerben Van Eldik
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Abstract

Un método para la introducción de RNA inhibidor en el citoplasma de células vegetales, reduciendo o anulando dicho RNA inhibidor la expresión de un gen diana en dichas células vegetales, comprendiendo dicho método: a) introducir en dichas células vegetales un vector viral de RNA que comprende dicho RNA inhibidor o que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce dicho RNA inhibidor, en donde dicho RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana en dicha célula vegetal, y en donde dicho vector viral de RNA comprende al menos elementos cis procedentes de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; y b) introducir dicho virus adyuvante correspondiente en dicha célula vegetal.

Description

Métodos para administración de RNA inhibidor a las plantas y aplicaciones de los mismos.
Campo de la invención
Esta invención se refiere al campo de la genómica funcional en las plantas, refiriéndose más particularmente a métodos para la identificación y aislamiento ulterior de un ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos de interés en un conjunto de secuencias de ácido nucleico preseleccionadas correlacionadas con un rasgo particular, preferiblemente un rasgo agronómico importante, utilizando un kit de vectores virales de RNA, en donde uno de los vectores virales de RNA comprende una genoteca de constructos silenciadores de genes para las secuencias de ácido nucleico preseleccionadas. La invención se refiere también a un método para modular, preferiblemente reducir, y particularmente eliminar la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada, utilizando el kit de vectores virales, en donde uno de los vectores comprende un constructo silenciador de genes para la secuencia de ácido nucleico seleccionada. El último método puede utilizarse para validar la función de una secuencia de ácido nucleico cuya expresión está correlacionada con la presencia o ausencia de un rasgo específico en las plantas, pero con función desconocida por lo demás. Preferiblemente, uno de los componentes de los vectores virales de RNA del kit es un vector derivado de un virus satélite.
Técnica anterior
La reciente expansión rápida de información de secuencias de ácido nucleico disponibles ha exigido el desarrollo de métodos para identificar la función de las secuencias de ácido nucleico, particularmente secuencias de ácido nucleico transcritas tales como marcadores de secuencia expresados, con función desconocida, de una manera eficiente y eficaz en costes de mano de obra.
Para identificar el papel de los ácidos nucleicos secuenciados a partir de plantas con función desconocida, es necesario producir o identificar plantas en las cuales dichos ácidos nucleicos están desactivados estructural o funcionalmente. Plantas en las cuales secuencias de ácido nucleico predeterminadas están desactivadas estructuralmente pueden generarse utilizando tecnologías de recombinación tales como recombinación homóloga como ha sido descrito por Kempin et al. (1997) o utilizando tecnologías específicas tales como el uso de oligonucleótidos dúplex mixtos (quimeraplastos) para generar mutaciones específicas (como se describe en los documentos WO 96/22364 y WO 99/07865). Alternativamente, pueden identificarse plantas con una mutación en una secuencia de nucleótidos predeterminada por cribado de una genoteca mutante saturada, tal como, pero sin carácter limitante, una genoteca de inserción de T-DNA o una genoteca de inserción del transpones (sic) (véase p.ej. Pereira y Aerts, 1998). Estas metodologías requieren todas ellas la generación de un gran número de plantas alteradas de modo permanente, y por tanto son menos susceptibles de aplicación en métodos de alta capacidad. Además, la recuperación de plantas con mutaciones recesivas en genes esenciales requiere la mejora genética, que consume mucho tiempo, para mantener las plantas en estado heterocigótico. El mantenimiento de mutaciones dominantes letales en genes esenciales es prácticamente imposible.
Plantas con secuencias de nucleótidos predeterminadas desactivadas funcionalmente pueden generarse de una manera inmediata utilizando metodologías en las cuales se genera RNA inhibidor, tal como RNA antisentido o RNA de sentido.
El uso de RNA inhibidor para reducir o anular la expresión génica, conocido también como silenciación de genes, está perfectamente establecido en la técnica y ha sido objeto de varias revisiones (v.g. Baulcombe 1996, Stam et al. 1997, Depicker y Van Montagu, 1997). Varias solicitudes de patente se refieren a la explotación práctica de la silenciación de genes.
Los documentos US 5190131 y EP 0 467 349 A1 describen métodos y medios para regular o inhibir la expresión génica en una célula por incorporación en o asociación con el material genético de la célula de una secuencia de ácido nucleico no natural que se transcribe para producir un mRNA que es complementario a y capaz de fijarse al mRNA producido por el material genético de dicha célula.
EP 0 240 208 describe un método para regular la expresión de genes codificados en genomas de células vegetales, que se consigue por integración de un gen bajo el control de la transcripción de un promotor que es funcional en el hospedador y en el cual la cadena de DNA transcrita es complementaria de la cadena de DNA que se transcribe desde el o los genes endógenos que se desea regular.
EP 0 223 399 A1 describe métodos para efectuar cambios somáticos útiles en plantas por provocación de la transcripción en las células de las plantas de cadenas negativas de RNA que son sustancialmente complementarias a una cadena de RNA diana. La cadena de RNA diana puede ser un transcrito de mRNA creado en la expresión génica, un RNA viral, u otro RNA presente en las células de la planta. La cadena de RNA negativa es complementaria para al menos una porción de la cadena de RNA diana a fin de inhibir su actividad in vivo.
EP 0 647 715 A1 y las patentes US 5.034.323, 5.231.020 y 5283184 describen métodos y medios para producir plantas que exhiben rasgos fenotípicos deseados, por selección de transgenotes (sic) que comprenden un segmento de DNA enlazado operativamente a un promotor, en donde los productos de transcripción del segmento son sustancialmente homólogos a transcritos correspondientes de genes endógenos, particularmente genes del camino de biosíntesis de los flavonoides endógenos.
WO 93/23551 describe métodos y medios para la inhibición de dos o más genes diana, que comprenden introducir en la planta un solo gen de control que tiene regiones de DNA diferenciadas homólogas a cada uno de los genes diana y un promotor operativo en plantas adaptado para transcribir desde tales regiones diferenciadas RNA que inhibe la expresión de cada uno de los genes diana.
Una desventaja principal de esta tecnología, que impide el aprovechamiento de la misma en métodos de descubrimiento de funciones de genes de alta capacidad, es la impredecibilidad intrínseca y la baja frecuencia de aparición del fenómeno de silenciación de genes.
Recientemente, Waterhouse et al (1998) han descrito métodos y medios para producir la silenciación de genes en plantas más eficientes y predecibles, por expresión simultánea de constructos tanto de sentido como antisentido en células de una misma planta. Los ácidos nucleicos de sentido y antisentido pueden encontrarse en la misma unidad de transcripción, de tal modo que se genere después de la transcripción un transcrito de RNA simple que tiene autocomplementariedad.
Hamilton et al. (1998) describen la silenciación mejorada, v.g., de la expresión del gen ACC-oxidasa del tomate utilizando un RNA de sentido que contiene dos copias invertidas adicionales aguas arriba de su región 5' no traducida.
WO 98/53083 describe constructos y métodos para aumentar la inhibición de un gen diana dentro de un organismo, que implican la inserción en el vector de silenciación del gen de una repetición invertida de la totalidad o parte de una región polinucleotídica dentro del vector.
Debería entenderse claramente, sin embargo, que el uso de RNA inhibidor como instrumento en el análisis genético invertido de la función de los genes por la vía de métodos de alta capacidad, con lo cual el RNA inhibidor se genera a partir de constructos de silenciación de genes que están integrados de manera estable en el genoma de las plantas transgénicas, adolece de los mismos inconvenientes que los métodos en los cuales las secuencias de nucleótidos están desactivadas estructuralmente.
EP 0 194 809 y US 5.500.360 sugieren el uso de vectores virales de RNA para producir RNA regulador tal como RNA antisentido.
La exploración inicial del uso de vectores virales para suministrar RNA inhibidor en células vegetales ha sido descrita por Chapman (1991). En esta publicación, se describían constructos de silenciación de genes que comprenden secuencias de nucleótidos complementarias a la región traducida del gen GUS en un vector viral derivado de PVX. Sin embargo, los experimentos no eran concluyentes en cuanto a si la silenciación de los genes podía provocarse utilizando vectores virales para la producción de RNA inhibidor.
WO 93/03161 está dirigido a ácidos nucleicos virales recombinantes de plantas y a hospedadores infectados por ellos. La secuencia de ácido nucleico no nativa que se transcribe puede transcribirse como un RNA que es capaz de regular la expresión de un rasgo fenotípico por un mecanismo antisentido.
English et al., 1996, describen la supresión de la acumulación de un vector viral que comprende una secuencia nucleotídica extraña en plantas transgénicas que exhiben silenciación de genes nucleares que comprenden las mismas secuencias de nucleótidos extrañas, enlazando por tanto la silenciación de genes y vectores virales, aunque de una manera inversa a la contemplada en esta memoria.
Kumagai et al. 1995 (PNAS 92, 1679-1683) describen la inhibición del gen de fitoeno-desaturasa por suministro viral de RNA antisentido.
WO 95/34668 sugiere el uso de constructos genéticos basados en virus de RNA que se replican en el citoplasma de las células para proporcionar RNA inhibidor, sea RNA antisentido o RNA co-supresor (de sentido).
Baulcombe et al. (1998) y Ruiz et al. (1998) describen la silenciación de genes inducida por virus del gen endógeno de fitoeno-desaturasa (PDS) o de un transgén de la proteína fluorescente verde (GFP) en plantas, utilizando vectores derivados del virus X de la patata que llevan inserciones homólogas a PDS y GFP, respectivamente. Los autores sugerían adicionalmente que la silenciación de genes inducida por virus puede desarrollarse en un nuevo ensayo de la función de los genes, por introducción de un fragmento del genoma de un vector viral e inferencia de la función del gen a partir de los síntomas de las plantas infectadas que exhiben la silenciación del gen.
Sin embargo, los métodos descritos para identificación de la función de un gen con secuencia nucleotídica conocida tienen inconvenientes y limitaciones. En primer lugar, la aplicabilidad de los métodos de silenciación de genes mencionados basados en vectores virales de RNA en mayor escala se limita en la práctica a la identificación de genes con funciones esenciales, o genes con fenotipos macroscópicamente visibles. En segundo lugar, todos los métodos emplean vectores virales que son capaces de replicación autónoma en células vegetales y movimiento célula-a-célula, por lo cual debe tenerse cuidado a fin de no desactivar las funciones esenciales requeridas para estas funciones. Esto puede ser particularmente una desventaja cuando se adaptan estos métodos a las necesidades de plantas particulares, tales como plantas de cosecha, por desarrollo de nuevos vectores virales más aptos para replicación y propagación sistémica en las plantas.
La técnica anterior es por tanto deficiente en el sentido de la carencia de métodos eficaces para identificación en gran escala de la función de los ácidos nucleicos con secuencia nucleotídica conocida, o para el aislamiento de los genes de interés a partir de una agrupación de genes con secuencia nucleotídica conocida, pero función desconocida.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una representación esquemática de los vectores virales de RNA utilizados en los ejemplos.
MP: proteína de movimiento; CP: proteína de la cubierta; OAS: origen del ensamblaje. Los marcos de lectura abiertos se indican por recuadros. Cada genoma viral original se caracteriza por un patrón específico.
100: Virus del mosaico del tabaco; 101 virus de la necrosis del tabaco; 102 virus satélite del mosaico del tabaco; 103 virus satélite de la necrosis del tabaco.
Sumario de la invención
La invención proporciona un método para aislamiento de los genes implicados en la determinación de un rasgo o un fenotipo de una especie vegetal, que comprende identificar una serie de secuencias de ácido nucleico de genes, cuya expresión está correlacionada con un rasgo de interés; creación de una genoteca de constructos de silenciación de genes, que son ácidos nucleicos que, cuando se transcriben, producen moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, que comprenden una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con las secuencias de ácido nucleico de los genes, cuya expresión está correlacionada con el rasgo de interés en un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa a partir de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de funciones esenciales requeridas para dicha replicación; infección de un conjunto de plantas individuales de la misma especie vegetal con la genoteca de constructos de silenciación de genes y con un virus adyuvante o RNA del virus adyuvante correspondiente, en donde dicha planta se infecta con al menos un miembro de la genoteca y con el virus adyuvante o RNA del virus adyuvante; identificación de una planta en la cual el rasgo o fenotipo está alterado utilizando un ensayo adaptado para dicho rasgo o fenotipo; y aislamiento del gen implicado en la determinación del rasgo o fenotipo en la especie vegetal, a partir de la genoteca, basándose en la secuencia de nucleótidos para la cual se direccionó el constructo de silenciación de genes en la planta identificada.
Preferiblemente, el virus satélite de RNA es virus satélite del mosaico del tabaco o virus satélite de la necrosis del tabaco, y el vector viral de RNA comprende adicionalmente un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco. Preferiblemente, el virus adyuvante es virus del mosaico del tabaco o virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen codificante de un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
Constructos de silenciación de genes comprendidos dentro del vector viral de RNA pueden comprender RNA antisentido o RNA de sentido de al menos 100 nucleótidos de longitud. Particularmente, los constructos de silenciación de genes comprenden un tramo complementario de al menos 50, preferiblemente al menos 100, nucleótidos de RNA de sentido y antisentido. Se prefieren especialmente constructos de silenciación de genes que comprenden al menos dos copias de parte de las secuencias de nucleótidos de la colección de ácidos nucleicos, encontrándose las copias en repetición invertida.
Es otro objeto de la invención proporcionar un método para el aislamiento o la selección de un ácido nucleico con una función específica a partir de una colección de ácidos nucleicos, en donde la colección de ácidos nucleicos se caracteriza por el hecho de que la variación en el patrón de expresión de los ácidos nucleicos está correlacionada con la variación en un rasgo o fenotipo de una planta que alberga los ácidos nucleicos que comprenden los pasos de creación de una genoteca de constructos de silenciación de genes, que son ácidos nucleicos que, cuando se transcriben, proporcionan moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dichos ácidos nucleicos, estando correlacionada la variación en el patrón de expresión de los mismos con la variación en un rasgo/fenotipo de una planta que alberga dichos ácidos nucleicos en un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando se le proporcionan externamente las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; infección de una colección de plantas con la genoteca de constructos de silenciación de genes y con un virus adyuvante correspondiente o RNA de virus adyuvante, en donde cada planta está infectada con un miembro de la genoteca y con el virus adyuvante o RNA de virus adyuvante; identificación de plantas con el rasgo o fenotipo alterado utilizando un ensayo adaptado para el rasgo o fenotipo objeto de investigación; y, opcionalmente, aislamiento del ácido nucleico con la función específica de la planta identificada que tiene el rasgo o fenotipo alterado.
Es todavía otro objeto de la invención proporcionar un método para determinar la función codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos conocida en una planta, que comprende los pasos de proporcionar un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de funciones esenciales requeridas para dicha replicación que comprende un constructo de silenciación de genes que es un ácido nucleico que, cuando se transcribe, produce moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, que comprenden una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos conocida; infectar o inocular la planta con el vector viral de RNA quimérico y un virus adyuvante correspondiente o RNA de virus adyuvante; e identificar un rasgo o fenotipo alterado de la planta co-infectada.
La invención proporciona adicionalmente un método para identificar genes esenciales de una planta, que comprende crear una genoteca de constructos de silenciación de genes aleatorios por clonación de fragmentos aleatorios de DNA o cDNA de al menos 100 nucleótidos de longitud, particularmente fragmentos de cDNA duplicados de al menos 100 nucleótidos de longitud en repetición invertida, en una copia de cDNA de un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA, preferiblemente STMV o STNV, particularmente un vector viral de RNA que comprende un origen de ensamblaje de TMV, reconocido por una replicasa a partir de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando se le proporcionan externamente las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; infectar una planta con miembros individuales de la genoteca y con un virus adyuvante correspondiente, preferiblemente virus del mosaico del tabaco o virus de la necrosis del tabaco que comprende la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco; identificar plantas que desarrollan un fenotipo asociado gen-constructo de silenciación, particularmente necrosis y, opcionalmente, aislar el vector viral de RNA a partir del tejido que exhibe el fenotipo gen-constructo de silenciación asociado, particularmente el tejido necrotizado.
Es otro objeto adicional de la invención proporcionar un método para introducción de RNA inhibidor, preferiblemente RNA de sentido o antisentido, particularmente RNA inhibidor que comprende un tramo complementario de al menos 50, preferiblemente al menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido, en células vegetales, preferiblemente en el citoplasma de células vegetales, que comprende introducir en una célula vegetal, un vector viral de RNA que comprende el RNA inhibidor o que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce el RNA inhibidor, en donde el RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia respecto a la secuencia nucleotídica del gen diana en la célula vegetal, y en donde el vector viral de RNA comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA, preferiblemente STMV o STNV, particularmente un vector de RNA derivado de STMV o derivado de STNV que comprende un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco, reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal sólo cuando se le proporcionan externamente las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; e introducir en la misma célula vegetal, un virus adyuvante correspondiente, preferiblemente virus del mosaico del tabaco o virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
La invención proporciona adicionalmente un kit para introducción de RNA inhibidor, preferiblemente RNA de sentido o antisentido, particularmente RNA inhibidor que comprende un tramo complementario de al menos 50, preferiblemente al menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido en el citoplasma de una célula vegetal que comprende 1) un vector viral de RNA que comprende el RNA inhibidor o un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce el RNA inhibidor, en donde el RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia respecto a la secuencia nucleotídica del gen diana en la célula de la planta, y en donde el vector viral de RNA comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal sólo cuando se le proporcionan externamente las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; y 2) un virus adyuvante correspondiente.
Un kit particularmente preferido comprende 1) un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite del mosaico del tabaco, que comprende adicionalmente o codifica el RNA inhibidor; y 2) un virus adyuvante correspondiente que es un virus del mosaico del tabaco.
Otro kit particularmente preferido comprende 1) un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis del virus satélite de la necrosis del tabaco, especialmente STNV-2 o STNV-C, y que comprende adicionalmente un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco, que comprende adicionalmente o codifica el RNA inhibidor; y 2) un virus adyuvante correspondiente que es el virus de la necrosis del tabaco, particularmente TNV-A o TNV-D, que comprende un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Las definiciones siguientes se aplican a lo largo de esta solicitud, a no ser que se especifique otra cosa.
Como se utiliza en esta memoria, "que comprende(n)" debe interpretarse como especificación de la presencia de las características, entidades completas, pasos o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, unidades, pasos o componentes, o grupos de los mismos. Así, v.g., un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los citados explícitamente, es decir, puede estar incluido en un ácido nucleico o proteína mayor. Un gen quimérico que comprende una región de DNA que se define funcional o estructuralmente, puede comprender regiones de DNA adicionales, etc.
Como se utiliza en esta memoria, "un rasgo de una planta" indica un fenotipo que es el resultado combinado de la expresión coordinada de cierto número de genes. Rasgos típicos incluyen rendimiento, heterosis, resistencia a la sequía, resistencia al estrés, resistencia a temperatura alta o baja, vigor, rendimiento de semillas, hábitat de la planta, la arquitectura, etc. Típicamente, un rasgo de una planta se cita después de su aspecto propuesto.
Como se utiliza en esta memoria, un "fenotipo" de una planta hace referencia a cualquier característica cuantitativa o cualitativa de dicha planta, sea morfológica (con inclusión de características macroscópicas y microscópicas), bioquímica (con inclusión de la presencia, ausencia o concentración de metabolitos o moléculas particulares), funcional o de otro tipo.
El término "gen" significa cualquier fragmento de DNA o RNA que comprende una región (la "región transcrita") que se transcribe en una molécula de RNA (v.g., un mRNA) en una célula, enlazado(a) operativamente a regiones reguladoras adecuadas, v.g., un promotor expresable en la planta. Un gen puede comprender así varios fragmentos enlazados operativamente tales como un promotor, una secuencia conductora 5', una región codificante, y una región 3' que comprende un sitio de poliadenilación. Un gen de planta endógeno para una especie de planta o virus particular (gen de planta o virus endógeno) es un gen que se encuentra naturalmente en dicha especie de planta o virus, o que puede introducirse en dicha especie de planta por técnicas de reproducción tales como técnicas de reproducción convencionales. Un gen quimérico es cualquier gen que no se encuentra normalmente en una especie de planta o, alternativamente, cualquier gen en el cual el promotor no está asociado en la naturaleza con parte o la totalidad de la región de DNA transcrita o con al menos otra región reguladora del gen.
El término "expresión de un gen" hace referencia al proceso por el cual una región de DNA o RNA que está enlazada operativamente a regiones reguladoras apropiadas, particularmente a un promotor, se transcribe en un RNA que es biológicamente activo, es decir, que es capaz de interacción con otro ácido nucleico, o que es capaz de traducirse en un polipéptido o proteína biológicamente activo. Se dice que un gen codifica un RNA cuando el producto final de la expresión del gen es RNA biológicamente activo, tal como v.g. un RNA antisentido, una ribozima o un compuesto intermedio replicativo. Se dice que un gen codifica una proteína cuando el producto final de la expresión del gen es una proteína o polipéptido biológicamente activa(o). Además de los elementos definidos anteriormente, un gen puede comprender adicionalmente elementos para traducción independiente de la cápsula tales como una secuencia de entrada de ribosoma interna o los 6 primeros y segundos elementos intensificadores de la traducción como se definen en WO 97/49814.
Como se utilizan en esta memoria, los términos "silenciación de genes" o "inhibidor" no deben interpretarse con el significado de una anulación completa de la expresión del gen o genes diana, sino que incluye también cualquier reducción de la expresión, medida sea como una reducción en la transcripción y/o traducción, como una reducción en la acumulación de transcritos o productos de traducción tales como proteínas, o como una reducción en la expresión fenotípica del gen diana.
El término "reducción de la expresión fenotípica" se refiere a la comparación de la expresión fenotípica del ácido nucleico de interés en la célula eucariota en presencia del RNA inhibidor o constructos de silenciación de genes de la invención, con la expresión fenotípica del ácido nucleico de interés en una célula eucariota similar en ausencia del RNA inhibidor o constructos de silenciación de genes de la invención. La expresión fenotípica en presencia del RNA inhibidor de la invención debería ser por tanto menor que la expresión fenotípica en ausencia del mismo, preferiblemente ser sólo aproximadamente 25%, en particular sólo aproximadamente 10%, de modo más particular sólo aproximadamente 5% de la expresión fenotípica en ausencia del RNA inhibidor, debiendo ser inhibida la expresión fenotípica especialmente por completo para todos los propósitos prácticos por la presencia del RNA inhibidor o el constructo de silenciación de genes que codifica dicho RNA.
Una reducción de la expresión fenotípica de un ácido nucleico donde el fenotipo es un rasgo cualitativo significa que en presencia del RNA inhibidor, el rasgo fenotípico cambia a un estado discreto o diferente cuando se compara con una situación en la cual dicho RNA inhibidor está ausente. Una reducción de la expresión fenotípica de un ácido nucleico puede medirse por tanto, entre otras maneras, como una reducción en la transcripción de (parte de) dicho ácido nucleico o reducción en el nivel de transcrito, una reducción en la traducción de (parte de) dicho ácido nucleico o reducción en el nivel de productos de traducción, o una reducción del efecto que tiene la presencia del o de los RNA(s)
transcritos o polipéptido(s) traducido(s) sobre la célula eucariota o el organismo, y conducirá finalmente a fenotipos alterados. Está claro que la reducción en la expresión fenotípica de un ácido nucleico de interés puede ir acompañada por o estar correlacionada con un aumento en un fenotipo o rasgo.
En una realización de la invención, se produce un método para identificar y aislar genes implicados en la determinación de un rasgo o un fenotipo de una planta. A este fin, se identifican secuencias de ácido nucleico cuya expresión está correlacionada con el rasgo y/o fenotipo de interés. Están disponibles en la técnica métodos y medios para la identificación y/o aislamiento prácticamente simultáneos de un gran número, sino la parte predominante, de secuencias de nucleótidos cuya expresión, particularmente cuya transcripción, se ve influida subsiguientemente a un estímulo correspondiente al rasgo que se investiga, en comparación con la expresión de estas secuencias nucleotídicas en una planta de control. Tales métodos incluyen, pero sin carácter limitante, métodos de presentación diferencial, tales como los métodos de presentación diferencial de RNA basados en gel descritos por Prahasar et al. (1996). Como resultado de estos métodos, se identifica una colección de secuencias de nucleótidos al menos parcialmente caracterizados con expresión alterada en respuesta a un estímulo particular. Típicamente, sin embargo, la aplicación de tales métodos no permite discriminar entre genes cuya expresión alterada está causada directamente por el estímulo, y aquéllos que se encuentran adicionalmente aguas abajo en la cadena de sucesos y se ven influenciados sólo indirectamente por el estímulo, y se requerirá una selección ulterior entre la colección de secuencias de nucleótidos obtenida. Y menos aún permiten estos métodos predecir si se cumple también la relación inversa, es decir si la influencia de la expresión de genes con secuencias de nucleótidos particulares, identificadas de la manera arriba mencionada, influye también en el rasgo de interés. Se requiere por tanto una validación ulterior de las secuencias obtenidas, y preferiblemente una que verifique inmediatamente la relación inversa arriba mencionada. Para alcanzar esta meta de una manera eficiente y eficaz en costes, puede crearse una genoteca de constructos de silenciación de genes en un vector viral de RNA que es capaz de replicación en el interior de las células vegetales. La genoteca creada de constructos de silenciación de genes comprendidos dentro de un vector viral de RNA se utiliza luego para infectar un número representativo de plantas de tal manera que cada planta esté infectada por al menos un miembro (un clon) de la genoteca. Las plantas infectadas pueden analizarse luego para identificar aquellas plantas que exhiben alteraciones en el rasgo objeto de investigación, utilizando un ensayo que se adapta al rasgo que se investiga. Está claro que esta sintonía fina de ensayo y rasgo objeto de investigación puede ser una ventaja importante sobre los métodos actuales para análisis de alta capacidad, particularmente cuando se analizan rasgos y/o fenotipos que no dan como resultado alteraciones visibles microscópicamente, tales como, pero sin carácter limitante, modificaciones en caminos metabólicos específicos o alteraciones que son únicamente detectables en condiciones específicas (v.g. calor, estrés, tolerancia a la sequía, infección por patógenos, aplicación de herbicidas o insecticidas específicos, etc.).
El subconjunto de secuencias de ácido nucleico puede identificarse también sobre la base de la presencia de una huella particular característica de una clase de proteínas, tales como, pero sin carácter limitante, un dominio específico de quinasa, un motivo aglomerante, etc.
El constructo de silenciación de genes puede aislarse luego de la genoteca o de la planta que exhibe el rasgo o fenotipo alterado, y utilizarse para aislar el gen correspondiente basado en la secuencia de nucleótidos hacia la cual se direccionó el constructo de silenciación de genes.
Los autores de la invención han obtenido por primera vez indicaciones de que puede conseguirse la silenciación de genes en células vegetales tales como protoplastos, utilizando un vector viral derivado de un virus satélite que comprende una región codificante de \beta-1,3-glucanasa, en un experimento de co-infección con un virus adyuvante del virus satélite.
En otra realización preferida, el vector viral de RNA es capaz de replicación únicamente cuando las funciones requeridas se proporcionan en trans. Se prefiere particularmente el uso de un vector de RNA derivado de virus satélite, que puede replicarse en células vegetales y propagarse en toda la planta, cuando está presente un virus adyuvante correspondiente.
Como se utiliza en esta memoria, "un virus satélite" indica un virus de RNA, preferiblemente un virus de RNA monocatenario, cuyo genoma es susceptible de replicación en una célula vegetal y que está encapsidado por moléculas de proteína de la cubierta para formar una partícula de virus o virión únicamente cuando se provee externamente de cualquier número de funciones esenciales requeridas para el mismo. Por "proporcionado externamente" se entiende que tales funciones no están codificadas por el genoma del virus satélite. Los virus satélites dependen por tanto de la provisión externa de funciones esenciales, y pueden carecer de la capacidad para codificar replicasa funcional, proteína de movimiento, u otras funciones esenciales requeridas para completar su ciclo de vida en el interior de una célula vegetal. En una situación natural, tales funciones esenciales son proporcionadas usualmente por un virus replicante autónomamente o un denominado virus adyuvante.
Virus satélite útiles para la presente invención pueden incluir aislados de tipo salvaje, pero están abarcados también por esta definición variantes que dan como resultado síntomas reducidos o mínimos cuando se infectan en una planta hospedadora, en particular cuando se co-inoculan con un virus adyuvante correspondiente. La definición incluye también virus satélite sintéticos tales como virus deficientes y virus satélite quiméricos.
Un "vector viral de RNA derivado de un virus satélite" debería incluir al menos elementos cis de un virus satélite que son reconocidos por una replicasa proporcionada externamente, y un origen de ensamblaje que permite la encapsidación por la proteína de la cubierta proporcionada. Preferiblemente, el vector viral de RNA no comprende un gen codifícate de una proteína funcional de la cubierta, y particularmente no comprende la secuencia de nucleótidos que es esencialmente similar a la secuencia de nucleótidos codificante de un gen de proteína de la cubierta. Se prefieren particularmente vectores virales de RNA que comprenden un origen de ensamblaje reconocido por moléculas de la proteína de la cubierta a partir de un virus en forma de varilla, tal como el virus del mosaico del tabaco, dado que los virus en forma de varilla no exhiben las limitaciones espaciales impuestas sobre el tamaño del genoma por virus icosaédricos, permitiendo así que se incorpore un mayor número de nucleótidos adicionales en el vector viral. Convenientemente, el vector viral de RNA comprende cierto número de sitios de reconocimiento de restricción singulares o de baja aparición.
El uso de receptores de RNA virales derivados de un virus satélite resuelve adicionalmente problemas asociados con el uso de vectores virales de RNA, tales como reducción del tamaño de los vectores, versatilidad creciente, etc.
Particularmente adecuados para la invención son vectores virales de RNA derivados de virus de mosaico del tabaco satélites que comprenden el origen de ensamblaje (OAS) de TMV, comprendiendo preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido en la posición 5443 hasta el nucleótido de la posición 5518 o el nucleótido de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la posición 5430 al nucleótido de la posición 5505 (tales como la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 12) y en donde el gen codificante de la proteína de la cubierta se ha delecionado. Son también particularmente adecuados para la invención vectores virales de RNA derivados de la cepa del vector satélite de la necrosis que comprende el OAS de TMV y en donde la mayor parte del gen de la proteína de la cubierta se ha delecionado. Ejemplos no limitantes de vectores virales de RNA, adecuados para la invención se describen más adelante en esta memoria.
Un "virus adyuvante correspondiente" como se utiliza en esta memoria, indica aquellos virus de RNA, preferiblemente virus de RNA monocatenario, que pueden suministrar al virus satélite o al vector derivado de RNA viral las funciones requeridas en trans por dicho virus satélite o el vector viral de RNA derivado, para permitir que el mismo se replique en el citoplasma de las células vegetales, y se propague en la totalidad de una planta infectada. Típicamente, los virus adyuvantes correspondientes proporcionarán al virus satélite o al vector derivado del mismo una replicasa (RNA-polimerasa dependiente de RNA) que reconoce las secuencias cis presentes en el RNA viral satélite, y permitirá la replicación del genoma del virus satélite o el vector derivado. Otras proteínas que pueden ser proporcionadas típicamente por el virus adyuvante son proteínas de movimiento, que permiten, entre otras, la propagación mediada por plasmodesmos de partículas virales de célula a célula. Para virus satélites o vectores virales de RNA derivados de los mismos que carecen de un gen codificante de la proteína de la cubierta funcional, los virus adyuvantes correspondientes pueden proporcionar también una proteína funcional de la cubierta. Preferiblemente, el virus adyuvante correspondiente será capaz de propagación sistémica autónoma en una planta infectada. Sin embargo, una propagación sistémica de este tipo parece no ser un requisito previo para la silenciación eficiente de los genes. Las funciones requeridas en trans para un vector viral de RNA particular, pueden ser suministradas en trans por virus adyuvantes correspondientes diferentes.
Está claro que los virus adyuvantes correspondientes pueden ser aislados de tipo salvaje de virus de RNA, preferentemente de virus de RNA monocatenarios tales como los tobamovirus o necrovirus. Se prefieren particularmente virus de RNA en forma de varilla tales como tobamovirus que incluyen el virus del mosaico del tabaco y los tobamovirus afines tales como el virus del mosaico del alpiste, el virus de aclaramiento de los nervios del nabo, el virus del mosaico de la colza china, y el virus del mosaico de la colza oleaginosa.
Cuando puede utilizarse TMV como virus adyuvante, el mismo puede reemplazarse también por uno de los tobamovirus estrechamente afines mencionados anteriormente, en particular cuando se utilizan los vectores virales en especies de plantas particulares.
Se abarcan también por los métodos y medios de la invención variantes de tales aislados de tipo salvaje, preferiblemente variantes o mutantes que desarrollan síntomas mínimos cuando se inoculan en plantas hospedadoras o cuando se co-infectan con un virus satélite o vector de RNA correspondiente derivado del mismo. Virus adyuvantes adicionales preferidos pueden ser variantes o mutantes de aislados de tipo salvaje que tienen una gama de hospedadores extensa tales como los tobamovirus que pueden replicarse y propagarse en el maíz o en la familia de las crucíferas.
Sin embargo, virus adyuvantes correspondientes pueden ser también virus quiméricos o híbridos, en los cuales parte del genoma viral se ha reemplazado por un ácido nucleico extraño, particularmente en los casos en que parte del genoma viral se ha reemplazado por un ácido nucleico derivado de otro genoma viral, preferiblemente una parte que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de movimiento, o una parte que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cubierta. Por ejemplo, cuando se utiliza un necrovirus tal como TNV, puede ser ventajoso insertar una región codificante de proteína de movimiento, preferiblemente una proteína de movimiento derivada de un tobamovirus tal como TMV, en particular la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 desde el nucleótido de la posición 4903 al nucleótido de la posición 5709, a fin de asegurar la propagación de las partículas virales más allá de la hoja infectada. Sin embargo, la propagación del virus adyuvante o el vector viral de RNA no es esencial para la desactivación eficiente de la expresión de los genes diana a lo largo de la planta, como encontraron los inventores. Asimismo, cuando se utiliza p.ej. un necrovirus tal como TNV, puede ser adicionalmente ventajoso reemplazar la región codificante de la proteína de la cubierta del necrovirus por una región codificante de la proteína de la cubierta de un virus en forma de varilla, tal como TMV, particularmente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 2 desde el nucleótido de la posición 5712 al nucleótido de la posición 6191. Es innecesario decir que un origen de ensamblaje apropiado para la proteína de la cubierta sustituida tiene que incorporarse en el genoma del virus adyuvante quimérico. Sin embargo, en el ejemplo descrito anteriormente, el OAS de TMV está localizado convenientemente dentro de la región codificante de la proteína de movimiento. Ejemplos no limitantes de virus adyuvantes correspondientes se describirán más adelante en esta memoria.
Debe quedar claro que siempre que se especifica que las plantas se co-infectan o se infectan con un vector viral de RNA y un virus adyuvante correspondiente, es indiferente que el virus adyuvante se inocule antes, después o simultáneamente con el vector viral de RNA con tal, sin embargo, que exista un límite de tiempo razonable entre la infección del vector de DNA viral o el virus adyuvante correspondiente.
Alternativamente, las funciones requeridas en trans para la replicación y el movimiento del vector viral de RNA pueden ser proporcionadas por la expresión de genes quiméricos, que codifiquen una replicasa (RNA-polimerasa dependiente de RNA) y/o una proteína de movimiento y/o una proteína funcional de la cubierta, integrada en el genoma de las plantas de test.
Kits preferidos para suministrar RNA inhibidor o constructos de silenciación de genes a células vegetales para utilización en los métodos descritos en esta memoria comprenden un vector viral de RNA derivado de un virus satélite de RNA , particularmente del virus satélite de la necrosis del tabaco (STNV) o virus satélite del mosaico del tabaco (STMV) y un virus adyuvante correspondiente, en particular un virus adyuvante correspondiente con forma de varilla, en donde el vector viral de RNA comprende un constructo de silenciación de genes.
En una realización preferida, el kit comprende un vector viral de RNA derivado del vector satélite de la necrosis del tabaco, comprendiendo preferiblemente los elementos cis requeridos para replicación, comprendiendo particularmente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3 desde el nucleótido de la posición 1 al nucleótido de la posición 32, y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3 desde el nucleótido de la posición 738 al nucleótido de la posición 1245, en donde se ha insertado un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco, comprendiendo preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido de la posición 5443 al nucleótido de la posición 5518 o comprendiendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la posición 5430 al nucleótido de la posición 5505, o comprendiendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 12 y en donde dicho virus adyuvante se deriva del virus de la necrosis del tabaco, preferentemente con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1, y comprende un gen que codifica la proteína de movimiento del virus del mosaico del tabaco, preferiblemente con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido de la posición 4903 al nucleótido de la posición 5709 o con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 15 desde el nucleótido de la posición 479 al nucleótido de la posición 1285, y un gen que codifica la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco, preferiblemente con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido de la posición 5712 al nucleótido de la posición 6191 o con la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 15 desde el nucleótido de la posición 1288 al nucleótido de la posición 1767.
Combinaciones preferidas son aquellos kits en los cuales el vector viral de RNA se deriva de las cepas STNV-1 o STNV-2 (como ha sido descrito por Ysebaert et al. 1980; número de acceso a Genbank M10388, o Danthinne et al., 1991, numero de acceso a Genbank M64479) y el virus adyuvante es TNV-A (Meulewaeter et al. 1990, SEQ ID No 1). Otras combinaciones preferidas son aquellos kits en los cuales el vector viral de RNA se deriva de STNV-C (Bringloe et al. (1998); número de acceso a Genbank AJ000898) y el virus adyuvante correspondientes es TNV-D (Coutts et al (1991); número de acceso a Genbank D00942).
En otra realización particularmente preferida, el kit comprende un vector viral de RNA derivado del virus satélite del mosaico del tabaco, comprendiendo preferiblemente los elementos cis requeridos para replicación, que comprenden particularmente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 desde el nucleótido de la posición 1 al nucleótido de la posición 197 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 4 desde el nucleótido de la posición 604 al nucleótido de la posición 1058, o comprendiendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 13 y la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 14; y comprendiendo adicionalmente un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco, comprendiendo preferiblemente la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 2 desde el nucleótido de la posición 5443 al nucleótido de la posición 5518, o comprendiendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 5 desde el nucleótido de la posición 5430 al nucleótido de la posición 5505, o comprendiendo la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 12, y en donde dicho virus adyuvante correspondiente es un virus del mosaico del tabaco, particularmente TMV-U1 (SEQ ID No 2) o TMV-U2 (SEQ ID No 5).
Estará claro para las personas expertas en la técnica que los vectores virales de RNA pueden generarse convenientemente por métodos de transcripción in vitro a partir de copias de cDNA del RNA viral. Análogamente, RNA viral infeccioso para los virus adyuvantes correspondientes puede ser generado a partir de copias de cDNA de su genoma. Genotecas, vectores virales y virus adyuvantes correspondientes pueden mantenerse también por replicación en células vegetales.
Métodos para infectar o inocular plantas y células vegetales con vectores virales de RNA, virus adyuvantes y genotecas comprendidas dentro de vectores virales de RNA son bien conocidos en la esfera de las personas expertas en la técnica y pueden realizarse de acuerdo con los métodos descritos en Walkey (1985).
En una realización de los métodos de la invención se inoculan plantas, v.g. con una solución que contiene las genotecas de constructos de silenciación de genes en un vector viral, o con una solución que contiene una mixtura de constructos de silenciación de genes en un vector viral y virus adyuvantes correspondientes. La solución puede contener además compuestos adicionales para mejorar la inoculación y la infección de las plantas, tales como, pero sin carácter limitante, abrasivos, adherentes, productos tensioactivos y análogos.
Las plantas pueden infectarse durante etapas de desarrollo diferentes, con objeto de maximizar el fenotipo objeto de investigación. Asimismo, pueden inocularse partes diferentes de plantas para optimizar la observación del fenotipo esperado.
Aunque no se pretende limitar el alcance de la invención a un modo de acción particular, se cree que el RNA inhibidor comprendido dentro del vector viral de RNA puede ejercer su efecto inhibidor, con tal que exista un equilibrio entre el RNA encapsidado en un virión y el RNA libre. Se cree que el equilibrio entre RNA encapsidado y libre puede verse influido por variación de la secuencia y posición de un origen de ensamblaje dentro del vector viral de RNA. Sin embargo, el efecto de silenciación de los genes puede amplificarse poniendo el ácido nucleico codificante del RNA inhibidor bajo control de un promotor viral, preferiblemente un promotor de la proteína de la cubierta, o un promotor subgenómico de tal manera que durante el ciclo vital del virus se genere o se transcriba RNA inhibidor adicional.
La expresión "constructos de silenciación de genes" como se utiliza en esta memoria, debe interpretarse como un ácido nucleico, que cuando se transcribe produce "RNA inhibidor" que comprende o está constituido por RNA de sentido o RNA antisentido, o una combinación de ambos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, particularmente al menos 85%, más particularmente al menos 90%, y especialmente al menos 95% de identidad de secuencia con o es idéntica a la secuencia de nucleótidos cuya expresión debe suprimirse, o su complemento. Adicionalmente, la secuencia de nucleótidos de la región de sentido o antisentido debería tener preferiblemente una longitud de al menos aproximadamente 100 nucleótidos, de modo más preferible al menos aproximadamente 250 nucleótidos, y en particular al menos aproximadamente 500 nucleótidos, pero puede extenderse hasta la longitud total de la región codificante del gen cuya expresión debe reducirse.
Para propósitos prácticos en la aplicación de los métodos para cribado o validación de alta capacidad, el constructo de silenciación de genes puede ser idéntico en secuencia y longitud a los ácidos nucleicos diana, o aquéllos pueden ser exactamente complementarios en secuencia e idénticos en longitud a los ácidos nucleicos diana.
Para el propósito de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos afines, expresada como porcentaje, hace referencia al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen residuos idénticos (x 100) dividido por el número de posiciones comparadas. Una laguna, es decir una posición en una alineación en la cual un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra se considera como una posición con residuos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se realiza por el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmanm, 1983) utilizando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos o aminoácidos, una longitud de palabra de 2 aminoácidos, y una penalidad por laguna de 4. El análisis y la interpretación de datos de secuencias asistido por ordenador, con inclusión de la alineación de las secuencias como se ha descrito arriba, puede realizarse convenientemente utilizando paquetes de Software disponibles comercialmente tales como los programas de la serie Intelligenetics^{TM} (Intelligenetics Inc., CA) o el paquete GCG Wisconsin.
Está claro para las personas expertas en la técnica que los constructos de silenciación de genes pueden comprender al mismo tiempo RNA de sentido y antisentido direccionado hacia la misma secuencia de nucleótidos cuya expresión debe reducirse. Preferiblemente, los RNA de sentido y antisentido son al menos parcialmente complementarios uno a otro y capaces de formar una estructura tronco-bucle, dado que se ha demostrado que una configuración de este tipo aumenta la eficiencia de la silenciación de genes, tanto en aparición como en nivel de silenciación de los genes (Waterhouse et al 1998). En la realización más inmediata, al menos parte del ácido nucleico diana, preferiblemente el ácido nucleico diana completo, se clona en forma duplicada, con lo cual las dos copias se encuentran en repetición invertida, separadas preferiblemente por una secuencia nucleotídica espaciadora no afín.
La invención está orientada también a proporcionar los kits descritos en esta memoria en sus diferentes realizaciones. Es también un objeto de la invención proporcionar los kits que comprenden los virus adyuvantes y vectores virales de RNA descritos sin los constructos silenciadores de genes o RNA inhibidor así como sus copias de cDNA, donde las copias de cDNA se encuentran bajo control de un promotor (que puede utilizarse en métodos de transcripción in vitro disponibles en la técnica) tales como, pero sin carácter limitante, los promotores reconocidos por promotores de polimerasa de bacteriófago simples (los promotores específicos de RNA-polimerasa T7, T3, SP6, y análogos).
La invención se refiere adicionalmente a un método para identificar genes que son esenciales en las plantas que comprende los pasos siguientes:
a)
se crea una genoteca de constructos aleatorios de silenciación de genes específicos para la planta utilizando un vector viral de RNA que se deriva de un virus satélite de RNA, como se define en esta memoria, con inclusión de todas sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, la genoteca se crea en una copia de cDNA del vector viral y puede generarse por inserción de secuencias aleatorias de DNA, con preferencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, en particular al menos aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Las secuencias de DNA aleatorias pueden obtenerse a partir de DNA total de una planta o pueden representar un subconjunto del genoma de una planta, tal como DNA derivado de orgánulos (plástidos, cloroplastos, mitocondria, etc.). Alternativamente, la genoteca puede crearse por inserción de cDNAs generados por transcriptasa inversa a partir de RNA, preferiblemente mRNA obtenido a partir de dicha planta. La genoteca puede normalizarse, v.g. como se describe en Takayuki et al. (1995). La genoteca debería ser con preferencia de tamaño suficientemente grande, es decir que contuviera un número suficiente de clones independientes para abarcar el genoma de la planta, de acuerdo con los estándares conocidos en la técnica. En una realización preferida, la genoteca puede contener duplicación del ácido nucleico insertado, con lo cual las copias se encuentran en repetición invertida. El ácido nucleico insertado puede clonarse aguas abajo de un promotor viral tal como, pero sin carácter limitante, un promotor del gen de la proteína de la cubierta o un promotor subgenómico. Adicionalmente, estará claro para las personas expertas en la técnica que la orientación relativa del ácido nucleico insertado, en relación al vector de RNA tiene únicamente importancia limitada dado que se generará cualquier RNA inhibidor de sentido o antisentido.
b)
Las plantas de ensayo se infectan con miembros individuales de la genoteca y también con un virus adyuvante correspondiente. La infección puede tener lugar de acuerdo con cualquiera de los métodos mencionados en esta memoria. Evidentemente, la copia de DNA de la genoteca debería convertirse en una copia de RNA de acuerdo con cualquiera de lo métodos descritos en esta memoria, preferiblemente antes de la infección de las plantas de ensayo.
c)
Se identifican las plantas que desarrollan un fenotipo asociado al constructo de silenciación de genes. Como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que un "fenotipo asociado al constructo de silenciación de genes" indica un fenotipo que no se observa cuando se realiza una inoculación falsa con un vector viral de RNA sin constructo de silenciación de genes, en combinación con un virus adyuvante correspondiente en una planta similar. Fenotipos preferidos comprenden clorosis, necrosis o cualquier fenotipo, preferiblemente un fenotipo morfológico que indique que el tejido infectado está inhibido o moribundo o en fase de deterioro.
d)
Opcionalmente, aislamiento del vector de RNA viral del tejido que exhibe el fenotipo asociado al constructo de silenciación de genes de acuerdo con métodos disponibles en la técnica para aislamiento de virus. Preferiblemente, el vector viral de RNA aislado que comprende el constructo de silenciación de genes de interés debería re-ensayarse en plantas nuevas a fin de confirmar el fenotipo observado. Por supuesto, el vector viral de RNA puede recuperarse también a partir de la genoteca si la infección de las plantas se llevó a cabo de una manera conservadora de la identidad.
e)
El constructo de silenciación de genes o la información de la secuencia de nucleótidos del mismo puede utilizarse luego para recuperar el clon correspondiente de DNA genómico o cDNA utilizando métodos disponibles en la técnica (hibridación, PCR, etc.).
Como se define en esta memoria, "genes esenciales" de una planta, son aquellos genes que son necesarios durante el desarrollo normal de una planta. Como se ha definido, los genes esenciales pueden ser esenciales para el desarrollo normal únicamente en etapas particulares del desarrollo, o únicamente en tejidos u órganos particulares, tales como v.g. las flores. Típicamente, la inhibición de la expresión de genes esenciales puede tener un efecto letal sobre una planta o parte de una planta. Genes esenciales preferidos son aquellos genes que dan como resultado el retardo o la muerte de las plantas jóvenes cuando están inhibidos.
Estará claro para las personas expertas en la técnica que si la inhibición del ácido nucleico diana da como resultado un efecto dominante, como sucede en el caso de la inhibición de la expresión de genes esenciales, los métodos descritos pueden llevarse a cabo utilizando la infección de más de un vector viral de RNA que comprende un constructo de silenciación de genes por planta. Debe tenerse cuidado a fin de no diluir demasiado el efecto fenotípico por infección de un número excesivamente grande de vectores virales de RNA diferentes que comprenden constructos diferentes de silenciación de genes en la misma planta. Se cree que óptimamente, cualquier número comprendido entre 1 y 5 RNAs inhibidores diferentes puede introducirse en una sola célula de planta.
En otra realización adicional de la invención, se produce un método para determinar la función codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos conocida. Esta secuencia de nucleótidos puede haber sido obtenida v.g. por un programa de secuenciación de genoma, que incluye programas de secuenciación de marcadores de secuencia expresados. Con objeto de descifrar la función de dicha secuencia, un constructo de silenciación de genes o RNA inhibidor direccionado hacia dicha secuencia de nucleótidos, como se describe en todas sus realizaciones en esta memoria, puede introducirse en un vector viral de RNA derivado de un virus satélite, como se describe en esta memoria, y utilizarse para inocular una planta o introducirse en una célula de la planta, particularmente en un protoplasto, junto con un virus adyuvante correspondiente, como se describe en esta memoria.
Un gran número de las realizaciones descritas en esta memoria se refieren así a un método para la introducción de RNA inhibidor en células vegetales, que comprende los pasos de:
a.)
Introducir en una célula de la planta un vector viral de RNA que comprende RNA inhibidor o que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce el RNA inhibidor, en donde el vector viral de RNA se deriva de un virus satélite de RNA; y
b.)
introducir en la misma célula de la planta un virus adyuvante correspondiente.
Los métodos de la invención pueden aplicarse esencialmente a todas las plantas para las cuales están disponibles vectores virales y/o virus adyuvantes correspondientes. Se considera que los métodos de la invención son particularmente adecuados para Nicotiana spp, particularmente N. tabacum, N. sylvestris, N. benthamiana, y otras Solanáceas, arroz (Oryza sativa), maíz (Zea Mays), Brassica spp., algodón (Gossypium hirsutum), trigo, Arabidopsis spp. y Petunia spp.
Se contemplan también por la presente invención métodos para desarrollo de un producto agronómicamente útil, tal como un herbicida o una planta transgénica utilizando los métodos y medios descritos en esta memoria, que comprenden adicionalmente los pasos de inserción de un ácido nucleico implicado en la determinación de un rasgo particular de la planta, aislado por los métodos de la invención, preferiblemente bajo control de un promotor extraño expresable en plantas, particularmente bajo control de un promotor controlable expresable en plantas en el genoma de una planta, particularmente una planta de cosecha. Cuando se han identificado genes esenciales de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, estos genes esenciales o sus productos génicos codificados, particularmente las proteínas codificadas pueden utilizarse en ensayos in vitro para identificar compuestos que inhiben la actividad, particularmente la actividad enzimática, que pueden utilizarse como herbicidas. Alternativamente, puede utilizarse como compuesto herbicida un vector viral de RNA que codifica constructos de silenciación de genes direccionados hacia genes esenciales.
Los ejemplos no limitantes siguientes describen la construcción de vectores virales de RNA derivados de virus satélites, y usos de los mismos. A no ser que se indique otra cosa en los ejemplos, todas las técnicas de RNA recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como han sido descritos en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU. Materiales y métodos estándar para trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Pulications, Reino Unido.
A lo largo de la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las secuencias siguientes:
SEQ ID No 1:
secuencia de nucleótidos del genoma de TNV-A
SEQ ID No 2:
secuencia de nucleótidos del genoma de TMV-U1 (No. de acceso a Genbank V01408).
SEQ ID No 3:
secuencia de nucleótidos del genoma de STNV-2
SEQ ID No 4:
secuencia de nucleótidos del genoma de STMV (No. de acceso a Genbank M25782).
SEQ ID No 5:
secuencia de nucleótidos del genoma de TMV-U2 (No. de acceso a Genbank M34077).
SEQ ID No 6:
secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la fitoeno-desaturasa (pds) del tomate (No. de acceso a Genbank X59948).
SEQ ID No 7:
secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la nitrato-reductasa (nia-2) del tabaco (No. de acceso a Genbank X14059).
SEQ ID No 8:
secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la nitrito-reductasa (nir-1) del tabaco (No. de acceso a Genbank X66145).
SEQ ID No 9:
secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la \beta-1,3-glucanasa (gn-1) de Nicotiana plumbagenifolia.
SEQ ID No 10:
secuencia de nucleótidos de una región codificante de proteína fluorescente verde (gfp).
SEQ ID No 11:
secuencia de nucleótidos de una región codificante de \beta-glucuronidasa (gus)
SEQ ID No 12:
secuencia de nucleótidos de un origen de ensamblaje de una cepa de TMV-U2.
SEQ ID No 13:
secuencia de nucleótidos de la secuencia conductora de una cepa de STMV
SEQ ID No 14:
secuencia de nucleótidos de la secuencia de arrastre de una cepa de STMV.
SEQ ID No 15:
secuencia de nucleótidos de parte del genoma de una cepa de TMV-U2 que comprende la proteína de movimiento y los genes de la proteína de la cubierta.
Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de los kits vectores virales de RNA
Se construye un vector plasmídico para la síntesis de un RNA de virus adyuvante TMV/TNV híbrido infectivo utilizando los elementos siguientes enlazados operativamente:
\bullet
\vtcortauna Un promotor de RNA-polimerasa T7
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde los nucleótidos 1 a 2234 de TNV-A (nt 1 a 2234 de SEQ ID No 1), en donde el codón AUG de los nucleótidos 2218-220 ha mutado a un codón diferente.
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el marco de lectura abierto para la proteína de movimiento de TMV-U1 (nt 4903-5709 de Número de Acceso a Genbank V01408 o nt 4903-5709 de SEQ ID No 2 o nt 479-1285 de SEQ ID No 12)
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde los nucleótidos 2235 a 2612 de TNV-A (SEQ ID No 1)
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el marco de lectura abierto para la proteína de la cubierta de TMV-U1 (nt 5712-6191 de Número de Acceso a Genbank V01408 o nt 5712-6191 de SEQ ID No 2 o nt 1288-1767 de SEQ ID No 15).
\bullet
\vtcortauna Una secuencia que comprende los nucleótidos 3444 a 3684 de TNV-A (nt 3444 a 3684 de SEQ ID No 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se construye un vector plasmídico para la síntesis de un RNA de vector viral TMV/STNV híbrido infectivo utilizando los elementos siguientes enlazados operativamente:
\bullet
\vtcortauna Un promotor de RNA-polimerasa T7
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1 al 32 de STNV-2 (nt 1 a 32 de SEQ ID No 3)
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende el origen de ensamblaje (OAS) de TMV-U1 (nt 5443-5518 de Número de Acceso a Genbank V01408 o nt 5443-5518 de SEQ ID No 2 o nt 1018 a 1094 de SEQ ID No 15).
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 738 al 1245 de STNV-2 (nt 738 a 1245 de SEQ ID No 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se construye un vector plasmídico para la síntesis de un RNA de vector viral TMV/STMV híbrido infectivo utilizando los elementos siguientes enlazados operativamente:
\bullet
\vtcortauna Un promotor de RNA-polimerasa T7
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1 al 197 de STMV (No. de Acceso a Genbank M25782; nt 1 al 197 de SEQ ID No 4) o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 13.
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende el OAS de TMV-U1 (nt. 5443-5518 de No. de Acceso a Genbank V01408; nt 5443 al 5518 de SEQ ID No 2; nt 1019-1094 de SEQ ID No 15) o de TMV-U2 (nt 5430-5505 de No. de Acceso a Genbank M34077; nt 5430-5505 de SEQ ID No 5) tal como la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 12.
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 604 al 1058 de STMV (No. de Acceso a Genbank M25782; nt 604 al 1058 de SEQ ID No 4) o que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Demostración de la factibilidad de la utilización de genes endógenos o transgenes conocidos
Para demostrar la factibilidad del uso de los kits virales descritos en el Ejemplo 1 para silenciación funcional de genes endógenos o transgenes específicos en plantas de Nicotiana, se inserta uno de los fragmentos de DNA siguientes en el vector híbrido TMV/STNV o TMV/STMV, inmediatamente aguas arriba o aguas abajo del TMV OAS:
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la fitoeno-desaturasa (pds) del tomate (que comprende el nucleótido 1021 al 1671 de SEQ ID No 6 o No. de Acceso a Genbank X59948)
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la nitrato-reductasa del tabaco (nia-2) (que comprende los nucleótidos 1103 al 2114 o los nucleótidos 5169 al 6497 de SEQ ID No 7 o No. de Acceso a Genbank X14059)
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la nitrito-reductasa (nir-1) del tabaco (que comprende el nucleótido 650-1212 de SEQ ID No 8 o No. de Acceso a Genbank X66145)
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la \beta-1,3-glucanasa (gn-1) de Nicotiana plumbaginifolia (SEQ ID No 9 o No. de Acceso a Genbank X07280)
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
\bullet
\vtcortauna un fragmento que comprende una secuencia de nucleótidos de una región codificante de proteína fluorescente verde (gfp) (SEQ ID No 10)
\bullet
\vtcortauna un fragmento que comprende una secuencia de nucleótidos del nucleótido 1 al 600 de la región codificante de \beta-glucuronidasa (gus) (SEQ ID No 11)
Se sintetizan transcritos infectivos quiméricos in vitro, utilizando RNA-polimerasa T7 con los DNAs plasmídicos linealizados de los vectores descritos como moldes.
Los RNAs de TMV/STNV se inoculan mecánicamente en hojas de plantas Nicotiana benthamiama o Nitotiana tabacum junto con el RNA de TMV/TNV, mientras que se inoculan los RNAs de TMV/STMV junto con partículas de virus TMV-U2 o RNA viral.
Las plantas infectadas se registran respecto a fenotipos, acumulación de virus, y supresión del gen de plantas homólogo entre las semanas 1 y 4 después de la inoculación.
Las plantas infectadas con vectores que contienen el cDNA de pds exhiben un fenotipo blanqueante en las hojas infectadas y silenciación del transcrito endógeno de pds.
Las plantas infectadas con vectores que contienen el cDNA nia-2 o nir-1 exhiben un fenotipo clorótico en las hojas infectadas y silenciación del transcrito endógeno nia-2 o nir-1, respectivamente.
Las plantas infectadas con vectores que contienen el cDNA de gn-1 exhiben silenciación del transcrito endógeno 1,3-glucanasa básica. Después de la infección con vectores que contienen la secuencia gfp, las plantas transgénicas que expresan normalmente un transgén gfp exhiben silenciación del transcrito del transgén gfp y supresión de la fluorescencia de GFP.
Después de la infección con vectores que contienen la secuencia gus, las plantas transgénicas que expresan normalmente un transgén gus exhiben silenciación del transcrito del transgén gus y supresión de la actividad de GUS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Desactivación de la fitoeno-desaturasa en Nicotiana benthamiama utilizando un sistema vector híbrido TNV/STNV
Se utilizó un sistema vector híbrido TNV/STNV para la desactivación funcional de un gen vegetal endógeno expresado constitutivamente. De este modo, se han construido los vectores híbridos STNV siguientes:
pIF9 que lleva los elementos siguientes enlazados operativamente:
\bullet
\vtcortauna Un promotor de RNA-polimerasa T7 que comprende el nucleótido 402 al 420 de No. de Acceso a Genbank M77811;
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1 al 32 de SEQ ID No 3 (conductor STNV);
\bullet
\vtcortauna un ácido nucleico que comprende el origen de ensamblaje (OAS) de TMV-U1 desde el nucleótido 5443 al 5518 de SEQ ID No 2 o No. de Acceso a Genbank V01408;
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la fitoeno-desaturasa (pds) del tomate que comprende el nucleótido 1021 al 1671 de SEQ ID No 6 o No. de Acceso a Genbank X59948;
\bullet
\vtcortauna un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 806 al 1418 de SEQ ID No 3 (arrastre de STNV-2).
\vskip1.000000\baselineskip
pIF12 que lleva los elementos siguientes enlazados operativamente:
\bullet
\vtcortauna Un promotor de RNA-polimerasa T7 que comprende el nucleótido 402 al 420 de No. de Acceso a Genbank M77811;
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1 al 32 de SEQ ID No 3 (conductor STNV);
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la fitoeno-desaturasa (pds) del tomate que comprende el nucleótido 1021 al 1671 de SEQ ID No 6 o No. de Acceso a Genbank X59948;
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 742 al 1354 de SEQ ID No 3 (arrastre de STNV-2).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se han sintetizado transcritos infectivos quiméricos in vitro utilizando RNA-polimerasa T7 con los DNAs plasmídicos linealizados de los vectores híbridos pIF9 y pIF12 descritos como moldes utilizando procedimientos estándar. Los transcritos de control in vitro se han sintetizado en DNAs plasmídicos linealizados de los plásmidos precursores de pIF9 y pIF12 sin las inserciones de los fragmentos de pds y en DNA plasmídico linealizado de un clon infectivo del tipo salvaje STNV y de un vector STNV híbrido que lleva una inserción del gen cat.
Los transcritos in vitro se han inoculado mecánicamente en hojas de 4 semanas de edad de plantas de Nicotiana benthamiama junto con el virus adyuvante TNV.
Todas las plantas infectadas se registraron continuamente respecto a desactivación de la pds, lo cual dio como resultado un fenotipo que mostraba blanqueo de las hojas. En todas las inoculaciones se observaron lesiones necróticas para las hojas inoculadas al cabo de 2 días de la inoculación (p.i.). Al cabo de una semana, aparecían también lesiones necróticas en las hojas superiores, lo que indicaba la propagación sistémica de los virus en N. benthamiama. En la mayoría de las plantas infectadas, los síntomas del virus eran severos, pero las plantas sobrevivían durante muchas semanas.
Únicamente las plantas que han sido infectadas con los vectores híbridos pIF9 y pIF12 que llevaban fragmentos de pds, exhibían además de los síntomas del virus cambios fenotípicos adicionales. Aproximadamente 4 semanas p.i., las hojas verdes superiores, que no exhibían síntomas de virus de ningún tipo, desarrollaron manchas blanqueadas dispersas por todas las hojas. El blanqueo era progresivo y no iba acompañado por lesiones necróticas. Al cabo de otras 3 semanas, el tamaño de las manchas aumentaba constantemente y el color cambió desde verde pálido a amarillo a blanco-amarillento pálido. Estos síntomas no se han observado nunca en plantas en las cuales se llevaron a cabo inoculaciones con TNV/STNV de tipo salvaje o inoculaciones de control mutantes de deleción TNV/STNV. Así pues, este fenotipo indica la silenciación funcional de la pds en las plantas de N. benthamiama después de infección con vectores virales híbridos pIF9 y pIF12.
En los análisis de transferencias en gel de RNA realizados con preparaciones de RNA total de manchas verdes y blanqueadas de las hojas superiores de plantas que exhibían un fenotipo FKO no pudo detectarse RNA alguno de virus quimérico STNV y únicamente niveles muy bajos de RNA de virus adyuvante TNV. Esto indica que la silenciación de genes inducida por virus de pds en un tejido específico no precisa ir acompañada por niveles altos de RNA viral.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Desactivación de fitoeno-desaturasa en Petunia hybrida utilizando un sistema vector híbrido TMV/STMV
Se utilizó un sistema vector híbrido TMV/STMV para la desactivación funcional de un gen de plantas endógeno expresado constitutivamente. De este modo, se han construido los vectores híbridos STMV siguientes:
pVE293 que lleva los elementos siguientes enlazados operativamente:
\bullet
\vtcortauna Un promotor de RNA-polimerasa T7 que comprende el nucleótido 402 al 420 de No. de Acceso a Genbank M77811
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1 al 197 de STMV de SEQ ID No 4 o No. de Acceso a Genbank M25782 (conductor STMV)
\bullet
\vtcortauna un ácido nucleico que comprende el origen de ensamblaje (OAS) de TMV-U2 desde el nucleótido 5430 al 5505 de SEQ ID No 5 o No. de Acceso a Genbank M34077 ("short" TMV OAS)
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la fitoeno-desaturasa (pds) del tomate que comprende el nucleótido 1021 al 1671 de SEQ ID No 6 o No. de Acceso a Genbank X59948
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 604 al 1058 de STMV de SEQ ID No 4 o Número de Acceso a Genbank M25782 (arrastre de STMV)
\bullet
\vtcortauna un promotor de RNA-polimerasa SP6 que comprende el nucleótido 143 al 124 de No. de Acceso a Genbank X65308
\vskip1.000000\baselineskip
pVE294 que lleva los elementos siguientes enlazados operativamente:
\bullet
\vtcortauna Un promotor de RNA-polimerasa T7 que comprende el nucleótido 402 al 420 de No. de Acceso a Genbank M77811
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 1 al 197 de STMV de SEQ ID No 4 o No. de Acceso a Genbank M25782 (conductor STMV)
\bullet
\vtcortauna un ácido nucleico que comprende el origen de ensamblaje (OAS) de TMV-U2 desde el nucleótido 5441 al 5849 de SEQ ID No 2 o No. de Acceso a Genbank M34077 ("long" TMV OAS)
\bullet
\vtcortauna un fragmento del cDNA de la fitoeno-desaturasa (pds) del tomate que comprende el nucleótido 1021 al 1671 de SEQ ID No 6 o No. de Acceso a Genbank X59948
\bullet
\vtcortauna Un ácido nucleico que comprende la secuencia nucleotídica desde el nucleótido 604 al 1058 de STMV de SEQ ID No 4 o Número de Acceso a Genbank M25782 (arrastre de STMV)
\bullet
\vtcortauna un promotor de RNA-polimerasa SP6 que comprende el nucleótido 143 al 124 de No. de Acceso a Genbank X65308
Se han sintetizado transcritos infectivos quiméricos in vitro utilizando RNA-polimerasa T7 con los DNAs plasmídicos linealizados de los vectores híbridos pVE293 y pVE294 descritos como moldes utilizando procedimientos estándar. Se han sintetizado transcritos de control in vitro sobre DNAs plasmídicos linealizados de los plásmidos precursores de pVE293 y pVE294 sin la inserción del fragmento de pds y sobre DNA plasmídico linealizado del clon infectivo STMV-10 del tipo salvaje.
Los transcritos in vitro se han inoculado mecánicamente sobre hojas de 3 meses de plantas de Petunia hybrida V26 junto con el virus adyuvante TMV-U2.
Las plantas infectadas se han registrado continuamente respecto a desactivación de la pds, lo cual dio como resultado un fenotipo que exhibía blanqueo de las hojas. La infección de las plantas de petunia con TMV/STMV causó la aparición de hojas arrugadas a partir de las ramas infectadas, pero que progresaba rápidamente de modo sistémico en toda la planta. Las plantas sobrevivían a las infecciones y a menudo exhibían fenotipos de recuperación prácticamente carentes de síntomas.
Únicamente las plantas que se han infectado con los vectores híbridos pVE293 y pVE294 que llevaban el fragmento de pds exhibían, además de los síntomas del virus, cambios fenotípicos adicionales. En el caso de las infecciones por TMV/pVE293, las ramas infectadas desarrollaban hojas jóvenes con sectores blanqueados alrededor de los nervios y en el ápice de las hojas. Este blanqueo era progresivo e independiente de la presencia de síntomas de virus. Algunas de las hojas se blanquearon completamente y cambiaban progresivamente a un color prácticamente blanco. Este fenotipo se limitaba a las hojas de las ramas infectadas. En el caso de las infecciones TMV/pVE294, se observó un blanqueo similar de las hojas jóvenes para todas las ramas en desarrollo, pero no para las ramas que llevaban ya yemas terminales de flores. El blanqueo se iniciaba de nuevo alrededor de los nervios y en los ápices de las hojas, pero progresaba rápidamente produciendo patrones de diversificación variable de las hojas. Este fenotipo no se ha observado nunca en inoculaciones de control con virus de tipo salvaje o mutantes de deleción. Por consiguiente, este fenotipo indica la silenciación funcional de la pds en plantas de Petunia hybrida después de infección con los vectores virales híbridos pVE293 y pVE294.
En los análisis de transferencia en gel de RNA con preparaciones de RNA total de manchas verdes y blanqueadas de las hojas superiores de plantas que exhiben un fenotipo FKO no pudo detectarse RNA quimérico alguno del virus STMV y únicamente niveles bajos de RNA del virus adyuvante TMV. Esto indica que la silenciación del gen de pds inducida por el virus en un tejido específico no precisa ir acompañada por niveles elevados de RNA viral.
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<141>
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<150> US SN 09/294022
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<151> 1999-04-20
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<160> 15
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 3684
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma de TNV-A
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<400> 1
1
2
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<210> 2
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<211> 6395
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia el cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma de TMV-U1
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<400> 2
3
4
5
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<210> 3
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<211> 1245
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma de STNV-2
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<400> 3
6
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<210> 4
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<211> 1058
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma de STMV
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<400> 4
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7
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<210> 5
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<211> 6355
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de la secuencia de nucleótidos del genoma de TMV-U2
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<400> 5
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8
9
10
11
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<210> 6
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<211> 2346
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la fitoenodesaturasa (pds) del tomate
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<400> 6
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12
120
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<210> 7
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<211> 7096
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la nitrato-reductasa (nia-2) del tabaco
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<400> 7
13
14
15
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<210> 8
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<211> 1839
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos del cDNA codificante de la nitrito-reductasa (nir-1) del tabaco
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<400> 8
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16
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<210> 9
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<211> 1294
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: DNA de la beta-1,3-glucanasa de Nicotina plumbagenifolia
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<400> 9
17
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<210> 10
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<211> 720
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Región codificante de la proteína fluorescente verde
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<400> 10
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18
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<210> 11
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<211> 1809
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Región codificante de la beta-glucuronidasa
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<400> 11
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19
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<210> 12
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<211> 411
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de un aparte de la región de una variante de TMV-2 que comprende el origen del ensamblaje
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<400> 12
20
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<210> 13
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<211> 198
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de la región conductora de STMV
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<400> 13
21
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<210> 14
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<211> 455
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de la región de arrastre de STMV
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<400> 14
22
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<210> 15
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<211> 1971
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Copia del cDNA de parte del genoma de una variante de TMV-U1, que comprende los genes MP y CP
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<400> 15
23

Claims (45)

1. Un método para la introducción de RNA inhibidor en el citoplasma de células vegetales, reduciendo o anulando dicho RNA inhibidor la expresión de un gen diana en dichas células vegetales, comprendiendo dicho método:
a)
introducir en dichas células vegetales un vector viral de RNA que comprende dicho RNA inhibidor o que comprende un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce dicho RNA inhibidor, en donde dicho RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana en dicha célula vegetal, y en donde dicho vector viral de RNA comprende al menos elementos cis procedentes de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; y
b)
introducir dicho virus adyuvante correspondiente en dicha célula vegetal.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho RNA inhibidor comprende RNA de sentido de al menos 100 nucleótidos de longitud.
3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho RNA inhibidor comprende RNA antisentido de al menos 100 nucleótidos de longitud.
4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al menos 50 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
5. El método de la reivindicación 1 ó 4, en donde dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho vector viral de RNA comprende dichos elementos cis de STMV y en donde dicho virus adyuvante es virus del mosaico del tabaco.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho vector viral de RNA comprende dichos elementos cis procedentes del virus satélite de la necrosis del tabaco y comprende adicionalmente un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco y en donde dicho virus adyuvante es un virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
8. El método de la reivindicación 7, en donde dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del virus satélite de la necrosis del tabaco y dicho virus TNV es TNV-A.
9. El método de la reivindicación 7, en donde dicho virus satélite de RNA es STNV-C y dicho virus TNV es TNV-D.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha planta se selecciona de Nicotiana spp, Oryza sativa, Zea mays, Brassica spp., Gossypium spp., Triticum spp., Arabidopsis spp. o Petunia spp.
11. Un kit para introducción de RNA inhibidor en el citoplasma de una célula vegetal, donde dicho RNA inhibidor reduce o anula la expresión de un gen diana en dicha célula vegetal, comprendiendo dicho kit
a)
un vector viral de RNA que comprende dicho RNA inhibidor o un ácido nucleico quimérico que, cuando se transcribe, produce dicho RNA inhibidor, en donde dicho RNA inhibidor comprende un RNA de sentido o un RNA antisentido que comprende una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos de longitud que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dicho gen diana en dicha célula vegetal, y en donde dicho vector viral de RNA comprende al menos elementos cis procedentes de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa de un virus adyuvante correspondiente y es capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación; y
b)
dicho virus adyuvante correspondiente.
12. El kit de la reivindicación 11, en donde dicho RNA inhibidor comprende RNA de sentido de al menos 100 nucleótidos de longitud.
13. El kit de la reivindicación 11, en donde dicho RNA inhibidor comprende RNA antisentido de al menos 100 nucleótidos de longitud.
14. El kit de la reivindicación 11, en donde dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al menos 50 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
15. El kit de la reivindicación 11 ó 14, en donde dicho RNA inhibidor comprende un tramo complementario de al menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
16. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde dicho vector viral de RNA comprende dichos elementos cis de STMV, y en donde dicho virus adyuvante correspondiente es el virus del mosaico del tabaco.
17. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde dicho vector viral de RNA comprende dichos elementos cis del virus satélite de la necrosis del tabaco y comprende adicionalmente un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco y en donde dicho virus adyuvante correspondiente es un virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
18. El kit de la reivindicación 17, en donde dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del vector satélite de la necrosis del tabaco y dicho virus TNV correspondiente es TNV-A.
19. El kit de la reivindicación 17, en donde dicho virus satélite de RNA es STNV-C y dicho virus TNV es TNV-D.
20. Un método para aislamiento de genes implicados en la determinación de un tramo o fenotipo de una especie de planta, comprendiendo dicho método
a)
identificar una serie de secuencias de ácido nucleico de genes cuya expresión está correlacionada con un rasgo de interés,
b)
crear una genoteca de constructos de silenciación de genes en un vector de RNA viral, comprendiendo dicho vector viral de RNA al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación, y siendo dichos constructos de silenciación de genes ácidos nucleicos que, cuando se transcriben, producen moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo dicho RNA de sentido o antisentido una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con dichas secuencias de ácido nucleico de dichos genes, cuya expresión está correlacionada con dicho rasgo de interés;
c)
infectar una colección de plantas individuales de dicha especie de planta con dicha genoteca de constructos de silenciación de genes y con un virus adyuvante o RNA de virus adyuvante correspondiente, de tal modo que cada planta se infecta con al menos un miembro de dicha genoteca y con dicho virus adyuvante o RNA de virus adyuvante;
d)
identificar una planta en la cual dicho rasgo o fenotipo está alterado, utilizando un ensayo adaptado para dicho rasgo o fenotipo;
e)
aislar dicho gen implicado en la determinación de dicho rasgo o fenotipo en dicha especie de planta, a partir de dicha genoteca basada en la secuencia de nucleótidos a la cual estaba direccionado dicho constructo de silenciación de genes en dicha planta identificada.
21. El método de la reivindicación 20, en donde dicho virus de RNA satélite es el virus satélite del mosaico del tabaco.
22. El método de la reivindicación 21, en donde dicho vector viral de RNA comprende un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco.
23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde dicho virus adyuvante es el virus del mosaico del tabaco.
24. El método de la reivindicación 20, en donde dicho virus satélite de RNA es el virus satélite de la necrosis del tabaco.
25. El método de la reivindicación 24, en donde dicho vector viral de RNA comprende un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco.
26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20, 24 ó 25, en donde dicho virus adyuvante es el virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
27. El método de la reivindicación 26, en donde dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del virus satélite de la necrosis del tabaco y dicho virus TNV es TNV-A.
28. El método de la reivindicación 26, en donde dicho virus satélite de RNA es TNV-C y dicho virus STNV es TNV-D.
29. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, en donde dichos constructos de silenciación de genes comprenden RNA antisentido de al menos 100 nucleótidos de longitud.
30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, en donde dichos constructos de silenciación de genes comprenden RNA de sentido de al menos 100 nucleótidos de longitud.
31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, en donde dichos constructos de silenciación de genes comprenden un tramo complementario de al menos 50 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
32. El método de la reivindicación 31, en donde dichos constructos de silenciación de genes comprenden un tramo complementario de al menos 100 nucleótidos de RNA de sentido y antisentido.
33. El método de la reivindicación 31 ó 32, en donde dichos constructos de silenciación de genes comprenden al menos dos copias de parte de las secuencias de nucleótidos de dicha colección de ácidos nucleicos, encontrándose dichas copias en repetición invertida.
34. Un método para el aislamiento de un ácido nucleico con una función específica a partir de una colección de ácido nucleicos, caracterizándose dicha colección de ácidos nucleicos porque dicha variación en el patrón de expresión de dichos ácidos nucleicos está correlacionada con la variación en un rasgo/fenotipo de una planta que alberga dichos ácidos nucleicos, comprendiendo dicho método los pasos de
a)
crear una genoteca de constructos de silenciación de genes en un vector viral de RNA, comprendiendo dicho vector viral de RNA al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando está provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación, y siendo dichos constructos de silenciación de genes ácidos nucleicos que, cuando se transcriben, producen moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo dicho RNA de sentido o antisentido una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de dichos ácidos nucleicos, estando la variación del patrón de expresión del mismo correlacionada con la variación en un rasgo/fenotipo de una planta que alberga dichos ácidos nucleicos;
b)
infectar una colección de plantas con dicha genoteca de constructos de silenciación de genes y con dicho virus adyuvante o RNA de virus adyuvante correspondiente, de tal modo que cada planta se infecta con al menos un miembro de dicha genoteca y con dicho virus adyuvante o RNA de virus adyuvante;
c)
identificar las plantas con el rasgo o fenotipo alterado utilizando un ensayo adaptado para dicho rasgo o fenotipo.
35. El método de la reivindicación 34, que comprende adicionalmente el paso de aislar dicho ácido nucleico con dicha función específica a partir de dicha planta identificada con el rasgo o fenotipo alterado.
36. Un método para determinación de la función codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos conocida en una planta, conteniendo dicho método
a)
proporcionar un vector viral de RNA, comprendiendo dicho vector viral de RNA al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa a partir de un virus adyuvante correspondiente capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando se provee externamente con las funciones esenciales requeridas para dicha replicación, que comprende un constructo de silenciación de genes que es un ácido nucleico que, cuando se transcribe, produce moléculas de RNA que comprenden RNA de sentido o RNA antisentido o ambos, comprendiendo dicho RNA de sentido o antisentido una secuencia nucleotídica de al menos 100 nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia con dicha secuencia de nucleótidos conocida;
b)
infectar dicha planta con dicho vector viral de RNA y dicho virus adyuvante correspondiente;
c)
identificar un rasgo o fenotipo alterado de dicha planta co-infectada.
37. Un método para identificación de genes esenciales en una planta, que comprende
a)
crear una genoteca de constructos aleatorios de silenciación de genes por clonación de fragmentos aleatorios de DNA o cDNA de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de longitud en una copia de cDNA de un vector viral de RNA que comprende al menos elementos cis de un virus satélite de RNA reconocido por una replicasa procedente de un virus adyuvante correspondiente y capaz de replicarse en una célula vegetal únicamente cuando se ha provisto externamente de las funciones esenciales requeridas para dicha replicación;
b)
infectar una planta con al menos un miembro de dicha genoteca y con dicho virus adyuvante correspondiente;
c)
identificar plantas que desarrollan un fenotipo asociado con el constructo de silenciación de genes.
38. El método de la reivindicación 37, que comprende adicionalmente el paso de aislar el vector viral de RNA del tejido que exhibe dicho fenotipo asociado con el constructo de silenciación de genes.
39. El método de la reivindicación 37, en el cual dicha genoteca se crea por clonación de fragmentos de DNA aleatorios de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de longitud en una copia de cDNA del vector viral de RNA.
40. El método de la reivindicación 37, en donde dicha genoteca se crea por clonación de fragmentos de cDNA aleatorios de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de longitud en una copia de cDNA del vector viral de RNA.
41. El método de la reivindicación 37, en donde dicha genoteca se crea por clonación de fragmentos de cDNA duplicados aleatorios de dicha planta de al menos 100 nucleótidos de longitud en repetición invertida.
42. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, en donde dicho virus satélite de RNA es STMV, y en donde dicho virus adyuvante es el virus del mosaico del tabaco.
43. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, en donde dicho virus satélite de RNA es el virus satélite de la necrosis del tabaco y comprende un origen de ensamblaje del virus del mosaico del tabaco y en donde dicho virus adyuvante es el virus de la necrosis del tabaco que comprende un gen de la proteína de la cubierta del virus del mosaico del tabaco.
44. El método de la reivindicación 42, en donde dicho virus satélite de RNA es la cepa 1 ó 2 del virus satélite de la necrosis del tabaco y dicho virus TNV es TNV-A.
45. El método de la reivindicación 42, en donde dicho virus satélite de RNA es STNV-C y dicho virus TNV es TNV-D.
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