BR102015009386A2

BR102015009386A2 - transformação do milho haplóide

Info

Publication number: BR102015009386A2
Application number: BR102015009386A
Authority: BR
Inventors: Jayakumar P Samuel; Joseph F Petolino; Matthew A Simpson; Ryan C Blue; Tonya L Strange
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2014-04-28
Filing date: 2015-04-27
Publication date: 2016-01-05
Also published as: JP2017513506A; CN106455512A; CA2946987A1; AR101080A1; WO2015167956A1; IL248456A0; KR20160145649A; TW201546283A; MX2016013982A; US20150307889A1; AU2015253536A1; RU2016143352A; EP3136842A1; EP3136842A4

Abstract

transformação do milho haploide. são divulgados métodos para a transformação de uma linhagem celular haploide derivada androgênica com uma nuclease específica do sítio. em algumas modalidades, a linhagem celular haploide derivada androgênica é uma cultura de tecido de planta derivada de micrósporo do milho. além disso, a divulgação fornece um método para a modificação, por exemplo, através da mutação ou direcionamento e integração do dna doador, de um lócus específico de um genoma de tecido haploide ou diaploide. a divulgação fornece ainda métodos para a regeneração de uma planta inteira a partir do tecido haploide ou diaploide que contém a mutação em um lócus genômico específico ou um dna doador integrado dentro de um lócus genômico específico pode ser obtido a partir da divulgação exposta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRANS- FORMAÇÃO DO MILHO HAPLOIDE".

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A divulgação refere-se de uma forma geral às plantas, teci- dos vegetais e linhagens celulares, à regeneração das plantas, e aos métodos para a introdução e/ou rearranjo de ácido nucleico nesse par- ticular. São fornecidos métodos para a transformação, incluindo a in- serção específica do sítio, do DNA exógeno e da edição de genes nas células haploides derivadas androgênicas do milho.

ANTECEDENTES [002] A produção de milho transgênico tipicamente envolve a li- beração de um transgene por meio da co-cultura de Agrobacterium ou bombardeio de micropartículas nos tecidos somáticos diploides tais como a região escutelar do embrião zigótico imaturo. Estes procedi- mentos tipicamente levam aos transgenes integrados que são 'hemi- zigóticos' nos transformantes primários (T0) e segregam na geração da planta T1. O movimento do transgene em outros ambientes genéticos requer a introgressão por meio do retrocruzamento. Consequentemen- te, tais métodos para a liberação de transgenes no genoma de tecidos ou células somáticas diploides e movimentação dos transgenes em outros ambientes genéticos podem ser trabalhosos, de uso intensivo de recursos e demorado. [003] A liberação específica no sítio de transgenes em um ou mais locais predeterminados no genoma (edição de genoma) das plan- tas diploides utilizando polinucleotídeos que codificam as nucleases específicas do sítio, pode apresentar um conjunto adicional de desafi- os devido ao fato de que o genoma diploide possui dois conjuntos cor- respondentes de cromossomas homólogos e estas nucleases especí- ficas do sítio codificadas modificam os sítios alvos através da divagem de um ou ambos os cromossomas de um par homólogo. As mutações decorrentes do reparo imperfeito dos sítios clivados não são incomuns.

Além disso, visto que o processo de reparação genômico se baseia no modelo, o processo de reparo pode utilizar o polinucleotídeo doador de entrada ou a sequência de alelos no cromossoma homólogo corres- pondente como um modelo. Assim, nas células diploides, as sequên- cias alélicas no cromossoma homólogo correspondente podem com- petir com o polinucleotídeo doador de entrada. Quando este processo resulta na reparação indesejável do cromossoma clivado com base no cromossoma homólogo correspondente (em lugar do polinucleotídeo doador), a eficiência da integração direcionada do transgene é dessa maneira reduzida. [004] Vários métodos de transformação de plantas foram descri- tos que resultam na integração aleatória de um transgene no genoma haploide do milho. Estes métodos incluem a integração aleatória de transgenes por meio do tratamento de polietileno glicol de protoplastos haploides (Sukhapinda et al., 1993, Plant Cell Reports, 13:63-68; Jar- dinaud et al., 1995), bombardeamento de micropartículas de estruturas semelhantes a embrião derivadas de micrósporos (Protoplasma, 187:138-143) e a co-cultura de Agrobacterium de embriões maternal- mente derivados (Patente U.S. N- 7.572.635). No entanto, a modifica- ção estável específica do sítio (direcionada) dos locais selecionados no genoma haploide de milho permanece inexplorada. [005] Portanto, existe um desejo com relação a um método de produção estável e modificações direcionadas do genoma haploide no milho. [006] Além disso, em uma célula haploide existe apenas um úni- co conjunto de cromossomas, isto é, nenhuma sequência alélica cor- respondente para cada gene fornecido, o polinucleotídeo doador de entrada é um modelo prontamente disponível para o reparo direciona- do pela homologia sem interferência do cromossoma homólogo cor- respondente que serve como um modelo de reparo e as mutações são facilmente reveladas. Os fenótipos de muitas mutações, por exemplo, silenciados, são recessivos de tal modo que eles não são observados em tecidos diploides, mas podem ser vistos nos haploides. Assim, permanece uma necessidade de composições e métodos para a trans- formação e mutagênese por meio de nucleases específicas do sítio dentro do derivado androgênico, linhagens celulares haploides e a subsequente divagem do DNA genômico haploide, e, opcionalmente, a integração direcionada de um polinucleotídeo doador ou a modifica- ção direcionada de uma sequência específica, por exemplo, mutação, dentro da linhagem celular haploide derivada androgênica, por exem- plo, o genoma haploide de culturas de tecido vegetal derivadas de mi- crósporos. [007] Consequentemente, a presente divulgação fornece novas composições e métodos para a transformação e liberação de nuclea- ses específicas do sítio dentro da linha celular haploide derivada an- drogênica, por exemplo, genoma haploide de culturas de tecido vege- tal derivadas de micrósporos. A aplicação do método de transformação da cultura de tecido vegetal derivada de micrósporo pode resultar em um aumento da eficiência da integração de nuclease específica do sí- tio dentro do genoma da planta, reduzindo assim a necessidade de triagem para o grande número de eventos de transformação e subse- quentemente a redução dos custos e tempo com pessoal associados com a conclusão desses tipos de experiências. Por exemplo, o desen- volvimento da transformação do genoma haploide da planta derivada de micrósporos pode ser utilizado para integrar um DNA doador dentro de um sítio genômico específico e para obter plantas homozigóticas sem os requisitos de triagem dispendiosa e trabalhosa de dezenas de milhares de eventos vegetais. Além disso, o uso de linhagens celula- res haploides androgênicas para a mutagênese direcionada mediada pelas nucleases específicas do sítio leva em conta a identificação e isolamento eficientes das mutações recessivas.

BREVE SUMÁRIO [008] A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta inesperada de um método para a modificação estável e direcionada do genoma haploide através da mutagênese específica do sítio ou inte- gração do transgene doador nos tecidos ou células haploides do milho. O método divulgado de modificação genômica pode ser utilizado com um método para a duplicação de cromossoma para produzir as muta- ções específicas do sítio ou transgenes instantaneamente homozigo- tos em um ambiente genético completamente fixado. Além disso, o método divulgado de modificação genômica estável no tecido ou célu- las haploides, pode ser mais eficiente do que outros métodos no tecido diploide. No tecido diploide, cada sequência genômica em um primeiro cromossoma possui uma sequência alélica correspondente em um se- gundo cromossoma que serve como o modelo em um reparo direcio- nado pela homologia que evoluiu para reparar quaisquer mutações ou transgenes inseridos no primeiro cromossoma. Ao contrário, os tecidos ou células haploides estão ausentes do segundo cromossoma corres- pondente, isto é, falta-lhes o modelo de reparo utilizado pela reparação direcionada pela homologia para remover as mutações ou transgenes recentemente introduzidos. Em alguns casos, o polinucleotídeo doador de entrada pode ser o modelo mais facilmente disponível para o repa- ro direcionado de homologia, assim, ajuda a garantir que uma modifi- cação direcionada desejada seja integrada de forma estável no geno- ma haploide. Adicionalmente, o método descrito também é útil para revelar as mutações de modificação genômica estáveis, por exemplo, silenciadas e inativações de gene, que possuem fenótipos recessivos.

Nos tecidos diploides, os fenótipos recessivos não são evidentes, en- quanto que, tais modificações genômicas direcionadas que levam aos fenótipos recessivos podem ser observadas nos tecidos haploides. [009] Em um aspecto, a divulgação objeto refere-se sujeitas a um método para a modificação de um genoma de milho, o método com- preendendo o fornecimento de tecido haploide competente de trans- formação derivado do micrósporo de milho que compreende um ge- noma de tecido haploide; liberação de um polinucleotídeo que codifica uma nuclease específica do sítio para o tecido haploide competente de transformação; e confirmação de que o genoma de tecido haploide é modificado pela nuclease específica do sítio codificada. Em algumas modalidades, o tecido haploide competente de transformação é o teci- do de embrião ou calo. Nos métodos divulgados, o polinucleotídeo que codifica o polinucleotídeo da nuclease específica do sítio é liberado ao tecido haploide competente de transformação através de um método de transformação de plantas. Em certas modalidades, o método de transformação de plantas inclui qualquer método do grupo consistindo de um método de transformação de bombardeio com micropartículas, um método de transformação de Agrobacterium, um método de trans- formação de fosfato de cálcio, um método de transformação de poli- breno, um método de transformação de eletroporação, um método de transformação de ultra-sons, um método de transformação do lipos- soma, um método de transformação por microinjeção, um método de transformação de DNA exposto, um método de transformação do vetor plasmídeo, um método de transformação do vetor viral, um método de transformação mediado por carboneto de silício, um método de trans- formação por aerossol radiante e um método de transformação de PEG. Em qualquer dos métodos divulgados, o polinucleotídeo nu- clease específico do sítio codifica uma nuclease selecionada incluindo uma nuclease dedo de zinco, nuclease TALEN, meganuclease e nu- clease CRISPR. Em algumas modalidades, a nuclease específica do sítio preferencialmente corta uma região alvo do DNA genômico do genoma do milho haploide. Nas modalidades particulares, dois fila- mentos do DNA genômico são cortados. Em outra modalidade, um único filamento do DNA genômico é cortado. Nas modalidades adicio- nais, qualquer um dos métodos anteriores pode ainda incluir a libera- ção de um polinucleotídeo doador, e integrar de forma estável o poli- nucleotídeo doador no genoma do tecido haploide modificado. Em al- gumas modalidades, cada polinucleotídeo doador compreende pelo menos um domínio que é pelo menos 85 % idêntico à região alvo do DNA genômico do genoma de tecido haploide. Em outras modalida- des, o polinucleotídeo doador compreende dois domínios que são pelo menos 85% idênticos às duas sequências diferentes na região alvo do DNA genômico do genoma de tecido haploide. Nas modalidades adici- onais de qualquer um dos métodos aqui divulgados para a modificação de um genoma de milho haploide, o tecido competente de transforma- ção derivado de micrósporo é de milho que possui características de desempenho de elite. Por exemplo, o tecido competente de transfor- mação derivado de micrósporo pode ser de milho híbrido derivado a partir do cruzamento de uma linhagem de milho elite com uma linha- gem de milho diferente tendo elevada resposta de cultura de micróspo- ro. Adicionalmente, em qualquer um dos métodos divulgados, a con- firmação de que o genoma de tecido haploide é modificado compreen- de a execução de um ensaio baseado na PCR, o ensaio de Southern blot, ensaio de Northern blot, ensaio de expressão de proteína, ensaio de Western blot, ensaio ELISA ou ensaio Next Generation Sequen- cing. [0010] O tecido haploide competente de transformação derivado de um micrósporo de milho de qualquer um dos métodos descritos, pode ser obtido por: colher pendões de milho contendo micrósporo; incubar os pendões em uma temperatura ao redor de 4 a 12 O; isolar as anteras contendo micrósporos dos pendões; cultivar as anteras em meio de cultura de anteras para gerar embriões derivados de micrós- poros; e cultivar os embriões derivados de micrósporos em meio de calo para desse modo gerar o tecido haploide competente de trans- formação derivado de micrósporos. [0011] Em outra modalidade, o tecido haploide que compreende o genoma do tecido haploide modificado pode ser ainda tratado com um agente de duplicação do cromossoma, produzindo assim o tecido de milho di-haploide compreendendo um genoma de milho di-haploide modificado. O tecido de milho di-haploide pode ser cultivado ou rege- nerado em uma planta de milho di-haploide compreendendo o genoma de milho di-haploide modificado. Além disso, tal planta de milho di- haploide é homozigota para a modificação genômica do tecido haploi- de. [0012] Em mais outro aspecto, a divulgação objeto refere-se a um método para a integração direcionada de um doador, o método com- preendendo: fornecer um tecido haploide competente de transforma- ção derivado de micrósporo de milho compreendendo o genoma do tecido haploide; liberar um ou mais polinucleotídeos doadores e um ou mais polinucleotídeos que codificam as nucleases específicas do sítio ao tecido haploide competente de transformação; e confirmar que o um ou mais polinucleotídeos doadores estão integrados no genoma de tecido haploide e o genoma de tecido haploide é assim modificado. Em algumas modalidades, o tecido haploide competente de transformação é o tecido de embrião ou calo. Nestes métodos, a liberação de um ou mais polinucleotídeos doadores e o um ou mais polinucleotídeos que codificam as nucleases específicas do sítio ao tecido haploide compe- tente de transformação, pode ser realizada através de um método de transformação de plantas. Em algumas modalidades, o método de transformação de plantas inclui um método de transformação por bombardeio de micropartículas, um método de transformação de Agrobacterium, um método de transformação de fosfato de cálcio, um método de transformação de polibreno, um método de transformação de eletroporação, um método de transformação de ultra-som, um mé- todo de transformação de lipossoma, um método de transformação de microinjeção, um método de transformação de DNA exposto, um mé- todo de transformação de vetor de plasmídeo, um método de trans- formação de vetor viral, um método de transformação mediado por carboneto de silício, um método de transformação radiante de aeros- sol, e um método de transformação de PEG. Nas modalidades adicio- nais, a polinucleotídeo nuclease específico do sítio codifica uma nu- clease selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco, nuclease TALEN, meganuclease e nuclease CRISPR. Em cer- tas modalidades, o um ou mais polinucleotídeos codificam as nuclea- ses específicas do sítio que preferencial mente cortam uma região alvo de DNA genômico do genoma de tecido haploide. Em outras modali- dades, qualquer um dos métodos aqui descritos ainda inclui uma inte- gração estável do um ou mais polinucleotídeos doadores dentro do genoma de tecido haploide. Por exemplo, o um ou mais polinucleotí- deos doadores podem integrar dentro da região alvo por meio do repa- ro direcionada pela homologia ou por meio da de reparação homóloga da união final. Em qualquer um dos métodos aqui divulgados para mo- dificar um genoma de milho haploide, o tecido competente de trans- formação derivado de micrósporo é de milho tendo características de desempenho de elite. Por exemplo, o tecido competente de transfor- mação derivado de micrósporo é de milho híbrido derivado do cruza- mento de uma linhagem de milho elite com uma linhagem de milho di- ferente tendo elevada resposta de cultura de micrósporo. Em qualquer um dos métodos aqui divulgados para a modificação de um genoma de milho haploide, o genoma de tecido haploide inclui a confirmação da integração no genoma de tecido haploide compreendendo a execu- ção de um ensaio à base de PCR, um ensaio de Southern blot, um en- saio de Northern blot, um ensaio de expressão da proteína, um ensaio de Western blot, um ensaio ELISA ou ensaio um ensaio Next Genera- tion Sequencing. Em qualquer uma das modalidades divulgadas, o um ou mais polinucleotídeos doadores no genoma de tecido haploide po- de transmitir (por exemplo, codifica um gene que, quando expresso, fornece o milho tendo) um traço agronômico. Por exemplo, o traço agronômico pode ser selecionado a partir de um traço de resistência a inseticida, um traço de tolerância a herbicida, um traço de eficiência de uso de nitrogênio, um traço de eficiência de uso de água, um traço de qualidade nutricional, um traço de ligação ao DNA, e um traço de mar- cador selecionável. Em qualquer uma das modalidades divulgadas, o polinucleotídeo doador pode ser expresso de forma estável dentro da planta de milho. Além disso, qualquer um dos métodos divulgados pelo qual a integração de um polinucleotídeo doador no genoma de tecido haploide pode ainda incluir o tratamento do tecido haploide com um agente de duplicação do cromossoma para produzir um tecido haploi- de de duplicação que compreende e é homozigoto com relação ao po- linucleotídeo doador integrado. [0013] Em outro aspecto, a divulgação objeto refere-se a uma planta que compreende o polinucleotídeo doador. Em uma modalida- de, a planta compreende um genoma haploide. Em uma outra modali- dade, a planta compreende um genoma di-haploide. Tais plantas po- dem ser regeneradas a partir do tecido que compreende o genoma de tecido haploide modificado ou o genoma de tecido di-haploide modifi- cado de qualquer um dos métodos aqui divulgados. [0014] Em outro aspecto, a divulgação objeto refere-se a um mé- todo para a introdução de uma mutação dentro de um genoma haploi- de de milho, o método compreendendo: fornecer o tecido haploide competente de transformação derivado de micrósporo de milho que compreende um genoma de tecido haploide; liberar um polinucleotídeo que codifica uma nuclease específica do sítio ao tecido haploide com- petente de transformação; e confirmar que o genoma de milho haploi- de compreende uma mutação introduzida pelos polinucleotídeos nu- cleases específicos do sítio codificados. O tecido haploide competente de transformação pode ser um tecido de embrião ou calo. O um ou mais polinucleotídeos que codificam nucleases específicas do sítio po- dem ser liberados ao tecido haploide competente de transformação através de um método de transformação de plantas. O método de transformação de plantas pode ser selecionado de um método de transformação com bombardeio de micropartículas, um método de transformação de Agrobacterium, um método de transformação de fos- fato de cálcio, um método de transformação de polibreno, um método de transformação de eletroporação, um método de transformação de ultra-som, um método de transformação de lipossoma, um método de transformação por microinjeção, um método de transformação de DNA exposto, um método de transformação de vetor plasmídeo, um método de transformação de vetor viral, um método de transformação mediado por carboneto de silício, um método de transformação radiante de ae- rossol, e um método de transformação de PEG. Em qualquer um dos métodos divulgados, o polinucleotídeo nuclease específico do sítio co- difica uma nuclease que inclui uma nuclease dedo de zinco, uma nu- clease TALEN, uma meganuclease e uma nuclease CRISPR. O poli- nucleotídeo nuclease específico do sítio codificado pode ser aquele que preferencialmente corta o DNA genômico em uma região alvo do genoma de milho haploide. Em qualquer um dos métodos divulgados, o tecido competente de transformação derivado de micrósporo pode ser de milho tendo características de desempenho de elite. Por exem- plo, o tecido competente de transformação derivado de micrósporo pode ser de milho híbrido derivado do cruzamento de uma linhagem de milho elite com uma linhagem de milho diferente tendo elevada resposta de cultura de micrósporo. Em qualquer dos métodos divulga- dos, a confirmação de que o um ou mais polinucleotídeos que codifi- cam as nucleases específicas do sítio introduzem uma mutação no genoma pode ser realizada através de um ensaio baseado na PCR, um ensaio de Southern blot, um ensaio de Northern blot, um ensaio de expressão da proteína, um ensaio de Western blot, um ensaio ELISA e um ensaio Next Generation Sequencing. Em qualquer um dos méto- dos divulgados, a confirmação de que o genoma de milho haploide é modificado compreende a execução de um ensaio baseado na PCR, um ensaio de Southern blot, um ensaio de Northern blot, um ensaio de expressão da proteína, um ensaio de Western blot, um ensaio ELISA, e um ensaio Next Generation Sequencing. A mutação introduzida de acordo com o método divulgado pode infra-regular a expressão de um gene endógeno. Em algumas modalidades, a infra-regulação de um gene endógeno resulta em uma via metabólica alterada. Além disso, qualquer um dos métodos divulgados pelo qual integram um polinucle- otídeo doador no genoma de tecido haploide, pode ainda incluir o tra- tamento do tecido haploide com um agente de duplicação do cromos- soma para produzir um tecido haploide dobrado que compreende e é homozigoto para o polinucleotídeo doador integrado. [0015] Em um aspecto, a divulgação objeto refere-se a uma planta que compreende a mutação introduzida. Em algumas modalidades, a planta compreende um genoma de tecido haploide. Em outras modali- dades, a planta compreende um genoma de tecido di-haploide. Tais plantas podem ser regeneradas a partir do tecido haploide modificado ou do tecido di-haploide produzido de acordo com qualquer dos méto- dos aqui divulgados. [0016] Em um aspecto, a divulgação objeto refere-se a um método para a introdução de um ou mais polinucleotídeos que codificam as nucleases específicas do sítio em uma linhagem celular haploide deri- vada de androgênicos. Em algumas modalidades, o método compre- ende: fornecer uma linhagem celular haploide derivada androgênica competente de transformação; liberar o um ou mais polinucleotídeos que codificam uma nuclease específica do sítio à linhagem celular ha- ploide derivada androgênica competente de transformação; e confir- mar que o um ou mais polinucleotídeos que codificam uma nuclease específica do sítio modificam o genoma da linhagem celular haploide derivada androgênica. Em uma modalidade, a linhagem celular haploi- de derivada androgênica é uma linhagem celular de micrósporo haplo- ide. Em uma outra modalidade, a linhagem celular de micrósporo ha- ploide é propagada em um tecido de embrião ou calo. Em uma outra modalidade, o método compreende a liberação de um ou mais polinu- cleotídeos que codificam as nucleases específica do sítio à linhagem celular haploide derivada androgênica através de um método de trans- formação de plantas. Os polinucleotídeos podem ser liberados por meio de um método de transformação de planta tal como, por exem- plo, um método de transformação biolística, um método de transfor- mação de Agrobacterium, um método de transformação de fosfato de cálcio, um método de transformação de polibreno, um método de transformação de eletroporação, um método de transformação de ul- tra-som, um método de transformação de lipossoma, um método de transformação por microinjeção, um método de transformação de DNA exposto, um método de transformação de vetor plasmídeo, um método de transformação de vetor virai, um método de transformação mediado por carboneto de silício, um método de transformação radiante de ae- rossol e um método de transformação de PEG. Cada um dos polinu- cleotídeos nucleases específicos do sítio pode codificar uma nuclease selecionada de uma nuclease dedo de zinco, nuclease TALEN, me- ganuclease e nuclease CRISPR. Em mais outra modalidade, o método compreende a liberação de um ou mais polinucleotídeos que codificam uma nuclease específica do sítio que preferencialmente modifica uma região alvo de DNA genômico do genoma. Nas modalidades particula- res, um único filamento de dois filamentos da região alvo de DNA ge- nômico é cortado. Em outra modalidade, um único filamento da região alvo de DNA genômico é cortado. Em qualquer um dos métodos divul- gados que inclui a liberação de um ou mais polinucleotídeos doadores, o um ou mais polinucleotídeos doadores podem ser integrados de for- ma estável no genoma modificado. Em certas modalidades, cada poli- nucleotídeo doador compreende pelo menos um domínio que é pelo menos 85 % idêntico à região alvo de DNA genômico do genoma. Em outras modalidades, cada polinucleotídeo doador compreende dois domínios que são pelo menos 85 % idênticos a duas sequências dife- rentes na região alvo de DNA genômico do genoma. O polinucleotídeo doador pode integrar dentro da região alvo de DNA genômico por meio do reparo direcionado pela homologia ou por meio do reparo de união final não homólogo. Em outra modalidade, a confirmação de que o po- linucleotídeo que codifica a nuclease específica do sítio modifica o ge- noma é executada através de um ensaio à base de PCR, um ensaio de Southern blot, ensaio de Northern blot, ensaio de expressão de pro- teína, ensaio de Western blot, ensaio ELISA ou ensaio Next Genera- tion Sequencing. Em outra modalidade, a confirmação de que o um ou mais polinucleotídeos doadores está integrado na região alvo de DNA genômico compreende a execução de um ensaio baseado na PCR, um ensaio de Southern blot, um ensaio de Northern blot, um ensaio de expressão de proteína, um ensaio de Western blot, um ensaio ELISA, e um ensaio Next Generation Sequencing. [0017] Em mais outras modalidades, qualquer um dos métodos divulgados pode ainda compreender a obtenção de tecido haploide que compreende o genoma modificado da linhagem celular haploide derivada androgênica; o tratamento do tecido haploide com um agente de duplicação de cromossoma; a produção de tecido di-haploide com- preendendo um genoma di-haploide modificado; e o cultivo do tecido di-haploide em uma planta di-haploide compreendendo o genoma di- haploide modificado. Em uma modalidade adicional, a linhagem celular haploide derivada androgênica é obtida de uma planta de milho. Em qualquer uma das modalidades divulgadas, o genoma diaploide modi- ficado resulta de uma divagem do genoma.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0018] A Figura 1 fornece um mapa de plasmídeo de pDAB111879. Este mapa de plasmídeo é de um constructo de ZFN para a modificação do genoma direcionada. [0019] A Figura 2 fornece um mapa de plasmídeo de pDAB111845. Este mapa de plasmídeo é de um constructo de doador para a integração direcionada em protoplastos haploides. [0020] A Figura 3 fornece um mapa de plasmídeo de pDAB118783. Este mapa de plasmídeo é de um constructo de doador para uma integração aad-1 direcionada dentro de um lócus genômico específico de células de calo haploides. [0021] A Figura 4 fornece uma ilustração de alinhamentos de se- quência que mostra as inserções e deleções no sítio de divagem PPL1 demonstrando a mutagênese direcionada após o bombardeio de calo haploide. As sequências são fornecidas no alinhamento para exemplificar as deleções e inserções como SEQ ID NO: 33 a SEQ ID

NO: 45. Essas sequências alteradas são comparadas com a SEQ ID NO: 32, a qual fornece a sequência alvo de DNA genômico em que as nucleases dedo de zinco foram projetadas para ligar e clivar. [0022] A Figura 5 fornece um histograma de núcleos de calo sub- metido a diploide após o tratamento de colquicina que demonstra a duplicação eficaz do cromossoma.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0023] A presente divulgação fornece um método para a modifica- ção de um genoma de milho no tecido haploide competente de trans- formação derivado de um micrósporo de milho. O método inclui a libe- ração de um ou mais polinucleotídeos que codificam as nucleases es- pecífica do sítio ao tecido haploide competente de transformação, e a confirmação de que a uma ou mais nucleases específicas do sítio co- dificadas modificam o genoma de milho haploide. [0024] As linhagens celulares derivadas androgênicas podem ser mantidas como uma cultura de tecido vegetal derivada de micrósporo. A cultura de tecido vegetal derivada de micrósporo resulta em uma cul- tura de tecido haploide que contém apenas um conjunto de cromos- somas. As linhagens celulares haploides derivadas androgênicas são geradas a partir dos tecidos androgênicos tais como micrósporos e pólen, ou tecidos esporofíticos (por exemplo, embriões haploides pa- ternos), e podem ser mantidas como uma cultura de suspensão ou protoplasto de embrião ou calo. No milho, relatos de produção da plan- ta androgênese e haploide remontam à década de 1970 (Ku et al 1978, Proc. Symp. Plant Tissue Cult. 35-42), no entanto, as frequên- cias de baixa produção de embriões androgênicos, assim como as di- ficuldades associadas com a regeneração vegetal e duplicação de cromossoma impede o uso geral de cultura vegetal derivada de ante- ras ou micrósporo na reprodução aplicada. Muitos destes problemas fundamentais foram superados com o desenvolvimento de idioplasma altamente responsivo (Petolino et al., 1988, Theor. Appl. Genet. 76:157-159) e técnicas in vitro para a duplicação de cromossoma (Wan et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 77:889-892), embora no milho, na sua maior parte, esta técnica tem sido largamente abandonada. [0025] A invenção também fornece um método para integração direcionada de um polinucleotídeo doador em um genoma de milho haploide no tecido haploide competente de transformação derivado de um micrósporo de milho. O método inclui a liberação de um ou mais polinucleotídeos doadores e um ou mais polinucleotídeos que codifi- cam as nucleases específica do sítio ao tecido haploide competente de transformação; e a confirmação de que o um ou mais dos polinucleotí- deos doadores estão integrados no genoma haploide de milho. [0026] A invenção fornece ainda um método para a introdução de uma mutação dentro de um genoma de milho haploide no tecido ha- ploide competente de transformação derivado de um micrósporo de milho; para a liberação de polinucleotídeos que codificam uma ou mais nucleases específica do sítio ao tecido haploide competente de trans- formação; e para a confirmação de que a uma ou mais nucleases es- pecíficas do sítio codificadas modificam o genoma de milho haploide, em que o genoma de milho haploide é submetido a mutação pela di- vagem como indicado pela presença de inserções ou deleções dentro do DNA genômico. [0027] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método para a modificação do genoma da linhagem celular haploide derivada andro- génica competente de transformação. O método inclui a liberação do um ou mais polinucleotídeos que codificam as nucleases específicas do sítio à linhagem celular haploide derivada androgênica competente de transformação, e confirmação de que as nucleases específicas do sítio codificadas modificam o genoma da linhagem celular haploide de- rivada androgênica, em que o genoma da linhagem celular haploide derivada androgênica é modificado pela divagem.

Definições [0028] A não ser que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que como normalmente compreendido por uma pessoa de habilidade práti- ca na técnica à qual esta divulgação se refere. Em caso de conflito, o presente pedido incluindo as definições irá regular. A não ser que de outra maneira requerida pelo contexto, os termos singulares devem incluir a pluralidade e os termos no plural devem incluir o singular. To- das as publicações, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade para todos os pro- pósitos, como se cada publicação ou pedido de patente individual fos- se específica e individualmente indicado para ser incorporado por refe- rência, a não ser que apenas as seções específicas de patentes ou publicações de patente sejam indicadas para serem incorporadas por referência. [0029] A fim de esclarecer ainda mais esta divulgação, os seguin- tes termos, abreviaturas e definições são fornecidas. [0030] Como aqui utilizados, os termos "compreende", "compreen- dendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação destes, se destinam a serem não exclusivos ou ilimitados. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um pro- cesso, um método, um artigo, ou um mecanismo que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitado a apenas es- ses elementos, mas podem incluir outros elementos que não expres- samente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou mecanismo. Além disso, a não ser que expressa- mente mencionado ao contrário, "ou" refere-se a um ou inclusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B verdadeiro (ou pre- sente), e tanto A quanto B são verdadeiros (ou presentes). [0031] Da mesma forma, os artigos indefinidos "um" e "uma" pre- cedendo um elemento ou componente de uma modalidade da divulga- ção são destinados a serem não restritivos em relação ao número de casos, isto é, as ocorrências do elemento ou componente. Portanto "um" ou "uma" deve ser lido para incluir um ou pelo menos um, e a forma singular da palavra do elemento ou componente também inclui o plural a não ser que o número seja obviamente concebido para ser singular. [0032] O termo "invenção" ou "presente invenção" como aqui utili- zado é um termo não limitativo e não se destina a referir-se a qualquer modalidade única da invenção em particular, mas engloba todas as possíveis modalidades como divulgadas no pedido. [0033] Como aqui utilizado, o termo "planta" inclui uma planta intei- ra e qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma planta. O termo "partes da planta" inclui qualquer parte de uma planta, incluindo, por exemplo, e sem limitação: sementes (incluindo as sementes madu- ras e as sementes imaturas); um corte da planta; uma célula vegetal; uma cultura de células vegetais; um órgão da planta (por exemplo, pó- len, embriões, flores, frutos, brotos, folhas, raízes, caules e explantes).

Um tecido vegetal ou órgão da planta pode ser uma semente, proto- plastos, calos, ou qualquer outro grupo de células vegetais que é or- ganizado dentro de uma unidade estrutural ou funcional. Uma célula vegetal ou cultura de tecidos pode ser capaz de regenerar uma planta tendo as características fisiológicas e morfológicas da planta da qual a célula ou tecido foi obtido, e de regenerar uma planta tendo substanci- almente o mesmo genótipo como a planta. Ao contrário, algumas célu- las vegetais não são capazes de ser regeneradas para produzir plan- tas. As células que podem ser regeneradas em uma célula vegetal ou cultura de tecido podem ser embriões, protoplastos, células meriste- máticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, seda, flo- res, grãos, espigas, sabugos, palhas ou talos. [0034] Partes da planta incluem partes cultiváveis e partes úteis para a propagação de plantas descendentes. As partes da planta úteis para a propagação inclui, por exemplo, e sem limitação: semente; fru- ta; um corte; uma muda; um tubérculo; e um rizoma. Uma parte culti- vável de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, inclu- indo, por exemplo, e sem limitação: flor; pólen; mudas; tubérculo; fo- lha; caule; fruta; semente; e raiz. [0035] Uma célula vegetal é a unidade estrutural e fisiológica da planta, e inclui as células de protoplasto sem uma parede celular e cé- lulas vegetais com uma parede celular. Uma célula vegetal pode estar na forma de uma única célula isolada, ou de um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula cultivada), e pode ser parte de uma unidade organizada superior (por exemplo, um tecido vegetal, um órgão vegetal, e uma planta). Assim, uma célula vegetal pode ser um protoplasto, uma célula produtora de gametas, ou uma célula ou um conjunto de células que pode regenerar em uma planta integral.

Como tal, uma semente, que compreende múltiplas células vegetais e é capaz de regenerar em uma planta completa, é aqui considerada uma "célula vegetal", nas modalidades. [0036] Como aqui utilizado, o termo "isolado" refere-se a um com- ponente biológico (incluindo um ácido nucleico ou proteína) que foi se- parado, produzido à parte de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente naturalmente ocorre (isto é, ou- tros DNA e RNA cromossômicos e extra-cromossômicos, e proteínas). [0037] Como aqui utilizado, o termo "purificado" em referência às moléculas de ácido nucleico não requer uma pureza absoluta (tal co- mo uma preparação homogênea); em vez disso, representa uma indi- cação de que a sequência é relativamente mais pura do que no seu ambiente celular nativo (em comparação ao nível natural, este nível deverá ser pelo menos de 2 a 5 vezes maior, por exemplo, em termos de níveis de concentração ou de expressão genética). As moléculas de DNA reivindicadas obtidas diretamente a partir do DNA total ou do RNA total. Além disso, os clones de cDNA não são de ocorrência natu- ral, mas de preferência são obtidos através da manipulação de uma substância parcialmente purificada de ocorrência natural (RNA men- sageiro). A construção de uma biblioteca de cDNA a partir do mRNA envolve a criação de uma biblioteca. Os clones de cDNA individuais podem ser produzidos a partir da biblioteca através da seleção clonal das células que transportam a biblioteca de cDNA. Assim, o processo que inclui a construção de uma biblioteca de cDNA a partir do mRNA e seleção dos clones de cDNA distintos produz uma purificação de apro- ximadamente 106 vezes da mensagem nativa. Da mesma forma, uma sequência de DNA do promotor ou gene pode ser clonada em um plasmídeo. Um tal clone não é de ocorrência natural, mas sim é prefe- rivelmente obtido através da manipulação de uma substância parcial- mente purificada de ocorrência natural tal como uma biblioteca de DNA genômico. Assim, a purificação de pelo menos uma ordem de magnitude, de preferência duas ou três ordens, e mais preferivelmente quatro ou cinco ordens de grandeza é favorecida nestas técnicas. [0038] Similarmente, sintética representa uma indicação de que uma alteração química ou funcional na sequência de DNA do compo- nente ocorreu. Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "sin- tetizadas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas geradas pela amplificação da PCR ou por métodos recombinantes, em que um polinucleotídeo purificado é ainda mais modificado através da incorpo- ração dentro de um plasmídeo ou vetor. O termo "sintético" também abrange os ácidos nucleicos e as proteínas preparadas por métodos de DNA recombinante em uma célula hospedeira (por exemplo, célu- las vegetais), assim como moléculas de ácido nucleico quimicamente sintetizadas, proteínas e peptídeos. [0039] Na engenharia de um gene para a expressão nas plantas, a polarização dos códons da plantas hospedeiras prospectivas pode ser determinada, por exemplo, através da utilização das bases de dados de sequência de DNA publicamente disponíveis para encontrar infor- mações sobre a distribuição de códon dos genomas vegetais ou a pro- teína que codifica as regiões de vários genes das plantas. Assim que uma sequência de DNA otimizada (por exemplo, uma planta otimiza- da) foi concebida em papel, ou em silício, as moléculas de DNA reais podem ser sintetizadas no laboratório para corresponder na sequência precisamente com a sequência concebida. Tais moléculas da molécula de ácido nucleico sintética podem ser clonadas e de outra forma mani- puladas exatamente como se elas fossem derivadas de fontes naturais ou nativas. [0040] Como aqui utilizado, os termos "polinucleotídeo", "ácido nu- cleico" e "molécula de ácido nucleico" são utilizados de modo trocável, e podem incluir um ácido nucleico singular; ácidos nucleicos plurais; um fragmento de ácido nucleico, variante, ou seus derivados; e cons- tructo de ácido nucleico (por exemplo, o RNA mensageiro (mRNA) e o DNA plasmídico (pDNA)). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeo de uma sequência de cDNA de comprimento total, ou um fragmento deste, incluindo as sequências 5' e/ou 3' não transladadas e as sequências de codificação. Um polinu- cleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de qualquer polir- ribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, o qual pode incluir ribo- nucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos não modificados ou ribonu- cleotídeos ou desoxirribonucleotídeos modificados. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de DNA de filamento único e duplo; DNA que é uma mistura de regiões de fila- mento único e duplo; RNA de filamento único e duplo; e RNA que é uma mistura de regiões de filamento único e duplo. As moléculas hí- bridas compreendendo DNA e RNA podem ser de filamento único, fi- lamento duplo, ou uma mistura de regiões de filamento único e duplo.

Os termos anteriores incluem as formas química, enzimática e meta- bolicamente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico. [0041] Fica compreendido que um DNA específico também se re- fere ao seu complemento, cuja sequência é determinada de acordo com as regras de pareamento de base de desoxirribonucleotídeo. [0042] Como aqui utilizado, o termo "gene" refere-se a um ácido nucleico que codifica um produto funcional (RNA ou polipeptí- deo/proteína). Um gene pode incluir sequências reguladoras que pre- cedem (sequências de não codificação 5') e/ou após (sequências de não codificação 3') a sequência que codifica o produto funcional. [0043] Como aqui utilizado, o termo "sequência de codificação" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma se- quência de aminoácido específica. Uma "sequência reguladora" refere- se a uma sequência de nucleotídeo localizada a montante (por exem- plo, sequências de não codificação 5'), dentro, ou a jusante (por exemplo, sequências de não codificação 3') de uma sequência de co- dificação, que influenciam a transcrição, o processamento de RNA ou a estabilidade ou a translação da sequência de codificação associada.

As sequências reguladoras incluem, por exemplo, e sem limitação: promotores; sequências líder de translação; íntrons; sequências de reconhecimento da poliadenilação; sítios de processamento de RNA; sítios de ligação efetora; e estruturas de alça penducular. [0044] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" inclui um poli- peptídeo singular, polipeptídeos plurais, e seus fragmentos. Este termo refere-se a uma molécula compreendida de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer ca- deia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento ou tamanho específico do produto. Consequentemente, os peptídeos, os dipeptídeos, os tripeptídeos, os oligopeptídeos, as proteínas, a cadeia de aminoácido, e qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos dentro da definição de "polipeptídeo" e os termos anteri- ores são utilizados aqui alternadamente com "polipeptídeo". Um poli- peptídeo pode ser purificado a partir de uma fonte biológica natural ou produzido pela tecnologia recombinante, mas um polipeptídeo especí- fico não é necessariamente transladado a partir de um ácido nucleico específico. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer modo apro- priado, incluindo, por exemplo, e sem limitação, pela síntese química. [0045] Como aqui utilizado, o termo "nativo" refere-se à forma de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo que é encontrado na nature- za com as suas próprias sequências reguladoras, se presentes. O termo "endógeno" refere-se à forma nativa do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo na sua localização natural no organismo ou no genoma do organismo. [0046] Ao contrário, o termo "heterólogo" refere-se a um polinucle- otídeo, do gene ou polipeptídeo que não é normalmente encontrado na sua localização no organismo de referência (hospedeiro). Por exem- plo, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que é normaimente encontrado no organismo de referência em uma localiza- ção genômica diferente. A título de outro exemplo, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que normalmente não se en- contra no organismo de referência. Um organismo hospedeiro que compreende um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo po- de ser produzido através da introdução do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo no organismo hospedeiro. Nos exemplos par- ticulares, um polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência de codificação nativa, ou sua parte, que é reintroduzida no organismo de origem de uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo cor- respondente. Nos exemplos particulares, um gene heterólogo compre- ende uma sequência de codificação nativa, ou uma parte desta, que é reintroduzida no organismo de origem de uma forma que é diferente do gene nativo correspondente. Por exemplo, um gene heterólogo po- de incluir uma sequência de codificação nativa que é uma parte de um gene quimérico incluindo as regiões reguladoras não nativas, que é reintroduzida no hospedeiro nativo. Nos exemplos particulares, um po- lipeptídeo heterólogo é um polipeptídeo nativo que é reintroduzido em um organismo de origem de uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente. [0047] Um gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser um gene ou polipeptídeo que compreende um polipeptídeo funcional ou uma se- quência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcional que é fundido a outros genes ou polipeptídeo para produzir um polipeptídeo quimérico ou de fusão, ou um gene que o codifica. Os genes e proteí- nas de modalidades particulares incluem especificamente as sequên- cias de comprimento total exemplificadas e as partes, segmentos, fra- gmentos (incluindo fragmentos contíguos e deleções internas e/ou terminais em comparação com as moléculas de comprimento total), variantes, mutantes, quiméricos, e fusões destas sequências. [0048] "Endógeno" refere-se aos materiais que se originam de dentro do organismo ou célula. [0049] "Exógeno" refere-se aos materiais que se originam de fora do organismo ou célula. Como aqui utilizado, exógeno pretende referir- se a qualquer ácido nucleico de uma fonte diferente da célula ou tecido receptor, independente do fato de que um ácido nucleico semelhante (mas não igual) já pode estar presente na célula ou tecido receptor. [0050] Como aqui utilizado, o termo "modificação" pode referir-se a uma alteração em um polinucleotídeo de referência particular que re- sulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Al- ternativamente, o termo "modificação" pode referir-se a uma alteração em um polinucleotídeo de referência que resulta na atividade aumen- tada ou acentuada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência, assim como uma alteração em um polipeptídeo de refe- rência que resulta em atividade aumentada ou acentuada do polipeptí- deo de referência. Quando utilizado para descrever a atividade de uma nuclease específica do sítio, a modificação pode significar a divagem de uma parte da molécula de referência (por exemplo, uma divagem de DNA genômico; uma divagem de filamento duplo ou filamento úni- co do DNA genômico). As alterações tais como mencionadas anteri- ormente pode resultar em, por exemplo, e sem limitação: deleção de uma parte da molécula de referência; mutação da molécula de refe- rência (por exemplo, através da mutagênese espontânea, através da mutagênese aleatória, através da mutagênese provocada por genes mutantes, e através da mutagênese por transpósons); substituição de uma parte da molécula de referência; inserção de um elemento na mo- lécula de referência; expressão de infra-regulação da molécula de re- ferência; alteração da localização celular da molécula de referência; alteração do estado da molécula de referência (por exemplo, através de metilação de um polinucleotídeo de referência, e através da fosfori- lação e ubiquitinação ou de um polipeptídeo de referência); remoção de um co-fator da molécula de referência; introdução de um RNA/DNA anti-sentido que direciona a molécula de referência; introdução de um RNA/DNA de interferência que direciona a molécula de referência; modificação química da molécula de referência; modificação covalente da molécula de referência; irradiação da molécula de referência com radiação UV ou raios-X; recombinação homóloga que altera a molécu- la de referência; recombinação mitótica que altera a molécula de refe- rência; substituição do promotor da molécula de referência; e/ou com- binações de qualquer um dos anteriores. [0051] A direção na determinação de que os nucleotídeos ou resí- duos de aminoácido podem ser modificados em um exemplo específi- co pode ser encontrada através da comparação da sequência do poli- nucleotídeo ou polipeptídeo de referência com aquela de polinucleotí- deos ou polipeptídeos homólogos (por exemplo, levedura homóloga ou bacteriana), e maximização do número de modificações produzidas nas regiões de elevada homologia (regiões conservadas) ou sequên- cias de consenso. [0052] O termo "promotor" refere-se a uma sequência de DNA ca- paz de controlar a expressão de uma sequência de codificação de áci- do nucleico ou RNA funcional. Nos exemplos, a sequência de codifica- ção controlada está localizada 3' de uma sequência promotora. Um promotor pode ser derivado na sua totalidade de um gene nativo, um promotor pode ser compreendido de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou um promotor pode ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É compreen- dido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores po- dem direcionar a expressão de um gene em diferentes tipos de tecido ou célula, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em res- posta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Exemplos de todos os promotores anteriores são conhecidos e utilizados na técnica para controlar a expressão de ácidos nucleicos heterólogos. Os pro- motores que direcionam a expressão de um gene na maior parte dos tipos de células na maioria das vezes são comumentes referidos como "promotores constitutivos". Além disso, embora aqueles da técnica te- nham (em muitos casos sem sucesso) tentado delinear as fronteiras exatas das sequências reguladoras, veio a ser compreendido que os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade idêntica de promotor. A atividade de promotor de um ácido nucleico particular pode ser experimentada utilizando técnicas familiares para aqueles da técnica. [0053] O termo "operativamente ligado" refere-se a uma associa- ção de sequências de ácido nucleico em um único ácido nucleico, em que a função de uma das sequências de ácido nucleico é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado com uma sequência de codificação quando o promotor é capaz de efetuar a ex- pressão desta sequência de codificação (por exemplo, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Uma se- quência de codificação pode ser operativamente ligada a uma sequên- cia reguladora em uma orientação de sentido ou anti-sentido. [0054] O termo "expressão" ou "que expressa", como aqui utiliza- do, pode referir-se à transcrição e acúmulo estável de RNA sentido (mRNA) ou anti-sentido a partir de um DNA. A expressão também po- de se referir à translação do mRNA em um polipeptídeo. Como aqui utilizado, o termo "super-expressão" refere-se à expressão que é mais elevada do que a expressão endógena do mesmo gene ou um gene relacionado. Assim, um gene heterólogo é "super-expresso" se a sua expressão for mais elevada do que aquele de um gene endógeno comparável. [0055] Como aqui utilizado, o termo "transformação" ou "que trans- forma" refere-se à transferência e integração de um ácido nucleico ou seu fragmento em um organismo hospedeiro, o que resulta em heran- ça geneticamente estável. Os organismos hospedeiros contendo um ácido nucleico de transformação são referidos como organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados". Os métodos co- nhecidos de transformação incluem, por exemplo: a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes; transfor- mação de fosfato de cálcio; transformação de polibreno; fusão de pro- toplasto; eletroporação; métodos de ultra-som (por exemplo, sonopo- ração); transformação de lipossoma; microinjeção; transformação com DNA exposto; transformação com vetores plasmídeos; transformação com vetores virais; transformação biolística (bombardeio com micro- partículas); transformação mediada por carboneto de silício WHIS- KERS; aerossol radiante; e transformação mediada por PEG. [0056] Como aqui utilizado, o termo "introduzido" (no contexto da introdução de um ácido nucleico dentro de uma célula) inclui a trans- formação de uma célula, assim como o cruzamento de uma planta que compreende o ácido nucleico com uma segunda planta, de tal modo que a segunda planta contém o ácido nucleico, como pode ser execu- tado utilizando técnicas convencionais de reprodução de plantas. Tais técnicas de reprodução são conhecidas na especialidade. Para um debate de técnicas de reprodução de plantas, ver Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4th Edition, AVI Publication Co., Westport CT. [0057] Métodos de retrocruzamento podem ser utilizados para in- troduzir um ácido nucleico dentro de uma planta. Esta técnica tem sido utilizada há décadas para introduzir características nas plantas. Um exemplo de uma descrição de retrocruzamento (e outras metodologias de reprodução de plantas) pode ser encontrado, por exemplo, em Po- ehlman (1995), supra; e Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY. Em um protocolo de retrocruzamento exemplar, uma planta original de interesse (a "de origem recorrente") é cruzada com uma segunda planta (a "de origem não recorrente") que carrega o ácido nucleico ser introduzido. A prole resultante desse cruzamento é então cruzada novamente com a planta de origem recorrente, e o pro- cesso é repetido até que uma planta transformada é obtida, em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas de- sejadas da planta de origem recorrente são recuperadas na planta transformada, além do ácido nucleico da planta de origem não recor- rente. [0058] Como aqui utilizado, o termo "isogênico" refere-se a duas plantas individuais (ou suas partes, por exemplo, sementes, células) tendo um genótipo substanciaimente idêntico (por exemplo, não mais do que 1 gene é diferente entre os indivíduos). [0059] Como aqui utilizado, o termo "integração estável" ou "trans- formação estável", "herança geneticamente estável" ou "forma estável" refere-se à introdução de um segmento de ácido nucleico ou polinu- cleotídeo dentro do genoma de um organismo (geralmente uma se- quência de ácido nucleico heteróloga ou gene) tal como uma planta, tecido vegetal, organela da planta (isto é, um plastídeo ou cloroplasto), ou célula vegetal que não continha anteriormente este segmento de ácido nucleico ou polinucleotídeo. A integração resultante é afixada no genoma da planta e pode ser transmitida para as plantas descenden- tes. De preferência, a transformação resulta na integração estável da sequência de ácido nucleico no genoma da planta. Como aqui utiliza- do, o termo "genoma" abrange os genomas nucleares, genomas de plastídeo e genomas mitocondriais. Comparativamente, a "transforma- ção transitória" refere-se à introdução de um fragmento de ácido nu- cleico dentro do núcleo, ou organela contendo DNA, de um organismo hospedeiro resultando na expressão do gene sem herança genetica- mente estável. [0060] "Ligação" refere-se a uma interação não covalente específi- co da sequência entre as macromoléculas (por exemplo, entre uma proteína e um ácido nucleico). Nem todos os componentes de uma interação de ligação necessitam ser específicos da sequência (por exemplo, os contatos com resíduos de fosfato em uma cadeia principal de DNA), contanto que a interação como um todo seja específica da sequência. Tais interações são geralmente caracterizadas por uma constante de dissociação (Kd) de 10'6 M'1 ou inferior. "Afinidade" refe- re-se à força de ligação: aumento da afinidade de ligação sendo corre- lacionada com uma Kd inferior. [0061] "divagem" refere-se à ruptura da cadeia principal covalente de uma molécula de DNA. A divagem pode ser iniciada por uma vari- edade de métodos incluindo, mas não limitado a estes, hidrólise enzi- mática ou química de uma ligação de fosfodiéster. Tanto a divagem de filamento único quanto a divagem de filamento duplo são possíveis, e a divagem de filamento duplo pode ocorrer como um resultado de dois eventos de divagem de filamento único distintos. A divagem de DNA pode resultar na produção de extremidades cegas ou extremidades alternadas. Em certas modalidades, os polipeptídeos de fusão são uti- lizados para a divagem direcionada de DNA de filamento duplo de tal modo que o DNA genômico é modificado. [0062] Os termos "plasmídeo" e "vetor", como aqui utilizados, refe- rem-se a um elemento cromossômico adicional que pode transportar um ou mais genes que não fazem parte do metabolismo central da cé- lula. Os plasmídeos e vetores tipicamente são moléculas de DNA de filamento duplo circulares. No entanto, os plasmídeos e vetores podem ser ácidos nucleicos lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fi- lamento único ou duplo, e podem ser derivados de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeo foram unidas ou recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e uma sequência de DNA de codificação juntamente com qualquer sequência não transladada 3' apropriada dentro de uma célu- la. Nos exemplos, os plasmídeos e vetores podem compreender se- quências de replicação autônomas, sequências de integração do ge- noma e/ou sequências de fago ou de nucleotídeo. [0063] O termo "proteína de fusão" indica que a proteína inclui componentes de polipeptídeo derivados de mais do que uma proteína ou polipeptídeo de origem. Tipicamente, uma proteína de fusão é ex- pressa a partir de um gene de fusão em que uma sequência de nucle- otídeo que codifica uma sequência de polipeptídeo de uma proteína é anexada na estrutura e opcionalmente separada por um ligante de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de polipep- tídeo a partir de uma proteína diferente. O gene de fusão pode então ser expresso por uma célula hospedeira recombinante como uma úni- ca proteína. [0064] "Haploide" refere-se às células vegetais, tecidos ou plantas com um conjunto (n) de cromossomas. [0065] "Di-haploide" ou "haploide duplicado" ou "diploide" refere-se às células vegetais, tecidos ou plantas derivadas de um haploide. Os di-haploides possuem dois conjuntos (2n) de cromossomas e são tipi- camente homozigotos. É possível, no entanto, que as mutações, dele- ções ou inserções, ou outras modificações semelhantes no DNA pos- sam levar a alguns desvios em relação à capacidade homozigota ab- soluta que seria normalmente observada nos di-haploides. Similarmen- te, uma pessoa de habilidade na técnica pode modificar intencional- mente o DNA di-haploide através da execução de mutações, deleções, inserções aleatórias ou direcionadas ou através do rearranjo do DNA ou suas partes. Tais "di-haploides modificados" são englobados pela divulgação. Os poliploides também podem ser obtidos utilizando os métodos da presente divulgação, se desejável. Os poliploides terão três ou mais conjuntos de cromossomas e também devem ser homo- zigotos, exceto para as modificações debatidas acima. [0066] "Agente de duplicação do cromossoma" refere-se a um produto químico que duplica o número de cromossomas na célula (por exemplo, de haploide para diploide ou diploide para tetraploide, etc.).

Tais agentes são tipicamente agentes antimicrotúbulos tais como colquicina, pronamida, ou APM (amiprofos-metila). O óxido nitroso também foi relatado de ser um agente de duplicação (Ped. de Pat. US 2003/0005479, aqui incorporada por referência na sua totalidade).

Uma pessoa de habilidade na técnica está familiarizada com os com- postos que podem causar a duplicação do cromossoma (por exemplo, através do bloqueio da divisão do ciclo celular normal, etc.). [0067] "Calo" refere-se a uma massa de proliferação indiferencia- da de células ou tecido. [0068] "Calo do tipo I" refere-se ao calo que é calo de milho morfo- logicamente compacto a partir do qual as plantas inteiras podem ser regeneradas através da organogênese, embriogênese ou uma combi- nação dos dois. [0069] "Calo do tipo II" refere-se ao calo de milho morfologicamen- te friável altamente embriogênico (Armstrong and Green, Planta. 164:207-214. 1985). [0070] "Embrião maduro" refere-se a um embrião zigótico que po- de ser obtido aproximadamente 15 dias ou mais após a polinização e tipicamente não produz calo regenerável quando cultivado in vitro. [0071] "Embrião imaturo" refere-se a um embrião zigoto que pode ser obtido aproximadamente 15 dias ou menos após a polinização e pode tipicamente produzir calo regenerável quando cultivado in vitro. [0072] O termo "embrião zigoto" é utilizado para englobar semen- tes, embriões maduros extraídos da semente, embriões maduros ou embriões imaturos capazes de germinação. [0073] "Cultura embriogênica" ou "célula embriogênica" ou "tecido embriogênico" ou "embrião" ou "estrutura semelhante a embrião" refe- re-se às células e tecidos vegetais cultivados capazes de serem rege- nerados em uma planta. [0074] "Regulador do crescimento vegetal ou hormônio vegetal" refere-se aos compostos que afetam o crescimento das plantas. Os reguladores do crescimento vegetal incluem, mas não são limitados a estes, auxinas, citocininas, ABA, giberelinas, etileno, brassinosteroides e poliaminas. As auxinas afetam o alongamento de brotos e raízes em baixa concentração, mas inibem o crescimento em níveis mais eleva- dos. As auxinas comumente utilizadas incluem picloram (ácido 4- amino-3,5,6-tricloropicolínico), 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), IAA (ácido indol-3-acético), NAA (ácido α-naftalenoacético), e dicamba (ácido 3,6-dicloroanísico). As citocininas provocam a divisão celular, a diferenciação celular e a diferenciação de brotos. As citocininas co- mumente utilizadas incluem cinetina, BA (6-benzilaminopurina), 2-ip (2-isopenteniiadenina), BAP (6-benzilaminopurina), tidiazuron (TDZ), ribosídeo de zeatina e zeatina. [0075] "Monocot" ou "monocotiledôneo" refere-se às plantas tendo um único cotilédone. Exemplos incluem cereais tais como milho, arroz, trigo, aveia e cevada. [0076] "Fenótipo" refere-se a uma característica apresentada por um organismo que resulta da expressão (ou falta de expressão) de ácidos nucleicos no genoma (incluindo o DNA e o RNA não genômicos tais como plasmídeos e cromossomas artificiais) e/ou de organelas do organismo. [0077] "Regeneração" refere-se ao processo de crescimento de uma planta a partir de uma célula ou tecido vegetal. [0078] "Marcador selecionável" ou "marcador detectável" refere-se a uma sequência de ácido nucleico cuja expressão confere um fenóti- po que facilita a identificação de células, tecidos ou plantas contendo a sequência de ácido nucleico. [0079] "Esporofítico" refere-se às plantas na fase do ciclo de vida que são caracterizadas de terem o número de cromossomas dobrado.

Isto está em contraste com o "gametofítico", que inclui micrósporos e pólen.

Tecidos Derivados de Linhagens celulares Haploides Derivadas de Androqênicos [0080] Geralmente, o nível de ploidia de um genoma refere-se ao número de conjuntos de cromossoma que estão presentes dentro do núcleo da célula. O nível de ploidia pode variar dependendo do tipo de células e/ou fonte de células que compõem o organismo. O número haploide (n) é uma indicação de que apenas um conjunto de cromos- somos está presente dentro do organismo. O número di-haploide ou diploide (2n) é uma indicação de que dois conjuntos de cromossomas estão presentes dentro do organismo. É comum para alguns organis- mos, especialmente espécies vegetais, conter um número ainda maior de conjuntos de cromossomas, por exemplo, triploide (3n), tetraploide (4n), pentaploide (5n) e hexaploide (6n). Tais exemplos de aumento conjuntos de cromossomas, por exemplo, triploide ou maior, são ge- ralmente conhecidos como poliploides. [0081] Tipicamente, o estágio muiticelular diploide (2n) se alterna com um estágio muiticelular haploide (n) durante todo o ciclo de vida de um organismo. O estágio haploide (n) do ciclo de vida de um orga- nismo é considerado como o estágio gametofítico, por exemplo, a pro- dução de gametas. Comparativamente, o estágio diploide (2n) do ciclo de vida de um organismo é considerado como o estágio esporofítico, por exemplo, a produção de esporos. Durante o estágio esporofítico, o organismo produz micrósporos (isto é, esporos) que são haploide (n), através de um processo chamado meiose. Os micrósporos resultantes podem produzir gametas, por exemplo, núcleos de esperma que se fundem com outras gametas, por exemplo, núcleos de ovos, produzi- dos por megasporos para gerar um zigoto diploide durante a fertiliza- ção. [0082] Nas plantas os micrósporos são produzidos em órgãos re- produtores masculinos. Os órgãos reprodutores masculinos são co- nhecidos como anteras. As anteras produzem microsporos haploides que amadurecem dentro dos núcleos de esperma contendo pólen. O pólen representa o início de uma fase gametofítica masculina de curta duração de um ciclo de vida da planta durante o qual dois núcleos es- permáticos são liberados ao saco embrionário do óvulo para a fertiliza- ção dobrada e subsequente formação do embrião e do endosperma.

Embora este estágio de um maior ciclo de vida da planta consista tipi- camente de apenas algumas divisões celulares, sob certas condições experimentais, os micrósporos podem ser induzidos a sofrer um de- senvolvimento alterado, que leva à produção de estruturas semelhan- tes a embrião sem uma intervenção da fertilização. Como tais, estas estruturas semelhantes a embrião são haploides (n). Este processo, referido por androgênese, é a base biológica para a técnica in vitro co- nhecida como cultura de anteras ou micrósporos. [0083] Em uma modalidade, uma linhagem celular derivada an- drogênica competente de transformação é fornecida. Nas modalidades subsequentes, uma linhagem celular de micrósporo haploide é obtida a partir da linhagem celular derivada androgênica competente de transformação. Em uma outra modalidade, um tecido haploide compe- tente de transformação é derivado de um micrósporo de milho. As cul- turas derivadas de anteras fornecem um método rápido de indução da capacidade homozigota nas plantas que são de interesse para a pro- dução de linhagens de reprodução. A cultura de anteras envolve o iso- lamento de anteras imaturas a partir de plantas e a sua colocação em um meio que induz as células dentro da antera, que normalmente seri- am destinadas a se tornar grãos de pólen, os micrósporos, para come- çar a divisão e formar uma cultura de células a partir da qual as plan- tas podem ser regeneradas. Para um debate geral de cultura de ante- ras, ver J. M. Dunwell, “Anther and Ovary Culture”, In S. W. J. Bright and M. G. K. Jones, (eds.), Cereal Tissue and Cell Culture, Martinus Nijhoff Publisher, 1985, Dordrecht, pp. 1-44. As culturas resultantes são haploides e contêm apenas um único conjunto de cromossomos das plantas originais. As plantas derivadas dessas culturas são esté- reis a não ser que a duplicação do cromossoma ocorra, espontanea- mente ou por indução, para criar haploides dobrados, os quais são to- talmente férteis e completamente congênitos. [0084] Numerosos estudos sobre a cultura in vitro das células ga- metofíticas com o objetivo de produzir plantas haploides foram relata- dos durante as últimas décadas. Um grande número de revistas, capí- tulos de livro e procedimentos de simpósios tem sido igualmente publi- cado (ver de uma forma geral Chu, “Haploids in Plant Improvement”, In I. K. Vasil, W. R. Scowcroft, K. J. Frey (eds.), Plant Improvement and Somatic Cell Genetics, New York: Academic Press, 1982, pp. 129-158;

Heberle-Bors, 1985, “In Vitro Haploid Formation of Pollen: A Criticai Review”, Theor. Appl. Genet. 71:361-374; e, Hu and Yang, “Haploids of Higher Plants in Vitro.” Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag, 1986). [0085] A cultura de anteras representa um método pelo qual, teori- camente, grandes números de indivíduos haploides podem ser produ- zidos diretamente a partir das anteras e/ou micrósporos in vitro. Ver, Keller et al., “Haploids from gametophytic cells -- recent developments and future prospects”, In C. E. Green, D. A. Somers, W. P. Hackett, D. D. Biesoer (eds.), Plant Tissue and Cell Culture, Alan R Liss, New York, pp 223-241, 1986. Os haploides podem ser regenerados de célu- las gametofíticas tanto masculinas quanto femininas através da cultura de anteras, micrósporos, ovários e óvulos. Uma resposta positiva in vitro levará ao desenvolvimento de embriões e/ou calos, dos quais as plantas podem ser regeneradas. Eventos precoces durante a cultura in vitro foram caracterizados no nível citológico, ultra-estrutural e bioquí- mico (Chen et al., 1984, “Segmentation Patterns and Mechanisms of Genome Multiplication in Cultured Microspores of Barley”, J. Can, Ge- net. Cytol., 26:475-483; Raghavan, 1984, “Protein Synthetic Activity during Normal Pollen Development and During Induced Pollen Embry- ogenesis in Hyoscyamus niger”, J. Can Bot., 62:2493-2513; Huang, “Ultrastructural Aspects of Pollen Embryogenesis in Hordeum, Triticum and Paeonia”, 1986). [0086] Em outras modalidades, o tecido haploide derivado de uma linhagem celular derivada de androgênicos, por exemplo, um micrós- poro de milho, é um tecido de embrião ou calo. Em outra modalidade, os métodos fornecidos podem ou não passar por um estágio de for- mação de calo. Os embriões haploides podem ser colocados em um "meio de não promoção de calo". O termo "meio de não promoção de calo" refere-se a um meio que não sustenta a proliferação de massas indiferenciadas de células ou tecido. Um "meio de não promoção de calo" preferido é utilizado para o salvamento de embriões contendo formulações típicas de sal e vitamina bem conhecidas na técnica. Tal salvação de embriões, ou cultura de embriões, os meios contêm pouca ou nenhuma auxina (para revisão ver Raghaven, V., 1986, Biol. Rev., 41:1-58). Em algumas modalidades, o meio de maturação de embriões também representa outro "meio de não promoção de calo" preferido. O meio de maturação de embrião é utilizado para promover o desenvol- vimento de embriões cultivados in vitro, que previne a germinação pre- coce, e tipicamente contém formulações padrão de sal/vitamina (de- pendendo da espécie), níveis aumentados de açúcar e/ou ácido abscí- sico exogenamente adicionado, com pouca ou nenhuma auxina. Outro tipo de meio é utilizado para a cultura de brotos, ou múltipla prolifera- ção de brotos. Este meio de múltiplos brotos pode novamente conter pouca auxina ou teor reduzido de auxina, mas em vez disso contém níveis elevados de citoquinina que promovem a proliferação e cresci- mento de meristemas. [0087] A cultura de anteras tem sido empregada para igualmente se obter calos, embriões e plantas derivados de micrósporos de 200 espécies (Maheshwari et al., 1982, “Haploids from Pollen Grains- Retrospect and Prospect”, Amer. J. Bot., 69:865-879). No entanto, a capacidade de resposta da cultura de anteras varia consideravelmente entre as espécies. O maior rendimento de respostas de anteras (ante- ras que formam embriões e/ou calos por 100 anteras plaqueadas) Foi observado de ser 87 por cento no trigo (A. M. Wei, 1982, “Pollen Callus Culture in Triticumaertivum”, Theor. Appl. Genet., 63,pp. 71-73), 67 por cento no arroz (S. L. Lin and H. S. Tsay, 1983, J. Agr. Res., China, cited in Dunwell, 1985), 17 porcento no milho (Ting et al., 1981, “Improved Anther Culture of Maize” (Zea mays L.), Plant Science Lett., 23,pp. 139-145) e 1 por cento na cevada (Z. H. Xu and N. Sunderland, 1982, “Innoculation Density in the Culture of Barley Anthers”, Scient.

Sinic., 25, pp. 961-968). No centeio, 43 estruturas em desenvolvimento por 100 anteras foram observadas (G. Wenzel et al., 1977, “Increased Induction and Chromosome Doubling of Androgenetic Haploid Rye”, Theor. Appl. Genet., 51, pp. 81-86). As frequências de calos que pro- duzem plantas verdes por 100 anteras cultivadas estão no trigo a 72 por cento (J. W. Ouyang et al., 1983, “The Response of Anther Culture to Temperature in Triticum Aestivum”, Theor. Appl. Genet., 66, pp. 101-109), no arroz a 12 por cento (L. J. Chen et al., “Médium Evalua- tion for Rice Anther Culture”, in A. Fujiwara (ed.), “Plant Tissue Cul- ture”, pp. 551-551. Jap. Assoe. Plant Tissue Culture Tokyo, 1982) e na cevada a 10 por cento (K. N. Kao, “Plant Formation from Barley Anther Cultures with Ficoll Media”, Z. Pflanzenzuchtg., 103, 1981, pp. 437- 443). [0088] Em uma outra modalidade, o micrósporo é de milho tendo características de desempenho de elite. Em um aspecto da modalida- de, o micrósporo é de milho híbrido derivado do cruzamento de uma linhagem de milho elite com uma linhagem de milho diferente tendo elevada resposta de cultura de micrósporo. Como fornecido na Pat. U.S. N2 5.306.864 (aqui incorporada por referência na sua totalidade) e na Pat. U.S. N2 5.602.310 (aqui incorporada por referência na sua tota- lidade), o uso de cultura de anteras como um meio de reprodução de haploide no milho (Zea mays L.) é facilmente aplicável a diferentes ge- nótipos de milho, incluindo as linhagens de desempenho de elite. Os processos que levam em conta a identificação de idioplasma de milho que apresentam resposta reforçada à cultura de anteras podem ser transferíveis para aumentar a capacidade de cultivo das anteras em outros genótipos selecionados. Tais processos são facilmente conhe- cidos na técnica, e podem ser utilizados para converter o idioplasma de milho, incluindo as linhagens de desempenho de elite, em plantas que produzem níveis elevados de culturas de tecido haploides e/ou diaploides a partir das anteras e/ou micrósporos cultivados.

Duplicação de Cromossomas [0089] Em uma modalidade, qualquer um dos métodos divulgados de produção de um tecido vegetal haploide com um genoma de tecido haploide modificado ainda inclui o tratamento do tecido haploide modi- ficado com um agente de duplicação de cromossomas para produzir um tecido vegetal di-haploide. Em certas modalidades, o tecido di- haploide assim produzido compreende um genoma que é homozigoto para a modificação (por exemplo, o polinucleotídeo doador integrado ou mutação) que foi gerado no genoma haploide. Em uma outra moda- lidade, o tecido de milho compreendendo o genoma di-haploide modi- ficado é propagado em uma planta madura que é homozigota para a modificação genômica. [0090] Os métodos de duplicação cromossômica são divulgados em Antoine-Michard, S. et at, Plant cell, tissue organ cult., Cordrecht, the Netherlands, Kluwer Academic Publishers, 1907, 48(3):203-207;

Kato, A., Maize Genetics Cooperation Newsletter 1897, 38-37; e Wan, Y. et al., Theor. Appl. Genet., 1980, 77:889-892, Wan, Y, et al., Theor.

Appl. Genet., 1991, 81:205-211. Cujas divulgações são aqui incorpo- radas por referência. Os métodos típicos envolvem o contato das célu- las com colquicina, agentes anti-microtúbulos ou herbicidas anti- microtúbulos, pronamida, óxido nitroso, ou qualquer inibidor mitótico para criar células haploides duplicadas homozigotas. Outros agentes podem ser utilizados com os inibidores mitóticos para melhorar a efici- ência de duplicação. Tais agentes podem ser sulfóxido de dimetila (DMSO), adjuvantes, tensoativos, e outros mais. [0091] Os agentes de duplicação de cromossomas adicionais são conhecidos na técnica, os produtos químicos listados na Pat. U.S. N- 5.866.513, aqui incorporada por referência na sua totalidade, são apli- cáveis para uso na geração de plantas diaploides. Além disso, a Tabe- la 1 lista os vários agentes de duplicação de cromossomas conheci- dos.

Tabela 1. Agentes de duplicação de cromossomas. [0092] Em uma modalidade, a dosagem adequada para os agen- tes de duplicação de cromossomas para o método de embebimento de mudas aqui divulgados inclui, por exemplo, 0,01 μΜ, 0,5 μΜ, 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, 25 pM, 30 pM, 35 pM, 40 pM, 45 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 125 pM, 150 pM, 200 pM, 500 pM e 1000 pM. As faixas adequadas também inclu- em, por exemplo, de 0,1 a 10 pM, de 1 a 100 pM, de 5 a 125 pM, de 25 a 200 pM, de 50 a 500 pM, de 15 a 150 pM e de 1 a 10000 pM. [0093] Em outra modalidade, o agente de duplicação de cromos- somas pode variar de 0,01% a 0,5% da solução utilizada no método de embebimento de mudas. Por exemplo, 0,01 %, 0,02 %, 0,025 %, 0,05%, 0,075%, 0,1 %, 0,125 %, 0,15 %, 0,175 %, 0,2 %, 0,225 %, 0,25 %, 0,275 %, 0,3 %, 0,325 %, 0,35 %, 0,375 %, 0,4 %, 0,425 %, 0,45 %, 0,475 % ou 0,5 % do agente de duplicação de cromossomas podem ser utilizados para dobrar os cromossomas. [0094] Em outras modalidades, a baixa mortalidade de mudas dos agentes de duplicação de cromossomas aqui divulgados, quando comparados com a colquicina (por exemplo, em 0,025%), pode variar, por exemplo, de menos de 10% a cerca de 40% ou menos do que cer- ca de 5% a cerca de 20 % ou menos do que cerca de 15% a cerca de 25% ou menos do que 50% do número total de mudas ou células ve- getais tratadas. [0095] Em outras modalidades, a dosagem adequada com relação ao agentes de duplicação de cromossomas para o método de aplica- ção foliar das mudas aqui divulgado inclui, por exemplo, 3,5 g ai/ha, 70 g ai/ha, 140 g ai/ha, 280 g ai/ha. As taxas de aplicação adequadas in- cluem as faixas de, por exemplo, 5 g ai/ha a 1120 g ai/ha, e mais pre- ferivelmente a 2800 g ai/ha. [0096] O termo "contato" inclui a referência a "contato direto" e "contato indireto". Por exemplo, o meio compreendendo um agente de duplicação pode ter contato direto com a célula haploide ou o meio que compreende o agente de duplicação pode ser separado da célula haploide por uma barreira tal como um papel de filtro, tecido vegetal ou outras células, assim, o agente de duplicação é transferido através do papel de filtro ou células ou tecido para a célula haploide. O contato é conseguido de qualquer modo adequado, por exemplo, tratamento hi- dropônico das raízes, pulverização, injeção, infiltração, embebimento e umectação. [0097] As células haploides, embriões haploides, sementes haplo- ides, mudas haploides ou plantas haploides podem ser tratadas com um agente de duplicação de cromossomas. As plantas homozigotas podem ser regeneradas a partir de células haploides mediante o con- tato das células haploides, tais como as células de embrião haploides, com os agentes de duplicação de cromossomas. As células haploides podem entrar em contato com o agente de duplicação durante qual- quer período de tempo. Em uma modalidade as células haploides es- tão em contato com o agente de duplicação durante 1 minuto, 2 minu- tos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 mi- nutos, 35 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas, 10 horas, 24 horas ou 48 horas. [0098] O embrião haploide pode ser isolado. Ele pode estar conti- do dentro da noz, óvulo ou semente, ele também pode estar sobre a espiga nas espigas de milho, ou sobre o espigão, como no caso de outros cereais como o trigo. A espiga compreendendo: o embrião ha- ploide pode estar sobre a planta ou isolado da planta. A espiga tam- bém pode ser secionada. Após a duplicação do cromossoma, o em- brião haploide duplicado irá conter 2 cópias dos cromossomos mater- nalmente derivados. A eficiência do processo para a obtenção de plan- tas haploides duplas a partir de embriões haploides pode ser maior do que 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %.

Transformação de Plantas [0099] Os métodos divulgados da divulgação incluem métodos de transformação de plantas. Os métodos de transformação de plantas que podem ser utilizados nos métodos da divulgação incluem, mas não são limitados a estes, bombardeio de micropartículas específico do sítio, método de transformação de Agrobacterium, método de trans- formação de fosfato de cálcio, método de transformação de polibreno, o método de transformação de eletroporação, método de transforma- ção de ultra-som, método de transformação de lipossoma, método de transformação por microinjeção, método de transformação de DNA exposto, método de transformação de vetor plasmídeo, método de transformação de vetor viral, método de transformação mediado por carboneto de silício, método de transformação radiante de aerossol ou método de transformação de PEG. Geralmente qualquer método de transformação de plantas pode ser utilizado para inserir DNA ou qual- quer outra sequência de polinucleotídeo no genoma de uma célula hospedeira. Assim, qualquer método que fornece transforma- ção/transfecção eficiente pode ser empregado. [00100] Numerosos métodos para a transformação de plantas têm sido desenvolvidos, incluindo os protocolos de transformação biológica e física para plantas dicotiledôneas, assim como para as plantas mo- nocotiledôneas (por exemplo, Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)). Além disso, os vetores compreen- dendo os cassetes de expressão de genes e os métodos de cultura in vitro para a transformação e regeneração de célula ou tecido vegetal estão disponíveis, por exemplo, em Gruber et al., Methods in Plant Mo- lecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E.

Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993). [00101] Um grande número de técnicas está disponível para inserir DNA compreendendo um cassete de expressão de gene em uma célu- la hospedeira vegetal. Essas técnicas incluem a transformação com T- DNA desarmado utilizando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacte- rium rhizogenes como o agente de transformação, transfecção com fosfato de cálcio, transformação com polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, métodos de ultra-som (por exemplo, sonoporação), transformação de lipossomas, micro-injeção, DNA exposto, vetores plasmídeos, vetores virais, biolística (bombardeio de micropartículas), transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS™, aeros- sol radiante, ou transformação mediada por polietileno glicol, assim como outros métodos possíveis. [00102] Por exemplo, o constructo de DNA compreendendo um cassete de expressão do gene pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como eletro- poração e micro-injecção de protoplastos de células vegetais. Tais mé- todos de transformação de plantas incluem, por exemplo, a transfor- mação de protoplastos através da precipitação de cloreto de cálcio, polietileno glicol (PEG) ou absorção mediada por eletroporação de DNA (ver Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc.

Nat. Acad. Sei. USA 82:5824-5828; e Shimamoto (1989) Nature 338:274-276) e eletroporação de tecidos vegetais (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505). [00103] Os constructos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido da planta utilizando métodos biolísticos, tais como bombar- deio de partículas de DNA (ver, por exemplo, Klein et al. (1987) Nature 327:70-73). Os métodos biolísticos incluem a transformação mediada por micro projéteis, em que o DNA é carregado sobre a superfície de microprojéteis. Neste método, o vetor de expressão é introduzido nos tecidos vegetais com um dispositivo biolístico que acelera os micropro- jéteis em velocidades suficientes para penetrar as paredes celulares das plantas e das membranas. Sanford et al., Part. Sei. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992). [00104] Os métodos adicionais para a transformação de células ve- getais incluem a microinjeção por meio da absorção de DNA mediada por carboneto de silício WHISKERS™ (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Repórter 9:415-418). Alternativamente, o constructo de DNA pode ser introduzido na célula vegetal através da transformação de nano- partículas (ver, por exemplo, o Pedido de Patente US No. 12/245.685, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). [00105] Um método amplamente utilizado para a introdução de um vetor que compreende um cassete de expressão de gene nas plantas baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobacterium.

Horsch et al., Science 227:1229 (1985). A. tumefaciens e A. rhizoge- nes são bactérias do solo patogênicas de plantas conhecidas de se- rem úteis para geneticamente transformar as células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamen- te, carregam os genes responsáveis pela transformação genética da planta. Kado, C. I., Crit. Rev. Plant. Sei. 10:1 (1991). As descrições de sistemas de vetores de Agrobacterium e métodos para a transferência de genes mediada por Agrobacterium, também estão disponíveis, por exemplo, Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989), e Patentes U.S. N— 4.940.838 e 5.464.763. [00106] Quando a Agrobacterium for utilizada para a transformação de plantas, o DNA a ser inserido pode ser clonado em um plasmídeo especial referido como um vetor intermediário ou em um vetor binário.

Os vetores intermediários não podem replicar em Agrobacterium na ausência de um plasmídeo auxiliar (conjugação). O sistema Japan To- bacco Superbinary é um exemplo de um tal sistema (ver a revisão por Komari et al., (2006) In: Methods in Molecular Biology No. 343: Agrobacterium Protocols (2nd Edition, Vol. 1) (K. Wang, ed.) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, pp.15-41; e Komori et al., (2007) Plant Phys- iol. 145:1155-1160). [00107] Os vetores binários podem replicar tanto em E. coli quanto em Agrobacterium. Eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante que são estruturados pelas regiões limites do T-DNA a direita e a esquerda. Os vetores binários podem ser trans- formados diretamente em Agrobacterium (Holsters, 1978). A Agrobac- terium pode ser utilizada como uma célula hospedeira compreendendo um plasmídeo, por exemplo, o plasmídeo Ti ou RI que carrega uma região vir que, tipicamente, é necessária para a transferência do T- DNA para dentro da célula vegetal. [00108] A virulência de um hospedeiro de Agrobacterium tumefaci- ens pode ser utilizada para direcionar a inserção de um DNA doador contendo filamento T dentro do tecido ou célula haploide que está in- fectada pela tecnologia de vetor de T DNA binário de Agrobacterium (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721), ou o procedimento de co-cultivo (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231). Geralmente, o sistema de transformação de Agrobacterium é utilizado para planejar as plantas dicotilédones (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). O sistema de transformação de Agrobacterium também pode ser utiliza- do para transformar, assim como transferir, o DNA em plantas mono- cotiledôneas e células vegetais. Ver a Patente U.S. Ng 5.591.616; Her- nalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; e Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434. [00109] Após a introdução do constructo genético que compreende um cassete de expressão de genes pela transformação de plantas, as células vegetais podem ser cultivadas e após o aparecimento de dife- renciação de tecidos tais como brotos e raízes, as plantas maduras podem ser geradas. Em algumas modalidades, uma pluralidade de plantas pode ser gerada. As metodologias para a regeneração de plantas são conhecidas por aqueles de habilidade prática na técnica e podem ser observdas, por exemplo, em: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers and in: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). A planta geneticamente modificada aqui descrita pode ser cultivada em um meio de fermentação ou cultivada em um meio adequado tal como o solo. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para as plantas superiores pode incluir qualquer meio de crescimento para plantas, incluindo, mas não limita- do a estes, terra, areia, quaisquer outros meios particulados que sus- tentem o crescimento da raiz (por exemplo, vermiculite, perlite, etc.) ou cultura hidropônica, assim como luz adequada, água e suplementos nutricionais que otimizam o crescimento da planta superior. [00110] As células vegetais transformadas que são produzidas por qualquer uma das técnicas de transformação de plantas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transformado e assim o fenótipo desejado. Tais técnicas de regenera- ção contam com a manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente contando com um bi- ocida e/ou um marcador de herbicida que foi introduzido juntamente com as sequências de nucieotídeo desejadas. A regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivads é descrita em Evans, et al., “Protoplasts Isolation and Culture” in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC

Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida a partir de calos, explantes, órgãos, pólen, embriões de plantas ou suas partes. Tais técnicas de regeneração são descritas de uma forma geral em Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486. [00111] Uma célula vegetal, calo, tecido ou planta pode ser identifi- cado e isolado através da seleção ou triagem do material vegetal pla- nejado com relação às características codificadas pelos genes marca- dores presentes no DNA de transformação. Por exemplo, a seleção pode ser executada através do crescimento do material vegetal plane- jado em meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida ao qual o constructo do gene de transformação confere re- sistência. Além disso, as plantas e células vegetais transformadas também podem ser identificadas pela triagem das atividades de quais- quer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes β- glucuronidase, luciferase ou gfp) que podem estar presentes nos cons- tructos de ácido nucleico recombinantes. As metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas daqueles versados na técnica. [00112] O termo "evento" transgênico refere-se a uma planta re- combinante produzida pela transformação e regeneração de uma célu- la vegetal única com DNA heterólogo, por exemplo, um cassete de ex- pressão que inclui um transgene de interesse. O termo "evento" refere- se ao transformante original e/ou descendência do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" também se refere à des- cendência produzida por um cruzamento sexual de plantas da mesma raça, mas de linhagem diferente, entre o transformante e outra planta.

Mesmo após o retrocruzamento repetido com um parente recorrente, o DNA inserido e o DNA de flanqueamento do parente transformado es- tão presentes na descendência do cruzamento no mesmo local cro- mossômico. Normalmente, a transformação do tecido vegetal produz múltiplos eventos, cada um dos quais representa a inserção de um constructo de DNA em um local diferente no genoma de uma célula vegetal. Com base na expressão do transgene, ou outras característi- cas desejáveis, um evento particular é selecionado. Nas modalidades da divulgação objeto o evento particular compreende um polinucleotí- deo de DNA doador inserido dentro de um lócus genômico direciona- do.

[00113] Como aqui utilizado, o "DNA inserido" refere-se ao DNA

heterólogo tal como um transgene dentro do polinucleotídeo de DNA doador, que pode compreender uma cassete de expressão de gene utilizado para transformar o material vegetal enquanto que o "DNA de flanqueamento" ou "DNA de junção" pode compreender o DNA genô- mico naturalmente presente em um organismo tal como uma planta, ou DNA estranho (heterólogo) introduzido por meio do processo de transformação que é irrelevante à molécula de DNA inserida, por exemplo, fragmentos associados com o evento de transformação.

Uma "junção" ou "região de flanqueamento" ou "sequência de flanque- amento" como aqui utilizada refere-se a uma sequência de pelo menos 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500 ou 5000 pares de bases ou mais que está localizada imediatamente a montante e contí- gua ou imediatamente a jusante e contígua com a molécula de DNA de inserção. [00114] Os embriões haploides transformados que são derivados por qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser cul- tivados para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo trans- formado. Tais técnicas de regeneração são chamadas de salvação de embriões. O meio de salvação de embriões pode compreender certos hormônios vegetais e fontes de energia ou apenas fontes de energia. O meio de crescimento também pode conter um agente de seleção tal como um biocida e/ou herbicida. Este agente de seleção pode ser utili- zado para indicar um marcador que foi introduzido através do processo de transformação. A transformação e a regeneração de milho têm sido descritas em, por exemplo, Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2:603- 618 (1990). [00115] A geração de embriões em plantas é bem conhecida na técnica. As técnicas de salvação de embriões que podem ser utiliza- das para gerar embriões haploides dobrados imaturos nas plantas também são conhecidas (Recent Research Developments in Genetics & Breeding. Vol. 1, Part II, 237-303 2004). A divulgação da qual é aqui incorporada por referência.

Vetores e Polinucleotídeos Doadores [00116] Em uma modalidade, a divulgação objeto refere-se à intro- dução de um ou mais polinucleotídeos de DNA doadores que são inse- ridos dentro de um lócus do genoma direcionado. Em algumas modali- dades os polinucleotídeos doadores compreendem a sequência de codificação. A sequência de codificação pode codificar, por exemplo, um gene (por exemplo, um transgene) que confere uma característica agronômica. Em outras modalidades, a característica agronômica é selecionada do grupo que inclui um traço de resistência a inseticida, um traço de tolerância a herbicida, um traço de eficiência de uso de nitrogênio, um traço de eficiência de uso de água, um traço de quali- dade nutricional, um traço de ligação ao DNA, e um traço de marcador selecionável. Nas modalidades adicionais, os polinucleotídeos doado- res são expressos dentro da planta. Uma modalidade da divulgação objeto inclui uma planta compreendendo um ou mais polinucleotídeos doadores. Em um aspecto da modalidade, a planta compreende um genoma haploide. Em outro aspecto da modalidade, a planta compre- ende um genoma diaploide. [00117] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo doador com- preende um cassete de expressão do gene. Técnicas padrão de DNA recombinante e clonagem molecular para a construção de um cassete de expressão de genes como aqui utilizado são bem conhecidas na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor La- boratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); e em Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoe, and Wil- ey-lnterscience (1987). [00118] Vários promotores que direciona a expressão de um gene em uma planta podem ser empregados em um polinucleotídeo doador.

Tais promotores podem ser selecionados a partir de promotores cons- titutivos, quimicamente regulados, induzíveis, específicos do tecido e preferíveis das sementes. O promotor utilizado para direcionar a ex- pressão de um ácido nucleico depende da aplicação particular. Por exemplo, um promotor constitutivo forte adequado para a célula hos- pedeira é tipicamente utilizado para a expressão e purificação das pro- teínas expressas. [00119] Exemplos não limitativos de promotores de plantas incluem as sequências promotoras derivadas de A. thaliana ubiquitina-10 (ubi- 10) (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); sintase ma- nopina de A. tumefaciens (Amas) (Petolino et al., Patente U.S. Ne 6.730.824); e/ou Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139). Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor do núcleo do vírus do mosaico da couve-flor 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); promotor de actina do arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); promotor da ubiquitina do milho (Patente U.S. N- 5.510.474; Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); promoter de pEMÜ (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); Promotor de ALS (Patente U.S. Ng 5.659.026); promotor de histona do milho (Chabouté et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)); e outros mais. [00120] Outros promotores de plantas úteis incluem os promotores específicos do tecido e induzíveis. Um promotor induzível é aquele que é capaz de direta ou indiretamente ativar a transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as sequências de DNA ou genes não serão transcritos.

Tipicamente, o fator de proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa a qual é então direta ou indiretamente converti- da na forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabólito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente pelo calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente pela ação de um agente patogênico ou agente de doença tal como um vírus. Tipi- camente o fator de proteína que se liga especificamente a um elemen- to regulador induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa a qual é então direta ou indiretamente convertida na for- ma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabólito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente pelo calor, frio, sal, ou elementos tóxicos ou indiretamente pela ação de um agente patogênico ou agente de doença tal como um vírus. Uma célu- Ia vegetal que contém um elemento regulador induzível pode ser ex- posta a um indutor mediante a aplicação externa do indutor à célula ou planta, tal como por pulverização, irrigação, aquecimento ou métodos semelhantes. [00121] Qualquer promotor induzível pode ser utilizado nas modali- dades da presente divulgação. Ver Ward et al., Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993). Os promotores induzíveis exemplares incluem os promotores do receptor de ecdisona (Patente U.S. N- 6.504.082); os promotores do sistema de ACE1 que respondem ao cobre (Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 4567-4571 (1993)); os genes In2-1 e ln2-2 do milho que respondem aos protetores de herbicida de benzenossulfo- namida (Patente U.S. Ng 5.364.780; Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) e Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)); repressor Tet de Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229- 237 (1991); ou os promotores de um gene de hormônio esteroide, a sua atividade de transcrição é induzida por uma hormônio de glucocor- ticosteroide, Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 10421 (1991) e McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257; o promotor de GST do milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são utilizados como herbicidas pré-emergentes (ver a Patente U.S. N- 5.965.387 e o Pedido de Patente Internacional, Publicação No. WO 93/001294); e o promotor PR-1a de tabaco, o qual é ativado pelo ácido salicílico (ver Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., “Evalua- tion of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Repórter Sys- tem,” Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800). Outros promotores regulados por produtos químicos de interesse incluem os promotores induzíveis por tetraciclina e reprimíveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, and U.S. Patent Numbers 5,814,618 and 5,789,156). [00122] Outros promotores reguláveis de interesse incluem um elemento regulador responsivo ao frio ou um elemento regulador de choque térmico, a transcrição do qual pode ser efetuada em resposta à exposição ao frio ou calor, respectivamente (Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992); o promoter do gene álcool deidrogenase (Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)), induzível pelas condições anaeróbicas; e o promotor induzível pela luz derivado do gene rbcS da ervilha ou gene psaDb da ervilha (Yamamoto et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265); um elemento regulador induzível pela luz (Feinbaum et al., Mol. Gen.

Genet. 226:449, 1991; Lam and Chua, Science 248:471, 1990; Mat- suoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590;

Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138), um elemento regulador induzível pelo hormônio vegetal (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990), e outros mais. Um elemento regulador induzível também pode ser o promotor do gene In2-1 ou ln2-2 do milho, o qual responde aos protetores de herbicida de benzenossulfonamida (Hershey et al., Mol.

Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32- 38, 1994), e o repressor Tet repressor de transpóson Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991). Os promotores induzíveis por estresse incluem os promotores induzíveis pelo estresse de sal/água tais como P5CS (Zang et al., (1997) Plant Sciences 129:81-89); pro- motores induzíveis pelo frio, tais como, cor15a (Hajela et al., (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm et al., (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wsc1 (Ouellet et al., (1998) FEBS Lett. 423-324- 328), ci7 (Kirch et al., (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), ci21A (Schneider et al., (1997) Plant Physiol. 113:335-45); promotores indu- zíveis pela seca, tais como Trg-31 (Chaudhary et al., (1996) Plant Mol.

Biol. 30:1247-57), rd29 (Kasuga et al., (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); promotores induzíveis osmóticos, tais como Rab17 (Vi- lardeli et ai, (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) e osmotina (Raghotha- ma et ai, (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28); e os promotores induzí- veis pelo calor, tais como as proteínas de choque térmico (Barros et ai, (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs et ai, (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters et ai, (1996) J. Experimental Botany 47:325-338), e o elemento induzível pelo choque térmico do promotor de ubiquitina da salsa (WO 03/102198). Outros promotores induzíveis pelo estresse incluem rip2 (Patente U.S. N- 5.332.808 e Publicação U.S. No. 2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et ai, (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340). Certos promotores são induzíveis por ferimentos, incluindo o promotor pMAS de Agrobacterium (Gueva- ra-Garcia et ai, (1993) Plant J. 4(3):495-505) e o promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen et ai, (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337- 343). [00123] Os promotores preferíveis do tecido podem ser utilizados para direcionar a transcrição e/ou a expressão acentuada dentro de um tecido vegetal em particular. Quando se refere à expressão prefe- rencial, se quer dizer expressão em um nível mais elevado no tecido vegetal particular do que em outros tecidos vegetais. Exemplos destes tipos de promotores incluem a expressão preferida da semente tal co- mo aquela fornecida pelo promotor de faseolina Bustos et ai, (1989) The Plant Cell Vol. 1, 839-853), e o gene de globulina-1 do milho (Be- langer, et ai (1991) Genetics 129:863-972). Para os dicotilédones, os promotores preferidos da semente incluem, mas não são limitados a estes, β-faseolina do feijão, napina, β-conglicinina, lecitina de soja, cruciferina, e outros mais. Para os monocotilédones, os promotores preferidos da semente incluem, mas não são limitadas a estes, 15 kDa zeína do milho, 22 kDa zeína, 27 kDa zeína, γ-zeína, ceras, encolhidos 1, encolhidos 2, globulina 1, etc. Os promotores preferidos da semente também incluem aqueles promotores que direcionam a expressão do gene predominantemente aos tecidos específicos dentro da semente tais como, por exemplo, o promotor preferencial do endosperma de γ- zeína, o promotor críptico do tabaco (Fobert et al., (1994) T-DNA tag- ging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577), o promotor P-gene do milho (Chopra et al., (1996) Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb- homologous proteins with C-terminal replacements. Plant Cell 7:1149- 1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109), o promotor de globulina-1 do milho (Belenger and Kriz (1991) Molecular basis for Allelic Polymor- phism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972), e os promotores que direcionam a expressão ao revestimento ou casca da semente dos grãos de milho, por exemplo, o promotor de glutamina sintetase específico do pericarpo (Muhitch et al., (2002) Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetasei_2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize.

Plant Science 163:865-872). [00124] Além do promotor, o cassete de expressão (que pode estar, por exemplo, em um vetor) tipicamente contém uma unidade de trans- crição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adici- onais requeridos para a expressão do ácido nucleico nas células hos- pedeiras, procarióticas ou eucarióticas. Um cassete de expressão típi- co assim contém um promotor operativamente ligado a uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto genético (por exemplo, uma proteína). O cassete de expressão também pode incluir elementos adicionais que são ligados de forma operacional de acordo com méto- dos conhecidos na técnica: os sinais requeridos para a poliadenilação eficiente do transcrito, o término da transcrição, os sítios de ligação ao ribossoma ou o término da translação. Adicionalmente, o cassete de expressão pode incluir intensificadores e/ou sinais de união heterólo- ga. [00125] Outros componentes do polinucleotídeo doador ou vetor podem ser incluídos, também dependendo do uso planejado do poli- nucleotídeo doador. Exemplos incluem os marcadores selecionáveis, direcionamento ou sequências reguladoras, sequências de peptídeos de trânsito tais como a sequência de peptídeo de trânsito otimizada (ver a Patente U.S. Ng 5.510.471) que estabiliza as sequências tais como RB7 MAR (ver Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692 e a Publicação de Patente Internacional No. WO 9727207) ou as sequências líderes, íntrons etc. As descrições e exemplos gerais de vetores de expressão de plantas e genes repórteres podem ser encon- trados em Gruber, et al., “Vectors for Plant Transformation” in Methods in Plant Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy, Glick et al eds; CRC

Press pp. 89-119 (1993). A seleção de um vetor de expressão apropri- ado irá depender do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão também irá in- cluir no terminal 3' da sequência de nucleotídeo heteróloga de interes- se, uma região de término da transcrição e translação funcional nas plantas. A região de término pode ser nativa com a sequência de nu- cleotídeo do promotor das modalidades da presente divulgação, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse, ou pode ser deriva- da de outra fonte. As regiões de término convenientes são disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de término da octopina sintase e nopalina sintase (nos) (Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) e Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Re- search vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)); ver também Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen et al.

Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990);

Bailas et al., Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nu- cleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987). [00126] Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter sequências líderes 5'. Tais sequências líderes podem atuar para au- mentar a translação. Os líderes de translação são conhecidos na téc- nica e incluem por meio de exemplo, os líderes de picornavírus, líder de EMCV (região de não codificação de encefalomiocardite 5'), Elroy- Stein etal., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:6126-6130 (1989); líderes de potyvírus, por exemplo, líder TEV (Tobacco Etch Virus) Carrington and Freed Journal ofVirology, 64:1590-1597 (1990), líder de MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus), Allison et al., Virology 154:9-20 (1986); proteína de ligação de cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP), Mace- jak et al., Nature 353:90-94 (1991); líder não transladado da proteína de revestimento mRNA do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4), Jobling et al., Nature 325:622-625 (1987); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV), Gallie et al., (1989) Molecular Biology of RNA, pages 237-256; e lidero do vírus malhado clorótico do milho (MCMV) Lommel et al., Virology 81:382-385 (1991). Ver também Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987). [00127] O constructo do cassete de expressão também pode conter sequências que aumentam a translação e/ou a estabilidade do mRNA tais como íntrons. Um exemplo é o primeiro íntrom II do gene da vari- ante de histona H3.III de Arabidopsis thaliana. Chaubet et al., Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992). [00128] Nesses casos onde é desejável para o cassete de expres- são expressar um produto genético que é direcionado para uma orga- nela particular, particularmente o plastídeo, amiloplasto, ou para o retí- culo endoplasmático, ou secretado na superfície da célula ou extrace- lularmente, o cassete de expressão pode ainda compreender uma se- quência de codificação para um peptídeo de trânsito. Tais peptídeos de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a estes, o peptídeo de trânsito para a proteína portadora de acila, a subunidade pequena de RUBISCO, EPSP sintase da planta e Helianthus annuus (Patente U.S. N- 5.510.417), peptídeo de trânsito de cloroplasto Zea mays Brittle-1 (Nelson et al., Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al., Plant Cell 3(12):1337-48; Sul- livan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004) e outros mais. Além disso, os peptídeos de trânsito de cloroplasto quimérico são conhecidos na técnica, tais como o Optimized Transit Peptide (Patente U.S. N- 5.510.471). Os peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais foram descritos anteri- ormente na Patente U.S. N- 5.717.084 e na Patente U.S. N- 5.728.925. Uma pessoa versada na técnica facilmente irá observar as muitas opções disponíveis na expressão de um produto em uma orga- nela particular. Por exemplo, a sequência de alfa-amilase de cevada é frequentemente utilizada para direcionar a expressão ao retículo en- doplasmático (Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)). [00129] Será observado por uma pessoa versada na técnica que o uso de tecnologias de DNA recombinante pode melhorar o controle da expressão das moléculas de ácido nucleico transfectadas através de manipulação, por exemplo, o número de cópias das moléculas de áci- do nucleico dentro da célula hospedeira, a eficiência com a qual essas moléculas de ácido nucleico são transcritas, a eficiência com que as transcrições resultantes são transladadas, e a eficiência de modifica- ções pós-translacionais. Adicionalmente, a sequência de promotor po- de ser geneticamente planejada para melhorar o nível de expressão em comparação com o promotor nativo. As técnicas recombinantes úteis para o controle da expressão de moléculas de ácido nucleico in- cluem, mas não são limitadas a estas, a integração estável das molé- culas de ácido nucleico em um ou mais cromossomas da célula hos- pedeira, a adição de sequências de estabilidade do vetor para plasmí- deos, substituições ou modificações dos sinais de controle da transcri- ção (por exemplo, promotores, operadores, intensificadores), substitui- ções ou modificações de sinais de controle de translação (por exem- plo, sítios de ligação ao ribossoma, sequências Shine-Dalgarno ou Ko- zak), a modificação de moléculas de ácido nucleico para corresponder ao uso de códons da célula hospedeira, e anulação das sequências que desestabilizam os transcritos. [00130] Os genes repórteres ou marcadores para seleção de célu- las ou tecidos ou partes de plantas ou plantas transformadas podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a anti- metabólitos tais como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, di- hidrofolato redutase, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13:143-149, 1994; ver também Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, (1983); Meijer et ai, Plant Mol. Bi- ol. 16:807-820, (1991)); neomicina fosfotransferase, que confere resis- tência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Her- rera-EstrelIa, EMBO J. 2:987-995, 1983 and Fraley et al., Proc. Natl.

Acad. Sei USA 80:4803 (1983)) e higromicina fosfotransferase, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32:481-485, (1984); see also Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, (1985); Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, (1995)); trpB, que permite que as célu- las utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as célu- las utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad.

Sei., USA 85:8047, (1988)); manose-6-fosfato isomerase, que permite que as células utilizem manose (Pedido de Patente Internacional No. WO 94/20627); ornitina descarboxilase, que confere resistência ao ini- bidor da ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO;

McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Bioloqy, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Aspergillus ter- reus, que confere resistência à blasticidina S (Tamura, Biosci. Bio- technol. Biochem. 59:2336-2338, (1995)). [00131] Os marcadores selecionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma acetolactato sintase mutante, que confere resistência a imidazolinona ou sulfonilureia (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, (1988)), um psbA mutante, que confere resistência a atrazina (Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, (1993)), ou um protoporfirinogen oxidase mutante (ver a Patente U.S. N- 5.767.373), ou outros marca- dores que conferem resistência a um herbicida tal como glufosinato.

Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não são limitados a estes, os genes que codificam para a resis- tência ao cloranfenicol (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, (1983)); estreptomicina (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, (1987)); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, (1996)); bleomicina (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, (1990)); sulfonamida (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, (1990)); bromoxinila (Stalker et al., Science 242:419-423, (1988)); gli- fosato (Shaw et al., Science 233:478-481, (1986)); fosfinotricina (De- Block et al., EMBO J. 6:2513-2518, (1987)), e outros mais. [00132] Uma opção para uso de um gene seletivo é um DNA que codifica resistência ao glufosinato e em uma modalidade pode ser a fosfinotricina acetil transferase (pat), gene de pat otimizado de milho ou gene bar sob o controlo do promotor do Vírus do Mosaico da Ner- vura de Mandioca. Estes genes conferem resistência a bialafos. Ver, (ver, Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993;

White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer et al., Theor.

Appl. Genet. 79:625-631, 1990; and Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989). Uma versão do gene pat é o gene pat otimizado de milho, descrito na Patente U.S. N2 6.096.947. [00133] Além disso, os marcadores que facilitam a identificação de uma célula vegetal contendo o polinucleotídeo que codifica o marcador podem ser empregados. Os marcadores contáveis ou rastreáveis são úteis, onde a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem destruição da célula vegetal. Exemplos incluem uma β-glucuronidase, ou o gene uidA (GUS), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, as Patentes U.S. N— 5.268.463 e 5.599.670); cloranfeni- col-acetil-transferase (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador utilizado é o beta-caroteno ou a provitamina A (Ye et al., Science 287:303-305-(2000)). O gene foi utilizado para melhorar a nu- trição de arroz, mas neste caso é empregado em vez disso como um marcador detectável, e a presença do gene ligado a um gene de inte- resse é detectada pela cor dourada fornecida. Ao contrário da situação onde o gene é utilizado para a sua contribuição nutricional à planta, uma quantidade menor da proteína é suficiente para os propósitos de marcação. Outros marcadores rastreáveis incluem os genes de anto- cianina/flavonoide em geral (Ver o debate em Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127) incluindo, por exemplo, um gene R-lócus, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos de an- tocianina (cor vermelha) nos tecidos vegetais (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); os genes que contro- lam a biossíntese dos pigmentos flavonoides, tais como o gene C1 do milho (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al., Mol.

Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e C2 do milho (Wienand et al., Mol.

Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene p1 (Grotewold et al., Proc. Natl. Acad.

Sei USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76:543- 553; Sidorenko et ai, Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); os genes locus de bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), entre outros. [00134] Outros exemplos de marcadores adequados incluem o ge- ne da proteína fluorescente de ciano (CYP) (Boite et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato et al., (2002) Plant Physiol 129: 913-42), o gene da proteína fluorescente amarela (PHIYFP™ da Evrogen; ver Boite et al., (2004) J. Cell Science 117: 943-54); um gene lux, o qual codifica uma luciferase, a presença do qual pode ser detectado utili- zando, por exemplo, película de raio-X, contagem de cintilação, espec- trofotometria fluorescente, câmaras de vídeo de baixa luminosidade, câmaras de contagem de fótons ou luminometria com múltiplas cavi- dades (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); um gene da proteína fluo- rescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84); e DsRed2 onde as células vegetais transformadas com o gene marcador são de cor vermelha, e assim visualmente selecionáveis (Dietrich et al., (2002) Biotechniques 2(2):286-293). Exemplos adicionais incluem um gene de β-lactamase (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalospo- rina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad.

Sei. U.S.A. (1983) 80:1101), que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter os catecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Iku- ta et al., Biotech. (1990) 8:241); e um gene de tirosinase (Katz et al., J.

Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona, que por sua vez se con- densa para formar o composto facilmente detectável melanina. Clara- mente, muitos desses marcadores são disponíveis e conhecidos da pessoa versada na técnica. [00135] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos do transgene que codifica um produto genético em um cassete de ex- pressão pode ser opcionalmente combinada com outra sequência de nucleotídeo de interesse no cassete e/ou na planta. O termo "sequên- cia de nucleotídeo de interesse" refere-se a uma molécula de ácido nucleico (que também pode ser referida como um polinucleotídeo) que pode ser uma molécula de RNA transcrita, assim como a molécula de DNA, que codifica um polipeptídeo ou proteína desejada, mas também pode referir-se às moléculas de ácido nucleico que não constituem um gene completo, e que não necessariamente codificam um polipeptídeo ou uma proteína (por exemplo, um promotor). Por exemplo, em certas modalidades do transgene pode ser combinado ou "empilhado" com outra sequência de nucleotídeo de interesse que fornece uma resis- tência ou tolerância adicional ao glifosato ou outro herbicida, e/ou for- nece a resistência aos insetos ou doenças selecionadas e/ou melhoras nutricionais, e/ou características agronômicas melhoradas, e/ou prote- ínas ou outros produtos úteis em ração, alimentos, produtos industri- ais, produtos farmacêuticos ou outros usos. O "empilhamento" de duas ou mais sequências de ácido nucleico de interesse dentro do genoma de planta pode ser conseguido, por exemplo, por meio da reprodução convencional de plantas utilizando dois ou mais eventos, da transfor- mação de uma planta com um constructo que contém as sequências de interesse, da re-transformação de uma planta transgênica, ou da adição de novas características através da integração direcionada por meio da recombinação homóloga. [00136] Tais sequências de nucleotídeo de interesse incluem, mas não são limitadas a estas, aqueles exemplos de genes ou sequências de codificação que conferem (1) resistência a pragas ou doença, (2) resistência a herbicidas, e (3) as características de valor adicionadas fornecidas abaixo: Genes ou Sequências de Codificação (por exemplo, iRNA) que confe- rem Resistência às Pragas ou Doença [00137] Genes de Resistência a Doença da Planta. As defesas da planta são muitas vezes ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene da falta de virulência correspondente (Avr) no patógeno.

Uma variedade de planta pode ser transformada com o gene de resis- tência clonado em plantas planejadas que são resistentes às cepas de patógenos específicos. Exemplos de tais genes incluem, o gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), o gene Pto do tomate, o qual codifica uma proteína cinase, para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262:1432), e o gene RSSP2 de Arabidopsis para re- sistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089). [00138] Uma proteína de Bacillus thuringiensis, seu derivado ou um polipeptídeo sintético nela modelado, tal como, uma sequência de nu- cleotídeo de um gene de Bt δ-endotoxina (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), e um gene de inseticida vegetativo (VIP) (ver, por exemplo, Estruch et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93:5389-94). Além do mais, as moléculas de DNA que codificam os genes de δ-endotoxina podem ser adquiridas da American Type Culture Collection (Rockviile, Md.), sob os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. [00139] Uma lecitina, tal como, as sequências de nucleotídeo de vários genes de lecitina de ligação a manose Clivia miniata (Van Da- mme et ai, 1994 Plant Molec. Biol. 24:825). [00140] Uma proteína de ligação a vitamina, tal como avidina e ho- mólogos de avidina que são úteis como iarvicidas contra pragas de inseto. Ver a Patente U.S. N2 5.659.026. [00141] Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor da pro- tease ou um inibidor da amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor da cisteína proteinase do arroz (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor da proteinase do tabaco I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Bioi. 21:985), e um inibidor da α-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243). [00142] Um hormônio específico de inseto ou feromônio tal como um ecdiesteroide e hormônio juvenil e uma variante deste, um miméti- co nele baseado, ou um antagonista ou agonista deste, tal como a ex- pressão de baculovírus de hormônio esterase juvenil clonado, um ina- tivador do hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344:458). [00143] Um peptídeo ou neuropeptídeo específico de inseto que, após a expressão, despedaça a fisiologia da praga afetada (J. Biol.

Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hor- mônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989), e neurotoxinas paralisantes es- pecíficas de inseto (Patente U.S. N- 5.266.361). [00144] Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc, tal como um peptídeo insetotóxico de es- corpião (Pang, (1992) Gene 116:165). [00145] Uma enzima responsável por uma hiperacúmulo de mono- terpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um deri- vado de fenilpropanoide ou outra molécula não protéica com atividade inseticida. [00146] Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modifi- cação pós-translacional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipo- lítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, uma poli- merase, um elastase, uma quitinase e uma glucanase, natural ou sin- tética. Exemplos de tais genes incluem, um gene callas (pedido publi- cado PCT WO 93/02197), sequências de codificação da quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, da ATCC sob os números de acesso 3999637 e 67152), quitinase de ancilóstomo do tabaco (Kramer et ai, (1993) Insect Molec. Biol. 23:691), e o gene de ubi4-2 poliubiquitina da salsa (Kawalleck etal., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673). [00147] Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Exem- plos de tais moléculas incluem as sequências de nucleotídeo para os clones de cDNA de calmodulina do feijão mung (Botella et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeo de um clo- ne de cDNA de calmodulina do milho (Griess et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467). [00148] Um peptídeo momento hidrofóbico. Ver as Patentes U.S. N— 5.659.026 e 5.607.914.; este último ensina peptídeos antimicrobia- nos sintéticos que conferem resistência a doenças. [00149] Uma membrana permease, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo lítico de cecro- pina-β (Jaynes et al., (1993) Plant Sei. 89:43) que torna as plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum. [00150] Uma proteína viral invasiva ou uma toxina complexa deri- vada desta. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral nas células vegetais transformadas confere resistência à infecção virai e/ou ao desenvolvimento de doença efetuado pelo vírus do qual o ge- ne da proteína de revestimento é derivado, assim como pelos vírus relacionados. Resistência mediada pela proteína de revestimento foi conferida sobre as plantas transformadas contra o vírus do mosaico da alfalfa, vírus do mosaico do pepino, vírus listrado do tabaco, vírus da batata X, vírus da batata Y, vírus de corrosão do tabaco, vírus de cho- calho do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Ver, por exemplo, Beachy etal., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. [00151] Um anticorpo específico do inseto ou uma imunotoxina des- te derivado. Assim, um anticorpo direcionado a uma função metabólica crítica no intestino do inseto deve inativar uma enzima afetada, matan- do o inseto. Por exemplo, Taylor et ai, (1994) Abstract #497, Seventh lnt'l. O Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions mostra a inativação enzimática no tabaco transgênico através da produção de fragmentos de anticorpos de cadeia única. [00152] Um anticorpo específico do vírus. Ver, por exemplo, Tavla- doraki et ai, (1993) Nature 266:469, que mostra que as plantas trans- gênicas que expressam os genes de anticorpos recombinantes são protegidas do ataque viral. [00153] Uma proteína de interrupção do desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, as endo a-1,4-D poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização de fungos e libe- ram nutrientes vegetais através da solubilização da parede celular ve- getal homo-a-1,4-D-galacturonase (Lamb et al., (1992) Bio/Technology 10:1436). A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína inibidora da endopoligalacturonase do feijão são descri- tas por (Toubart et al., (1992) Plant J. 2:367). [00154] Uma proteína de interrupção do desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como o gene de inativação do ribos- soma da cevada que fornece uma maior resistência à doença fúngica (Longemann et al., (1992). Bio/Technology 10:3305).

[00155] Interferência de RNA, em que um polinucleotídeo de DNA que codifica uma molécula de RNA é utilizado para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA em um exemplo é parcial ou totalmente de filamento duplo, o que deflagra uma resposta de silenci- amento, resultando na divagem do dsRNA em pequenos RNAs inter- ferentes, que são depois incorporados em um complexo de direciona- mento que destrói os mRNAs homólogos. Ver, por exemplo, Fire et al., Patente U.S. N2 6.506.559; Graham et al., Patente U.S. N2 6.573.099.

Genes ou Sequências de Codificação que Conferem Resistência a um Herbicida [00156] Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbi- cida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazalinona, sulfonanilida ou herbicida de sulfonilureia. Os genes exemplares nesta categoria codificam uma enzima ALS mutante (Lee et al., (1988) EMBOJ. 7:1241), que também é conhecida como enzima AHAS (Miki et ai, (1990)Theor. Appl. Genet. 80:449). [00157] Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância ao glifosato conferida pelos genes da EPSP sintase e aroA mutantes, ou através de inativação metabólica por genes tais como GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos de fosfono tais como glufosinato (genes pat e bar; DSM-2); e ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo-hexanodionas (genes de codi- ficação inibidores de ACCase), Ver, por exemplo, a Patente U.S. N- 4.940.835, que divulga a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o Núme- ro de Acesso ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeo do gene mu- tante é divulgada na Patente U.S. N2 4.769.061. O pedido de Patente Europeu No. 0 333 033 e a Patente U.S. N2 4.975.374 divulgam as se- quências de nucleotídeo dos genes de glutamina sintetase que confe- rem resistência a herbicidas tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene de fosfinotricina acetil-transferase é fornecida no pedido de Patente Europeu No. 0 242 246. De Greef et al., (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam os genes bar quiméricos que codificam a atividade de fos- finotricina acetil transferase. Exemplares dos genes que conferem re- sistência aos ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo-hexanodionas, tais como setoxidim e haloxifop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435. [00158] Os genes que codificam resistência ou tolerância a um her- bicida que inibe a fotossíntese, tais como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla et al., (1991) Plant Cell 3:169 descrevem o uso de plasmídeos que codificam os genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. As sequências de nucleotídeo para os genes de nitrilase são divulgadas na Patente U.S. N2 4.810.648, e as moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis sob os números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão de DNA que codificam uma glutationa S- transferase são descritas por Hayes et al., (1992) Biochem. J. 285:173. [00159] Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbi- cida que se liga a hidroxifenilpiruvato dioxigenases (HPPD), enzimas que catalisam a reação em que o para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isto inclui herbicidas, tais como iso- xazóis (Patente Européia No. 418175, Patente Européia No. 470856, Patente Européia No. 487352, Patente Européia No. 527036, Patente Européia No. 560.482, Patente Européia No. 682659, Patente U.S. N- 5.424.276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para o milho, dicetonitrilas (Patente Européia No. 496630 e Patente Euro- péia No. 496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4- CF3 fenil) propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4- 2,3CI2fenil) propano-1,3-diona, tricetonas (Patente Européia No. 625.505, Patente Européia No. 625.508, Patente U.S. N2 5.506.195), em particular sulcotriona e pirazolinatos. Um gene que produz um ex- cesso de HPPD nas plantas pode fornecer tolerância ou resistência a tais herbicidas, incluindo, por exemplo, os genes descritos nas Patente U.S. N— 6.268.549 e 6.245.968 e Pedido de Patente U.S., Publicação No. 20030066102. [00160] Genes que codificam resistência ou tolerância aos herbici- das de fenóxi auxina, tais como o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D) e que podem também conferir resistência ou tolerância aos herbici- das de ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes inclu- em o gene de enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (aad-1), descrito na Patente U.S. N- 7.838.733. [00161] Genes que codificam resistência ou tolerância aos herbici- das de fenóxi auxina, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que também podem conferir resistência ou tolerância aos herbicidas de piridilóxi auxina, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a- cetogiutarato (aad-12), descrito na WO 2007/053482 A2. [00162] Genes que codificam a resistência ou tolerância a dicamba (ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 20030135879). [00163] Genes que fornecem resistência ou tolerância a herbicidas que inibem a protoporfirinogen oxidase (PPO) (ver a Patente U.S. N- 5.767.373). [00164] Genes que fornecem resistência ou tolerância aos herbici- das de triazina (tais como atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tais como diuron) que se ligam a proteínas do núcleo dos centros de reação de fotossistema II (PS II) (Ver Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245).

Genes que Conferem ou Contribuem com uma Característica de Valor Agregado [00165] Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, atra- vés da transformação do milho ou Brassica com um gene anti-sentido ou estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon et al., (1992) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89:2624). [00166] Diminuição do teor de fitato. [00167] Introdução de um gene de codificação de fitase, tal como o gene de fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveidt et al., (1993) Gene 127:87), aumenta a decomposição química do fitato, adição de mais fosfato livre na planta transformada. [00168] Um gene pode ser introduzido que reduz o teor de fitato. No milho, isso, por exemplo, pode ser executado pela clonagem e depois pela reintrodução do DNA associada com o único alelo que é respon- sável pelos mutantes de milho caracterizado por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., (1990) Maydica 35:383). [00169] Composição do carboidrato modificado efetuada, por exemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido. Exemplos de tais enzimas incluem, o gene da frutosiltransferase de Streptococ- cus muco (Shiroza et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810), gene da levan- sucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genel. 200:220), α-amilase de Bacillus licheniformis (Pen et al., (1992) Bio/Technology 10:292), genes da invertase do tomate (Elliot et al., (1993), gene de amylase da cevada (Sogaard et al., (1993) J. Biol.

Chem. 268:22480), e a enzima II de ramificação de amido do endos- perma de milho (Fisher et al., (1993) Plant Physiol. 102:10450).

Nuclease específica de sítio [00170] Nas modalidades, os métodos e composições aqui descri- tos fazem uso de uma ou mais nucleases específicas do sítio. Os mé- todos divulgados compreendem a liberação de um ou mais polinucleo- tídeos que codificam as nucleases específicas do sítio no tecido haplo- ide competente de transformação derivado de micrósporos de milho.

Estas nucleases específicas do sítio podem modificar o DNA genômico através da divagem do DNA ou indução de quebras no DNA, que po- dem ser quebras de filamento duplo ou quebras de filamento único. As modalidades de nucleases específicas do sítio incluem um TALEN, uma meganuclease, uma CRISPR-nuclease, ou uma Nuclease Dedo de Zinco. [00171] Em uma modalidade, a nuclease específica do sítio utiliza- da nos métodos divulgados é uma nuclease TALEN planejada (de ocorrência não natural). Ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 20110301073, aqui incorporada por referência na sua totali- dade. As bactérias patogênicas da planta do gênero Xanthomonas são conhecidas de provocar muitas doenças nas plantas de cultivo impor- tantes. A patogenicidade de Xanthomonas depende de um sistema de secreção do tipo III conservado (T3S) que injeta mais do que diferen- tes proteínas efetoras dentro da célula vegetal. Entre estas proteínas injetadas estão os efetores semelhantes ao ativador da transcrição (TALEN) que imitam os ativadores da transcrição da planta e manipu- lam a transcriptoma da planta (ver Kay et al (2007) Science 318:648- 651). Estas proteínas contêm um domínio de ligação de DNA ao efetor TAL e um domínio de ativação da transcrição. Um dos efetores TAL mais bem caracterizados é AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv.

Vesicatoria (ver Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 e WO 2010079430). Os efetores TAL contêm um domínio centralizado de repetições em tandem, cada repetição contendo aproximadamente 34 aminoácidos, que são fundamentais para a especificidade de ligação de DNA dessas proteínas. Além disso, eles contêm uma sequência de localização nuclear e um domínio de ativação transcricional acídico (para uma revisão ver Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Nas bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum dois genes, designados brg11 e hpx17 foram observados de serem homó- logos à família AvrBs3 de Xanthomonas na cepa de R. solanacearum biovar GMI1000 e na cepa biovar 4 RS1000 (Ver Heuer et al (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384). Estes genes são 98,9 % idênticos na sequência de nucleotídeo entre si, mas diferem por uma anulação de 1575 pb no domínio de repetição de hpx17. No entanto, ambos os produtos genéticos possuem menos de 40 % de identidade de sequência com as proteínas da família AvrBs3 de Xanthomonas.

Ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 20110301073, incorporada por referência na sua totalidade. [00172] A especificidade destes efetores TAL depende das sequên- cias do domínio de repetições em tandem. Em certos exemplos, cada sequência repetida compreende aproximadamente 102 pb; e as repe- tições são tipicamente 91 a 100 % homologas entre si (Bonas et al, ibid). As repetições tipicamente incluem um polimorfismo, que está ge- ralmente localizado nas posições 12 e 13 e parece haver uma corres- pondência de um para um entre a identidade dos resíduos duplos hi- pervariáveis nas posições 12 e 13 com a identidade dos nucleotídeos contíguos na sequência alvo do efetor TAL (ver Moscou and Bogdano- ve, (2009) Science 326:1501 and Boch et al (2009) Science 326:1509- 1512). Experimentalmente, o código natural para o reconhecimento do DNA destes efetores TAL foi determinado de tal modo que uma se- quência de HD nas posições 12 e 13 leva a uma ligação a citosina (C), NG se liga a T, NI a A, C, G ou T, NN se liga a A ou G, e ING se liga a T. Estas repetições de ligação de DNA foram montadas nas proteínas com novas combinações e números de repetições, para produzir fato- res de transcrição artificiais que são capazes de interagir com as no- vas sequências e ativar a expressão de um gene repórter não endó- geno nas células vegetais (Boch et al, ibid). As proteínas TAL planeja- das foram ligadas a uma metade de domínio de divagem Fokl para produzir uma fusão de nuclease de domínio efetor TAL (TALEN) que apresenta atividade em um ensaio de repórter de levedura (alvo com base no plasmídeo). [00173] Em outra modalidade, a nuclease específica do sítio utiliza- da nos métodos da divulgação pode ser planejada para incluir uma meganuclease (de ocorrência não natural) (também descrita como uma endonuclease migrante). As sequências de reconhecimento das endonucleases migrantes ou meganucleases tais como l-Scel, \-Ceu\, Pl-Pspl, Pl-Sce, 1-ScelV, \-Csm\, \-Pan\, l-Scell, l-Ppol, l-Scelll, l-Crel, \-Tev\, \-Tev\\ e \-Tev\\\ são conhecidas. Ver também a Patente U.S. N- 5.420.032; Patente U.S. N° 6.833.252; Belfort eí al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118;

Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180;

Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo New En- gland Biolabs. Além disso, a especificidade de ligação de DNA das endonucleases migrantes e meganucleases pode ser manipulada para ligar os sítios alvos não naturais. Ver, por exemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicação de Patente U.S.

No. 20070117128. Os domínios de ligação ao DNA das endonuclea- ses migrantes e das meganucleases podem ser alterados no contexto da nuclease como um todo (isto é, de tal modo que a nuclease inclui o domínio de divagem cognato) ou podem ser fundidos com um domínio de divagem heterólogo. [00174] Em outras modalidades, a nuclease específica do sítio utili- zada nos métodos divulgados é uma nuclease CRISPR planejada (de ocorrência não natural). O sistema de nuclease CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR As- sociated) é um sistema de nuclease recentemente planejado com base em um sistema bacteriano que pode ser utilizado para o constructo do genoma. Baseia-se em parte da resposta imune adaptativa de muitas bactérias e Archea. Quando um vírus ou plasmídeo invade uma bacté- ria, os segmentos de DNA do invasor são convertidos em CRISPR RNAs (crRNA) pela resposta "imune". Este crRNA então se associa, através de uma região de complementaridade parcial, com outro tipo de RNA chamado tracrRNA para guiar a nuclease Cas (por exemplo, Cas9) para uma região homóloga ao crRNA no DNA alvo chamado um "protospacer". A nuclease Cãs cliva o DNA para gerar extremidades cegas no DSB em locais especificados por uma sequência guia conti- da dentro da transcrição de crRNA. Cas9 requer tanto o crRNA quanto o tracrRNA para reconhecimento e divagem do DNA específico do sí- tio. Este sistema foi agora planejado de tal modo que o crRNA e o tracrRNA podem ser combinados em uma molécula (o "RNA guia úni- co"), e a parte equivalente de crRNA do RNA guia único pode ser pla- nejada para guiar a nuclease Cas9 para direcionar qualquer sequência desejada (ver Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, e David Segai, (2013) eLife 2:e00563). Assim, o sistema CRISPR/Cas pode ser planejado para criar uma quebra de filamento duplo (DSB) em um alvo desejado em um genoma, e a repa- ração do DSB pode ser influenciada pela utilização de inibidores de reparo para provocar um aumento no reparo propenso a erro. [00175] Em certas modalidades, a nuclease Cas pode ser um "deri- vado funcional" de uma nuclease Cas de ocorrência natural. Um "deri- vado funcional" de um polipeptídeo de sequência nativa é um compos- to que possui uma propriedade biológica qualitativa em comum com um polipeptídeo de sequência nativa. Os "derivados funcionais" inclu- em, mas não são limitados a estes, fragmentos de uma sequência na- tiva e derivados de um polipeptídeo de sequência nativa e seus frag- mentos, contanto que eles possuam uma atividade de nuclease em comum com um polipeptídeo de sequência nativa correspondente. A atividade de nuclease aqui contemplada é a capacidade do derivado funcional em hidrolisar um substrato de DNA nos fragmentos. O termo "derivado" abrange tanto as variantes de sequência de aminoácido do polipeptídeo, modificações covalentes, quanto as suas fusões. Os de- rivados adequados de uma nuclease Cas ou um fragmento de nu- clease destes incluem, mas não são limitados a estes, mutantes, fu- sões, as modificações covalentes de proteína Cas ou um fragmento de nuclease destes. A nuclease Cas, ou seus derivados funcionais, po- dem ser obtidos de uma célula ou quimicamente sintetizados ou por uma combinação destes dois procedimentos. A célula pode ser uma célula que naturalmente produz a nuclease Cas, ou uma célula que naturalmente produz a nuclease Cas e é geneticamente planejada pa- ra produzir a proteína Cas endógena em um nível de expressão mais elevado, ou para produzir uma nuclease Cas a partir de um ácido nu- cleico exogenamente introduzido, cujo ácido nucleico codifica uma nu- clease Cas que é a mesma ou diferente da Cas endógena. Em alguns casos, a célula não produz naturalmente a proteína Cas e é genetica- mente planejada para produzir uma nuclease Cas. A nuclease Cas é disposta nas células de mamífero (e putativamente dentro das células vegetais) pela co-expressão da nuclease Cas com o RNA guia. Duas formas de RNAs guias podem ser utilizadas para facilitar a divagem do genoma mediada por CAS como divulgado em Le Cong, F., et al., (2013) Science 339(6121):819-823. [00176] Em certas modalidades, o domínio de ligação de DNA de uma ou mais das nucleases utilizadas para a divagem in vivo e/ou a divagem direcionada do genoma de uma célula compreende uma pro- teína dedo de zinco. Em algumas modalidades, a proteína dedo de zinco é de ocorrência não natural e é planejada para se ligar a um sítio alvo de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313- 340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segai et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr.

Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Patentes U.S. N— 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689,558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070,934; 7.361,635; 7.253.273; e Publicações de Patente U.S. Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061, todos aqui incorporados por referência na sua totalidade. [00177] Um domínio de ligação dedo de zinco planejado pode ter uma nova especificidade de ligação, em comparação com uma proteí- na dedo de zinco de ocorrência natural. Os métodos de planejamento incluem, mas não são limitados a estes, projeto racional e vários tipos de seleção. O projeto racional inclui, por exemplo, o uso de bancos de dados compreendendo sequências de nucleotídeo tripleto (ou quadru- pleto) e sequências de ácido aminoácido dedo de zinco individuais, em que cada sequência de nucleotídeo tripleto ou quadrupleto está asso- ciada com uma ou mais sequências de aminoácido de dedos de zinco que se ligam à sequência tripleto ou quadrupleto particular. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N— 6.453.242 e 6.534.261, aqui incorpora- das por referência na sua totalidade. [00178] A seleção de sítios alvos; ZFPs e métodos para a concep- ção e construção de proteínas de fusão (e os polinucleotídeos que as codificam) são conhecidos daqueles de habilidade na técnica e descri- tos com detalhes nas Patentes U.S. N— 6.140.0815.; 789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759;

WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO

00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO

98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496. [00179] Além disso, os domínios dedo de zinco e/ou as proteínas dedo de zinco de múltiplas utilidades podem ser ligados entre si utili- zando quaisquer sequências ligantes adequadas, incluindo, por exem- plo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Ver, também, as Patentes U.S. N— 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 para sequên- cias ligantes exemplares de 6 ou mais aminoácidos de comprimento.

As proteínas aqui descritas podem incluir qualquer combinação de li- gantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína. [00180] Assim, nos métodos para a integração de um polinucleotí- deo doador aqui divulgado, a nuclease específica do sítio compreende um domínio de ligação ao DNA que se liga especificamente a um sítio alvo em um lócus no genoma do milho em que se deseja inserir o poli- nucleotídeo de DNA doador (que pode compreender pelo menos um transgene). [00181] Qualquer domínio de divagem adequado pode ser operati- vamente ligado a um domínio de ligação de DNA para formar uma pro- teína de fusão de nuclease. Por exemplo, os domínios de ligação de DNA ZFP foram fundidos com os domínios de nuclease para criar as ZFNs - uma entidade funcional que é capaz de reconhecer o seu alvo de ácido nucleico planejado através do seu domínio de ligação ao DNA planejado (ZFP) e fazer com que o DNA seja cortado próximo do sítio de ligação ao ZFP através da atividade de nuclease. Ver, por exemplo, Kim et aí. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93(3):1156-1160.

Mais recentemente, as ZFNs têm sido utilizadas para a modificação do genoma em uma variedade de organismos. Ver, por exemplo, as Pu- blicações de Patente dos Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; e Publicação Internacional WO 07/014275. Da mesma forma, os domínios de ligação ao DNA TALEN foram fundidos com os domínios de nuclease para criar TALENS. Ver, por exemplo, a Publi- cação U.S. No. 20110301073. [00182] Conforme observado acima, o domínio de divagem pode ser heterólogo ao domínio de ligação do DNA, por exemplo, um domí- nio de ligação de DNA dedo de zinco e um domínio de divagem de uma nuclease diferente ou um domínio de ligação ao DNA TALEN e um domínio de divagem de uma nuclease diferente, ou um domínio de ligação do DNA da meganuclease e o domínio de divagem de uma nuclease diferente. Os domínios de divagem heterólogos podem ser obtidos a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. As endo- nucleases exemplares das quais um domínio de divagem pode ser derivado incluem, mas não são limitados a estas, endonucleases de restrição e endonucleases migrantes. Ver, por exemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. As enzimas adicionais que clivam o DNA adicionais são conhecidas (por exemplo, S1 Nuclease; nuclease de feijão mung; DNase I pancreática; nuclease microcócica; endonu- clease de levedura HO; ver também Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais destas enzimas (ou seus fragmentos funcionais) podem ser utilizadas como uma fonte de domínios de divagem e semi-domínios de divagem. [00183] Similarmente, um semi-domínio de divagem pode ser deri- vado de qualquer nuclease ou uma parte desta, como apresentado acima, que requer a dimerização para a atividade de divagem. Em ge- ral, duas proteínas de fusão são requeridas para a divagem, se as proteínas de fusão compreendem semi-domínios de divagem. Alterna- tivamente, uma única proteína que compreende dois semi-domínios de divagem pode ser utilizada. Os dois semi-domínios de divagem po- dem ser derivados da mesma endonuclease (ou seus fragmentos fun- cionais), ou cada semi-domínio de divagem pode ser derivado de uma endonuclease diferente (ou seus fragmentos funcionais). Além disso, os sítios alvos para as duas proteínas de fusão são de preferência dis- postos, em relação de um com o outro, de tal modo que a ligação das duas proteínas de fusão aos seus respectivos sítios alvos coloca os semi-domínios de divagem em uma orientação espacial entre si que permite os semi-domínios de divagem formar um domínio de divagem funcional, por exemplo, pela dimerização. Assim, em certas modalida- des, as arestas próximas dos sítios alvos são separadas por 5 a 8 nu- cleotídeos ou por 15 a 18 nucleotídeos. No entanto, qualquer número inteiro de nucieotídeos ou pares de nucleotídeo pode intervir entre os dois sítios alvos (por exemplo, de 2 a 50 pares de nucieotídeos ou mais). Em geral, o sítio de divagem se situa entre os sítios alvos. [00184] As endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação específica da sequências ao DNA (em um sítio de reconhecimento), e o DNA de di- vagem no ou perto do sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) clivam o DNA nos sítios removidos do sítio de reconhecimento e possuem domínios de ligação e divagem separá- veis. Por exemplo, a enzima Tipo IIS Fok I catalisa a divagem de fila- mento duplo do DNA, em 9 nucieotídeos a partir do seu sítio de reco- nhecimento em um filamento e 13 nucieotídeos a partir do seu sítio de reconhecimento sobre o outro. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N— 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; assim como Li et al. (1992) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. As- sim, em uma modalidade, as proteínas de fusão compreendem o do- mínio de divagem (ou meio-domínio de divagem) de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação dedo de zinco, os quais podem ou não ser planejados. [00185] Uma enzima de restrição Tipo IIS exemplar, cujo domínio de divagem é separável do domínio de ligação, é Fok I. Esta enzima particular é ativa como um dímero. Bitinaite et al., (1998) Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 95: 10,570-10,575. Consequentemente, para os pro- pósitos da presente divulgação, a parte da enzima Fok I utilizada nas proteínas de fusão divulgadas é considerada um semi-domínio de di- vagem. Assim, para a divagem de filamento duplo direcionada e/ou substituição direcionada das sequências celulares utilizando fusões dedo de zinco-Fok I, duas proteínas de fusão, cada uma compreen- dendo um semi-domínio de divagem Fok I, podem ser utilizadas para reconstituir um domínio de divagem cataliticamente ativo. Alternativa- mente, uma única molécula de polipeptídeo contendo um domínio de ligação dedo de zinco e dois semi-domínios de divagem Fok I também pode ser utilizada. Parâmetros para a divagem direcionada alvo e alte- ração de sequência direcionada utilizando fusões de dedo de zinco- Fok I são fornecidos em outras partes desta divulgação. [00186] Um domínio de divagem ou semi-domínio de divagem po- de ser qualquer parte de uma proteína que retém a atividade de diva- gem, ou que retém a capacidade de multimerizar (por exemplo, dime- rizar), para formar um domínio de divagem funcional. [00187] Exemplos de enzimas de restrição Tipo IIS são descritos na Publicação do Pedido de Patente Internacional WO 07/014275, aqui incorporada na sua totalidade. As enzimas de restrição adicionais também contêm os domínios de ligação e divagem separáveis, e es- tes são contemplados pela presente divulgação. Ver, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420. [00188] Em certas modalidades, o domínio de divagem compreen- de uma ou mais semi-domínios de divagem planejados (também refe- ridos como mutantes do domínio de dimerização) que minimizam ou impedem a homodimerização, tal como descrito, por exemplo, nas Pu- blicações de Patente U.S. Nos. 20050064474; 20060188987; 20070305346 e 20080131962, cujas divulgações de todas são aqui incorporadas por referência nas suas totalidades. Os resíduos de ami- noácido nas posições 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 e 538 de Fok I são todos alvos para influenciar a dimerização dos semi-domínios de divagem de Fok I. [00189] Os semi-domínios de divagem planejados exemplares de Fok I que formam heterodímeros obrigatórias incluem um par em que um primeiro semi-domínio de divagem inclui mutações nos resíduos de aminoácido nas posições 490 e 538 de Fok I e um segundo semi- domínio de divagem inclui mutações nos resíduos de aminoácido 486 e 499. [00190] Deste modo, em uma modalidade, uma mutação em 490 substitui Glu (E) com Lys (K); a mutação em 538 substitui Iso (I) com Lys (K); a mutação em 486 substituiu Gin (Q) com Glu (E); e a muta- ção na posição 499 substitui Iso (I) com Lys (K). Especificamente, os semi-domínios de divagem planejados aqui descritos foram prepara- dos através da mutação das posições 490 (E —> K) e 538 (I —» K) em um semi-domínio de divagem para produzir um semi-domínioo de di- vagem planejado designado "E490K:I538K" e através da mutação das posições 486 (Q —» E) e 499 (I —» L) em outro semi-domínio de diva- gem para produzir um semi-domínio de divagem planejado designado "Q486E:I499L". Os semi-domínios de divagem planejados aqui descri- tos são mutantes heterodiméricos obrigatórios em que a divagem aberrante é minimizada ou abolida. Ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 2008/0131962, cuja divulgação é incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos. Em certas mo- dalidades, o semi-domínio de divagem planejado compreende muta- ções nas posições 486, 499 e 496 (numeradas em relação ao Fokl tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem o resíduo Gin (Q) tipo selvagem na posição 486 com um resíduo Glu (E), o resíduo Iso (I) tipo selvagem na posição 499 com um resíduo Leu (L) e o resíduo Asn (N) tipo selvagem na posição 496 com um resíduo Asp (D) ou Glu (E) (também referido como domínios "ELD" e "ELE", respectivamente).

Em outras modalidades, o semi-domínio de divagem planejado com- preende mutações nas posições 490, 538 e 537 (numeradas em rela- ção ao Fokl tipo selvagem), por exemplo, mutações que substituem o resíduo Glu (E) tipo selvagem na posição 490 com um resíduo Lys (K), o resíduo Iso (I) tipo selvagem na posição 538 com um resíduo Lys (K), e ο resíduo His (H) tipo selvagem na posição 537 com um resíduo Lys (K) ou um resíduo Arg (R) (também referido como domínios "KKK" e "KKR", respectivamente). Em outras modalidades, o semi-domínio de divagem planejado compreende mutações nas posições 490 e 537 (numeradas em relação ao Fokl tipo selvagem), por exemplo, muta- ções que substituem o resíduo Glu (E) tipo selvagem na posição 490 com um resíduo Lys (K) e o resíduo His (H) tipo selvagem na posição 537 com um resíduo Lys (K) ou um resíduo Arg (R) (também referido como domínios "KIK" e "KIR", respectivamente). (Ver a Publicação de Patente U.S. No. 20110201055). Em outras modalidades, o semi- domínio de divagem planejado compreende as mutações "Sharkey" e/ou “Sharkey” (ver Guo et al, (2010)J. Mol. Biol. 400(1 ):96-107). [00191] Os semi-domínios de divagem planejados aqui descritos podem ser preparados utilizando qualquer método adequado, por exemplo, através da mutagênese direcionada ao sítio de semi- domínios de divagem do tipo selvagem (Fok I) como descritos nas Publicações de Patente U.S. Nos. 20050064474; 20080131962; e 20110201055. [00192] Alternativamente, as nucleases podem ser montadas in vivo no sítio alvo de ácido nucleico utilizando a assim chamada tecnologia de "enzima fracionada" (ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 20090068164). Os componentes de tais enzimas fracionadas podem ser expressos nos constructos de expressão separados, ou podem ser ligados em uma estrutura de leitura aberta, onde os com- ponentes individuais são separados, por exemplo, por um peptídeo 2A de auto-clivagem ou sequência IRES. Os componentes podem ser domínios de ligação dedo de zinco individuais ou domínios de um do- mínio de ligação de ácido nucleico meganuclease. [00193] As nucleases podem ser submetidas a triagem para ativi- dade antes do uso, por exemplo, em um sistema cromossômico base- ado em levedura como descrito nas WO 2009/042163 e 20090068164. os constructos de expressão de nuclease podem ser facilmente con- cebidas utilizando métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Publicações de Patente dos Estados Unidos Publicações 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474;

20060188987; 20060063231; e a Publicação Internacional WO 07/014275. A expressão da nuclease pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou um promotor induzível. [00194] Um "alvo" ou "sítio alvo" ou "lócus genômico direcionado" ou "região alvo de DNA genômico" é uma sequência de ácido nucleico que define uma parte de um ácido nucleico a qual uma molécula de ligação (por exemplo, nuclease específica do sítio) se ligará, contanto que existam condições suficientes para a ligação. [00195] Em uma modalidade, uma sequência lócus genômica inclui aquelas presentes nos cromossomas, epissomas, genomas organela- res (por exemplo, mitocôndrias, cloroplastos), cromossomas artificiais e qualquer outro tipo de ácido nucleico presente em uma célula tal como, por exemplo, sequências amplificadas, cromossomos minutos duplos e os genomas de bactérias e vírus endógenos ou infectantes.

As sequências lócus genômicas podem ser normais (isto é, tipo selva- gem) ou mutantes; as sequências mutantes podem compreender, por exemplo, inserções (por exemplo, polinucleotídeos exógenos previa- mente inseridos), anulações, translocações, rearranjos e/ou mutações pontuais. Uma sequência lócus genômica também pode compreender um de vários alelos diferentes. [00196] Também aqui descritos como uma modalidade da divulga- ção são os métodos para a inserção de uma sequência de polinucleo- tídeo de DNA doador dentro de lócus genômicos. As frequências rela- tadas e observadas de modificação genômica direcionada indicam que o direcionamento de um lócus genômico dentro das plantas é relati- vamente ineficiente. A taxa de sucesso de tais métodos é baixa, devi- do em parte à fraca eficiência de recombinação homóloga e uma ele- vada frequência de inserção não específica do DNA doador em regi- ões do genoma diferente do sítio alvo. A presente divulgação fornece métodos para a identificação de um polinucleotídeo de DNA doador dentro de um lócus genômico alvo. [00197] São aqui divulgados os métodos de uso de nucleases es- pecíficas do sítio (por exemplo, domínios de ligação dedos de zinco planejados fundidos com os domínios de divagem) para gerar uma ou mais quebras de filamento duplo direcionadas no DNA celular. Embora os métodos divulgados não dependam de um mecanismo particular de ação, sabe-se que as quebras de filamento duplo no DNA celular esti- mulam os mecanismos de reparação celular milhares de vezes na vi- zinhança do sítio de divagem, tal divagem direcionada leva em conta a alteração ou substituição (por meio da reparação direcionada pela homologia) de sequências em praticamente qualquer sítio no genoma. [00198] Além do uso de nucleases específicas do sítio aqui des- crito, a substituição direcionada de (ou inserção em) uma sequência genômica selecionada também requer a introdução do polinucleotídeo de DNA doador. O polinucleotídeo de DNA doador pode ser introduzi- do na célula antes, concorrentemente ou subsequente à expressão das nucleases específicas do sítio. O polinucleotídeo de DNA doador contém homologia suficiente para uma sequência genômica sustentar a recombinação homóloga (ou reparo direcionado pela homologia) en- tre o polinucleotídeo de DNA doador e a sequência genômica homólo- ga. Aproximadamente 25, 50 100, 200, 500, 750, 1000, 1500, 2000 nucleotídeos ou mais de homologia de sequência entre um polinucleo- tídeo de DNA doador e um lócus genômico (ou qualquer valor inteiro entre 10 e 2000 nucleotídeos, ou mais) irão sustentar a recombinação homóloga entre eles. As sequências de polinucleotídeo de DNA doa- dor podem variar no comprimento entre 10 e 5000 nucleotídeos (ou qualquer valor inteiro de nucleotídeos entre estes) ou mais. A sequên- cia de polinucleotídeo de DNA doador não necessita ser idêntica à se- quência genômica que ela substitui. Por exemplo, a sequência do poli- nucleotídeo de DNA doador pode conter uma ou mais alterações, in- serções, deleções, inversões ou rearranjos de base única no que diz respeito à sequência genômica, contanto que homologia suficiente com as sequências cromossômicas esteja presente. Alternativamente, uma sequência de polinucleotídeo de DNA doador pode conter uma sequência não homóloga flanqueada por duas regiões de homologia.

Adicionalmente, as sequências de polinucleotídeo de DNA doador po- dem compreender uma molécula de vetor contendo sequências que não são homólogas à região de interesse na cromatina celular. Geral- mente, as regiões homólogas de uma sequência de polinucleotídeo de DNA doador possuem pelo menos 50 % de identidade de sequência com um lócus genômico com o qual a recombinação é desejada. Em certas modalidades, a sequência de polinucleotídeo de DNA doador possui 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 99,9 % de identidade de sequência ao longo de uma expansão de 25 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 300 ou mais, 400 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1000 ou mais, 1500 ou mais ou 2000 ou mais nu- cleotídeos da homologia de sequência entre um polinucleotídeo de DNA doador e o lócus genômico. [00199] Uma molécula de polinucleotídeo de DNA doador pode con- ter duas ou mais regiões descontínuas de homologia com a cromatina celular. Por exemplo, para a inserção direcionada de sequências transgenes não normalmente presentes em uma região genômica de interesse, uma tal sequência transgene pode ser flanqueada por regi- ões de homologia com a região genômica de interesse no polinucleotí- deo de DNA doador. [00200] Em outras modalidades, a substituição direcionada de uma sequência genômica selecionada também requer a introdução da se- quência de polinucleotídeo de DNA de substituição ou doador dentro do lócus genômico direcionado por meio de um mecanismo de junção final não homólogo (NHEJ). Subsequentemente, o filamento doador não requer subdivisões homólogas para a integração da sequência de polinucleotídeo doador. Como um resultado de uma quebra de fila- mento dupla dentro de um lócus genômico direcionado, a sequência de polinucleotídeo doador é integrada dentro do cromossoma. A via de reparo pelo NHEJ fornece outro mecanismo alternativo para a integra- ção de um polinucleotídeo doador dentro do genoma. Ver a WO 2013169802, aqui incorporada por referência. [00201] O polinucleotídeo doador pode ser DNA ou RNA, de fila- mento único ou de filamento duplo e pode ser introduzidas em uma célula na forma linear ou circular. Se for introduzida na forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser protegidas (por exem- plo, da degradação exonucleolítica) por métodos conhecidos daqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos de di- deoxinucleotídeo são adicionados ao terminal 3' de uma molécula line- ar e/ou oligonucleotídeos auto-complementares são ligados a uma ou ambas as extremidades. Ver, por exemplo, Chang et al., (1987) Proc.

Natl Acad. Sd. USA 84:4959- 4963; Nehls et al., (1996) Science 272:886-889. Métodos adicionais para a proteção dos polinucleotídeos exógenos da degradação incluem, mas não são limitados a estes, adi- ção de grupos de amino terminais e o uso de ligações modificadas de internucleotídeos tais como, por exemplo, fosforotioatos, fosforamida- tos, e O-metil ribose ou resíduos de desoxirribose. [00202] Um polinucleotídeo de DNA doador pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor tendo sequên- cias adicionais tais como, por exemplo, origens de replicação, promo- tores e genes que codificam a resistência de antibióticos. Além do mais, os polinucleotídeos de DNA doadores podem ser introduzidos como ácido nucleico exposto, como ácido nucleico complexo com um agente tal como um lipossoma ou poloxâmero ou podem ser liberados por bactérias ou vírus (por exemplo, Agrobacterium sp., Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus do mosai- co do tabaco, vírus X da batata, vírus do mosaico da couve-flor e vírus do mosaico da nervura da mandioca. Ver, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sd. 11(1): 1-4). Em outras modalidades, o polinu- cleotídeo de DNA doador pode ser introduzido em uma célula (por exemplo, no tecido de calo androgênico) por um método de transfor- mação de bombardeio de micropartículas como aqui descrito. [00203] Os métodos do requerente podem combinar as poderosas capacidades de direcionamento de ZFPs planejados com um domínio de divagem (ou semi-domínio de divagem) para especificamente dire- cionar uma quebra de filamento duplo na região do genoma na inser- ção das sequências exógenas que é desejável. Embora não seja re- querido pelos métodos do requerente, parece que a presença de uma quebra de filamento duplo em uma sequência celular, acoplada com a presença de uma molécula de DNA exógena tendo homologia com uma região adjacente ou circundante à quebra, ativa os mecanismos celulares que reparam a quebra mediante a transferência da informa- ção de sequência a partir da molécula doador para dentro da sequên- cia celular (por exemplo, genômica ou cromossômica), isto é, por um processo de reparo direcionado pela homologia, também conhecido como "conversão do gene". [00204] Para alteração de uma sequência cromossômica, não é ne- cessário que toda a sequência do doador seja copiada no cromosso- ma, contanto que o suficiente da sequência doadora seja copiado para efetuar a alteração de sequência desejada. [00205] A eficiência da inserção de sequências doadoras através da recombinação homóloga é inversamente relacionada com distância, no DNA celular, entre a quebra de filamento duplo e o sítio em que a re- combinação é desejada. Eficiências mais elevadas de recombinação homóloga são tipicamente observadas quando a quebra de filamento duplo está mais perto do sítio em que a recombinação é desejada. Nos casos para os quais um sítio exato de recombinação não é requerido (por exemplo, o evento de recombinação desejado pode ocorrer ao longo de um intervalo de sequência genômica), o comprimento e a se- quência do ácido nucleico doador, juntamente com os sítios de diva- gem, pode ser selecionados para obter o evento de recombinação de- sejado. Nos casos em que o evento desejado foi designado para alte- rar a sequência de um único nucleotídeo em uma sequência genômi- ca, a cromatina celular é clivada dentro 10.000 nucleotídeos de cada lado do nucleotídeo. Por exemplo, a divagem pode ocorrer dentro de qualquer valor inteiro entre 2 e 1000 de nucleotídeos em cada lado do nucleotídeo. Em certos exemplos, a divagem ocorre dentro de 1000, 500, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, ou 2 nucleotídeos de cada lado do nucleotídeo que é modificado na sequência genômica. [00206] Conforme detalhado acima, os sítios de ligação para as du- as proteínas de fusão, cada uma compreendendo um domínio de liga- ção dedo de zinco e um semi-domínio de divagem, podem ser locali- zados de 5 a 8 ou de 15 a 18 nucleotídeos de distância afastados, co- mo medido a partir da aresta de cada sítio ligação mais próximo do outro sítio de ligação, e a divagem ocorre entre os sítios de ligação.

Se a divagem ocorre em um sítio isolado ou em múltiplos sítios entre os sítios de ligação ela é imaterial, visto que as sequências genômicas clivadas são substituídas pelas sequências doadoras. Assim, para a alteração eficiente da sequência de um único par de nucleotídeos através da recombinação direcionada, o ponto central da região entre os sítios de ligação está dentro de 10.000 nucleotídeos deste par de nucleotídeos, de preferência dentro de 1000 nucleotídeos ou 500 nu- cleotídeos, ou 200 nucleotídeos, ou 100 nucleotídeos, ou 50 nucleotí- deos, ou 20 nucleotídeos, ou 10 nucleotídeos, ou 5 nucleotídeos, ou 2 nucleotídeos, ou um nucleotídeo, ou no par de nucleotídeos de inte- resse. [00207] Em certas modalidades, um cromossoma homólogo pode servir como o polinucleotídeo de DNA doador. Assim, por exemplo, a correção de uma mutação em um heterozigoto pode ser alcançada pelo planejamento das proteínas de fusão que se ligam e clivam a se- quência mutante em um cromossoma, mas não clivam a sequência tipo selvagem no cromossoma homólogo. A quebra de filamento duplo no cromossoma que carrega a mutação estimula um processo de "conversão genética" à base de homologia em que a sequência tipo selvagem do cromossoma homóloga é copiada no cromossoma cliva- do, restaurando assim as duas cópias da sequência tipo selvagem. [00208] Os métodos e as composições também são fornecidas os quais podem aumentar os níveis de recombinação direcionada, inclu- indo, mas não limitado a estes, o uso de fusões adicionais de domínio funcional de ZFP para ativar a expressão dos genes envolvidos na re- combinação homóloga, tal como, por exemplo, os membros do grupo de epistasia RAD52 (por exemplo, Rad50, Rad51, Rad51B, RadSIC, RadSID, Rad52, Rad54, Rad54B, Mrell, XRCC2, XRCC3), genes cujos produtos interagem com os produtos genéticos anteriormente mencio- nados (por exemplo, BRCA1, BRCA2) e/ou genes no complexo NBSI.

Ver, por exemplo, Boyko et al. (2006) Plant Physiology 141 :488-497 e LaFarge et al. (2003) Nucleic Acids Res 31(4): 1148— 1155. Similar- mente, as fusões de domínio funcional de ZFP podem ser utilizadas, em combinação com os métodos e composições aqui divulgados, para reprimir a expressão de genes envolvidos na junção de extremidade não homóloga (por exemplo, Ku70/80, XRCC4, poli(ADP ribose) poli- merase, DNA ligase 4). Ver, por exemplo, Riha et al. (2002) EMBO 21 :2819- 2826; Freisner et al. (2003) Plant J. 34:427-440; Chen et al. (1994) European Journal of Biochemistry 224:135-142. Os métodos para a ativação e a repressão da expressão do gene utilizando as fu- sões entre um domínio de ligação dedo de zinco e um domínio funcio- nal são divulgados, por exemplo, nas Patentes US co-pertencentes 6.534.261; 6.824.978 e 6.933.113. Os métodos de repressão adicio- nais incluem o uso de oligonucleotídeos anti-sentido e/ou RNA interfe- rente pequeno (siRNA ou RNAi) direcionado à sequência do gene a ser reprimido.

Ensaios de Detecção [00209] Em certas modalidades, a divulgação refere-se a um méto- do que inclui a confirmação de uma modificação do DNA genômico tal como a divagem do genoma do milho direcionado, a integração de um polinucleotídeo de DNA doador dentro de um genoma do milho direci- onado, ou uma mutação incorporada dentro do genoma do milho dire- cionado. Em certas modalidades, o método de confirmação de uma tal modificação do genoma inclui a confirmação através de um ensaio ba- seado na PCR, ensaio de Southern blot, ensaio de Northern blot, aná- lise de expressão da proteína, ensaio de Western blot, ensaio ELISA, ou ensaio Next Generation Sequencing. [00210] Consequentemente, uma modificação do DNA genômico tal como uma divagem, transgene integrado, ou uma mutação no geno- ma, pode ser confirmada em uma variedade de maneiras, incluindo o uso de um iniciador ou sonda da sequência. Em certas modalidades, o transgene integrado de forma estável pode ser detectado com base na expressão constitutiva ou seletiva do transgene em determinados teci- dos da planta ou em algumas etapas de desenvolvimento, ou o trans- gene pode ser expresso em praticamente todos os tecidos vegetais, substancialmente ao longo de todo o seu ciclo de vida. [00211] A confirmação de uma modificação genômica direcionada, o transgene integrado, ou a mutação, pode ser realizada por qualquer método adequado de amplificação. Ver de uma forma geral, Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab. 8, 14-25 (1990). Exemplos de técnicas de amplificação adequadas incluem, mas não são limitados a estes, a re- ação da cadeia polimerase, a reação da cadeia ligase, a amplificação por deslocamento do cadeia (ver de uma forma geral G. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 392-396 (1992); G. Walker et al., Nu- cleic Acids Res. 20, 1691-1696 (1992)), a amplificação baseada na transcrição (ver D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 86, 1173- 1177 (1989)), a replicação da sequência auto-sustentada (ou "3SR") (ver J. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 1874-1878 (1990)), o sistema de Οβ replicase (ver P. Lizardi et al., BioTechnology 6, 1197-1202 (1988)), a amplificação baseada na sequência de ácido nucleico (ou "NASBA") (ver R. Lewis, Genetic Engineering News 12 (9), 1 (1992)), a reação da cadeia de reparo (ou "RCR") (ver R. Lewis, supra), e amplificação de DNA bumerangue (ou "BDA") (ver R. Lewis, supra). A reação da cadeia polimerase é geralmente preferida. [00212] "Amplificação" é um caso especial de replicação de ácido nucleico que envolve a especificidade do modelo. Deve ser comparada com a replicação não específica do modelo (isto é, a replicação que é dependente do modelo, mas que não depende de um modelo específi- co). A especificidade do modelo é aqui distinta de fidelidade de repli- cação (isto é, a síntese da sequência de polinucleotídeo apropriada) e especificidade de nucleotídeos (ribo- ou deoxirribo-). A especificidade do modelo é frequentemente descrita em termos de especificidade do "alvo". [00213] Conforme aqui utilizado, o termo "reação de cadeia polime- rase" e "PCR" geralmente se refere ao método para aumentar a con- centração de um segmento de uma sequência alvo em uma mistura de DNA genômico, sem clonagem ou purificação (Patentes U.S. N— 4.683.195; 4.683.202 e 4.965.188; aqui incorporadas por referência).

Este processo para amplificar a sequência alvo compreende a introdu- ção de um excesso de dois iniciadores de oligonucleotídeo na mistura de DNA contendo a sequência alvo desejada, seguido por uma se- quência precisa de ciclagem térmica na presença de uma DNA polime- rase. Os dois iniciadores são complementares aos seus respectivos filamentos da sequência alvo de filamento duplo. Para executar a am- plificação, a mistura é desnaturada e os iniciadores são depois trata- dos com calor nas suas sequências complementares dentro da molé- cula alvo. Após o tratamento com calor, os iniciadores são ampliados com uma polimerase de modo a formar um novo par de filamentos complementares. As etapas de desnaturação, tratamento com calor e amplificação de polimerase podem ser repetidas muitas vezes (isto é, a desnaturação, tratamento com calor e amplificação constituem um "ciclo"; pode haver numerosos "ciclos") para obter uma concentração elevada de um segmento amplificado da sequência alvo desejada. O comprimento do segmento amplificado da sequência alvo desejada é determinado pelas posições relativas dos iniciadores com respeito de um com o outro, e, portanto, este comprimento é um parâmetro contro- lável. Em virtude do aspecto de repetição do processo, o método é re- ferido como a "reação de cadeia polimerase" (em seguida "PCR"). Vis- to que os segmentos amplificados desejados da sequência alvo se tornam as sequências predominantes (em termos de concentração) na mistura, eles são ditos de serem amplificados pela "PCR". [00214] O termo "transcriptase reversa" ou "RT-PCR" refere-se a um tipo de PCR onde o material de partida é o mRNA. O mRNA de partida é enzimaticamente convertido em DNA complementar ou "cDNA", utilizando uma enzima transcriptase reversa. O cDNA é então utilizado como um "modelo" para uma reação "PCR". [00215] Em uma modalidade, a reação de amplificação é quantifi- cada. Em outras modalidades, a reação de amplificação é quantificada utilizando um perfil de assinatura, em que o perfil de assinatura é sele- cionado do grupo que inclui uma temperatura de fusão e um perfil de assinatura de fluorescência. [00216] A molécula de ácido nucleico das modalidades da divulga- ção, ou seus segmentos, podem ser utilizados como iniciadores para a amplificação da PCR. Ao executar a amplificação da PCR, um certo grau de má combinação pode ser tolerado entre o iniciador e o mode- lo. Portanto, as mutações, deleções e inserções (especialmente adi- ções de nucleotídeos na extremidade 5' ou 3') dos iniciadores exempli- ficados caem dentro do escopo da divulgação objeto. As mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em um determinado inici- ador por métodos conhecidos de um artífice comumente versado. [00217] Faróis moleculares têm sido descritos para uso na detecção de sequências. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada que se sobrepõe ao flanqueamento da junção de DNA genômico e de inserção. A estrutura única da sonda FRET resul- ta em conter uma estrutura secundária que mantém os componentes fluorescentes e de extinção em estreita proximidade. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um no flanqueamento da sequência genômica) passam por um ciclo na presença de uma polimerase termostável e dNTPs. Após a amplifi- cação de PCR bem sucedida, a hibridação das sondas FRET na se- quência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial dos componentes fluorescentes e de extinção. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção genô- mica/transgene de flanqueamento devido à amplificação e hibridação bem sucedidas. Um tal ensaio de farol molecular para a detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação objeto. [00218] O ensaio da sonda de hidrólise, de outro modo conhecido como TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.), é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Re- sumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é concebida com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica de flan- queamento para detecção específica de eventos. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de flanqueamento) passam por um ciclo na presença de uma polimerase termostável e dNTPs. A hibridação da sonda FRET resulta na divagem e liberação do componente fluores- cente longe do componente de extinção na sonda FRET. Um sinal flu- orescente indica a presença da sequência de inserção de flanquea- mento/transgene devido à amplificação e hibridação bem sucedidas.

Um tal ensaio de sonda de hidrólise para a detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação exposta. [00219] Os ensaios KASPar são um método para a detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Resumidamen- te, a amostra de DNA genômico compreendendo o lócus genômico direcionado é submetida a triagem utilizando um ensaio baseado na reação de cadeia polimerase (PCR) conhecido como um sistema de ensaio KASPar®. O ensaio KASPar® utilizado na prática da divulga- ção exposta pode utilizar uma mistura de ensaio de PCR KASPar® que contém múltiplos iniciadores. Os iniciadores utilizados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos aqueles iniciado- res diretos e pelo menos um iniciador inverso. O iniciador direto con- tém uma sequência que corresponde a uma região específica do poli- nucleotídeo de DNA doador, e o iniciador inverso contém uma se- quência que corresponde a uma região específica da sequência ge- nômica. Além disso, os iniciadores utilizados na mistura de ensaio de PCR podem compreender pelo menos alguns iniciadores diretos e pe- lo menos um iniciador inverso. Por exemplo, a mistura de ensaio de PCR KASPar® pode utilizar dois iniciadores diretos que correspondem a dois alelos diferentes e um iniciador inverso. Um dos iniciadores dire- tos contém uma sequência que corresponde à região específica da sequência genômica endógena. O segundo iniciador direto contém uma sequência que corresponde a uma região específica do polinu- cleotídeo de DNA doador. O iniciador inverso contém uma sequência que corresponde a uma região específica da sequência genômica. Um tal ensaio KASPar® para a detecção de uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação objeto. [00220] Em algumas modalidades o sinal fluorescente ou a tintura fluorescente é selecionado do grupo que inclui uma tintura fluorescen- te HEX, uma tintura fluorescente FAM, uma tintura fluorescente JOE, uma tintura fluorescente TET, uma tintura fluorescente Cy 3, uma tintu- ra fluorescente Cy 3,5, uma tintura fluorescente Cy 5, uma tintura fluo- rescente Cy 5,5, um tinturas fluorescente Cy 7, e um tintura fluores- cente ROX. [00221] Em outras modalidades, a reação de amplificação é opera- da utilizando tinturas de DNA fluorescentes secundárias adequadas que são capazes de manchar o DNA celular em uma faixa de concen- tração detectável por citometria de fluxo, e possuem um espectro de emissão fluorescente que é detectável por um termociclador em tempo real. Deve ser observado por aqueles de habilidade prática na técnica que outras tinturas de ácido nucleico são conhecidas e estão continu- amente sendo identificadas. Qualquer tintura de ácido nucleico ade- quada com espectros de excitação e emissão apropriados pode ser empregada, tal como YO-PRO-1®, SYTOX Green®, SYBR Green I®, SYT011®, SYT012®, SYT013®, BOBO®, YOYO®, e TOTO®. Em uma modalidade, uma tintura de DNA fluorescente secundária é SYT013® utilizada em menos do que 10 μΜ, menos do que 4 μΜ, ou menos do que 2,7 μΜ. [00222] Em outras modalidades, o Next Generation Sequencing (NGS) pode ser utilizado para confirmar uma modificação genômica.

Como descrito por Brautigma et al., 2010, a análise da sequência de DNA pode ser utilizada para determinar a sequência de nucleotídeo do fragmento isolado e amplificado. Os fragmentos amplificados podem ser isolados e sub-clonados em um vetor e sequenciados utilizando o método terminador de cadeia (também referido como sequenciamento de Sanger) ou sequenciamento terminador de tintura. Além disso, o amplicon pode ser sequenciado com o Next Generation Sequencing.

As tecnologias de NGS não requerem a etapa de sub-clonagem, e as múltiplas leituras de sequenciamento podem ser concluídas em uma única reação. Três plataformas de NGS são comercialmente disponí- veis, o Genome Sequencer FLX da 454 Life Sciences/Roche, o lllu- mina Genome Analyser da Solexa and Applied Biosystems’ SOLiD (acrônimo para: ‘Sequencing by Oligo Ligation and Detection’). Além disso, existem dois métodos de sequenciamento de molécula individu- al que estão atualmente sendo desenvolvidos. Estes incluem o true Single Molecule Sequencing (tSMS) da Helicos Bioscience e o se- quenciamento Single Molecule Real Time (SMRT) da Pacific Bioscien- ces. [00223] O FLX Genome Sequencher que é comercializado pela 454 Life Sciences/Roche é um NGS de leitura longa, que utiliza a PCR de emulsão e o piro-sequenciamento para gerar as leituras de sequenci- amento. Os fragmentos de DNA de 300 a 800 pb ou bibliotecas con- tendo fragmentos de 3 a 20 kpb podem ser utilizados. As reações po- dem produzir mais de um milhão de leituras ao redor de 250 a 400 ba- ses por operação para um rendimento total de 250 a 400 megabases.

Esta tecnologia produz as leituras mais longas, mas a produção total de sequência por operação é baixa em comparação com outras tecno- logias de NGS. [00224] O lllumina Genome Analyser que é comercializado pela So- lexa é um NGS de leitura curta que utiliza o sequenciamento pelo mé- todo de síntese com nucleotídeos terminadores reversível rotulados pela tintura fluorescente e baseia-se na PCR ligada com ponte de fase sólida. A construção de bibliotecas de sequenciamento de extremidade emparelhada contendo fragmentos de DNA de até 10 kb pode ser utili- zada. As reações produzem mais de 100 milhões de leituras curtas que são de 35 a 76 bases de comprimento. Estes dados podem pro- duzir de 3 a 6 gigabases por operação. [00225] O sistema de Sequencing by Oligo Ligation and Detection (SOLiD) comercializado pela Applied Biosystems é uma tecnologia de leitura curta. Esta tecnologia de NGS utiliza o DNA de filamento duplo de fragmentado que são de até 10 kbp de comprimento. O sistema uti- liza o sequenciamento por ligação de iniciadores de oligonucleotídeo rotulados por tintura e PCR de emulsão para gerar um bilhão de leitu- ras curtas que resultam em uma produção de sequência total de até 30 gigabases por operação. [00226] O tSMS da Helicos Bioscience e o SMRT da Pacific Biosci- ences aplicam um método diferente que utiliza moléculas individuais de DNA para as reações de sequência. O sistema tSMS Helicos pro- duz até 800 milhões de leituras curtas que resultam em 21 gigabases por operação. Estas reações são concluídas utilizando nucleotídeos terminadores virtuais rotulados com tintura fluorescente que são des- critos como um método de "sequenciamento por síntese". [00227] O sistema SMRT Next Generation Sequencing comerciali- zado pela Pacific Biosciences utiliza um sequenciamento em tempo real através da síntese. Esta tecnologia pode produzir leituras de até 1000 pb de comprimento como um resultado de não ser limitada por terminadores reversíveis. A produção bruta de leitura que é equivalen- te a uma cobertura de um genoma humano diploide pode ser produzi- da por dia utilizando esta tecnologia. [00228] Em outra modalidade, a confirmação da modificação genô- mica pode ser concluída utilizando ensaios de manchamento, incluindo Western blots, Northern blots e Southern blots. Tais ensaios de man- chamento são técnicas comumente utilizadas nas pesquisas biológicas para a identificação e quantificação de amostras biológicas. Estes en- saios incluem em primeiro lugar a separação dos componentes de amostra em géis por meios eletroforéticos, seguido pela transferência dos componentes eletroforeti ca mente separados dos géis para trans- ferir as membranas que são produzidas de materiais tais como nitroce- lulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou náilon. Os analitos também podem ser diretamente marcados nestes suportes ou direcionados pa- ra regiões específicas nos suportes mediante a aplicação de vácuo, ação capilar ou pressão, sem separação prévia. As membranas de transferência são então normalmente submetidas a um tratamento de pós-transferência para aumentar a capacidade dos analitos de serem distintos entre si e detectados, quer visualmente ou por leitoras auto- máticas. [00229] Em uma outra modalidade, a confirmação de uma modifica- ção genômica pode ser concluída utilizando um ensaio ELISA, que uti- liza um imunoensaio enzimático de fase sólida para detectar a presen- ça de uma substância, geralmente um antígeno, em uma amostra lí- quida ou amostra úmida. Os antígenos da amostra são ligados a uma superfície de uma placa. Depois, um outro anticorpo específico é apli- cado sobre a superfície de modo que possa ligar-se ao antígeno. Este anticorpo é ligado a uma enzima, e, na etapa final, uma substância contendo o substrato de enzima é adicionada. A subsequente reação produz um sinal detectável, mais comumente uma alteração de cor no substrato.

Introqressão de Transqenes em Plantas Proqênies [00230] A divulgação exposta fornece um método para a introgres- são de um polinucleotídeo doador compreendendo um transgene da planta diaploide derivada de calo androgênica nas plantas descenden- tes. A produção de plantas diaploides, incluindo as plantas diaploides que são homozigotas para um transgene, é aqui descrita. Em uma modalidade, o método compreende as etapas de: [00231] cruzamento de uma planta de origem feminina com uma planta de origem masculina, em que a planta de origem masculina é a planta diaploide, e em que a planta de origem feminina é uma planta de origem fértil; [00232] colheita de uma semente progênie do cruzamento de (a); [00233] plantio da semente progênie; e, [00234] cultivo da semente progênie, em que a semente progênie compreende o polinucleotídeo doador que compreende o transgene. [00235] Em certas modalidades do método, as plantas de origem femininas e masculinas são plantas de milho. Em outras modalidades a planta de origem feminina é uma planta de milho de elite. [00236] Um tal cruzamento para criar sementes progênies pode ser realizado utilizando técnicas convencionais de reprodução de plantas.

Para um debate de técnicas de reprodução de plantas, ver Poehlman (1995) Breedinq Field Croos. AVI Publication Co., Westport Conn, 4th Edit. Métodos de retrocruzamento podem ser utilizados para introduzir um gene nas plantas. Uma descrição desta técnica e outras metodolo- gias de reprodução de plantas para a introdução de características em uma planta podem ser encontrados nas referências tais como Poehl- man, supra, e Plant Breedinq Methodoloqy. edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988). Em um protocolo típico de retrocruzamento, a variedade original de interesse (origem recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (origem não recorrente) que transporta o úni- co gene de interesse a ser transferido. A progênie resultante desse cruzamento é depois cruzada novamente com a origem recorrente e o processo é repetido até que uma planta seja obtida, em que essenci- almente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas da origem recorrente são recuperadas da planta transformada, além do único gene transferido da origem não recorrente. [00237] Assim, esta divulgação fornece um processo de produção de planta de milho que inclui cruzamentos que utilizam as plantas dia- ploides produzidas de acordo com os métodos deste documento. Por exemplo, a divulgação objeto inclui um método para a produção de uma semente progênie mediante o cruzamento de uma planta diaploi- de (produzida de acordo com os métodos aqui divulgados) contendo os polinucleotídeos doadores com uma segunda e geneticamente dife- rente planta (por exemplo, origem inata), a colheita da semente progê- nie resultante, e detecção dos polinucleotídeos doadores integrados utilizando um método tal como a PCR em tempo real para determinar a zigosidade. [00238] Uma planta de milho pode ser pura mediante (i) o cruza- mento sexual de uma primeira planta de milho de origem, que é culti- vada a partir de sementes de uma linhagem contendo os polinucleotí- deos doadores compreendendo o transgene com uma segunda planta de milho de origem, produzindo assim uma pluralidade de plantas pro- gênies primárias; (ii) depois a seleção de uma primeira planta progênie que contém os polinucleotídeos doadores compreendendo o transge- ne; e (iii) a autopolinização da primeira planta progênie, produzindo assim uma pluralidade de plantas progênies secundárias; e então a seleção das plantas progênies secundárias, uma planta que contém os polinucleotídeos doadores compreendendo uma característica agro- nômica. Estas etapas podem ainda incluir (iv) o retrocruzamento da primeira planta progênie ou da segunda planta progênie com a segun- da planta de milho de origem ou uma terceira planta de milho de ori- gem. [00239] Quando a planta de milho da divulgação exposta é cruzada com outra planta inata para produzir uma progênie ou híbrida, a fonte original pode servir como planta materna ou paterna com basicamente as mesmas características nos híbridos. Ocasionalmente, as caracte- rísticas de herança materna podem se expressar de forma diferente dependendo da decisão de qual origem utilizar como o feminino. No entanto, muitas vezes uma das plantas de origem é preferível como a planta materna devido ao aumento de rendimento de sementes e ca- racterísticas preferidas de produção, tais como o tamanho ideal de semente e a qualidade ou facilidade de remoção do pendão. Algumas plantas produzem palhas de espiga mais firmes que levam à maiores perdas, por exemplo, devido ao apodrecimento, ou a palha da espiga pode ser tão firme que a seda não pode completamente colocar para fora a ponta, impedindo a polinização completa, o que resulta em ren- dimentos inferiores de semente. Pode haver atrasos na formação de seda, o que prejudicialmente afeta a regulação de tempo do ciclo re- produtivo de um par de congênitos de origem. As características do revestimento de semente podem ser preferíveis em uma planta que pode afetar a vida de prateleira do produto de semente híbrida. O pó- len vertido pode ser melhor em uma planta, tornando assim essa plan- ta como a origem masculina preferida. [00240] Em algumas modalidades, a primeira etapa de "cruzamen- to" da planta de origem feminina com a planta de origem diaploide masculina compreende o plantio, de preferência na proximidade de polinização, das sementes de uma primeira planta de milho e de uma segunda planta de milho inata feminina distinta. Em algumas modali- dades, polinização manual pode ser utilizada para cruzar as origens masculinas e femininas. Em outras modalidades, a polinização manual utilizada para cruzar as origens masculinas e femininas é executada com uma ferramenta ou por meios mecânicos. Em outras modalida- des, a polinização manual utilizada para cruzar as origens masculinas e femininas é executada pela obtenção de pólen de uma planta mas- culina e aplicação do pólen ao estigma (por meio do tubo de pólen) das plantas femininas. [00241] Um outra etapa compreende o cultivo ou o crescimento das as sementes da planta de origem feminina e da planta de origem mas- culina que produzem flores. Se as plantas de origem diferem na regu- lação de tempo da maturação sexual, as técnicas podem ser empre- gadas para se obter um entalhe apropriado, isto é, para garantir a dis- ponibilidade de pólen a partir da planta de milho de origem designada masculina durante o tempo em que as sedas da planta de milho de origem mãe designada feminina são receptivas ao pólen. Os métodos que podem ser empregados para obter o entalhe desejado incluem o retardo do florescimento da planta de maturação mais rápida, tal co- mo, mas não limitado ao atraso do plantio da semente de maturação mais rápida, o corte ou queima das folhas superiores da planta de ma- turação mais rápida (sem matar a planta) ou a aceleração da floração da planta de maturação mais lenta, tal como através da cobertura da planta de maturação mais lenta com a película projetada para acelerar a germinação e o crescimento ou através do corte da ponta de um bro- to de espiga jovem para expor a seda. [00242] Em certas modalidades, a planta de origem feminina e a planta de origem masculino são tratadas com um ou mais produtos químicos agrícolas quando considerado apropriado pelo produtor. [00243] Uma outra etapa compreende a colheita das sementes, per- to ou na maturidade, da espiga da planta que recebeu o pólen. Em uma modalidade particular, a semente é colhida da planta de origem feminina, e quando desejável, a semente colhida pode ser cultivada para produzir uma progênie ou uma planta de milho híbrida de primeira geração (F-i). [00244] Mais outra etapa compreende a secagem e o condiciona- mento das sementes, incluindo o tratamento, o dimensionamento (ou classificação) das sementes, e embalagens para a venda aos produto- res para a produção de grãos ou forragem. Assim como com as se- mentes inatas, pode ser desejável tratar as sementes híbridas com composições que tornam as sementes e mudas delas cultivadas mais resistentes quando expostas às condições adversas. A semente pro- gênie ou híbrida resultante pode ser vendido aos produtores para a produção de grãos e forragem e não para a reprodução ou produção de sementes. [00245] Ainda mais, a divulgação objeto fornece uma planta de mi- lho progênie produzida através do crescimento das sementes colhidas produzidos na planta de origem feminina, assim como grãos produzi- dos pela planta de milho progênie. [00246] Em uma modalidade subsequente, a divulgação fornece um método de introdução de um polinucleotídeo doador que confere uma característica desejada na planta progênie. Em um aspecto da modali- dade, a característica desejada é selecionada do grupo que inclui um traço de resistência a inseticida, um traço de tolerância a herbicida, um traço de resistência a doenças, um traço de aumento do rendimento, um traço de qualidade nutricional, um traço de aumento agronômico, e suas combinações. Outros exemplos de uma característica desejada incluem o metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, atra- vés da transformação de uma planta com um gene anti-sentido de es- tearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Ver Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 2624 (1992).

Teor reduzido de fitato: (i) A introdução de um gene de codificação de fitase aumentaria a decomposição do fitato, o que adiciona fosfato mais livre à planta transformada. Por exemplo, ver Van Hartingsveldt et al., Gene 127: 87 (1993), para uma divulgação da sequência de nu- cleotídeo de um gene de fitase de Aspergillus niger. (ii) Um gene pode ser introduzido que reduz o teor de fitato. No milho, isso, por exemplo, pode ser executado pela clonagem e depois pela reintrodução do DNA associado com o único alelo que é responsável pelos mutantes de mi- lho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico. Ver Raboy et al., Maydica 35: 383 (1990). (iii) Composição de carboidrato modificada efetuada, por exemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido.

Ver Shiroza et al., J. Bacteriol. 170: 810 (1988) (sequência de nucleo- tídeo do gene de fructosiltransferase de Streptococcus mutans), Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 200: 220 (1985) (sequência de nu- cleotideo do gene de levansucrase de Bacillus subtillus), Pen et al., Bio/Technology 10: 292 (1992) (produção de plantas transgênicas que expressam a a-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21: 515 (1993) (sequências de nucleotídeo dos genes de invertase do tomate), Sogaard et al., J. Biol. Chem. 268: 22480 (1993) (mutagênese direcionada ao sítio do gene de α-amilase da cevada), e Fisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993) (enzima II de ramificação de amido do endosperma de milho). Outros exemplos de característi- cas potencialmente desejadas incluem maior produtividade, melhores caules, melhores raízes, tempo reduzido para produzir maturidade, melhor qualidade agronômica, maior valor nutricional, maior capacida- de de extração do amido ou maior capacidade de fermentação do amido, resistência e/ou tolerância a inseticidas, herbicidas, pragas, ca- lor e seca, e doenças, e uniformidade nos tempos de germinação, es- tabelecimento de grupos de plantas, taxa de crescimento, maturidade e tamanho dos grãos. [00247] Uma cultura de milho compreendendo sementes de milho que contêm os polinucleotídeos doadores que compreendem uma ca- racterística agronômica, ou sua progênie, pode ser rapidamente detec- tada utilizando o método que inclui um ensaio de PCR em tempo real para determinar a zigosidade e depois ser plantada. O método que in- clui um ensaio de PCR em tempo real para determinar a zigosidade pode melhorar a eficiência deste processo. [00248] O método exposto incluindo um ensaio de PCR em tempo real para determinar a zigosidade é útil, por exemplo, nos programas de reprodução de milho, assim como no controle de qualidade, espe- cialmente para produção comercial de sementes de milho. Este méto- do também pode beneficiar o registro do produto e a administração de produtos. Este método pode ser utilizado para as estratégias de intro- gressão de reprodução acelerada. As técnicas de detecção da divul- gação exposta são especialmente úteis em conjunto com a introgres- são de reprodução de plantas, para determinar quais as plantas pro- gênies compreendem os polinucleotídeos doadores compreendendo uma característica agronômica após uma planta de origem contendo o evento ser cruzada com outra linhagem de planta em um esforço para conferir a característica agronômica na progênie. O método divulgado incluindo um ensaio de PCR em tempo real para determinar a zigosi- dade beneficia os programas de introgressão de reprodução do milho, assim como o controle de qualidade, especialmente para as sementes de milho comercializadas. [00249] A presente divulgação pode ser utilizada para um método de reprodução assistida por marcador (MAB). A presente divulgação pode ser utilizada em combinação com outros métodos (tais como, marcadores de AFLP, marcadores de RFLP, marcadores de RAPD, SNPs e SSR) que identificam os marcadores geneticamente ligados que são próximos dos polinucleotídeos doadores que compreendem uma característica agronômica. O método incluindo um ensaio de PCR em tempo real para determinar a zigosidade leva em conta o rastrea- mento dos polinucleotídeos doadores compreendendo uma caracterís- tica agronômica na progênie de um cruzamento de reprodução de plantas. O método incluindo um ensaio de PCR em tempo real para determinar a zigosidade da presente divulgação pode ser utilizado pa- ra identificar qualquer variedade de milho que contenha os polinucleo- tídeos doadores compreendendo uma característica agronômica. [00250] Deve ficar entendido que os exemplos e as modalidades aqui descritos são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações na sua compreensão serão sugeridas para as pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espí- rito e campo de ação deste pedido e do escopo das reivindicações anexas. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Geração de Calo Haploide Derivado de Micrósporos [00251] Pendões pré-emergentes do genótipo de Zea mays 139/39- 05 (Patente U.S. N- 5.306.864) foram colhidos de plantas de milho cul- tivadas em estufa (~5 a 6 semanas de idade), quando os micrósporos estavam no estádio de binucleado inicial de desenvolvimento (anteras de ~3 mm de comprimento, brilhante, amarelo polido). Os pendões fo- ram embrulhados em toalhas de papel úmidas e folha de alumínio e colocados em uma incubadora ajustada a 8 Ό durante 7 a 14 dias.

Após a esterilização da superfície (15 min em 0,08 % v/v de Chlorox™ seguido por um enxágue com água estéril), as anteras foram assepti- camente isoladas, colocadas sobre a superfície do 'meio de cultura de anteras' líquido (sais e vitaminas N6, 60 g/L de sacarose, 5 g/L de car- vão vegetal ativado, 500 mg/L de hidrolisado de caseína, 0,1 mg/L de TIBA ajustado para pH 5,8) em pratos de 6 reservatórios em uma den- sidade de 60 anteras em 6 ml de meio por reservatório e incubadas a 28 Ό no escuro. Estruturas semelhantes de embrião derivadas de mi- crósporos, aparecendo entre 14 a 28 dias, foram transferidas para o 'meio de calo' (sais MS e vitaminas, 30 g/L de sacarose, 700 mg/L de L-prolina, 500 mg/L de MES, 100 mg/L de hidrolisado de caseína, 15 mg/L de nitrato de prata, 3,3 mg/L de dicamba e 2,5 g/L de Geirite™ ajustado para pH 5,8). Calo embriogênico nodular foi subcultivado em 'meio de calo' fresco a cada 14 dias para aumentar a massa antes da determinação e transformação de ploidia. [00252] O precedente fornece um exemplo de tecido haploide com- petente de transformação androgênico derivado de micrósporos de milho, o qual pode ser utilizado nos métodos divulgados para modificar um genoma de milho haploide.

Exemplo 2. Determinação de Ploidia do Calo [00253] A fim de determinar o nível de ploidia da célula, 1 g de teci- do de calo preparado no Exemplo 1 foi transferido para uma placa de Petri™ estéril (Fisher Scientific, St. Louis, MO). Os núcleos foram libe- rados através do corte do tecido de calo com uma lâmina de barbear de único gume na presença de 1 a 2 ml de tampão Gailbraith gelado filtrado (0,01 M MgS04, 0,005 M KCI, 0,0005 M HEPES, 1 mg/mL TDT), juntamente com 'meio MMG' (4 mM MES [pH 6,0], 0,6 M mani- tol, 15 mM de MgCI2) e 0,25 % de Triton X-100™. A placa de Petri™ foi enxaguada com um adicional de 2 ml de tampão, o qual foi combi- nado com o extrato nuclear inicial para produzir um volume de pasta fluida final de -5 ml. O extrato nuclear bruto foi então suavemente ho- mogeneizado através da transferência para um homogeneizador de tecido de vidro e bombeamento do êmbolo para cima e para baixo al- gumas vezes. O homogeneizado foi então filtrado através de coadores de chá e o filtrado resultante foi aspirado através de um Steri-flip™ de 40 pm (Millipore; Billerica, Massachusetts, USA) para isolar os nú- cleos. Os núcleos isolados foram manchados com iodeto de propídio (Sigma-Aldrich; St Louis, Missouri, USA) utilizando 10 μΙ/200 μΙ de amostra e analisados com um citômetro de fluxo Beckman Quanta™ (Beckman-Coulter, Brea, CA, USA). Para cada amostra, pelo menos 50.000 núcleos foram coletados e amostras de 75 μΙ foram alimenta- das no citômetro para a análise utilizando um aparato em escala ioga- rítmica. Os resultados do citômetro de fluxo mostraram um grande pico de haploide (G0/G1) e um pico de diploide menor (G2). Os resultados confirmam que o tecido do calo produzido de acordo com o Exemplo 1 consistia de células haploides adequadas para uso nos métodos divul- gados para a modificação de um genoma de milho haploide.

Exemplo 3. Constructos para a Modificação Direcionada do Genoma nos Protoplastos Isolados do Calo Haploide [00254] Para a modificação direcionada do genoma, um constructo de nuclease dedo de zinco (ZFN), pDAB111879 (representada na Fi- gura 1), foi utilizada. A expressão de ZFN foi conduzida pelo promotor ubi 1 de milho e terminou com a UTR 3' de milho per5. Este cassete de expressão continha a arquitectura "T2A" compreendendo dois domí- nios monoméricos dedo de zinco (zmPPL_1360-r23a1 e zmPPL_1360- 30a1) codificados por, e expressos a partir de, uma única região de codificação. O transcrito expresso incluiu o sinal de repetição T2A (Mattion et a!., 1996, J. Virol., 70:8124-7) para introduzir uma repetição ribossômica que libera o primeiro polipeptídeo durante a translação e é designada, após outra translação, para produzir o primeiro e o segun- do polipeptídeo em quantidades equimolares. Uma sequência de loca- lização nuclear opaque2 (NLS) foi incluída em ambos os monômeros ZF para o direcionamento ao núcleo. Cada uma das duas fusões de domínio NLS-ZF possui especificidade de ligação com a sequência única do genoma do milho mostrada na Tabela 2. Os monômeros de- do de zinco também incluíram um domínio funcional de nuclease Fokl (Kim et ai., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 100:1156-1160) o qual foi condicionado pelo códon utilizando uma tabela de códon preferido monocotilédone.

Tabela 2. Domínios de ligação dedo de zinco e sequências únicas no genoma do milho reconhecidas pelas proteínas dedo de zinco desig- nadas. [00255] Um constructo de polinuc eotídeo doador, pDAB111845 (representada na Figura 2), foi utilizado para a integração de DNA di- recionada em protoplastos derivados de calos haploides através da divagem de filamento duplo direcionada ao sítio por meio do construc- to de ZFN e subsequente reparo do DNA. Este constructo contém a sequência de ligação de DNA para os dois monômeros ZF, zmPPL_1360-r23a1 e zmPPL_1360-30a1. Adicionalmente, este cons- tructo contém uma sequência de 110 pb referida como "UZI” para uso na análise a jusante, isto é, o projeto do sítio iniciador, da inserção di- recionada por meio da PCR interna/externa. A co-liberação deste plasmídeo com pDAB111879 (constructo de ZFN) resulta na divagem em uma sequência genômica única e dentro do constructo de doador, pDAB118845, após expressão de ZFN, o que facilita a integração dire- cionada do constructo de doador no sítio de divagem genômico atra- vés do reparo e recombinação do DNA na junção das extremidades não homólogas. [00256] O precedente fornece exemplos de constructos que podem ser utilizadas nos métodos divulgados para modificar um genoma de milho haploide: pDAB111879 para a liberação de nucleases dedo de zinco específicas do sítio e pDAB111845 para a integração direciona- da de um polinucleotídeo doador.

Exemplo 4. Modificação Direcionada do Genoma nos Protoplastos Iso- lados de Calos Haploides [00257] O calo haploide (~5 gramas) foi transferido para uma placa de Petri™ estéril e 5 ml de "meio MMG" foram adicionados. Uma lâmi- na de barbear de único gume foi utilizada para finamente cortar o calo em pedaços pequenos até que uma pasta fluida cremosa fosse obtida.

Uma espátula estéril foi utilizada para transferir a pasta fluida para um tubo cônico de 50 mL estéril (Fisher Scientific) e 20 mL de 'solução de enzima' (3 % de Celulase™ [Onozuka R10, Yakult Pharmaceuticals, Japan], 0,3 % Pectolyase™ [MP Biomedicals , San Diego, CA] dissol- vidos em meio MMG'). Os tubos foram embrulhados com Parafilm™ e colocados em uma plataforma oscilante Vari-Mix™ (Thermo Scientific, Waltham, MA) e fixados em agitação vigorosa durante -16 a 18 horas no escuro a 24 Ό. Em um tubo cônico de 50 ml estéril, a 'solução de enzima' foi lentamente filtrada através de um coador de células de 100 pm (Falcon). O coador de células (com células) foi enxaguado por pi- petagem de 10 ml de 'meio W5+' (1,86 mM MES [pH 6,0], 0,5 mL de 0,2 M MES [pH 6,0], 192 mM NaCI, 6,7 mL de 1,54 M NaCI, 154 mM

CaCI2, 8,3 mL de 1 M CaCI2, 4,7 mM KCI, 1,25 mL de 0,2 M KCI e 37 mL de água) através do coador de células de 100 pm. Esta etapa foi repetida utilizando um coador de células de 70 pm (Falcon) para cap- turar detritos menores. O filtrado foi então peneirado utilizando um co- ador de células de 40 pm (Falcon) e enxaguado novamente com 10 ml de 'meio W5+', resultando em um volume final de filtrado de 40 mL. O tubo foi então suavemente invertido e 8 ml de uma 'solução gradiente pesada' (500 mM sacarose, 1 mM CaCI2 e 5 mM MES [pH 6,0]) foram lentamente adicionados ao filtrado sob a mistura de protoplasto/ solu- ção de enzima/W5+ no tubo. O tubo foi então centrifugado com um rotor de caçamba de braço oscilante (da Eppendorf, Hauppauge, NY) durante 10 minutos a 1500 rpm. A camada de protoplasto (visível entre a 'solução gradiente pesada' e a 'solução de enzimaYmeio W5+') foi então lentamente removida utilizando uma ponta de pipeta de diâmetro estreito de 10 ml e colocada em um tubo cônico de 50 ml estéril. O tu- bo foi então levado a um volume de 35 ml utilizando 'meio W5+\ len- tamente invertido várias vezes e centrifugado durante 10 minutos a 1000 rpm. O sobrenadante foi então removido sem agitar o grânulo. O grânulo contendo os protoplastos foi então colocado novamente em suspensão em 5 mL de 'meio MMG'. A concentração de protoplastos por ml foi determinada utilizando um citômetro de fluxo Beckman Quanta™ em primeiro lugar colocando novamente em suspensão o grânulo em 5 ml de "meio MMG" e depois adicionando de 30 pl a 270 μΙ de 'meio MMG "em uma placa de 96 reservatórios. [00258] Para a transfecção, os protoplastos foram diluídos em 1,67 milhões por ml utilizando 'meio MMG'. 300 μΙ de cada amostra (-500.000 protoplastos) foram transferidos para um tubo de 2 ml esté- ril. Um total de 40 pg de DNA plasmídeo (36 pg de pDAB111845 [poli- nucleotídeo doador] + 4 pg de pDAB111879 [polinucleotídeo de codifi- cação da ZFN]) foram adicionados a cada tubo e lentamente mistura- dos mediante a inversão dos tubos e incubados durante 5 minutos na temperatura ambiente. PEG4000™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi lentamente adicionado (300 μΙ) à mistura de protoplasto/DNA e sua- vemente invertido até que os conteúdos fossem completamente mistu- rados. Os tubos foram incubados na temperatura ambiente durante 5 minutos, com inversão suave ocasional para misturar. Após a incuba- ção, 1 ml de 'meio W5+” foi lentamente adicionado e os tubos foram invertidos suavemente de 5 a 10 vezes. Os tubos foram depois centri- fugados a 1500 rpm durante 5 minutos em uma microcentrífuga (Ep- pendorf). O sobrenadante foi cuidadosamente removido tendo certeza de não agitar o grânulo. Assim que o sobrenadante foi removido, 1 ml de 'meio Wl' (4 mM MES [pH 6,0], 1 ml de 0,2 mM MES [pH 6,0], 0,6 M manitol, 30 ml de 1 M manitol, 20 mM KCI, 5 ml de 0,2 M KCI e 14 ml de água) foi adicionado a cada tubo e suavemente invertido colocar novamente em suspensão o grânulo. Os tubos foram em seguida co- bertos com folha de alumínio para eliminar a luminosidade e colocados no seu lado para a incubação durante a noite, após o que o DNA ge- nômico foi extraído e analisado com relação à modificação do genoma direcionada. [00259] O que precede demonstra um exemplo do método divulga- do para a modificação direcionada, por exemplo, integração específica do sítio, de um genoma de milho haploide nos protoplastos isolados a partir de calos derivados de micrósporos que foram transformados com um polinucleotídeo doador e um polinucleotídeo que codifica uma nuclease dedo de zinco (ZFN).

Exemplo 5. Análise Molecular de Protoplastos Haploides com Modifi- cação Direcionada do Genoma [00260] A PCR interna-externa embutida assimétrica (ANIO) (Ped.

Provisório U.S. No. 61/873719) foi utilizada para detectar a modifica- ção direcionada do genoma no DNA genômico extraído de protoplas- tos transfectados do Exemplo 4. Os conjuntos de pares de iniciadores utilizados para a detecção são mostrados na Tabela 3. Um par de ini- ciadores foi designado para se ligar especificamente à sequência ge- nômica e o outro par de iniciadores foi designado para se ligar à se- quência de DNA de polinucleotídeo doador. Após a desnaturação ini- cial, o programa de amplificação incluiu: 98 Ό durante 12 segundos e 66 Ό durante 30 segundos para 15 ciclos e depois 7 2 Ό durante 10 minutos com um final mantido a 4 Ό utilizando o ki t de PCR EX-TAQ

HS™ (Clontech Laboratories, Inc .; Mountain View, Califórnia, USA). O primeiro produto da PCR foi então utilizado em uma segunda reação de PCR embutida. Após a desnaturação inicial do primeiro produto de PCR, o programa de amplificação incluiu: 98Ό durante 12 segundos, 66Ό durante 30 segundos e depois 68Ό durante 1 mi nuto durante 30 ciclos e então 72Ό durante 10 minutos seguido de um final mantido a 4Ό. Os produtos da PCR foram decididos por eletrof orese em gel uti- lizando uma mistura E-gel™ a 1% (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os resul- tados da eletroforese produziram os tamanhos de fragmentos de gel esperados para os produtos da PCR (700 e 1053 pb, respectivamente, para as junções 5' e 3') indicando a presença de uma inserção direcio- nada. Assim, o precedente indica que o método divulgado produziu inserção direcionada do transgene de polinucleotídeo doador no ge- noma haploide do milho.

Tabela 3. Iniciadores utilizados para as reações de PCR AN IO. [00261] O que precede demonstra um exemplo do método divulgado para confirmar a integração direcionada do polinucleotídeo doador no genoma do tecido haploide derivado de micrósporo do milho.

Exemplo 6. Constructos para a Modificação Direcionada do Genoma de Calo Haploide [00262] Para a integração direcionada do transgene no calo haploi- de, um constructo de doador, pDAB118783, foi utilizada a qual contém -500 pb de sequência homóloga para o flanqueamento das sequên- cias de reconhecimento únicas zmPPL_1360-r23a1 e zmPPL_1360- 30a1 no genoma do milho (Figura 3). Estas sequências são referidas como "Subdivisões de Homologia'. Este constructo de doador também contém um cassete de expressão de aad-1 para a seleção in vitro em meios contendo haloxifop. A expressão do gene aad-1 é controlada pelo promotor ubi1 do milho e concluída pela UTR perõ 3' de milho. A co-liberação deste constructo com pDAB111879 (constructo de ZFN) resulta na divagem de DNA genômico de filamento duplo em uma se- quência genômica única como um resultado da expressão de ZFN. As "subdivisões de homologia' fornecem um modelo para o reparo direci- onado pela homologia, integrando assim o cassete de expressão aad- 1 no sítio de divagem genômico. [00263] O que precede fornece exemplos de um polinucleotídeo doador (pDAB118783) que compreende um transgene marcador sele- cionável, aad1, e é adequado para uso no método divulgado de modi- ficação de um genoma de milho haploide mediante a integração dire- cionada do transgene no genoma haploide.

Exemplo 7. Modificação Direcionada do Genoma no Calo Haploide [00264] Três dias antes do bombardeio, o calo haploide foi picado em pedaços de ~1 a 2 mm utilizando um bisturi descartável, colocado sobre a superfície do 'meio de calo' fresco e incubado no escuro a 28Ό. Cerca de 4 horas antes do bombardeio, os peda ços de calo fo- ram dispostos em um círculo de 1 cm de diâmetro no centro de uma placa de Petri™ de 100 x 15 mm contendo 'meio osmótico' ('meio de calo' com a adição de 45,5 g/L cada um de sorbitol e manitol) e incu- bados no escuro a 28 Ό. O calo foi bombardeado com um total de 0,5 pg de DNA (pDAB111879 [ZFN] somente ou uma combinação de 10:1 de pDAB118783 [Doador] e pDAB111879 [ZFN]) precipitados com 2,5 M CaCI2 e 0,1 M espermidina sobre a superfície de 150 pg de ouro 0,6 p em 900 psi e 6 cm de distância de vôo utilizando um PDS-1000 particle acceleration device™ (BioRad; Hercules, Califórnia, USA). [00265] O que precede demonstra um exemplo do método divulga- do para a modificação direcionada do genoma de milho haploide atra- vés do bombardeio de micropartículas do calo haploide derivado de micrósporo com uma ZFN e um polinucleotídeo doador.

Exemplo 8. Análise Molecular do Calo Haploide com Modificação Dire- cionada do Genoma [00266] As amostras de tecido de calo transformadas com pDAB111879 (ZFN) apenas através do bombardeio de micropartículas no Exemplo 7 foram liofilizadas para a extração do DNA genômico uti- lizando o Qiagen (Germantown, Maryland, USA) plant DNA extraction kit™ de acordo com as especificações do fabricante. O DNA genômico foi colocado novamente em suspensão em 200 pl de água e a concen- tração foi determinada por Nanodrop® (Invitrogen, Carlsbad, Califór- nia, USA). A integridade do DNA foi estimada através da operação de todas as amostras em 0,8% agarose E-gels™ (Invitrogen). Todas as amostras foram normalizadas (25 ng/μΙ) para amplificação de PCR pa- ra gerar amplicons para o sequenciamento utilizando um sistema de lllumina® (San Diego, CA). [00267] Para a PCR preparativa, 5 μΙ de cada representante foi reu- nido e as reações PCR em pequena escala individuais 5 foram execu- tadas para cada modelo utilizando 0,2 μΜ de iniciadores apropriados de código de barras, Accuprime Pfx Supermix® (Invitrogen) e 25 ng de DNA genômico modelo em uma reação de 24 μΙ. Os parâmetros de ciclagem incluíram a desnaturação inicial a 95° (5 minutos) seguido de 35 ciclos de desnaturação (95 °C, 15 segundos), recozimento (55 °C, 30 segundos), extensão (68 °C, 1 minuto) e uma extensão final (72 °C, 7 minutos). Os produtos da PCR foram reunidos entre si e purificados com gel em gel de agarose a 4 % utilizando o kit de extra- ção/purificação de gel da Qiagen MinElute™. As concentrações dos amplicons purificados com gel foram determinadas e as amostras de amplicon da PCR foram preparadas através do agrupamento de apro- ximadamente 200 ng de amplicons de código de barras da ZFN direci- onada e que corresponde aos controles do tipo selvagem (Tabela 4).

Tabela 4. Iniciadores utilizados para a amplificação da sequência alvo genômica. [00268] O sequenciamento com lllumina® foi executado e analisado utilizando um manuscrito de análise de sequências. As sequências de baixa qualidade (sequências com uma pontuação de qualidade inter- ceptada < 5) foram filtradas e as sequências remanescentes foram analisadas de acordo com os códigos de barras. As listas de código de barras foram depois alinhadas com a sequência de referência e pontu- adas com relação às inserções e/ou anulações. A atividade de diva- gem foi detectada como uma função das sequências de alta qualidade com inserções e/ou anulações que resultam do reparo NHEJ propenso a erros. Um conjunto representativo de sequências alteradas (SEQ ID NO: 33 a SEQ ID NO: 45) é fornecido como um alinhamento para a sequência alvo de DNA genômico (SEQ ID NO: 32) para mostrar as anulações e adições resultantes (Figura 4). Um resumo das frequên- cias é mostrado na Tabela 5.

Tabela 5. Frequência inserção-anulação (Indel) no lócus de PPL1 no bombardeio vs. controle de calo. [00269] Deste modo, o que precede indica que o método divulgado produziu mutagênese direcionada no lócus de PPL1 do genoma haplo- ide do milho. O precedente também demonstra um exemplo do méto- do divulgado para a confirmação da mutagênese direcionada do ge- noma haploide.

Exemplo 9. Duplicação do Cromossoma, Seleção e Regeneração da Planta do Calo Haploide [00270] O calo do Exemplo 7 co-bombardeado com pDAB118783 (doador) e pDAB111879 (ZFN) foi transferido na manhã seguinte para a superfície do papel de filtro (Whatman #4) colocado sobre a superfí- cie de uma placa de Petri™ de 100 x 25 contendo 'médio calo' fresco, absorvido com 1 ml de solução de colquicina a 0,025 % e incubado no escuro a 28 Ό. Após 48 horas, o calo tratado com colquicina foi enxa- guado com 4 ml de 'meio de calo' líquido utilizando um coador de célu- las 100 μ (Falcon 352360), secado por absorção em papel de filtro es- téril e transferido para placas de Petri™ de 100 x 20 mm contendo 'meio de calo' fresco. Após um adicional de 4 dias (8 dias pós- bombardeio) no escuro a 28 O, a natureza haploide duplicada do calo foi confirmada por citometria de fluxo, cujos resultados são mostrados na Figura 5. O calo foi então transferido para o 'meio de seleção' ('meio de calo' com 100 μΜ de Haloxyfop™. [00271] Após 14 dias no 'meio de seleção", o calo foi transferido para o 'meio de seleção' fresco durante um adicional de 14 dias e co- locado em condições de pouca luz a 28 °C. Após um total de quatro semanas no 'meio de seleção' (5 semanas de bombardeio), o calo foi transferido para placas de Petri™ de 100 x 25 mm contendo 'meio de pré-regeneração' (sais MS e vitaminas, 45 g/L de sacarose, 350 mg/L de L-prolina, 250 mg/L de MES, 100 mg/L de mio-inositol, 2,5 mg/L de ABA, 1 mg/L de BAP, 0,5 mg/L de NAA, 1 mg/L de nitrato de prata, 2,5 g/L de Gelrite ™ com 100 μΜ de haloxifope ajustado para pH 5,8) e colocado na luz (50 μΜ) a 28 Ό. Após 7 dias, o calo foi transferido pa- ra um PhytaTray™ II (Sigma-Aldrich; St Louis, Missouri, USA) conten- do 'meio de regeneração' (sais MS e vitaminas, 60 g/L de sacarose, 100 mg/L de mio-inositol , 2,5 g/L de Gelrite™ com 100 μΜ de Ha- loxyfop™ para pDAB118873 + pDAB111879 ajustado para pH 5,8) e colocado na luz (160 μΜ) a 28Ό. Após 14 a 21 dias, os brotos são transferidos para o 'médio de alongamento de broto' (sais MS, vitami- nas N6, 30 g/L de sacarose, 500 mg/L de MES, 5,5 g/L de ágar com 100 μΜ de Haloxyfop™ ajustado para pH 5,8) e colocados na luz (190 μΜ) a 28Ό. [00272] As plantas enraizadas foram transplantadas para dentro de vasos de plástico de 10 cm contendo Pro-Mix BX™ (Premier Tech; Ri- viere-du-Loup, Canada) e colocadas em câmara de crescimento (Con- viron; Winnipeg, Canada) com um fotoperíodo 16/8 h e temperaturas de 27/24 Ό. As plantas foram depois transplantadas para vasos de 5 galões (19 litros) contendo uma mistura de 95 % Pro-Mix BX™ e 5 % argila/terra argilosa e transferidas para uma estufa com iluminação su- plementar fornecida por lâmpadas de haleto de metal e de sódio de alta pressão com um fotoperíodo de 16/8 h e temperaturas de 30/20Ό. As plantas foram então cultivadas até à maturidade e auto- polinizadas. [00273] O que precede demonstra um exemplo do método divulga- do para a regeneração de uma planta haploide duplicada de calo ha- ploide derivado de micrósporo que compreende um transgene direcio- nado integrado no seu genoma.

Exemplo 10. Análise Molecular de Plantas Transqênicas Haploides Dobradas [00274] As amostras de tecido das plantas haploides duplas do Exemplo 9, foram coletadas em placas de coleta de 96 reservatórios e liofílizadas durante 2 dias. A maceração de tecido foi executada com um Genogrinder 2010™ (SPEX Sample Prep) e esferas de aço inoxi- dável. Após a maceração do tecido o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento, utilizando o BioSprint kit™ (Qiagen; Ger- mantown, Maryland, USA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi quantificada pelo Quant-IT Pico Green DNA assay kit™ (Molecular Probes; Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, USA). O DNA genômico quantificado foi ajustado par 2 ng/μΙ pelo en- saio de sonda de hidrólise utilizando um manipulador de líquido auto- matizado Biomek NXP™ (Beckman Coulter, Pasadena, Califórnia, USA). [00275] A determinação de número de cópias do transgene através do ensaio de sonda de hidrólise foi executada pela PCR em tempo real utilizando o LIGHTCYCLER®480 system (Roche Applied Science; Indi- anapolis, Indiana, USA). Os ensaios foram designados para aad-1 e o gene de referência interna, invertase (Genbank Accession No: U16123.1) utilizando LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Pa- ra a amplificação, LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (Roche Ap- plied Science) foi preparada na concentração final de 1X em uma rea- ção multiplex de 10 pl de volume contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 6). Uma reação de amplificação de du- as etapas foi executada com uma extensão a 60 Ό durante 40 segun- dos para aad-1/invertase com aquisição de fluorescência. A análise de dados da PCR em tempo real foi executada utilizando LIGHTCYCLER® software release 1.5 que utiliza o módulo quant rela- tiva e baseia-se no método AACt. Para isso, uma amostra de gDNA de um calibrador de única cópia e verificação conhecida 2 cópias foi inclu- ída em cada operação.

Tabela 6. Informações de iniciador e sonda para o ensaio de son- da de hidrólise de aad-1 e de referência interna (invertase). [00276] A detecção de eventos com a inserção do transgene direci- onada foi executada utilizando reações PCR ‘internas-externas’ indivi- duais. Os pares de iniciadores, um específico para a sequência genô- mica de flanqueamento e o outro específico para o constructo de doa- dor, que foram utilizados para a detecção, são mostrados na Tabela 7.

Após a desnaturação inicial, o programa de amplificação incluiu: 94Ό durante 30 s, 60Ό durante 30 s, 72Ό durante 1 m p ara 35 ciclos, se- guido por 72 Ό durante 10 min antes de ser mantida a 4Ό. As rea- ções PCR utilizaram o EX-TAQ PCR kit™ (Clontech Laboratories, Inc).

Os produtos da PCR foram decididos e identificados utilizando um gel de agarose a 1 %.

Tabela 7. Iniciadores para as reações PCR internas-externas. [00277] O rompimento mediado pela ZFN do sítio de divagem foi determinado por um ensaio de sonda de hidrólise por meio da PCR em tempo real utilizando o sistema de LIGHTCYCLER®480 (Roche Appli- ed Science). Os ensaios foram designados para ter os iniciadores e a sonda temperada para as sequências que flanqueiam o sitio de ligação a ZFN e a invertase de referência interna. Para a amplificação, a mis- tura de LIGHTCYCLER®480 Probe Master foi preparada na concentra- ção final 1X em uma reação multiplex de 10 μΙ de volume contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 μΜ de cada sonda (Tabela 8). Uma reação de amplificação de duas etapas é executada com uma extensão a 60 Ό durante 30 segundos com a aquisição de fluorescê ncia. A análise dos dados da PCR em tempo real foi executado com LIGHTCYCLER® software release 1,5 utilizando o módulo quant relativa e comparação da relação de alvo para referência. Uma amostra de DNA genômico de uma planta de controle não transgênica foi incluída em cada operação.

Tabela 8. Informações de iniciador e sonda para o ensaio de sonda de hidrólise do rompimento do lócus genômico. [00278] Plantas de milho haploides duplas T0 que continham um constructo de aad-1 direcionada como determinado por meio da PCR ‘interna-externa’ e ensaio qPCR de rompimento do lócus foram seleci- onadas para análise de Sothern blots. Southern blots foram prepara- das e investigadas como descrito anteriormente. As amostras foram depois digeridas utilizando Hindlll (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante a noite a 37 O, A sonda foi gerada utiliza ndo os iniciadores apresentados na Tabela 9, que se ligam à sequência genômica fora das 'subdivisões de homologia'. As Southern blots resultantes confir- mou que os eventos transgênicos continham uma cópia de compri- mento total do constructo de aad-1 direcionada.

Tabela 9. Iniciadores utilizados para a produção de sonda para a aná- lise de Southern blot. [00279] O que precede demonstra vários exemplos do método di- vulgado para a confirmação de que as plantas haploides duplas (rege- neradas a partir do calo haploide derivado de micrósporo) apresenta- ram integração de transgene direcionada.

Claims

1. Método para a modificação de um genoma de milho, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer tecido haploide competente de transformação derivado de micrósporo do milho compreendendo um genoma de teci- do haploide; (b) liberar um polinucleotídeo que codifica uma nuclease específica do sítio ao tecido haploide competente de transformação; e (c) confirmar que o genoma de tecido haploide é modificado pela nuclease específica do sítio codificada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido haploide competente de transformação é te- cido de embrião ou calo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que o método compreende a liberação de polinucleo- tídeo que codifica o polinucleotídeo de nuclease específico do sítio ao tecido haploide competente de transformação através de um método de transformação de plantas selecionado do grupo que consiste em um método de transformação por bombardeio de micropartículas, mé- todo de transformação de Agrobacterium, método de transformação de fosfato de cálcio, método de transformação de polibreno, o método de transformação de eletroporação, método de transformação de ultra- som, método de transformação de lipossoma, método de transforma- ção por microinjeção, método de transformação de DNA exposto, mé- todo de transformação de vetor plasmídeo, método de transformação de vetor viral, método de transformação mediado por carboneto de si- lício, método de transformação radiante de aerossol e método de transformação de PEG.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo nuclease específico do sítio codifica uma nuclease selecionada do grupo que consiste em uma nuclease dedo de zinco, nuclease TALEN, meganu- clease, e nuclease CRISPR.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende (b) a liberação de um polinucleotídeo doador e a integração de forma estável do polinucleotídeo doador no genoma de tecido haploide modi- ficado.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doador compreende um ou dois domínios e cada domínio é pelo menos 85 % idêntico a uma sequên- cia na região alvo de DNA genômico do genoma de tecido haploide.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o tecido competente de trans- formação derivado de micrósporo é de milho tendo características de desempenho de elite.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o tecido competente de transformação derivado de micrósporo é de milho híbrido derivado do cruzamento de uma linha- gem de milho elite com uma linhagem de milho diferente tendo eleva- da resposta de cultura de micrósporo.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o método compreende a con- firmação de que o genoma de tecido haploide é modificado através da execução de um ensaio baseado na PCR, um ensaio de Southern blot, um ensaio de Northern blot, uma análise de expressão de proteína, um ensaio de Western blot, um ensaio ELISA ou um ensaio de Next Gene- ration Sequencing.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o método ainda compre- ende: (d) tratar o tecido haploide compreendendo o genoma de tecido haploide modificado com um agente de duplicação do cromos- soma (e) produzir o tecido de milho diaploide compreendendo um genoma de milho diaploide modificado; e, (f) regenerar o tecido de milho diaploide em uma planta de milho diaploide compreendendo um genoma de milho diaploide modifi- cado homozigoto.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o tecido haploide com- petente de transformação derivado de micrósporo é gerado por um método que compreende: (i) a colheita de pendões contendo micrósporo de milho; (ii) a incubação dos pendões em uma temperatura de cerca de 4 a 12*C; (iii) o isolamento de anteras contendo micrósporos dos pendões; (iv) o cultivo de anteras no meio de cultura de antera para gerar embriões derivados de micrósporos; e, (v) o cultivo dos embriões derivados de micrósporo no meio de calo para desse modo gerar o tecido haploide competente de trans- formação derivado de micrósporo.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o método compreende (b') liberar um polinucleotídeo doador e integrar de forma estável o polinucleotídeo doador no genoma do tecido haploide modifi- cado, (b") integrar de forma estável o polinucleotídeo doador em uma região alvo do genoma de tecido haploide; e (c) confirmar o polinucleotídeo doador integrado na região alvo do ge- noma de tecido haploide.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doa- dor integrado é expresso dentro do tecido haploide do milho.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo doa- dor integrado confere uma característica agronômica.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o método ainda com- preende (b) expressar a nuclease específica do sítio e introduzir uma mutação no genoma haploide do milho, e (c) confirmar que o genoma do milho haploide compreende uma mutação.

16. Planta de milho regenerada a partir de tecido, caracteri- zada pelo fato de que compreende o genoma de tecido haploide modi- ficado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.

17. Planta de milho regenerada a partir do genoma de teci- do diaploide modificado como definido em qualquer uma das reivindi- cações de 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a planta regenerada compreende a modificação do genoma introduzido pela nuclease es- pecífica do sítio codificada.

18. Planta de milho diaploide regenerada a partir do geno- ma de tecido diaploide modificado como definido na reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a planta regenerada compreende a mo- dificação introduzida pela nuclease específica do sítio codificada.

19. Método de produção de uma planta progênie de milho, caracterizado pelo fato de que compreende a modificação introduzida pela nuclease específica do sítio codificada (a) que cruza a planta de milho como definida na reivindica- ção 17 com plantas de uma linhagem de milho de origem diferente pa- ra produzir plantas progênies F1; (b) que seleciona uma ou mais plantas progênies F1 tendo a modificação do genoma introduzida pela nuclease específica do sítio codificada para produzir uma ou mais plantas progênies de milho compreendendo a modificação introduzida pela nuclease específica do sítio codificada; e (c) opcionalmente, (i) para o retrocruzamento de plantas progênies F1 com a planta de milho como definida na reivindicação 18 ou a linhagem de milho de origem diferente para produzir plantas pro- gênies de retrocruzamento, (ii) seleção de plantas progênies de retro- cruzamento que compreende a modificação do genoma introduzida pela nuclease específica do sítio codificada, e (iii) opcionalmente ainda repetir as etapas (i) e (ii) para produzir uma ou mais plantas progênies do milho compreendendo a modificação introduzida pela nuclease es- pecífica do sítio codificada.

20. Método de produção de uma planta progênie de milho, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação introdu- zida pela nuclease específica do sítio codificada (a) que cruza a planta de milho como definida na reivindica- ção 18, com plantas de uma linhagem de milho de origem diferente para produzir plantas progênies F1; (b) que seleciona uma ou mais plantas progênies F1 tendo a modificação do genoma introduzida pela nuclease específica do sítio codificada para produzir uma ou mais plantas progênies de milho compreendendo a modificação introduzida pela nuclease específica do sítio codificada; e (c) opcionalmente, (i) para o retrocruzamento de plantas progênies F1 com a planta de milho como definida na reivindicação 18 ou a linhagem de milho de origem diferente para produzir plantas pro- gênies de retrocruzamento, (ii) seleção de plantas progênies de retro- cruzamento que compreende a modificação do genoma introduzida pela nuclease específica do sítio codificada, e (iii) opcionalmente ainda repetir as etapas (i) e (ii) para produzir uma ou mais plantas progênies do milho compreendendo a modificação introduzida pela nuclease es- pecífica do sítio codificada.

21. Grãos da planta progênie do milho, caracterizados pelo fato de que compreendem a modificação introduzida pela nuclease específica do sítio codificada produzida de acordo com o método como definido na reivindicação 19.

22. Grãos da planta progênie do milho, caracterizados pelo fato de que compreendem a modificação introduzida pela nuclease específica do sítio codificada produzida de acordo com o método como definido na reivindicação 20.