CN107034233B

CN107034233B - 一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法

Info

Publication number: CN107034233B
Application number: CN201710353716.3A
Authority: CN
Inventors: 裴得胜; 罗娟娟
Original assignee: Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology of CAS
Current assignee: Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology of CAS
Priority date: 2017-05-18
Filing date: 2017-05-18
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2037-05-18
Also published as: CN107034233A

Abstract

本发明提供一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法，包括如下步骤：步骤A：选择内源性基因，确定内源性基因的打靶位点以及打靶序列，合成gRNA；步骤B：构建外源性基因重组表达载体；步骤C：将Cas 9 capped RNA、步骤A获得的gRNA、步骤B获得的重组表达载体共同注射入动物的受精卵中，使得目的基因整合进入基因组，选育得到内源性启动子驱动外源性基因表达的动物体。本发明不破坏基因原有的功能，运用微同源技术将外源基因进行同源重组，明显提高重组效率；由内源性启动子驱动外源基因的表达，有助于外源基因与内源靶基因等量表达，利用外源基因真实地重现内源靶基因的表达模式，同时有效避免复杂性启动子的扩增。

Description

一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法

技术领域

本发明涉及CRISPR/Cas9的基因修饰技术领域，特别是涉及一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9)基因编辑系统是基于古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的一种新型基因编辑技术。相对于传统的基因编辑系统，该系统具有突变效率高、制作简单及成本低等特点。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点敲除、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。

目前已有用该技术将外源荧光蛋白定点敲入斑马鱼的不同基因的不同区域，如2015年，《cell》上发表了用CRISPR/Cas9技术将外源EGFP蛋白定点敲入斑马鱼基因的内含子中，利用基因组中原本的启动子驱动了外源EGFP绿色荧光蛋白的表达，并且成功地遗传下去。在其他模式生物中利用该技术也成功地将外源基因敲入基因组中。

在现有的CRISPR/Cas9基因定点敲入技术中均存在以下弊端：首先，破坏了生物体基因组本身的结构与功能，虽然敲入的基因可以表达蛋白，但是其插入位点的基因功能被破坏，若此基因在生物体中扮演重要角色，那么将导致致畸或致死的可能；其次，同源性重组进行基因敲入的效率低且不好掌握，有研究表明，基因敲入的非同源性重组比同源性重组的效率高。此外，敲入的外源基因自带启动子而非基因组中的启动子，这使得载体构建复杂，不易操作。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法，用于解决现有技术中CRISPR/Cas9基因定点敲入时易破坏生物体基因组本身的结构和功能等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法，包括如下步骤：

步骤A：选择内源性基因，确定内源性基因的打靶位点以及打靶序列，合成gRNA；

步骤B：构建外源性基因重组表达载体；

步骤C：将Cas9 capped RNA、步骤A获得的gRNA、步骤B获得的重组表达载体共同注射入动物的受精卵中，使得目的基因整合进入基因组，选育得到内源性启动子驱动外源性基因表达的动物体。

在本发明的一些实施例中，步骤B中，所述外源基因选自荧光蛋白基因，但不仅限于该基因，也可以选择其他的标记基因。

在本发明的一些实施例中，步骤A中，打靶序列如SEQ ID NO.1所示，当然，根据需要，也可以选择其他序列作为打靶序列。

在本发明的一些实施例中，步骤A中，打靶序列的正向引物如SEQ ID NO.2所示，反向引物如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一些实施例中，步骤A中，内源性基因选自GFAP基因，但不仅限于该基因，也可选择其他便于观察的蛋白，将其基因作为本发明的内源性基因。

在本发明的一些实施例中，步骤A中，在内源性基因的3’UTR区域选择打靶位点以及打靶序列。

在本发明的一些实施例中，步骤A中，将打靶序列反转录为gRNA，将该gRNA与Cas9capped RNA共同注射入动物受精卵中，培育受精卵，通过检测获得突变序列，筛选得到打靶位点，备用。

在本发明的一些实施例中，步骤B中，外源性基因重组表达载体包括打靶位点、前同源臂、融合蛋白T2A、外源基因、打靶位点与外源基因之间的3’UTR区、密码子置换后的打靶位点、后同源臂。外源性基因重组表达载体各区段的序列可以根据实际需要进行设计。

在本发明的一些实施例中，所述打靶位点序列如SEQ ID NO.19所示。

在本发明的一些实施例中，所述前同源臂序列如SEQ ID NO.20所示。

在本发明的一些实施例中，所述融合蛋白T2A序列如SEQ ID NO.21所示。

在本发明的一些实施例中，所述外源基因序列如SEQ ID NO.22所示。

在本发明的一些实施例中，所述打靶位点与外源基因之间的3’UTR区序列如SEQID NO.23所示。

在本发明的一些实施例中，所述密码子置换后的打靶位点序列如SEQ ID NO.24所示。

在本发明的一些实施例中，所述后同源臂序列如SEQ ID NO.25所示。

在本发明的一些实施例中，步骤B中，外源性基因重组表达载体的基因序列如SEQID NO.12所示。

在本发明的一些实施例中，步骤C中，将Cas9 capped RNA、步骤A获得的gRNA、步骤B获得的重组表达载体共同注射入动物的受精卵后，培育得到由内源性启动子驱动外源性插入荧光蛋白表达的嵌合体F₀代，将嵌合体F₀代与野生型动物体杂交，筛选得到发荧光的杂合体F₁代，将F₁代发荧光的个体与野生型动物体杂交，筛选得到发荧光的杂合体F₂代，将F₂代雌性个体与雄性个体自交，筛选得到发荧光的纯合体F₃代。

在本发明的一些实施例中，所述动物选自鱼、鼠、兔等中的任一种。

在本发明的一些实施例中，所述动物选自斑马鱼。

本发明第二方面提供一种外源性基因重组表达载体，包括打靶位点、前同源臂、融合蛋白T2A、外源基因、打靶位点与外源基因之间的3’UTR区、密码子置换后的打靶位点、后同源臂。

在本发明的一些实施例中，外源性基因重组表达载体的基因序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明第三方面提供上述外源性基因重组表达载体在培养转基因动物体中的用途。

如上所述，本发明的一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法，具有以下有益效果：本发明不破坏基因原有的功能，运用微同源技术将外源基因进行同源重组，明显提高重组效率；并且，由内源性启动子驱动外源基因的表达，有助于外源基因与内源靶基因等量表达，利用外源基因真实地重现内源靶基因的表达模式，同时有效避免复杂性启动子的扩增。

附图说明

图1显示为本发明实施例中构建入的重组载体中的gfap-mCherry-3’UTR片段的结构图；

图2显示为打靶位点经T7E1检测的琼脂糖凝胶电泳图,两个白色尖头表示被T7E1酶切开的片段大小；

图3-A显示为将重组表达载体与gRNA、Cas9 capped RNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中所得的F₀，将其剪尾提取基因组DNA进行前面接头检测的测序结果；

图3-B显示为将重组表达载体与gRNA、Cas9 capped RNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中所得的F₀，将其剪尾提取基因组DNA进行后面接头检测的测序结果；

图4-A和图4-B显示为F₀所产卵的荧光显微镜拍摄结果；

图5显示为F₀所产的鱼卵进行real-timePCR结果，P>0.05，无显著性差异。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所介绍的方法轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例以斑马鱼进行实验，需要说明的是，本发明也适用于鼠、兔等其他动物，也可适用于其他鱼类。

一、打靶位点的选择

以下实施例中选择的基因为斑马鱼胶质纤维酸性蛋白GFAP，其主要表达于斑马鱼中枢神经系统的星形胶质细胞，这种基因在斑马鱼全身普遍存在，便于观察。为了不破坏基因的原有结构与功能，将打靶位点选择在该基因的3’UTR区域内。根据CRISPR/Cas9的编辑特点，其位点一般为紧邻NGG特征序列之前的20bp序列，因此，在3’UTR区域内确认打靶序列。

二、质粒构建相关元件的选择

以下实施例中实现转基因的技术包括CRISPR/Cas9基因编辑技术、密码子置换与同源重组技术。以下实施例中，是将红色荧光蛋白加入重组质粒中，从而将载体插入待处理模式生物中，例如斑马鱼的基因组中，实现稳定表达。

此外，在红色荧光蛋白之前加上融合蛋白，使之能与基因组中的基因融合，将基因本身的终止密码子放到红色荧光蛋白之后，终止表达进程。

三、基因整合的方法与鉴定

把构建好的重组载体与Cas9 capped RNA以及gRNA通过显微注射同时注射到待处理斑马鱼的受精卵中，等待这些受精卵发育成幼鱼。鱼体透明，目的序列整合到鱼的基因组之后，鱼的特定位置会显示出特定荧光。将这些鱼收集并培育养大，得到由内源性GFAP启动子驱动表达特定荧光的斑马鱼(更具体地，此时得到的是嵌合体F₀)。

四、获得稳定表达的子代

选择生殖细胞中表达荧光的嵌合体F₀并与野生型进行杂交，后代中如果仍然有荧光的个体，属于杂合体F₁。将这些发荧光的杂合体F₁的单个个体与野生型再次进行杂交，它们的后代仍然有荧光的是杂合体F₂，由于杂合体F₂来自同一个父母(杂合体F₁和野生型)，因此，插入的荧光片段在基因组中的位置是一样的。将杂合体中的雌鱼和雄鱼进行杂交，在杂交得到的后代中，有1/4的概率得到内源性启动子驱动特定荧光蛋白表达的斑马鱼纯合体F₃，由于纯合体带有两倍于杂合体的基因，因此，荧光强度强于后者，可以通过荧光强度的方法进行区分。为了进一步验证以下实施例没有破坏基因组中基因的功能，将候选的荧光鱼剪去部分组织，通过Real time-PCR技术进行鉴定。

实施例1 GFAP启动子驱动红色荧光蛋白mCherry的表达

步骤1：构建打靶序列的gRNA序列

首先，在NCBI(美国国家生物技术信息中心)的网站上查到斑马鱼的GFAP基因的基因组序列。找到3’UTR区域，锁定的打靶序列为AGCTAGTGGTCAGAGCAGGT(SEQ ID NO.1)。

然后，为构建打靶序列gRNA，合成以下引物：

gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGAGCTAGTGGTCAGAGCAGGTGTTTTAGAGCT AGAAATAGC(SEQ ID NO.2)；

gRNA-R:AGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO.3)。

以带有gRNA骨架的质粒(中国科学院重庆绿色智能技术研究院环境与健康研究中心实验室已有质粒)为模板，以终浓度为10μM的gRNA-F和gRNA-R为引物扩增gRNA的DNA序列。

配方如表1所示：

表1

PCR程序设计：

第一步：95℃2min；

第二步：95℃20s；

第三步：55℃20s；

第四步：72℃10s；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

将PCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在1％的琼脂糖凝胶电泳上加入10％的加样缓冲液，混匀后，加入琼脂糖凝胶的样孔中，150V电压15min电泳。

切胶回收步骤(天根试剂盒)：在紫外的照射下，对比参照梯状条带(ladder)，将目的条带(100bp)切下(割胶尽可能的小，提高后续回收效率)，向胶块中加入等体积的PN溶液(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温下放置数分钟，彻底地晾干吸附柱，再将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μL ddH₂O，室温放置2min。12000rpm离心2min，收集DNA溶液。

步骤2：体外转录及RNA回收

将切胶纯化的产物转录成RNA，用mMessage mMachine Kit(Ambion公司)进行体外转录，配方如表2所示：

表2

组分	用量
		DNA模板	600ng
10×Transcription Buffer	2μL
		10mM NTP Mix	1μL
酶混合液	1μL
		无核酸酶水	补足至20μL

将上述混合液放入PCR仪中，37℃、3h进行转录。

向RNA产物中加入DNase I酶，去除DNA影响，PCR仪中37℃反应15min。

RNA的纯化(天根试剂盒)：在RNA样品中加入RNase-Free水，补足至100μL，加入350μL溶液RK，充分混匀。加入250μL无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步。将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR2中加入500μL已加入乙醇的漂洗液RW，室温放置2min后，12000rpm离心30sec，弃废液，将CR2放入收集管中。12000rpm离心5min，去除残余液体。将吸附柱CR2转入一个新离心管中，加14μLRNase-Free水，室温放置2min后，12000rpm离心2min，得到gRNA，置于-80℃下保存。

步骤3：Cas9的体外转录和RNA回收

体外转录：Cas9-DNA序列如SEQ ID NO.17所示，将Cas9-pXT表达载体线性化处理，具体地，取800ng Cas9-pXT7质粒(购自国家斑马鱼资源中心)，加入XbaI内切酶1μL、10X缓冲液2μL，加入ddH₂0补足至20μL，配成20μL的酶切体系，放在37℃的水浴锅内酶切2小时。将反应产物通过胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司，以下简称全式金公司)的柱子回收DNA。首先，混合3倍体积的GSB溶液，加入胶回收柱子，静置1分钟。12,000rpm离心1min。加入500μL漂洗液，12000rpm离心1min。加入45μL水洗脱，12,000rpm离心1min，得到线性化产物。

用mMessage mMachine Kit(购自Ambion公司)进行体外转录。

混合液配方如表3所示配方：

表3

组分	用量
		2×NTP/CAP	10μL
10×T7Reaction Buffer	2μL
		线性模板DNA	1μg
酶混合液	2μL
		无核酸酶水	补足至20μL

将上述混合液放入PCR仪中进行转录，条件为37℃、3h。

将RNA产物加入DNase I酶，去除DNA影响，PCR仪中37℃反应15min。

RNA的纯化(天根试剂盒)：在RNA样品中加入RNase-Free水补足至100μL，加入350μL溶液RK，充分混匀。加入250μL无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步。将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR2中加入500μL已加入乙醇的漂洗液RW，室温放置2min后，12,000rpm离心30sec，弃废液，将CR2放入收集管中，12,000rpm离心5min，去除残余液体。将吸附柱CR2转入一个新离心管中，加14μLRNase-Free水，室温放置2min后，12,000rpm离心2min，得到Cas9 capped RNA，置于-80℃保存。

将前述步骤得到的gRNA与Cas9 capped RNA共同注射入斑马鱼单细胞期受精卵中；24小时之后收集30颗鱼卵，提取基因DNA，将30颗鱼卵放入1.5mL离心管中研磨(越细越好)，加100μL裂解液、1μL蛋白酶K，50℃保温1小时，直到组织完全解体，加150μL氯仿，混匀，10000rpm离心4分钟。取上清液于新离心管，用等体积异戊醇抽提。待DNA沉淀形成白色絮状物后，10000rpm离心4分钟，弃去上清，加入70％乙醇，10000rpm离心2分钟，弃去上清，晾干沉淀，加20μL ddH₂O，-20℃保存或直接进行PCR扩增，扩增条带应包含打靶位点，将PCR产物加入T7E1酶(北京唯尚立德生物科技有限公司)进行T7E1检测，能被该酶切开的序列即为突变序列，筛选出能把被酶切开的靶位点作为打靶位点备用。

步骤4：构建重组载体

(1)插入片段的扩增与获取

以带有2A-mCherry序列的质粒(购自TAKARA生物技术公司)为模板，用以下引物PCR扩增插入片段2A-mCherry：

2A-mCherry-gfap-F：

AGCTAGTGGTCAGAGCAGGTGGG

GGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTC(SEQ ID NO.4)

2A-mCherry-gfap-R：

CAAGCCAGTGTCTGAGCCTCA

CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGCCG(SEQ ID NO.5)

其中，2A-mCherry-gfap-F中下划单直线标记的为打靶序列与识别位点的组合序列，前20个碱基为打靶序列，最后3个碱基为识别位点，以便Cas9蛋白能将插入序列从载体上剪切下来，下划双波浪线标记的是与基因组中GFAP基因同源的一段同源臂序列，无下划线的序列是融合蛋白T2A的一段序列。

其中，2A-mCherry-gfap-R中下划单直线标记的为基因组中GFAP基因3’UTR区域的一段序列，下划双波浪线标记的是终止密码子，无下划线的序列为mCherry的一段序列。

2A-mCherry的序列如SEQ ID NO.13所示。

配方如表4所示。

表4

组分	用量
		PrimeSTAR Max Premix(2×)	12.5μL
2A-mCherry-gfap-F	1μL
		2A-mCherry-gfap-R	1μL
模板	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	9.5μL
总计	25μL

PCR程序设计：

第一步：98℃5min；

第二步：98℃10s；

第三步：62℃5s；

第四步：72℃、1min；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃、10min；

反应结束。

其中，PCR模板来源于人工合成的带有2A-mCherry的质粒。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀释为10μL的工作浓度。PrimeSTAR Max Premix(2×)购自于TaKaRa生物公司。总的PCR体积为25μL。反应结束后，PCR管内产物放在4℃冰箱保存或直接进行下一步。

电泳：取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，条带应在800bp左右。

(2)打靶位点与插入片段之间3’UTR序列的扩增与获取

PCR扩增目的片段：用以下引物PCR扩增目的片段

3’UTR-gfap-F:

CGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

TGAGGCTCAGACACTGGCTTG(SEQ ID NO.6)3’UTR-gfap-R:

CCCACCTGCTCTGACCACTAGCTC

ACATCTTGTCCTACTGTTTA(SEQ ID NO.7)

其中，3’UTR-gfap-F中下划单直线标记的碱基是mCherry的一段序列，下划双波浪线标记的是终止密码子，无下划线的是3’UTR区域的一段序列。

其中，3’UTR-gfap-R中下划单直线标记的碱基为打靶序列，最前端的CCC为识别位点，以便CAS9蛋白能将插入序列从载体上剪切下来，下划双波浪线标记的碱基是与打靶位点之后基因组中GFAP基因3’UTR区域同源的一段同源臂序列，下划双直线标记的碱基是经过密码子置换后的打靶序列，无下划线的是3’UTR区域打靶位点前与插入片段之间的一段序列。

配方如表5所示。

表5

PCR程序设计：

第一步：98℃5min；

第二步：98℃10s；

第三步：60℃5s；

第四步：72℃1min；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

其中，PCR模板来源于斑马鱼的基因组。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀释为10μL的工作浓度。PrimeSTAR Max Premix(2×)购自TAKARA生物公司。总的PCR体积为50μL。反应结束后，PCR管内产物放在4℃冰箱保存或直接进行下一步。

电泳：向PCR产物中加入10％的加样缓冲液(loading buffer)，混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，条带应在400bp左右。

(3)2A-mCherry-3’UTR的合成

重组PCR:将步骤(1)和(2)所得的DNA片段用以下引物进行重组，得到2A-mCherry-3’UTR重组片段：

2A-mCherry-gfap-F:

AGCTAGTGGTCAGAGCAGGTGGG

GGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTC(SEQ ID NO.4)

3’UTR-gfap-R:

CCCACCTGCTCTGACCACTAGCTC

ACATCTTGTCCTACTGTTTA(SEQ ID NO.7)

其中，步骤(1)、(2)中的引物2A-mCherry-gfap-R与3’UTR-gfap-F是互补序列，以便于进行重组PCR。

2A-mCherry-3’UTR序列如SEQ ID NO.14。

配方如表6和表7所示。

表6

组分	用量
		PrimeSTAR Max Premix(2×)	12.5μL
模板(1)	1μL
		模板(2)	1μL
ddH<sub>2</sub>O	8.5μL
		总计	23μL

表7

组分	用量
		2A-mCherry-gfap-F	1μL
3’UTR-gfap-R	1μL
		总计	2μL

PCR程序设计：

第一步：98℃5min；

第二步：98℃10s；

第三步：62℃5s；

第四步：72℃1min；

第五步：返回到第二步，循环6次；

六个循环之后暂停PCR仪，将表4引物混合后加入PCR仪中继续以下反应。

第一步：98℃5min；

第二步：98℃10s；

第三步：62℃5s；

第四步：72℃2min；

第五步：返回到第二步，循环30次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

其中，PCR模板来源于步骤(1)和(2)的PCR产物，将产物稀释100倍。正向和反向引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其被稀释为10μL的工作浓度。PrimeSTAR MaxPremix(2×)购自TAKARA生物公司。总的PCR体积为25μL。反应结束后，PCR管内产物放在4℃冰箱保存或直接进行下一步。

电泳并回收PCR产物：取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，条带应在1200bp左右，切下目的片段的琼脂糖胶。

用购自天根生化科技(北京)有限公司的胶回收试剂盒进行胶回收，步骤如下：向胶块中加入等体积的溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液,将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干将吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μL ddH₂O，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。

(4)连接

将1μL的pEASY^⑩-Blunt3Cloning Vector(购自全式金公司)、2μL PCR产物、2μLH₂O混合，形成5μL的连接体系，混匀后，22℃恒温保持10min。

(5)转化涂板，鉴定阳性克隆

连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，冰浴30min，加入到42℃水浴锅中30s，立即至于冰上2min，加入800μL LB培养基，37℃摇床内复苏1h后取出，6000rpm离心3min，弃去500μL上清，将余下部分混匀后涂板，涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止，平板放在37℃培养箱中过夜。

鉴定阳性克隆：待菌落长出来后，用10μL的白枪头挑单菌落，在10μL超纯水中混匀，取1μL做PCR模板，加入2A-mCherry-gfap-F和3’UTR-gfap-R两种引物，62℃进行PCR反应35个循环。取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，在1200bp左右有条带的菌落为阳性菌落。加入5mL带有5μL Amp+的培养基摇菌，37℃过夜后提质粒。

提质粒的步骤如下(采用天根试剂盒)：向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中，向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加35μL ddH₂O，静置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。

用M13-F作为测序引物，进行测序，比对序列，与预期结果一致的序列即为构建成功的重组载体，完整的重组载体(即外源性插入荧光蛋白重组表达载体)序列如SEQ IDNO.12所示。

M13-F引物序列：GTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO.18)。

步骤5：显微注射受精卵

收卵：在喂完斑马鱼晚间食物并等待30分钟后，在配鱼的专用鱼缸中加入雌雄比为2:1、放置数量不多于八条的斑马鱼，用隔板将雌雄分开，放入三分之二的养鱼水。第二天早晨抽去隔板，雄鱼开始追逐雌鱼，一般在15分钟后雌鱼开始排卵，雄鱼将精子排入水中使卵受精，收集卵到平板培养皿中，去除死卵和杂物，用养鱼水洗涤几次，等待注射。

注射：制备注射皿，30mL的2％琼脂糖加热融化，倒入直径10cm的玻璃皿中，将模具轻轻覆盖于脚面，待胶凝固后，移走模具。加入少量养鱼水，保持界面湿润。准备注射针，将外径为1.02mm、内径为0.58mm的玻璃毛细管用拉针仪拉成针形。

受精卵排出后，再过约10分钟，卵膜膨胀，随后数分钟内细胞形态变得规整，此时可以开始注射。用无齿镊在体视镜最高倍放大率下将针头折断少许，尽量断成斜切面。用微量上样吸头吸取1-5μL胚胎纤维注射液从针尾穿入注射针上样，随后将注射针插入持针器中固定。将胚胎清洗后，放入注射模具中，排列成行，吸去多余的液体，使液面刚刚没过鱼卵。

注射时，注射针从胚胎动物极插入到细胞质中和从卵黄中穿过，抵达胞质中。将Cas9-pXT7载体转录出的Cas9 capped RNA(稀释至300ng/μL)、gRNA(20ng/μL)和重组2A-mCherry-3’UTR载体(30ng/μL)共同打入斑马鱼的单细胞期受精卵中。每枚卵注射Cas9capped RNA量为25pg、gRNA量为25pg、2A-mCherry-3’UTR载体量为25pg的混合物。用针尖拨动注射凹槽中的胚胎使细胞质方向与针尖方向一致或者相对，与水平面约成45度下针，扎入到位后踩动踏板注射，略保持后迅速退针，整个过程注意手不要抖动。

注射结束后，将胚胎移至盛有养鱼水的10cm培养皿中，再转移到28.5℃的环境中培养，等待孵化。这段时间需要定期检测，去除死胚和脱下的卵膜，并更换养鱼水。大约到4-5天时，胚胎可以进食草履虫，此时应转移至小鱼喂养盒中。幼鱼12天起可以开始用草履虫和卤水混合喂养，注意及时清理鱼缸，保持水质良好。待幼鱼全部吃卤水时(此时幼鱼的腹部呈红色)，可转入鱼房喂养。

步骤6：嵌合体F₀代的筛选与鉴定

1、荧光筛选

荧光蛋白在注射48h后出现表达，在荧光显微镜下观察幼鱼，挑出表达红色荧光蛋白的幼鱼，将幼鱼放在10cm的皿中，再次检查是否都有荧光，将没有荧光的幼鱼丢弃，剩下的就是嵌合体F₀。

2、分子生物学验证

(1)荧光鉴定后还可以用分子生物学进行验证，用PCR分子生物学手段，证实2A-mCherry-3’UTR序列是否精确无误的插入基因中GFAP基因的3’UTR区域内。在显微镜下挑出有荧光的幼鱼10条左右，提取基因组后进行PCR，检测前面接头处与后面接头处，引物设计如下：

gfap-qian-F:TTAGGATCCCACACAACTCAAA(SEQ ID NO.8)

gfap-qian-R:GCCAGTGTCTGAGCCTCATT(SEQ ID NO.9)

gfap-hou-F:ACCGGCGGCTGGACGAGCTGTA(SEQ ID NO.10)

gfap-hou-R:TCAAATAGCACCGCTGACCA(SEQ ID NO.11)

配方如表8所示。

表8

PCR程序设计：

第一步：94℃3min；

第二步：94℃5s；

第三步：60℃15s；

第四步：72℃10s；

第五步：返回到第二步，循环35次；

第六步：72℃10min；

反应结束。

其中，PCR模板来源于斑马鱼的基因组。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀释为10μL的工作浓度。

Taq DNA Polymerase kit购自于全式金生物公司。总的PCR体积为20μL。反应结束后，PCR管内产物放在4℃冰箱保存或直接进行下一步。

电泳：取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，测定前接头的产物条带应在1200bp左右，测定后接头的产物条带应在650bp左右。切下目的片段的琼脂糖胶。

用购自天根公司的胶回收试剂盒进行胶回收，步骤如下：向胶块中加入等体积的溶液PN，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干将吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μL ddH₂O，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。

(2)连接

将0.5μL pMD 19-T Vector(购自TAKARA生物公司)、2μL Solution I、2μL PCR产物、0.5μL H₂O混合，形成在5μL的连接体系，混匀后，16℃恒温30min。

(3)转化涂板，鉴定阳性克隆

连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，冰浴30min，加入到42℃水浴锅中45s，立即置于冰上2min，加入800μL的LB培养基，37℃摇床内复苏1h后取出，6000rpm离心3min，弃去500μL上清，将余下部分混匀后涂板，涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止，平板放在37℃培养箱中过夜。

鉴定阳性克隆：待菌落长出来后，用10μL的白枪头挑单菌落，在10μL超纯水中混匀，分别取前街头的PCR产物和后接头的PCR产物1μL做模板，各加入对应的上游引物和下游引物，62℃进行PCR反应35个循环。取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，测定前接头的产物条带应在1200bp左右，测定后接头的产物条带应在650bp左右，为阳性菌落。分别加入5mL带5μL Amp+的培养基摇菌，37℃过夜后提质粒。

提质粒的步骤如下(采用天根试剂盒)：向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中，向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加35μL ddH₂O，静置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(4)用M13-F作为测序引物，进行测序，比对序列，与预期结果一致的序列即为插入片段被精确插入到基因组的序列。图3-A显示为前面接头检测的测序结果，具体序列如SEQID NO.15所示；图3-B显示为后面接头检测的测序结果，具体序列如SEQ ID NO.16所示。

3、Realtime-PCR检测原有GFAP表达量变化

选取已剪尾鉴定的将重组片段精准插入基因组的可遗传F0代斑马鱼，用F0与野生型斑马鱼产卵，提取3组斑马鱼卵基因组DNA，每组30颗，并且以相同的组分颗数的野生型鱼卵作对照，通过实时定量PCR(Realtime-PCR)来检测GFAP表达量变化。根据图5结果可见，GFAP的表达量并未受到插入荧光蛋白基因的影响。

步骤7：纯合子的获得和鉴定

(1)纯合子的获得

由于嵌合体不是稳定表达的，因此需要进一步获得可以稳定表达的后代。取步骤6培育得到由内源性启动子驱动表达外源性插入荧光蛋白的嵌合体F₀代，将嵌合体F₀代与野生型动物体杂交，筛选得到发荧光的杂合体F₁代，F₁代荧光鱼是荧光基因已经整合在基因组当中的个体，将F₁代发荧光的个体与野生型动物体杂交，筛选得到发荧光的杂合体F₂代，将F₂代雌性个体与雄性个体自交，有1/4概率得到纯合体F₃，从中筛选得到发荧光的纯合体F₃代。

(2)纯合体的鉴定

首先通过荧光鉴定，在荧光镜下通过观察荧光强度的办法来简单区分开，纯合体带有两倍于杂合体的基因，因此获得的纯合体荧光亮度高于嵌合体。纯合体荧光鱼在激发光刺激下所发荧光特点见图4-A和图4-B。

综上所述，本发明为了在一定程度上克服现有技术的缺点，将打靶位点选在3’UTR区，不仅能够标记基因的表达部位，而且最大程度地不破坏基因原有功能，且运用了微同源技术将外源基因进行同源重组，明显提高重组效率；并且，由内源性启动子驱动外源基因的表达，有助于外源基因与内源靶基因等量表达，利用外源基因真实地重现内源靶基因的表达模式，同时有效避免复杂性启动子的扩增。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院重庆绿色智能技术研究院

<120> 一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法

<130> 171968

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 打靶序列

<400> 1

agctagtggt cagagcaggt 20

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gRNA-F

<400> 2

taatacgact cactatagga gctagtggtc agagcaggtg ttttagagct agaaatagc 59

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gRNA-R

<400> 3

agcaccgact cggtgccac 19

<210> 4

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2A-mCherry-gfap-F

<400> 4

agctagtggt cagagcaggt gggcactacg gagaggaagg atctgccagg cagtggagag 60

ggcagaggaa gtc 73

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2A-mCherry-gfap-R

<400> 5

caagccagtg tctgagcctc attacttgta cagctcgtcc atgccgccg 49

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3'UTR-gfap-F

<400> 6

cggcggcatg gacgagctgt acaagtaatg aggctcagac actggcttg 49

<210> 7

<211> 92

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3'UTR-gfap-R

<400> 7

cccacctgct ctgaccacta gctccaaaaa aaaaaaaaac actatatttc cctccggccc 60

ttacaaccag ctacatcttg tcctactgtt ta 92

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gfap-qian-F

<400> 8

ttaggatccc acacaactca aa 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gfap-qian-R

<400> 9

gccagtgtct gagcctcatt 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gfap-hou-F

<400> 10

accggcggct ggacgagctg ta 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gfap-hou-R

<400> 11

tcaaatagca ccgctgacca 20

<210> 12

<211> 4251

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 外源性基因重组表达载体

<400> 12

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60

tggatcgccc ttgagctagt ggtcagagca ggtgggcact acggagagga aggatctgcc 120

aggcagtgga gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg 180

cccaatggtg agcaagggcg aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt 240

caaggtgcac atggagggct ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga 300

gggccgcccc tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct 360

gcccttcgcc tgggacatcc tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa 420

gcaccccgcc gacatccccg actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga 480

gcgcgtgatg aacttcgagg acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca 540

ggacggcgag ttcatctaca aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc 600

cgtaatgcag aagaagacca tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga 660

cggcgccctg aagggcgaga tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga 720

cgctgaggtc aagaccacct acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa 780

cgtcaacatc aagttggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta 840

cgaacgcgcc gagggccgcc actccaccgg cggcatggac gagctgtaca agtaatgagg 900

ctcagacact ggcttggctg cagaagaaga tctccttcac taatgcttca ggaagctgtg 960

tttgtcaaac cttgtatttt ctcaccaact ttccctgctt ctctcctggt atatatagtt 1020

catggaaact gtattcactg tttttagcaa ctacctatat gttttgatct ccttttcttc 1080

ctgggcttct ctttttatct gtctgtttct tctgtggcag agtctttgca agatagtaga 1140

ctagtttatc gcagaatgtg ctataaaaag tcatggttgg acagatgaaa gtaaacagta 1200

ggacaagatg tagctggttg taagggccgg agggaaatat agtgtttttt ttttttttgg 1260

agctagtggt cagagcaggt gggaagggcg atcccaatca ctagtgaatt cgcggccgcc 1320

tgcaggtcga ccatatggga gagctcccaa cgcgttggat gcatagcttg agtattctat 1380

agtgtcacct aaatagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 1440

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 1500

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 1560

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 1620

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 1680

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 1740

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 1800

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 1860

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1920

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 1980

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 2040

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 2100

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 2160

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 2220

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 2280

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 2340

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 2400

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 2460

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 2520

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 2580

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 2640

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 2700

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 2760

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 2820

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 2880

ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 2940

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 3000

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 3060

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 3120

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 3180

cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 3240

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 3300

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 3360

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 3420

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 3480

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 3540

catttccccg aaaagtgcca cctgatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 3600

aaataccgca tcaggaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt 3660

gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa 3720

aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa 3780

agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac 3840

gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga 3900

accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa 3960

aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc 4020

tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tccattcgcc 4080

attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 4140

gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 4200

gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attgtaatac gactcactat a 4251

<210> 13

<211> 768

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2A-mCherry

<400> 13

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg 60

gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 120

cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 180

ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc 240

gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 300

gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 360

atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaagacggc 420

gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 480

cagaaaaaaa ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 540

ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 600

gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 660

atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 720

gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaagtaa 768

<210> 14

<211> 1084

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 2A-mCherry-3'UTR

<400> 14

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg 60

gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 120

cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 180

ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc 240

gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 300

gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 360

atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaagacggc 420

gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 480

cagaaaaaaa ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 540

ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 600

gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 660

atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 720

gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaagtaatg aggctcagac 780

actggcttgg ctgcagaaga agatctcctt cactaatgct tcaggaagct gtgtttgtca 840

aaccttgtat tttctcacca actttccctg cttctctcct ggtatatata gttcatggaa 900

actgtattca ctgtttttag caactaccta tatgttttga tctccttttc ttcctgggct 960

tctcttttta tctgtctgtt tcttctgtgg cagagtcttt gcaagatagt agactagttt 1020

atcgcagaat gtgctataaa aagtcatggt tggacagatg aaagtaaaca gtaggacaag 1080

atgt 1084

<210> 15

<211> 897

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 前接头检测结果

<400> 15

gatcattaaa gagtccacta cggagaggaa ggatctgcca ggcagtggag agggcagagg 60

aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaatggtga gcaagggcga 120

ggaggataac atggccatca tcaaggagtt catgcgcttc aaggtgcaca tggagggctc 180

cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac 240

ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg tggccccctg cccttcgcct gggacatcct 300

gtcccctcag ttcatgtacg gctccaaggc ctacgtgaag caccccgccg acatccccga 360

ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga 420

cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa 480

ggtgaagctg cgcggcacca acttcccctc cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat 540

gggctgggag gcctcctccg agcggatgta ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat 600

caagcagagg ctgaagctga aggacggcgg ccactacgac gctgaggtca agaccaccta 660

caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg cgcctacaac gtcaacatca agttggacat 720

cacctcccac aacgaggact acaccatcgt ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca 780

ctccaccggc ggcatggacg agctgtacaa gtaatgagct cagacactgg cttggctgca 840

gaagagatct ccttcactaa tgcttcagga agctgtgttt gtcaaacctt gtatttt 897

<210> 16

<211> 898

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 后接头检测结果

<400> 16

tgggacatcc tgtccctcag ttcatgtacg gctccaaggc ctacgtgaag cacccgccga 60

catcccgact acttgaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac 120

ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggcgagttc 180

atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac ttcccctccg acggcccgta atgcagaaga 240

agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg 300

gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga 360

ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt 420

tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg 480

gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta atgaggctca gacactggct 540

tggctgcaga agaagatctc cttcactaat gcttcaggaa gctgtgtttg tcaaaccttg 600

tattttctca ccaactttcc ctgcttctct cctggtatat atagttcatg gaaactgtat 660

tcactgtttt tagcaactac ctatatgttt tgatctcctt ttcttcctgg gcttctcttt 720

ttatctgtct gtttcttctg tggcagagtc cttgcaagat agtagactag tttatcgcag 780

aatgtgctat aaaaagtcat ggttggacag atgaaagtaa acagtaggac aagatgtagc 840

tggttgtaag ggccggaggg aaatatagtg tttttttttt ttttgtcaag cataaatt 898

<210> 17

<211> 4101

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CAS9

<400> 17

ctgttcttca tgtcgtagcc ggacctgtag ccgtggttga gacacccgac ccggcactag 60

tggctgctca tgttccacgg gtcgttcttt aagttccacg acccgttgtg gctggccgtg 120

tcgtagttct tcttggacta gcctcgggac gacaagctgt cgccgctttg tcggctccgg 180

tgggccgact tctcttggcg gtcttcttct atgtggtctg ccttcttggc ctagacgata 240

gacgttctct agaagtcgtt gctctaccgg ttccacctgc tgtcgaagaa ggtgtctgac 300

cttctcagga aggaccacct tctcctattc ttcgtgctcg ccgtggggta gaagccgttg 360

tagcacctgc tccaccggat ggtgctcttc atggggtggt agatggtgga ctctttcttt 420

gaccacctgt cgtggctgtt ccggctggac gccgactaga tagaccggga ccgggtgtac 480

tagttcaagg ccccggtgaa ggactagctc ccgctggact tggggctgtt gtcgctgcac 540

ctgttcgaca agtaggtcga ccacgtctgg atgttggtcg acaagctcct tttggggtag 600

ttgcggtcgc cgcacctgcg gttccggtag gacagacggt ctgactcgtt ctcgtctgcc 660

gaccttttag actagcgggt cgacgggccg ctcttcttct taccggacaa gcctttggac 720

taacgggact cggacccgga ctgggggttg aagttctcgt tgaagctgga ccggctccta 780

cggtttgacg tcgactcgtt cctgtggatg ctgctgctgg acctgttgga cgaccgggtc 840

tagccgctgg tcatgcggct ggacaaagac cggcggttct tggacaggct gcggtaggac 900

gactcgctgt aggactctca cttgtggctc tagtggttcc ggggggactc gcggagatac 960

tagttctcta tgctgctcgt ggtggtcctg gactgggacg actttcgaga gcacgccgtc 1020

gtcgacggac tcttcatgtt tctctaaaag aagctggtct cgttcttgcc gatgcggccg 1080

atgtaactgc cgcctcggtc ggtccttctc aagatgttca agtagttcgg gtaggacctt 1140

ttctacctgc cgtggctcct tgacgagcac ttcgacttgt ctctcctgga cgacgccttc 1200

gtcgcctgga agctgttgcc gtcgtagggg gtggtctagg tggaccctct cgacgtgcgg 1260

taagacgccg ccgtccttct aaaaatgggt aaggacttcc tgttggccct tttctagctc 1320

ttctaggact ggaaggcgta ggggatgatg cacccgggag accggtcccc tttgtcgtct 1380

aagcggacct actggtcttt ctcgctcctt tggtagtggg ggaccttgaa gctccttcac 1440

cacctgttcc cgcgaaggcg ggtctcgaag tagctcgcct actggttgaa gctattcttg 1500

gacgggttgc tcttccacga cgggttcgtg tcggacgaca tgctcatgaa gtggcacata 1560

ttgctcgact ggtttcactt tatgcactgg ctcccttact ctttcgggcg gaaggactcg 1620

ccgctcgtct ttttccggta gcacctggac gacaagttct ggttggcctt tcactggcac 1680

ttcgtcgact ttctcctgat gaagttcttt tagctcacga agctgaggca cctttagagg 1740

ccgcaccttc tagccaagtt gcggagggac ccgtgtatgg tgctagacga cttttaatag 1800

ttcctgttcc tgaaggacct gttactcctt ttgctcctgt aagaccttct atagcacgac 1860

tgggactgtg acaaactcct gtctctctac tagctccttg ccgacttttg gatacgggtg 1920

gacaagctgc tgtttcacta cttcgtcgac ttcgccgcct ctatgtggcc gaccccgtcc 1980

gactcggcct tcgactagtt gccgtaggcc ctgttcgtca ggccgttctg ttaggaccta 2040

aaggacttca ggctgccgaa gcggttgtct ttgaagtacg tcgactaggt gctgctgtcg 2100

gactggaaat ttctcctgta ggtctttcgg gtccacaggc cggtcccgct atcggacgtg 2160

ctcgtgtaac ggttagaccg gccgtcgggg cggtaattct tcccgtagga cgtctgtcac 2220

ttccaccacc tgctcgagca ctttcactac ccggccgtgt tcgggctctt gtagcactag 2280

ctttaccggt ctctcttggt ctggtgggtc ttccctgtct tcttgtcggc gctctcttac 2340

ttcgcctagc ttctcccgta gtttctcgac ccgtcggtct aggactttct tgtggggcac 2400

cttttgtggg tcgacgtctt gctcttcgac atggacatga tggacgtctt acccgcccta 2460

tacatgcacc tggtccttga cctgtagttg gccgacaggc tgatgctaca cctggtatag 2520

cacggagtct cgaaagactt cctgctgagg tagctgttgt tccacgactg gtcttcgctg 2580

ttcttggccc cgttctcgct gttgcacggg aggcttctcc agcacttctt ctacttcttg 2640

atgaccgccg tcgacgactt gcggttcgac taatgggtct ctttcaagct gttagactgg 2700

ttccggctct ctccgccgga ctcgcttgac ctattccggc cgaagtagtt ctctgtcgac 2760

cacctttggg ccgtctagtg tttcgtgcac cgtgtctagg acctgagggc ctacttgtga 2820

ttcatgctgc tcttactgtt cgactaggcc cttcactttc actagtggga cttcaggttc 2880

gaccacaggc taaaggcctt cctaaaggtc aaaatgtttc acgcgctcta gttgttgatg 2940

gtggtgcggg tgctgcggat ggacttgcgg cagcaccctt ggcgggacta gtttttcatg 3000

ggattcgacc tttcgctcaa gcacatgccg ctgatgttcc acatgctgca cgccttctac 3060

tagcggttct cgctcgtcct ttagccgttc cgatggcggt tcatgaagaa gatgtcgttg 3120

tagtacttga aaaagttctg gctctaatgg gaccggttgc cgctctaggc cttcgccgga 3180

gactagctct gtttgccgct ttggcccctc tagcacaccc tattcccggc cctaaaacgg 3240

tggcacgcct ttcacgactc gtacggggtt cacttatagc actttttctg gctccacgtc 3300

tgtccgccga agtcgtttct cagataggac gggttctcct tgtcgctatt cgactagcgg 3360

tctttcttcc tgaccctggg attcttcatg ccgccgaagc tgtcggggtg gcaccggata 3420

agacacgacc accaccggtt tcaccttttc ccgttcaggt tctttgactt ctcacacttt 3480

ctcgacgacc cctagtggta gtacctttct tcgtcgaagc tcttcttagg gtagctgaaa 3540

gaccttcggt tcccgatgtt tcttcacttt ttcctggact agtagttcga cggattcatg 3600

agggacaagc tcgacctttt gccggccttc tcttacgacc ggagacggcc gcttgacgtc 3660

ttccctttgc ttgaccggga cgggaggttt atacacttga aggacatgga ccggtcggtg 3720

atactcttcg acttcccgag ggggctccta ttactcgtct ttgtcgacaa acaccttgtc 3780

gtgttcgtga tggacctgct ctagtagctc gtctagtcgc tcaagaggtt ctctcactag 3840

gaccggctgc gattagacct gtttcacgac aggcggatgt tgttcgtggc cctattcggg 3900

tagtctctcg tccggctctt atagtaggtg gacaaatggg actggttaga ccctcgggga 3960

cggcggaagt tcatgaaact gtggtggtag ctggccttct ccatgtggtc gtggtttctc 4020

cacgacctgc ggtgggacta ggtggtctcg tagtggccgg acatgctctg tgcctagctg 4080

gacagagtcg accctccgct g 4101

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> M13-F引物

<400> 18

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 打靶位点

<400> 19

agctagtggt cagagcaggt ggg 24

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 前同源臂

<400> 20

cactacggag aggaaggatc tgcca 25

<210> 21

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 融合蛋白T2A

<400> 21

ggcagtggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc 60

cca 63

<210> 22

<211> 708

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 外源基因

<400> 22

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708

<210> 23

<211> 319

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 打靶位点与外源基因之间的3’UTR区

<400> 23

taatgaggct cagacactgg cttggctgca gaagaagatc tccttcacta atgcttcagg 60

aagctgtgtt tgtcaaacct tgtattttct caccaacttt ccctgcttct ctcctggtat 120

atatagttca tggaaactgt attcactgtt tttagcaact acctatatgt tttgatctcc 180

ttttcttcct gggcttctct ttttatctgt ctgtttcttc tgtggcagag tctttgcaag 240

atagtagact agtttatcgc agaatgtgct ataaaaagtc atggttggac agatgaaagt 300

aaacagtagg acaagatgt 319

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 密码子置换后的打靶位点

<400> 24

agctggttgt aagggccgga ggg 23

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 后同源臂

<400> 25

aaatatagtg tttttttttt ttttg 25

Claims

1.一种内源性启动子驱动外源基因表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A：选择内源性基因，所述内源性基因为斑马鱼胶质纤维酸性蛋白GFAP，在内源性基因的3’UTR区域选择打靶位点以及打靶序列，将打靶序列反转录为gRNA，构建打靶序列的gRNA序列的方法为：以带有gRNA骨架的质粒为模板，以正向引物gRNA-F和反向引物序gRNA-R为引物扩增gRNA的DNA序列；将所述gRNA与Cas9 capped RNA共同注射入动物受精卵中，培育受精卵，检测获得突变序列，筛选得到打靶位点，备用；所述打靶序列如SEQ ID NO.1所示，所述打靶序列的正向引物gRNA-F序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物gRNA-R序列如SEQID NO.3所示，所述打靶位点序列如SEQ ID NO.19所示；

步骤B：构建外源性基因重组表达载体，所述重组表达载体包括打靶位点、前同源臂、融合蛋白T2A、外源基因、打靶位点与外源基因之间的3’UTR区、密码子置换后的打靶位点、后同源臂；所述前同源臂序列如SEQ ID NO.20所示，所述融合蛋白T2A序列如SEQ ID NO.21所示，所述外源基因序列如SEQ ID NO.22所示，所述打靶位点与外源基因之间的3’UTR区序列如SEQ ID NO.23所示，所述密码子置换后的打靶位点序列如SEQ ID NO.24所示，所述后同源臂序列如SEQ ID NO.25所示；所述重组表达载体序列如SEQ ID NO.12所示；

步骤C：将Cas9 capped RNA、步骤A获得的gRNA、步骤B获得的重组表达载体共同注射入斑马鱼的受精卵中，使得目的基因整合进入基因组，选育得到内源性GFAP启动子驱动外源性基因表达特定荧光的斑马鱼。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C中，将Cas9 capped RNA、步骤A获得的gRNA、步骤B获得的重组表达载体共同注射入动物的受精卵后，培育得到由内源性启动子驱动外源性插入荧光蛋白表达的嵌合体F₀代，将嵌合体F₀代与野生型动物体杂交，筛选得到发荧光的杂合体F₁代，将F₁代发荧光的个体与野生型动物体杂交，筛选得到发荧光的杂合体F₂代，将F₂代雌性个体与雄性个体自交，筛选得到发荧光的纯合体F₃代。

3.一种外源性基因重组表达载体，其特征在于：包括打靶位点、前同源臂、融合蛋白T2A、外源基因、打靶位点与外源基因之间的3’UTR区、密码子置换后的打靶位点、后同源臂；

所述打靶位点序列如SEQ ID NO.19所示，所述前同源臂序列如SEQ ID NO.20所示，所述融合蛋白T2A序列如SEQ ID NO.21所示，所述外源基因序列如SEQ ID NO.22所示，所述打靶位点与外源基因之间的3’UTR区序列如SEQ ID NO.23所示，所述密码子置换后的打靶位点序列如SEQ ID NO.24所示，所述后同源臂序列如SEQ ID NO.25所示；所述重组表达载体序列如SEQ ID NO.12所示。

4.根据权利要求3所述的外源性基因重组表达载体在培养转基因动物体中的用途。