JP2002262876A - 高感度な核酸のハイブリダイゼーション方法、及びその方法を用いた遺伝子解析方法 - Google Patents
高感度な核酸のハイブリダイゼーション方法、及びその方法を用いた遺伝子解析方法Info
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- JP2002262876A JP2002262876A JP2001064050A JP2001064050A JP2002262876A JP 2002262876 A JP2002262876 A JP 2002262876A JP 2001064050 A JP2001064050 A JP 2001064050A JP 2001064050 A JP2001064050 A JP 2001064050A JP 2002262876 A JP2002262876 A JP 2002262876A
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- annealing
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Abstract
(57)【要約】
【課題】 高い測定感度を有するとともに操作が簡便で
ある核酸のハイブリダイゼーション方法、及び当該核酸
のハイブリダイゼーション方法を利用した遺伝子解析方
法を提供する。 【解決手段】 被固定材料の表面上に固定化された第一
の単鎖核酸断片と、蛍光又はラジオアイソトープ標識を
施した第二の単鎖核酸断片を用意し、第一の単鎖核酸断
片と第二の単鎖核酸断片の相補的二本鎖を形成させるア
ニーリング工程と、酵素処理工程とを含む核酸のハイブ
リダイゼーション方法であって、アニーリング工程にお
いては高温域から低温域への温度勾配処理を実施して相
補的二本鎖を形成させるとともに、酵素処理工程におい
てはエンドヌクレアーゼを添加して、相補的二本鎖に含
まれる非相補的核酸部分を認識して切除する。
ある核酸のハイブリダイゼーション方法、及び当該核酸
のハイブリダイゼーション方法を利用した遺伝子解析方
法を提供する。 【解決手段】 被固定材料の表面上に固定化された第一
の単鎖核酸断片と、蛍光又はラジオアイソトープ標識を
施した第二の単鎖核酸断片を用意し、第一の単鎖核酸断
片と第二の単鎖核酸断片の相補的二本鎖を形成させるア
ニーリング工程と、酵素処理工程とを含む核酸のハイブ
リダイゼーション方法であって、アニーリング工程にお
いては高温域から低温域への温度勾配処理を実施して相
補的二本鎖を形成させるとともに、酵素処理工程におい
てはエンドヌクレアーゼを添加して、相補的二本鎖に含
まれる非相補的核酸部分を認識して切除する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】 本発明は、高感度な核酸の
ハイブリダイゼーション方法、及びその方法を用いた遺
伝子解析方法に関する。
ハイブリダイゼーション方法、及びその方法を用いた遺
伝子解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】 遺伝子の先天的異常に起因する遺伝病
やＤＮＡの突然変異等に起因する疾患、例えば、各種の
ガンの診断等にＤＮＡシーケンサー等を利用した検査方
法が実際に使用されている。一方、各種生物のゲノム塩
基配列の解読が進み、その知見に基づき遺伝子の機能解
析を目的とする研究開発が一段と活発化してきている。
やＤＮＡの突然変異等に起因する疾患、例えば、各種の
ガンの診断等にＤＮＡシーケンサー等を利用した検査方
法が実際に使用されている。一方、各種生物のゲノム塩
基配列の解読が進み、その知見に基づき遺伝子の機能解
析を目的とする研究開発が一段と活発化してきている。
【０００３】 ところで、遺伝子の機能解析には、遺伝
子配列の個体差や変異、細胞内での遺伝子発現の頻度な
どを、効率よく測定・検査する技術の開発が求められて
いる。そのような技術に、癌などの検査方法の１つとし
て、特定遺伝子の発現を検査するために、所定の検査対
象であるＤＮＡ断片が予め登載されたＤＮＡマイクロア
レイ上に、検査対象者から抽出し、蛍光又はラジオアイ
ソトープ標識したＤＮＡ断片の被検試料を添加し、ハイ
ブリダイゼーションを行った後、特異的スポット上の蛍
光又はラジオアイソトープ標識を同定、認識することに
より、被検試料中に特定遺伝子が発現しているか否かを
検査する方法が知られている。
子配列の個体差や変異、細胞内での遺伝子発現の頻度な
どを、効率よく測定・検査する技術の開発が求められて
いる。そのような技術に、癌などの検査方法の１つとし
て、特定遺伝子の発現を検査するために、所定の検査対
象であるＤＮＡ断片が予め登載されたＤＮＡマイクロア
レイ上に、検査対象者から抽出し、蛍光又はラジオアイ
ソトープ標識したＤＮＡ断片の被検試料を添加し、ハイ
ブリダイゼーションを行った後、特異的スポット上の蛍
光又はラジオアイソトープ標識を同定、認識することに
より、被検試料中に特定遺伝子が発現しているか否かを
検査する方法が知られている。
【０００４】 マイクロアレイ上に固定化されたＤＮＡ
断片と蛍光又はラジオアイソトープ標識したＤＮＡプロ
ーブで相補的二本鎖を形成する工程（以下、「アニーリ
ング工程」という）では、使用するＤＮＡの塩基組成に
よって温度・ｐＨ・塩濃度等の諸条件を適宜設定して実
施する。例えば、温度条件に関しては、ＤＮＡの融解温
度（以下、「Ｔｍ」という）を指標として設定される。
断片と蛍光又はラジオアイソトープ標識したＤＮＡプロ
ーブで相補的二本鎖を形成する工程（以下、「アニーリ
ング工程」という）では、使用するＤＮＡの塩基組成に
よって温度・ｐＨ・塩濃度等の諸条件を適宜設定して実
施する。例えば、温度条件に関しては、ＤＮＡの融解温
度（以下、「Ｔｍ」という）を指標として設定される。
【０００５】 一般的には、ＤＮＡの長さが一定の場
合、ＤＮＡを構成する塩基の種類であるグアニン及びシ
トシンの含有率の合計で示されるＧＣ含量が高いほど、
Ｔｍは高い数値を示すことになる。また、ＤＮＡの繰り
返し配列の配列長、繰り返し数の構造的複雑度によって
アニーリングの温度は異なってくる。従って、至適なア
ニーリング温度はＤＮＡ断片固有であり、使用するＤＮ
Ａプローブに依って至適アニーリング温度は異にしてい
る。
合、ＤＮＡを構成する塩基の種類であるグアニン及びシ
トシンの含有率の合計で示されるＧＣ含量が高いほど、
Ｔｍは高い数値を示すことになる。また、ＤＮＡの繰り
返し配列の配列長、繰り返し数の構造的複雑度によって
アニーリングの温度は異なってくる。従って、至適なア
ニーリング温度はＤＮＡ断片固有であり、使用するＤＮ
Ａプローブに依って至適アニーリング温度は異にしてい
る。
【０００６】 また、アニーリングの条件を決定する要
因としては、上述した温度の他にｐＨ、塩濃度等を挙げ
ることができるが、いずれの場合においても、使用する
ＤＮＡ断片の種類によって至適条件が異なる。すなわ
ち、複数種類のＤＮＡプローブを使用する際には、その
アニーリングの条件を画一的に決定することが困難であ
る。従って多くの場合、比較的アニーリングを生起し易
い低温度・中性ｐＨ・高塩濃度条件下においてハイブリ
ダイゼーションを実施し、次いで遺伝子発現を解析する
ことが一般的である。
因としては、上述した温度の他にｐＨ、塩濃度等を挙げ
ることができるが、いずれの場合においても、使用する
ＤＮＡ断片の種類によって至適条件が異なる。すなわ
ち、複数種類のＤＮＡプローブを使用する際には、その
アニーリングの条件を画一的に決定することが困難であ
る。従って多くの場合、比較的アニーリングを生起し易
い低温度・中性ｐＨ・高塩濃度条件下においてハイブリ
ダイゼーションを実施し、次いで遺伝子発現を解析する
ことが一般的である。
【０００７】 しかしながら、上述したアニーリングの
条件下においては相補性の低いＤＮＡ同士であってもア
ニーリングしてしまうために、アニーリング後の洗浄操
作で相補性の低いＤＮＡ二本鎖を除去する必要性があ
る。したがって、厳格な条件下で洗浄を行うと検出感度
が良好ではなくなる等の不具合を生ずる場合もあった。
条件下においては相補性の低いＤＮＡ同士であってもア
ニーリングしてしまうために、アニーリング後の洗浄操
作で相補性の低いＤＮＡ二本鎖を除去する必要性があ
る。したがって、厳格な条件下で洗浄を行うと検出感度
が良好ではなくなる等の不具合を生ずる場合もあった。
【０００８】 これに対して、検出感度を増加させるた
めに洗浄操作を穏やかに行うと、バックグラウンドのノ
イズシグナルが増加し、擬陽性数が増加して、正確な検
査、解析が行われ難くなってくる。このため、使用する
ＤＮＡプローブ及び被検試料によっては検出感度が低く
なる場合もあり、高感度な遺伝子発現解析のためには、
更なる高検出感度を有するハイブリダイゼーション方法
の創出が望まれていた。
めに洗浄操作を穏やかに行うと、バックグラウンドのノ
イズシグナルが増加し、擬陽性数が増加して、正確な検
査、解析が行われ難くなってくる。このため、使用する
ＤＮＡプローブ及び被検試料によっては検出感度が低く
なる場合もあり、高感度な遺伝子発現解析のためには、
更なる高検出感度を有するハイブリダイゼーション方法
の創出が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】 本発明は、このよう
な従来技術の有する問題点に鑑みてなされたものであ
り、その目的とするところは、高い測定感度を有すると
ともに操作が簡便である核酸のハイブリダイゼーション
方法、及び当該核酸のハイブリダイゼーション方法を利
用した遺伝子解析方法を提供することにある。
な従来技術の有する問題点に鑑みてなされたものであ
り、その目的とするところは、高い測定感度を有すると
ともに操作が簡便である核酸のハイブリダイゼーション
方法、及び当該核酸のハイブリダイゼーション方法を利
用した遺伝子解析方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】 即ち、本発明によれ
ば、被固定材料の表面上に固定化された第一の単鎖核酸
断片と、蛍光又はラジオアイソトープ標識を施した第二
の単鎖核酸断片を用意し、第一の単鎖核酸断片と第二の
単鎖核酸断片の相補的二本鎖を形成させるアニーリング
工程と、酵素処理工程とを含む核酸のハイブリダイゼー
ション方法であって、該アニーリング工程においては高
温域から低温域への温度勾配処理を実施して該相補的二
本鎖を形成させるとともに、該酵素処理工程においては
エンドヌクレアーゼを添加して、該相補的二本鎖に含ま
れる非相補的核酸部分を認識して切除することを特徴と
する核酸のハイブリダイゼーション方法が提供される。
ば、被固定材料の表面上に固定化された第一の単鎖核酸
断片と、蛍光又はラジオアイソトープ標識を施した第二
の単鎖核酸断片を用意し、第一の単鎖核酸断片と第二の
単鎖核酸断片の相補的二本鎖を形成させるアニーリング
工程と、酵素処理工程とを含む核酸のハイブリダイゼー
ション方法であって、該アニーリング工程においては高
温域から低温域への温度勾配処理を実施して該相補的二
本鎖を形成させるとともに、該酵素処理工程においては
エンドヌクレアーゼを添加して、該相補的二本鎖に含ま
れる非相補的核酸部分を認識して切除することを特徴と
する核酸のハイブリダイゼーション方法が提供される。
【００１１】 また、本発明においては、アニーリング
工程において、高温域から低温域への温度勾配処理に代
えて、高ｐＨ域から低ｐＨ域へのｐＨ勾配処理を実施す
ることが好ましい。
工程において、高温域から低温域への温度勾配処理に代
えて、高ｐＨ域から低ｐＨ域へのｐＨ勾配処理を実施す
ることが好ましい。
【００１２】 さらに、本発明においては、アニーリン
グ工程において、高温域から低温域への温度勾配処理に
代えて、低塩濃度域から高塩濃度域への塩濃度勾配処理
を実施することが好ましい。
グ工程において、高温域から低温域への温度勾配処理に
代えて、低塩濃度域から高塩濃度域への塩濃度勾配処理
を実施することが好ましい。
【００１３】 一方、本発明によれば、上述したいずれ
かの核酸のハイブリダイゼーション方法を用いることを
特徴とする遺伝子解析方法が提供される。
かの核酸のハイブリダイゼーション方法を用いることを
特徴とする遺伝子解析方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】 以下、本発明の実施の形態につ
いて説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定され
るものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当
業者の通常の知識に基づいて、適宜、設計の変更、改良
等が加えられることが理解されるべきである。
いて説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定され
るものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当
業者の通常の知識に基づいて、適宜、設計の変更、改良
等が加えられることが理解されるべきである。
【００１５】 本発明の核酸のハイブリダイゼーション
方法は、まず、予め被固定材料の表面上に固定化された
第一の単鎖核酸断片と、蛍光、又はラジオアイソトープ
標識が施された第二の単鎖核酸断片を用意する。次に、
高温域から低温域への温度勾配処理を実施しながら第一
の単鎖核酸断片と第二の単鎖核酸断片をアニーリングし
（アニーリング工程）、相補的二本鎖を形成させる。そ
の後、エンドヌクレアーゼを添加して、前記アニーリン
グ工程において形成された相補的二本鎖に含まれる非相
補的核酸部分を認識して切断し、除去する（酵素処理工
程）。
方法は、まず、予め被固定材料の表面上に固定化された
第一の単鎖核酸断片と、蛍光、又はラジオアイソトープ
標識が施された第二の単鎖核酸断片を用意する。次に、
高温域から低温域への温度勾配処理を実施しながら第一
の単鎖核酸断片と第二の単鎖核酸断片をアニーリングし
（アニーリング工程）、相補的二本鎖を形成させる。そ
の後、エンドヌクレアーゼを添加して、前記アニーリン
グ工程において形成された相補的二本鎖に含まれる非相
補的核酸部分を認識して切断し、除去する（酵素処理工
程）。
【００１６】 ここで、前記アニーリング工程において
は、高温域から低温域への温度勾配処理を実施すること
によって、アニーリングを生起し難い高温条件からアニ
ーリングを開始し、順次処理温度を下げていく。したが
って、特定の温度でのみアニーリングを実施していた従
来の方法に比して、非特異的なアニーリングを排除する
ことが可能である。
は、高温域から低温域への温度勾配処理を実施すること
によって、アニーリングを生起し難い高温条件からアニ
ーリングを開始し、順次処理温度を下げていく。したが
って、特定の温度でのみアニーリングを実施していた従
来の方法に比して、非特異的なアニーリングを排除する
ことが可能である。
【００１７】 上述の工程においては、非特異的なアニ
ーリングが生起されてしまう場合もある。そこで、その
後の酵素処理工程において、反応系中にエンドヌクレア
ーゼを添加することによって、相補的二本鎖に含まれる
非相補的部分である、非対合塩基対部分を認識して切断
し、除去する。このことにより、完全な相補的二本鎖を
形成した部分のみを測定・検出することが可能である。
さらには、当該酵素処理工程と、前述した温度勾配処理
を実施するアニーリング工程とを組み合わせることによ
って、その後の解析において高検出感度を実現すること
ができる。
ーリングが生起されてしまう場合もある。そこで、その
後の酵素処理工程において、反応系中にエンドヌクレア
ーゼを添加することによって、相補的二本鎖に含まれる
非相補的部分である、非対合塩基対部分を認識して切断
し、除去する。このことにより、完全な相補的二本鎖を
形成した部分のみを測定・検出することが可能である。
さらには、当該酵素処理工程と、前述した温度勾配処理
を実施するアニーリング工程とを組み合わせることによ
って、その後の解析において高検出感度を実現すること
ができる。
【００１８】 なお、ここで使用する被固定材料として
は、例えばポリスチレン製基材や、核酸との親和性付与
のために表面処理のなされたガラス基材等をはじめとし
て、マイクロタイタープレート等の適当なウェルを有す
る反応容器、あるいはニトロセルロース、ナイロン等の
メンブレンを好適に採用することができる。
は、例えばポリスチレン製基材や、核酸との親和性付与
のために表面処理のなされたガラス基材等をはじめとし
て、マイクロタイタープレート等の適当なウェルを有す
る反応容器、あるいはニトロセルロース、ナイロン等の
メンブレンを好適に採用することができる。
【００１９】 また、第一、及び第二の単鎖核酸断片と
しては、通常はクローン化したＤＮＡ断片、ＰＣＲ法に
より増幅した増幅ＤＮＡ断片、あるいはＲＮＡ断片やｃ
ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド等が好適に使用される。Ｐ
ＣＲ増幅方法については、当業者なら周知のことである
のでこれ以上詳述はしない。なお、ＰＣＲ増幅方法につ
いては、例えば、Innis M., D. H. Gelfand, J. J. Sni
nsky and T. White, PCR Protocols: A Guide to Metho
ds and Applications, Academic Press N.Y., N.Y., 19
90に記載されているので必要に応じて参照されたい。
しては、通常はクローン化したＤＮＡ断片、ＰＣＲ法に
より増幅した増幅ＤＮＡ断片、あるいはＲＮＡ断片やｃ
ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド等が好適に使用される。Ｐ
ＣＲ増幅方法については、当業者なら周知のことである
のでこれ以上詳述はしない。なお、ＰＣＲ増幅方法につ
いては、例えば、Innis M., D. H. Gelfand, J. J. Sni
nsky and T. White, PCR Protocols: A Guide to Metho
ds and Applications, Academic Press N.Y., N.Y., 19
90に記載されているので必要に応じて参照されたい。
【００２０】 さらに、酵素処理工程において用いるエ
ンドヌクレアーゼとしては、相補的二本鎖に含まれる非
相補的核酸部分を認識、切除するエンドヌクレアーゼで
あればよく、このようなエンドヌクレアーゼを添加する
ことによって上述した高検出感度を達成することができ
る。例を挙げると、ｕｖｒＡＢＣエクシヌクレアーゼ等
のＤＮＡ修復酵素を好適に採用することができる。
ンドヌクレアーゼとしては、相補的二本鎖に含まれる非
相補的核酸部分を認識、切除するエンドヌクレアーゼで
あればよく、このようなエンドヌクレアーゼを添加する
ことによって上述した高検出感度を達成することができ
る。例を挙げると、ｕｖｒＡＢＣエクシヌクレアーゼ等
のＤＮＡ修復酵素を好適に採用することができる。
【００２１】 また、本発明に係る核酸のハイブリダイ
ゼーション方法においては、上述してきたアニーリング
工程における高温域から低温域への温度勾配処理に代え
て、高ｐＨ域から低ｐＨ域へのｐＨ勾配処理を実施する
ことも、同様に好ましい。アニーリング工程における条
件の一つであるｐＨも、アニーリングし易さを決定する
ための一要因である。すなわち、アニーリングを生起し
難い高ｐＨ条件からアニーリングを開始し、順次処理ｐ
Ｈを下げていく。従って、特定のｐＨ値でのみアニーリ
ングを実施していた従来の方法に比して、非特異的なア
ニーリングを排除することが可能である。
ゼーション方法においては、上述してきたアニーリング
工程における高温域から低温域への温度勾配処理に代え
て、高ｐＨ域から低ｐＨ域へのｐＨ勾配処理を実施する
ことも、同様に好ましい。アニーリング工程における条
件の一つであるｐＨも、アニーリングし易さを決定する
ための一要因である。すなわち、アニーリングを生起し
難い高ｐＨ条件からアニーリングを開始し、順次処理ｐ
Ｈを下げていく。従って、特定のｐＨ値でのみアニーリ
ングを実施していた従来の方法に比して、非特異的なア
ニーリングを排除することが可能である。
【００２２】 このときｐＨを下げていくためには、一
般的に使用され得る酸水溶液であればその種類を問わず
使用可能であるが、塩酸、燐酸、燐酸水素ナトリウムな
どが好適に使用される。中でも、塩酸が好適に使用する
ことができ、また、ｐＨ１２〜７に調整しうる濃度範囲
内で適宜使用し、順次ｐＨを下げていけばよい。
般的に使用され得る酸水溶液であればその種類を問わず
使用可能であるが、塩酸、燐酸、燐酸水素ナトリウムな
どが好適に使用される。中でも、塩酸が好適に使用する
ことができ、また、ｐＨ１２〜７に調整しうる濃度範囲
内で適宜使用し、順次ｐＨを下げていけばよい。
【００２３】 さらに、本発明に係る核酸のハイブリダ
イゼーション方法においては、アニーリング工程におけ
る高温域から低温域への温度勾配処理に代えて、低塩濃
度域から高塩濃度域への塩濃度勾配処理を実施すること
も、同様に好ましい。アニーリング工程における条件の
一つである塩濃度も、アニーリングし易さを決定するた
めの一要因であり、アニーリングを生起し難い低塩濃度
条件からアニーリングを開始し、順次処理塩濃度を上げ
ていく。従って、特定の塩濃度域でのみアニーリングを
実施していた従来の方法に比して、非特異的なアニーリ
ングを排除することが可能である。
イゼーション方法においては、アニーリング工程におけ
る高温域から低温域への温度勾配処理に代えて、低塩濃
度域から高塩濃度域への塩濃度勾配処理を実施すること
も、同様に好ましい。アニーリング工程における条件の
一つである塩濃度も、アニーリングし易さを決定するた
めの一要因であり、アニーリングを生起し難い低塩濃度
条件からアニーリングを開始し、順次処理塩濃度を上げ
ていく。従って、特定の塩濃度域でのみアニーリングを
実施していた従来の方法に比して、非特異的なアニーリ
ングを排除することが可能である。
【００２４】 このとき塩濃度を決定するために使用す
る塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸ナトリウム等の無機塩を好適に使用することができ
るが、中でも、塩化ナトリウムが好適に使用される。こ
れらの塩を使用し、例えば１５ｍＭ〜３Ｍの濃度範囲内
で順次塩濃度を上げていけばよい。
る塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸ナトリウム等の無機塩を好適に使用することができ
るが、中でも、塩化ナトリウムが好適に使用される。こ
れらの塩を使用し、例えば１５ｍＭ〜３Ｍの濃度範囲内
で順次塩濃度を上げていけばよい。
【００２５】 なお、上述してきた温度勾配、ｐＨ勾
配、塩濃度勾配の各パラメーターは段階的に変化させる
（ステップワイズ）他、グラジェント的に変化させても
よい。また、各パラメーターを個別に変化させる他、こ
れらの２種以上を組み合わせて変化させてもよい。
配、塩濃度勾配の各パラメーターは段階的に変化させる
（ステップワイズ）他、グラジェント的に変化させても
よい。また、各パラメーターを個別に変化させる他、こ
れらの２種以上を組み合わせて変化させてもよい。
【００２６】 上述の核酸のハイブリダイゼーション方
法を遺伝子解析方法に使用するには、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄ
ａｍｉｎｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光、又はラジオアイ
ソトープで５’−末端が標識されたオリゴヌクレオチ
ド、或いはニックトランスレーションで蛍光又はラジオ
アイソトープ標識されたＤＮＡ等を使用すればよい。解
析は、定法に従って行えばよく、例えば、蛍光標識され
たＤＮＡ等については蛍光マイクロアレイスキャナー等
を使用して行う。具体的には、上述した田代康介ら、細
胞工学、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．７（１９９９）：１０５
０−１０５６等に記載の方法に従えばよい。
法を遺伝子解析方法に使用するには、ＦＡＭ、Ｒｈｏｄ
ａｍｉｎｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光、又はラジオアイ
ソトープで５’−末端が標識されたオリゴヌクレオチ
ド、或いはニックトランスレーションで蛍光又はラジオ
アイソトープ標識されたＤＮＡ等を使用すればよい。解
析は、定法に従って行えばよく、例えば、蛍光標識され
たＤＮＡ等については蛍光マイクロアレイスキャナー等
を使用して行う。具体的には、上述した田代康介ら、細
胞工学、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．７（１９９９）：１０５
０−１０５６等に記載の方法に従えばよい。
【００２７】
【実施例】 以下、実施例及び比較例によって本発明を
さらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例などに
より制限的に解釈されるものではないことはいうまでも
ない。
さらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例などに
より制限的に解釈されるものではないことはいうまでも
ない。
【００２８】（実施例） １．ブロッティング 配列番号１に示す２９６１ｂｐのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ II ＫＳ（この配列は、全ヌクレオチドの配列を示
す。）２００ｎｇを用いて、常法に従って、Ｈｙｂｏｎ
ｄ Ｎ＋(アマシャム・ファルマシア社製）メンブレンに
対してブロッティングを行った。
ｔ II ＫＳ（この配列は、全ヌクレオチドの配列を示
す。）２００ｎｇを用いて、常法に従って、Ｈｙｂｏｎ
ｄ Ｎ＋(アマシャム・ファルマシア社製）メンブレンに
対してブロッティングを行った。
【００２９】２．プローブの準備 配列番号２に示す２０ｂｐのｐＢＫ２−１５−ＦＡＭ
（ＦＡＭで蛍光標識したオリゴヌクレオチド、ライフテ
ック社製）、及び、配列番号３に示す２０ｂｐのｐＢＫ
２−３０６−Ｒｈｏ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅで蛍光標識し
たオリゴヌクレオチド、ライフテック社製）を準備し、
使用した。なお、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭ、ｐＢＫ２−
３０６−ＲｈｏのＧＣ含量は、各々１０％、５０％であ
る。
（ＦＡＭで蛍光標識したオリゴヌクレオチド、ライフテ
ック社製）、及び、配列番号３に示す２０ｂｐのｐＢＫ
２−３０６−Ｒｈｏ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅで蛍光標識し
たオリゴヌクレオチド、ライフテック社製）を準備し、
使用した。なお、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭ、ｐＢＫ２−
３０６−ＲｈｏのＧＣ含量は、各々１０％、５０％であ
る。
【００３０】３．温度勾配条件（実施例１〜３） ブロッティング後のメンブレンをハイブリバッグに入
れ、プレハイブリダイゼーションカクテル（５ｘＳＳＰ
Ｅ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ、
１００μｇ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）中、
４２℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。
次いで、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭのみ、ｐＢＫ２−３０
６−Ｒｈｏのみ、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭとｐＢＫ２−
３０６−Ｒｈｏの両方を、各１００ｎｇずつ添加し（実
施例１〜３）、ｐＨ７．４、７５０ｍＭ ＮａＣｌの条
件下、５５℃で２時間、４０℃で２時間振盪した。
れ、プレハイブリダイゼーションカクテル（５ｘＳＳＰ
Ｅ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ、
１００μｇ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）中、
４２℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行った。
次いで、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭのみ、ｐＢＫ２−３０
６−Ｒｈｏのみ、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭとｐＢＫ２−
３０６−Ｒｈｏの両方を、各１００ｎｇずつ添加し（実
施例１〜３）、ｐＨ７．４、７５０ｍＭ ＮａＣｌの条
件下、５５℃で２時間、４０℃で２時間振盪した。
【００３１】４．ｐＨ勾配条件（実施例４〜６） ブロッティング後のメンブレンをハイブリバッグに入
れ、プレハイブリダイゼーションカクテル（５ｘＳＳＰ
Ｅ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ、
１００μｇ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、ｐＨ
１１）中、４２℃、２時間プレハイブリダイゼーション
を行った。次いで、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭのみ、ｐＢ
Ｋ２−３０６−Ｒｈｏのみ、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭと
ｐＢＫ２−３０６−Ｒｈｏの両方を、各１００ｎｇずつ
添加し（実施例４〜６）、４２℃、７５０ｍＭ ＮａＣ
ｌの条件下で２時間、その後１Ｎ ＨＣｌを添加してｐ
Ｈ１０で２時間、ｐＨ９で２時間、ｐＨ８で２時間振盪
した。
れ、プレハイブリダイゼーションカクテル（５ｘＳＳＰ
Ｅ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０．５％ ＳＤＳ、
１００μｇ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、ｐＨ
１１）中、４２℃、２時間プレハイブリダイゼーション
を行った。次いで、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭのみ、ｐＢ
Ｋ２−３０６−Ｒｈｏのみ、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭと
ｐＢＫ２−３０６−Ｒｈｏの両方を、各１００ｎｇずつ
添加し（実施例４〜６）、４２℃、７５０ｍＭ ＮａＣ
ｌの条件下で２時間、その後１Ｎ ＨＣｌを添加してｐ
Ｈ１０で２時間、ｐＨ９で２時間、ｐＨ８で２時間振盪
した。
【００３２】５．塩濃度勾配条件（実施例７〜９） ブロッティング後のメンブレンをハイブリバッグに入
れ、プレハイブリダイゼーションカクテル（０．１ｘＳ
ＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤ
Ｓ、１００μｇ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）
中、４２℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。次いで、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭのみ、ｐＢＫ２−
３０６−Ｒｈｏのみ、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭとｐＢＫ
２−３０６−Ｒｈｏの両方を、各１００ｎｇずつ添加し
（実施例７〜９）、４２℃、ｐＨ７．４の条件下、Ｎａ
Ｃｌを添加して最終塩濃度２０ｍＭで２時間、２００ｍ
Ｍで２時間振盪した。
れ、プレハイブリダイゼーションカクテル（０．１ｘＳ
ＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤ
Ｓ、１００μｇ Ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）
中、４２℃、２時間プレハイブリダイゼーションを行っ
た。次いで、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭのみ、ｐＢＫ２−
３０６−Ｒｈｏのみ、ｐＢＫ２−１５−ＦＡＭとｐＢＫ
２−３０６−Ｒｈｏの両方を、各１００ｎｇずつ添加し
（実施例７〜９）、４２℃、ｐＨ７．４の条件下、Ｎａ
Ｃｌを添加して最終塩濃度２０ｍＭで２時間、２００ｍ
Ｍで２時間振盪した。
【００３３】６．メンブレンの洗浄及びヌクレアーゼ処
理 メンブレンを２ｘＳＳＰＥで軽くリンスし、１ｍｌの緩
衝液（５０ｍＭ ＫＡｃ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯ
Ｈ、１０ｍＭ ＭｇＡｃ2、１ｍＭ ＤＴＴ）中に移し
た。次に、５０ｕｎｉｔｓのＴ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅ
ａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
社製）を添加して、３７℃で１５分間反応させた後、洗
浄液（２ｘＳＳＰＥ）でリンスした。
理 メンブレンを２ｘＳＳＰＥで軽くリンスし、１ｍｌの緩
衝液（５０ｍＭ ＫＡｃ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡｃＯ
Ｈ、１０ｍＭ ＭｇＡｃ2、１ｍＭ ＤＴＴ）中に移し
た。次に、５０ｕｎｉｔｓのＴ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅ
ａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
社製）を添加して、３７℃で１５分間反応させた後、洗
浄液（２ｘＳＳＰＥ）でリンスした。
【００３４】７．測定 モレキュラーイメジャーＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を
使用して、ＦＡＭ及び／又はＲｈｏｄａｍｉｎｅの蛍光
量を計測した。結果を表１に示す。
使用して、ＦＡＭ及び／又はＲｈｏｄａｍｉｎｅの蛍光
量を計測した。結果を表１に示す。
【００３５】（比較例）アニーリングの際に、温度・ｐ
Ｈ・塩濃度の各勾配条件の実施をしない以外は上記実施
例と同様にしてアニーリングを行った（比較例１〜
３）。その後、メンブレンを洗浄液１（２ｘＳＳＰＥ、
０．１％ ＳＤＳ）を用いて、４２℃で１５分間の洗浄
２回、次に洗浄液２（１ｘＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤ
Ｓ）にて４２℃で１５分間の洗浄１回を行い、ＦＡＭ及
び／又はＲｈｏｄａｍｉｎｅの蛍光量を計測した。同じ
く結果を表１に示す。
Ｈ・塩濃度の各勾配条件の実施をしない以外は上記実施
例と同様にしてアニーリングを行った（比較例１〜
３）。その後、メンブレンを洗浄液１（２ｘＳＳＰＥ、
０．１％ ＳＤＳ）を用いて、４２℃で１５分間の洗浄
２回、次に洗浄液２（１ｘＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤ
Ｓ）にて４２℃で１５分間の洗浄１回を行い、ＦＡＭ及
び／又はＲｈｏｄａｍｉｎｅの蛍光量を計測した。同じ
く結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】（考察）本発明に係る方法は、上記の結果
から明らかなとおり、比較例に比して大幅に測定感度が
高くなることが判る。また、洗浄操作も簡単であり、本
発明の優位性を確認することができた。
から明らかなとおり、比較例に比して大幅に測定感度が
高くなることが判る。また、洗浄操作も簡単であり、本
発明の優位性を確認することができた。
【００３８】
【発明の効果】 以上説明したように、本発明の核酸の
ハイブリダイゼーション方法によれば、アニーリング工
程において、温度・ｐＨ・塩濃度の各勾配処理を実施し
ているために、非特異的なアニーリングが起こり難い。
また、その後の酵素処理工程においてエンドヌクレアー
ゼ処理を実施しているために、完全な相補的二本鎖のみ
得られるので、信頼性の高いデータ収集と高い測定感度
の実現が可能である。さらに、このハイブリダイゼーシ
ョン方法を用いることにより、より高い感度で測定可能
な遺伝子解析方法が提供されることとなる。
ハイブリダイゼーション方法によれば、アニーリング工
程において、温度・ｐＨ・塩濃度の各勾配処理を実施し
ているために、非特異的なアニーリングが起こり難い。
また、その後の酵素処理工程においてエンドヌクレアー
ゼ処理を実施しているために、完全な相補的二本鎖のみ
得られるので、信頼性の高いデータ収集と高い測定感度
の実現が可能である。さらに、このハイブリダイゼーシ
ョン方法を用いることにより、より高い感度で測定可能
な遺伝子解析方法が提供されることとなる。
【００３９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NGK Insulators, LTD. <120> A method for high performance hybridization of nucleic acids, and a method for genome analysis using the same <130> WP03480 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2961 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Sequence of pBluescript II KS <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660 ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatatcaa 720 gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg gcccggtacc cagcttttgt tccctttagt 780 gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 840 atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 900 cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 960 gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 1020 gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 1080 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 1140 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 1200 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 1260 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1320 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 1380 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 1440 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 1500 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 1560 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 1620 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 1680 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 1740 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 1800 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 1860 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 1920 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 1980 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 2040 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 2100 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 2160 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 2220 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 2280 ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 2340 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 2400 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 2460 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 2520 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 2580 cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 2640 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 2700 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 2760 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 2820 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 2880 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 2940 catttccccg aaaagtgcca c 2961 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 ttaatatttt gttaaaattc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gatttagagc ttgacgggga 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松田 千穂 神奈川県川崎市幸区北加瀬３−２−28− 205 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA04 CA09 HA14 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07
Claims (4)
- 【請求項１】 被固定材料の表面上に固定化された第一
の単鎖核酸断片と、蛍光又はラジオアイソトープ標識を
施した第二の単鎖核酸断片を用意し、第一の単鎖核酸断
片と第二の単鎖核酸断片の相補的二本鎖を形成させるア
ニーリング工程と、酵素処理工程とを含む核酸のハイブ
リダイゼーション方法であって、 該アニーリング工程においては高温域から低温域への温
度勾配処理を実施して該相補的二本鎖を形成させるとと
もに、 該酵素処理工程においてはエンドヌクレアーゼを添加し
て、該相補的二本鎖に含まれる非相補的核酸部分を認識
して切除することを特徴とする核酸のハイブリダイゼー
ション方法。 - 【請求項２】 該アニーリング工程において、 高温域から低温域への温度勾配処理に代えて、 高ｐＨ域から低ｐＨ域へのｐＨ勾配処理を実施する請求
項１に記載の核酸のハイブリダイゼーション方法。 - 【請求項３】 該アニーリング工程において、 高温域から低温域への温度勾配処理に代えて、 低塩濃度域から高塩濃度域への塩濃度勾配処理を実施す
る請求項１に記載の核酸のハイブリダイゼーション方
法。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載の核
酸のハイブリダイゼーション方法を用いることを特徴と
する遺伝子解析方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001064050A JP2002262876A (ja) | 2001-03-07 | 2001-03-07 | 高感度な核酸のハイブリダイゼーション方法、及びその方法を用いた遺伝子解析方法 |
| EP02701660A EP1367122A4 (en) | 2001-03-07 | 2002-03-01 | HYBRIDIZATION METHOD FOR HIGHLY SENSITIVE NUCLEIC ACID AND GENETIC ANALYSIS METHOD THEREOF |
| US10/258,344 US7052842B2 (en) | 2001-03-07 | 2002-03-01 | Method for highly sensitive hybridization of nucleic acids, and method for gene analysis using the same |
| PCT/JP2002/001894 WO2002070687A1 (fr) | 2001-03-07 | 2002-03-01 | Procede d'hybridation de l'acide nucleique hautement sensible et procede d'analyse genetique associe |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001064050A JP2002262876A (ja) | 2001-03-07 | 2001-03-07 | 高感度な核酸のハイブリダイゼーション方法、及びその方法を用いた遺伝子解析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002262876A true JP2002262876A (ja) | 2002-09-17 |
Family
ID=18922937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001064050A Pending JP2002262876A (ja) | 2001-03-07 | 2001-03-07 | 高感度な核酸のハイブリダイゼーション方法、及びその方法を用いた遺伝子解析方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1367122A4 (ja) |
| JP (1) | JP2002262876A (ja) |
| WO (1) | WO2002070687A1 (ja) |
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| DK3110973T3 (da) | 2014-02-27 | 2019-05-13 | Univ Leuven Kath | Oxidativt stress og kardiovaskulære sygdomshændelser |
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| US5776672A (en) * | 1990-09-28 | 1998-07-07 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Gene detection method |
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| US6045996A (en) * | 1993-10-26 | 2000-04-04 | Affymetrix, Inc. | Hybridization assays on oligonucleotide arrays |
| US5807522A (en) * | 1994-06-17 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for fabricating microarrays of biological samples |
| US5556752A (en) * | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
| JPH08191700A (ja) | 1995-01-13 | 1996-07-30 | Nippon Flour Mills Co Ltd | アルカリハイブリダイゼーション法による核酸の検出方法 |
| WO1997010359A1 (fr) | 1995-09-13 | 1997-03-20 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de concentration d'acide nucleique variant et materiel de test de concentration d'acide nucleique de mise en application du procede |
| EP0880598A4 (en) * | 1996-01-23 | 2005-02-23 | Affymetrix Inc | RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM |
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2002
- 2002-03-01 EP EP02701660A patent/EP1367122A4/en not_active Withdrawn
- 2002-03-01 US US10/258,344 patent/US7052842B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-01 WO PCT/JP2002/001894 patent/WO2002070687A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060912 |
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