CN111088405A

CN111088405A - 用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111088405A
Application number: CN202010081488.0A
Authority: CN
Inventors: 朱琦
Original assignee: Suzhou Xingzhi Kangzhong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Xingzhi Kangzhong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2020-05-01

Abstract

本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒2019‑nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法，其通过设计组合物一和组合物二作为引物探针组合物，以数字PCR技术为基础，针对病毒多个靶向基因设计特异性引物探针，数字PCR检测可直接统计PCR终点阳性微反应体系个数，利用泊松统计直接计算目标分子的绝对拷贝数，可实现单个目标分子的检测，做到绝对计数定量检测病毒含量，此外，整个检测时长不超过3h，省时高效且灵敏度高。

Description

用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法，属于体外诊断检测领域。

背景技术

新型冠状病毒，也称2019-nCoV，是一种可导致呼吸系统疾病的病毒。此病毒可引起炎症及肺部气道内粘液和体液积聚(肺炎)。冠状病毒有多种类型，大多数类型仅感染动物，但有时会发生变异并感染人类。

新型冠状病毒可引起呼吸系统疾病并导致肺炎，肺炎症状包括：发热,咳嗽，呼吸困难等。该病毒感染途径包括：吸入感染者咳嗽或打喷嚏时喷出的飞沫；触摸被病毒污染的物品，如桌子或门把手，之后再触摸口、鼻或眼睛；接近携带病毒的动物或食用未经烹饪或未煮熟的含有病毒的肉类或动物制品等。

就目前新型冠状病毒感染状况而言，健康者预防工作是重中之重，但对病毒感染者快速有效的检测更应是首当其冲。现阶段市场推出的新型冠状病毒检测试剂盒多为以荧光定量qPCR技术为基础的检测试剂盒，最快检测结果输出时长4h，且只是定性判断无法绝对定量，灵敏度较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法，能实现单个目标分子的检测，做到绝对计数定量检测病毒含量，此外，整个检测时长不超过3h，省时高效。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物，包括组合一和组合二所示的引物探针组合物：

组合一

含有如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ IDNO.1)；

含有如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物：ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID NO.2)；

含有如SEQ ID NO.3所示序列的探针：GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC(SEQ IDNO.3)；

组合二

含有如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ IDNO.4)；

含有如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ IDNO.5)；

含有如SEQ ID NO.6所示序列的探针：GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC(SEQ ID NO.6)；

所述组合一和组合二还包括荧光基因和荧光淬灭基因。

进一步地，所述荧光基因选自VIC、FAM、HEX、Cy5、Rox或TET中的至少一种。

进一步地，所述荧光淬灭基因选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BBQ或TAMRA中的至少一种。

进一步地，所述探针的5’端标记有所述荧光基因，所述探针的3’端标记有所述荧光淬灭基因。

本发明还提供一种用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其包括所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物。

进一步地，还包括反应混合液，所述反应混合液包括缓冲液、MgCl₂、dNTPs和酶。

进一步地，所述酶包括DNA聚合酶和逆转录酶。

进一步地，所述反应混合液包括混合液一和混合液二，所述混合液一包括2×缓冲液、MgCl₂、dNTPs和DNA聚合酶；所述混合液二包括1×缓冲液、逆转录酶h和甘油。

进一步地，还包括阴性对照品和/或阳性对照品，所述阴性对照品为空载质粒混合物，所述阳性对照品为冠状病毒2019-nCoV核酸质粒混合物。

本发明还提供一种冠状病毒2019-nCoV的核酸检测方法，其采用所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒来提取待检测样本DNA，通过数字PCR对靶向基因扩增片段进行绝对定量。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法通过设计组合物一和组合物二作为引物探针组合物，以数字PCR技术为基础，针对病毒多个靶向基因设计特异性引物探针，数字PCR检测可直接统计PCR终点阳性微反应体系个数，利用泊松统计直接计算目标分子的绝对拷贝数，可实现单个目标分子的检测，做到绝对计数定量检测病毒含量，此外，整个检测时长不超过3h，省时高效且灵敏度高。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1至图5为实施例二采用本发明试剂盒检测新型冠状病毒2019-nCoV的检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中，所用仪器和试剂如下：

一、荧光基因

VIC：greenfluorescentprotein(绿色荧光蛋白)；

FAM：6-Carboxy-fluorescein(6-羧基-荧光素)。

HEX：5-Hexachloro-flurescein(5-六氯-荧光素)；

Cy5：Indodicarbocyanine(Cy5荧光素)；

Rox：Carboxy-x-rhodamine(羧基-X-罗丹明)；

TET：5-Tetrachloro-fluorescein(5-四氯-荧光素)。

二、荧光淬灭基因

BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3：BlackHole Quencher-1，Black Hole Quencher-2，BlackHole Quencher-3，即黑洞淬灭剂-1、黑洞淬灭剂-2、黑洞淬灭剂-3；

BBQ：BlackBerry Quencher(黑莓猝灭剂)；

TAMRA：Tetramethyl-6-carboxyrhodamine(四甲基-6-羧基罗丹明)。

在本发明中，上述荧光染料(荧光基因)、荧光淬灭剂(荧光淬灭基因)仅仅是部分列举，也可采用其他试剂。本发明各实施例中，荧光基因、荧光淬灭基因、酶、甘油以及超纯水等匀从市面上常规采购，具体可以是购自赛默飞life、罗氏公司的定量反应液等，当然，不限于上述公司，也可以购自美国ABI、BIO-RAD等公司。

三、对照品

阳性对照品为插入新型冠状病毒2019-nCoV病毒基因特异序列的pUC57载体质粒；所述阴性对照品为未插入新型冠状病毒2019-nCoV病毒基因特异序列的pUC57空载体质粒。上述阳性对照品以及阴性对照品，浓度为5～500copies/μL，体积为10-50μL，保存条件为-20℃。

四、仪器

下述实施例中所采用的PCR仪器为QuantStudio^TM3D数字PCR仪。

实施例一新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒组分的制备

根据中国国家疾病控制中心公布的新型冠状病毒2019-nCoV的基因序列(如SEQID NO.7所示)，设计目标引物和特异性探针，设计的引物和探针可以按照现有方法进行人工合成。

具体的，引物和探针如下：

在本实施例中，引物探针组合物还包括荧光基因和荧光淬灭基因。具体的，所述荧光基因选自VIC、FAM、HEX、Cy5、Rox或TET中的至少一种；所述荧光淬灭基因选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BBQ或TAMRA中的至少一种。并且，探针的5’端标记有所述荧光基因，所述探针的3’端标记有所述荧光淬灭基因。

诚然，在其他实施例中，还可以采用其他荧光基因和荧光淬灭基因进行标记，本发明中仅对上述列举常用的荧光基因和荧光淬灭基因进行说明。例如，本发明的探针组合包括点不限于以下：

1)5’-VIC-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ1-3’

2)5’-VIC-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ2-3’

3)5’-VIC-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ3-3’

4)5’-VIC-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BBQ-3’

5)5’-VIC-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-TAMRA-3’

6)5’-HEX-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ1-3’

7)5’-HEX-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ2-3’

8)5’-HEX-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ3-3’

9)5’-HEX-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BBQ-3’

10)5’-HEX-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-TAMRA-3’

11)5’-Cy5-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ1-3’

12)5’-Cy5-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ2-3’

13)5’-Cy5-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ3-3’

14)5’-Cy5-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BBQ-3’

15)5’-Cy5-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-TAMRA-3’

16)5’-Rox-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ1-3’

17)5’-Rox-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ2-3’

18)5’-Rox-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ3-3’

19)5’-Rox-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BBQ-3’

20)5’-Rox-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-TAMRA-3’

21)5’-TET-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ1-3’

22)5’-TET-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ2-3’

23)5’-TET-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ3-3’

24)5’-TET-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BBQ-3’

25)5’-TET-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-TAMRA-3’

26)5’-FAM-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ2-3’

27)5’-FAM-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BHQ3-3’

28)5’-FAM-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-BBQ-3’

29)5’-FAM-GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC-TAMRA-3’

30)5’-VIC-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ1-3’

31)5’-VIC-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ2-3’

32)5’-VIC-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ3-3’

33)5’-VIC-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BBQ-3’

34)5’-VIC-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-TAMRA-3’

35)5’-HEX-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ1-3’

36)5’-HEX-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ2-3’

37)5’-HEX-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ3-3’

38)5’-HEX-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BBQ-3’

39)5’-HEX-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-TAMRA-3’

40)5’-Cy5-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ1-3’

41)5’-Cy5-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ2-3’

42)5’-Cy5-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ3-3’

43)5’-Cy5-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BBQ-3’

44)5’-Cy5-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-TAMRA-3’

45)5’-Rox-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ1-3’

46)5’-Rox-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ2-3’

47)5’-Rox-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ3-3’

48)5’-Rox-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BBQ-3’

49)5’-Rox-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-TAMRA-3’

50)5’-TET-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ1-3’

51)5’-TET-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ2-3’

52)5’-TET-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ3-3’

53)5’-TET-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BBQ-3’

54)5’-TET-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-TAMRA-3’

55)5’-FAM-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ1-3’

56)5’-FAM-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ2-3’

57)5’-FAM-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BHQ3-3’

58)5’-FAM-GGCAATGGCGGTGATGCTGCTC-BBQ-3’。

当采用其他未列举荧光基因和荧光淬灭基因进行标记时，所设计的引物组合可有所不同，但应在本领域技术人员容易想到的范围之内，因此不构成对本发明专利范围的限制。

本发明中，新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒具体包括：

组成	主要成分
		混合液一	2×缓冲液、MgCl<sub>2</sub>、dNTPs，聚合酶
混合液二	1×缓冲液，逆转录酶，甘油
		引物探针组合物混合液	靶向基因引物，荧光探针
无酶无菌水	超纯水
		阴性对照品	空载质粒混合物
阳性对照品	冠状病毒2019-nCoV核酸质粒混合物

实施例二利用数字PCR检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸

本实施例通过采用所述实施例一所示的试剂盒来提取待检测样本DNA，通过数字PCR对靶向基因扩增片段进行绝对定量，其包括以下步骤：

1)样本处理

样本种类：采集待测人员上呼吸道标本(包括但不限于咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深喉痰液)；下呼吸道标本：(包括但不限于呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本)；组织培养物等。

样本保存条件：采集的样本应及时送检，24小时内检测的优选为在4℃保存，超过24小时检测的优选为在-70℃保存，并避免反复冻融。

使用实施例一所示的病毒核酸共提试剂盒提取样本。取待检测样本(优选为200μL样本悬浮液)进行提取。阴性对照品、阳性对照品不参与提取，直接作为模板使用。

2)试剂配制

从试剂盒中取出反应混合液、酶混合液，在室温下融化并轻轻混匀后，优选为在2000rpm转速下离心10sec。计算所需反应试剂人份数n[n＝样本数+对照数(2)]+2，每人份反应体系配制如下：

组分	混合液一	混合液二	引物探针组合物混合液
				体积	10μL	1μL	3μL

按n+2人份计算上述各试剂的用量，加入适当容积的离心管中混匀。按14μL量分装到PCR管中，然后转移到样本处理区。按一定顺序向反应液中分别加入6μL/孔的的阴性对照品(质粒模板需稀释处理)、阳性对照品(质粒模板需稀释处理)、样品处理上清液，盖紧反应管，然后以1000rpm离心1分钟，去除反应体系中的气泡。立即上样至数字PCR 20K芯片(在配好反应液之后尽快加载数字PCR 20K芯片，以获得最佳结果；若放置反应液在冰上，优选室温溶解后再加载数字PCR 20K芯片)。上样并密封芯片，对数字PCR 20K芯片进行热循环。每次运行成功后，QuantStudio^TM3D数字PCR仪均显示成像数据总结。

3)输出结果：请参见图1至图5，图示横坐标以及纵坐标分别表示不同荧光信号阈值，刻度单位为相对荧光强度。具体的，横坐标表示VIC阈值范围，纵坐标表示FAM荧光阈值范围。

阴阳性判断阈值为15，低于15为阴性，高于(等于)15为阳性，根据国家疾控中心要求，探针一与探针二的结果均为阳性时样品判断为新型冠状病毒检测阳性。

仪器可以在分析结束后立即自动传输各成像芯片的结果(至云存储服务器、网络文件服务器或USB驱动器)；但如果网络连接失败或USB驱动器已满，则可以手动传输文件，以供二次分析使用。

五组实验检测结构如下表所示：

由图和表可知，采用本发明的试剂盒通过数字PCR技术对新型冠状病毒2019-nCoV进行检测，其灵敏度高，最低检测限为1copies/μL。且检测所需时间不超过3h，大幅度提高了检测效率。

综上所述：本发明的用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法通过设计组合物一和组合物二作为引物探针组合物，以数字PCR技术为基础，针对病毒多个靶向基因设计特异性引物探针，数字PCR检测可直接统计PCR终点阳性微反应体系个数，利用泊松统计直接计算目标分子的绝对拷贝数，可实现单个目标分子的检测，做到绝对计数定量检测病毒含量，此外，整个检测时长不超过3h，省时高效且灵敏度高。

并且，本发明的试剂盒特异性高：其采用特异性引物探针扩增，仅针对新型冠状病毒2019-nCoV样本均能检出，且与其他冠状病毒如：HcoV-229E、HcoV-HKU1、HcoV-OC43、HcoV-NL63、MERS-cov等均无交叉反应。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州行知康众生物科技有限公司

<120> 用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列-引物target1-F(Artificial Sequence)

<400> 1

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列-引物target1-R(Artificial Sequence)

<400> 2

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列-探针target1(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctgtagtt gtgatcaact ccgc 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列-引物target2-F(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列-引物target2-R(Artificial Sequence)

<400> 5

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列-探针target2(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcaatggcg gtgatgctgc tc 22

<210> 7

<211> 2983

<212> DNA

<213> 冠状病毒(2019-nCoV)

<400> 7

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tatcggatcc cgacgctaat gaccctgtgg gttttacact taaaaacaca 480

gtctgtaccg tctgcggtat gtggaaaggt tatggctgta gttgtgatca actccgcgaa 540

cccatgcttc agtcagctga tgcacaatcg tttttaaacg ggtttgcggc agcagtaggg 600

gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc 660

ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa cgacgggccc 720

gtcgactgca gaggcctgca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 780

tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 840

gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 900

ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 960

ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 1020

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 1080

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 1140

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 1200

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 1260

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 1320

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 1380

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 1440

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 1500

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 1560

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 1620

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 1680

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 1740

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 1800

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 1860

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 1920

agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 1980

atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 2040

cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 2100

aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 2160

cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 2220

aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 2280

ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 2340

gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 2400

ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 2460

tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 2520

tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 2580

ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 2640

tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 2700

agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 2760

acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 2820

ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 2880

gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 2940

acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtc 2983

Claims

1.一种用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物，其特征在于，包括组合一和组合二所示的引物探针组合物：

组合一

含有如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(SEQ ID NO.1)；

含有如SEQ ID NO.3所示序列的探针：

GGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGC(SEQ ID NO.3)；

组合二

含有如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物：

GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO.4)；

含有如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物：

CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ ID NO.5)；

所述组合一和组合二还包括荧光基因和荧光淬灭基因。

2.如权利要求1所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光基因选自VIC、FAM、HEX、Cy5、Rox或TET中的至少一种。

3.如权利要求1所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光淬灭基因选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、BBQ或TAMRA中的至少一种。

4.如权利要求1所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5’端标记有所述荧光基因，所述探针的3’端标记有所述荧光淬灭基因。

5.一种用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4中任一项所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物。

6.如权利要求5所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，还包括反应混合液，所述反应混合液包括缓冲液、MgCl₂、dNTPs和酶。

7.如权利要求6所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，所述酶包括DNA聚合酶和逆转录酶。

8.如权利要求7所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，所述反应混合液包括混合液一和混合液二，所述混合液一包括2×缓冲液、MgCl₂、dNTPs和DNA聚合酶；所述混合液二包括1×缓冲液、逆转录酶h和甘油。

9.如权利要求5所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品和/或阳性对照品，所述阴性对照品为空载质粒混合物，所述阳性对照品为冠状病毒2019-nCoV核酸质粒混合物。

10.一种冠状病毒2019-nCoV的核酸检测方法，其特征在于，采用如权利要求5至9中任一项所述的用于检测冠状病毒2019-nCoV的试剂盒来提取待检测样本DNA，通过数字PCR对靶向基因扩增片段进行绝对定量。