CN113652504A - 一种新型冠状病毒核酸检测成套试剂与试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒核酸检测成套试剂与试剂盒。本发明公开的新型冠状病毒核酸检测成套试剂由用于检测2019‑nCoV的成套引物对和成套探针组成；成套引物对由序列1和2所示的两条单链DNA组成的引物对1、序列4和5所示的两条单链DNA组成的引物对2、序列7和8所示的两条单链DNA组成的引物对3组成；成套探针由序列分别为序列3、6、9的探针2019‑nCoV‑P1、2019‑nCoV‑P2、2019‑nCoV‑P3组成。实验证明，本发明的成套试剂和检测试剂盒可以检测2019‑nCoV并筛查COVID‑19患者，灵敏度高，重复性好，具有很好的实用价值。

Description

一种新型冠状病毒核酸检测成套试剂与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，一种新型冠状病毒核酸检测成套试剂与试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-COV-2)，2020年1月12日被世界卫生组织 命名COVID-19，可以导致新型冠状病毒肺炎人与人之间现象。新型冠状病毒属于β属 的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特 征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前急需一种可以快速准确并且灵敏度高的 检测新型冠状病毒的方法，便于临床早期应用(本发明中称为2019-nCoV)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高检测2019-nCoV检测灵敏度并筛查COVID-19早期患者。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂，所述成套试剂由用于检测2019-nCoV的成套引物对和成套探针组成；
所述成套引物对包括引物对1和引物对2；
所述引物对1由名称分别为2019-nCoV-F1与2019-nCoV-R1的单链DNA组成，所 述2019-nCoV-F1与所述2019-nCoV-R1分别为序列表中序列1和2所示的单链DNA；
所述引物对2由名称分别为2019-nCoV-F2与2019-nCoV-R2的单链DNA组成，所 述2019-nCoV-F2与所述2019-nCoV-R2分别为序列表中序列4和5所示的单链DNA；
所述成套探针包括2019-nCoV-P1和2019-nCoV-P2，所述2019-nCoV-P1的序列为序列表中序列3；所述2019-nCoV-P2的序列为序列表中序列6。
上述成套引物对还可包括引物对3，所述引物对3由名称分别为2019-nCoV-F3与2019-nCoV-R3的单链DNA组成，所述2019-nCoV-F3与所述2019-nCoV-R3分别为序列 表中序列7和8所示的单链DNA；
所述成套探针还可包括2019-nCoV-P3，所述2019-nCoV-P3的序列为序列表中序列9。
所述成套引物对可由所述引物对1和所述引物对2组成，也可由所述引物对1、 所述引物对2和所述引物对3组成。
所述成套探针可由所述2019-nCoV-P1和所述2019-nCoV-P2组成，也可由所述2019-nCoV-P1、所述2019-nCoV-P2和所述2019-nCoV-P3组成。
上述成套试剂中，所述2019-nCoV-P1可由在序列表中序列3所示的单链DNA的5′末端和3′末端分别标记6-FAM和BHQ1得到；
所述2019-nCoV-P2可由在序列表中序列6所示的单链DNA的5′末端和3′末端 分别标记6-FAM和BHQ1得到；
所述2019-nCoV-P3可由在序列表中序列9所示的单链DNA的5′末端和3′末端 分别标记HEX和BHQ1得到。
所述成套试剂中的各单链DNA与各探针均可独立包装，也可包装在一起。所述成套试剂中的各单链DNA与各探针的摩尔数均可相等。
所述成套试剂可为具有如下任一用途的试剂：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段；
X6、制备用于检测或辅助检测2019-nCoV的产品；
X7、制备用于诊断或辅助诊断COVID-19的产品；
X8、制备用于筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者的产品；
X9、制备用于筛查或辅助筛查COVID-19患者的产品；
X10、制备检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段产品。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有所述成套试剂。
上述试剂盒还可含有PCR反应液、PCR反应酶、阳性质控品、阴性质控品和/或内 标质控；
所述PCR反应液为进行PCR扩增所需的除引物、模板和酶外的溶液；
所述PCR反应酶为逆转录酶和热启动DNA聚合酶；
所述阳性质控品为序列表中序列10和12所示的两条DNA片段或含量这两种片段的重组质粒；
所述阴性质控品为水；
所述内标质控为序列表中序列11所示的DNA片段或含有该片段的重组质粒。
具体的，所述PCR反应液可为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，货号B110026-0200。
所述逆转录酶可为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，货号为 B110022-0010。
所述热启动DNA聚合酶可为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，货号为B600002-0500。
所述阳性质控品可为pUC57-1与pUC57-2，所述pUC57-1为在pUC57的多克隆位 点间插入序列表中序列10所示的DNA片段得到的重组质粒，所述pUC57-2为在pUC57 的多克隆位点间插入序列表中序列12所示的DNA片段得到的重组质粒。
所述内标质控可为pUC57-3，所述pUC57-3为在pUC57的多克隆位点间插入序列 表中序列11所示的DNA片段得到的重组质粒。
所述试剂盒可为具有如下任一用途的试剂盒：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段。
所述成套试剂的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段；
X6、制备用于检测或辅助检测2019-nCoV的产品；
X7、制备用于诊断或辅助诊断COVID-19的产品；
X8、制备用于筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者的产品；
X9、制备用于筛查或辅助筛查COVID-19患者的产品；
X10、制备检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段产品。
所述试剂盒的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段；
X6、制备用于检测或辅助检测2019-nCoV的产品；
X7、制备用于诊断或辅助诊断COVID-19的产品；
X8、制备用于筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者的产品；
X9、制备用于筛查或辅助筛查COVID-19患者的产品；
X10、制备检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段产品。
利用本发明的成套试剂或试剂盒检测待测样本可在具有FAM、HEX、ROX、CY5等通道的荧光定量PCR仪上进行，如ABI 7500、LightCycler 480、Bio-Rad CFX96、安 捷伦MX3000P、安捷伦MX3005P或上海宏石SLAN-96P等荧光定量PCR仪，不同仪器间 兼容性好。
实验证明，利用本发明的成套试剂和检测试剂盒，可以检测2019-nCoV并筛查COVID-19患者，且灵敏度高，灵敏度可达200拷贝/反应；重复性好，变异系数CV (％)值≤5％；灵敏性高，为99.5％，线性：R2≥0.997。说明本发明的成套试剂及检 测试剂盒具有很好的实用价值。
附图说明
图1为利用实施例2的试剂盒检测待测样本的曲线图。1为引物对1及其探针的 结果，2为引物对2及其探针的结果，3为引物对3及其探针的结果(即内标质控)， 4为阴性质控。
图2为灵敏度的检测结果。1为pUC57-1的浓度为1×105拷贝/体系，2为pUC57-2 的浓度为1×105拷贝/体系，3为pUC57-1的浓度为1×104拷贝/体系，4为pUC57-2 的浓度为1×104拷贝/体系，5为pUC57-1的浓度为1×103拷贝/体系，6为pUC57-2 的浓度为1×103拷贝/体系，7为pUC57-1的浓度为1×102拷贝/体系，8为pUC57-2 的浓度为1×102拷贝/体系，9为pUC57-3的浓度为1×105拷贝/体系、1×104拷贝/ 体系、1×103拷贝/体系和1×102拷贝/体系。
图3为标准曲线。
图4为变异系数检测时的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明， 均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均 值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA 的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、用于检测2019-nCoV的成套试剂的制备
本实施例提供了一种用于检测2019-nCoV的成套试剂，由用于检测2019-nCoV的三个引物对组成的成套引物对与成套探针组成，三个引物对分别为2019-nCoV-F1与 2019-nCoV-R1组成的引物对1、2019-nCoV-F2与2019-nCoV-R2组成的引物对2、 2019-nCoV-F3与2019-nCoV-R3组成的引物对3，成套探针由2019-nCoV-P1、2019-nCoV-P2、2019-nCoV-P3组成，2019-nCoV-P1、2019-nCoV-P2、2019-nCoV-P3 分别特异识别引物对1、引物对2和引物对3对2019-nCoV的扩增产物。引物对3和 2019-nCoV-P3分别为内参引物和探针。
各引物的序列如表1所示，2019-nCoV-P1、2019-nCoV-P2、2019-nCoV-P3的序列 为序列表中序列3、6和9，其中2019-nCoV-P1的5′和3′末端分别标记有6-FAM和 BHQ1，2019-nCoV-P2的5′和3′末端分别标记有6-FAM和BHQ1，2019-nCoV-P3的5′ 和3′末端分别标记有HEX和BHQ1，表1。
用于检测2019-nCoV的成套试剂中各引物探针的摩尔数均相等。
表1、引物探针信息
名称 序列(5′-3′) 5′末端修饰 3′末端修饰
2019-nCoV-F1 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA(序列1) - -
2019-nCoV-R1 ACGATTGTGCATCAGCTGA(序列2) - -
2019-nCoV-P1 CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG(序列3) 6-FAM BHQ1
2019-nCoV-F2 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(序列4) - -
2019-nCoV-R2 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(序列5) - -
2019-nCoV-P2 TTGCTGCTGCTTGACAGATT(序列6) 6-FAM BHQ1
2019-nCoV-F3 ACTTCAACACGTGCATCTG(序列7) - -
2019-nCoV-R3 GCATGACTCAAACGTCT(序列8) - -
2019-nCoV-P3 CTCCAGCCTGGTCCCTACA(序列9) HEX BHQ1
实施例2、用于检测2019-nCoV的试剂盒的制备
本实施例提供了用于检测2019-nCoV的试剂盒，由表2中编号为1-6的试剂组成。
其中，引物探针反应液为将实施例1中的各引物和探针分别利用DEPC水(生工生物工程(上海)股份有限公司)溶解混合得到，引物探针反应液中2019-nCoV-F1与 2019-nCoV-R1、2019-nCoV-F2与2019-nCoV-R2、2019-nCoV-F3与2019-nCoV-R3以及 探针2019-nCoV-P1、2019-nCoV-P2、2019-nCoV-P3的浓度均为10μM/μl。
PCR反应液：生工生物工程(上海)股份有限公司产品，包含3.3mM Mg2+，2.5mMdNTP， 0.25mg/ml BSA，货号B110026-0200。
PCR反应酶：由逆转录酶和热启动DNA聚合酶组成，逆转录酶含量为200U/μl，热 启动DNA聚合酶含量为5U/μl，逆转录酶和热启动DNA聚合酶均为生工生物工程(上 海)股份有限公司产品，货号分别为B110022-0010和B600002-0500。
阳性质控品：重组质粒pUC57-1与pUC57-2的等摩尔混合物，pUC57-1为在pUC57 的多克隆位点间插入序列表中序列10所示的DNA片段得到的重组质粒，pUC57-2为在pUC57的多克隆位点间插入序列表中序列12所示的DNA片段得到的重组质粒。
阴性质控品：DEPC水，生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B501005-0500。
内标质控：重组质粒pUC57-3，pUC57-3为在pUC57的多克隆位点间插入序列表中序列11所示的DNA片段得到的重组质粒。
表2、用于检测2019-nCoV的试剂盒
序号 产品组成 主要组成成分
1 引物探针反应液 引物探针混合液
2 PCR反应液 Mg离子、BSA、DNTP等
3 PCR反应酶 逆转录酶、热启动DNA聚合酶
4 阳性质控品 阳性DNA片段
5 阴性质控品 DEPC水
6 内标质控 阳性DNA片段
注：不同批次试剂盒组分不可混用。
实施例3、利用实施例2的试剂盒的检测待测样本
利用实施例2的试剂盒的检测待测样本是否为2019-nCoV或是否含有其核酸片 段的检测步骤如下：
1、检测
1.1反应液的配制
按照表2配制N个反应的反应液，包括n个待测样本核酸与2个质控(阳性质 控和内标质控)，配置总数为N，N＝n+2+1。
表2反应液配制
组分 体积(N)
PCR反应液 20×Nμl
引物探针混合液 5×Nμl
PCR反应酶 2×Nμl
DEPC水 3×Nμl
1.2反应体系分管
准备相应数量的PCR八联排扩增管，按30μl/管将上述反应液分装至PCR八 连管中，盖紧PCR反应管盖，震荡15秒，瞬时离心10秒，排除气泡，将分装好的 PCR八联排扩增管转移至样本准备区。
1.3加样(核酸片段准备区)
取5μl待测样本核酸、5μl阳性质控、5μl内标质控、5μl阴性质控分别 加入到对应PCR八联扩增管中，盖紧PCR反应管盖后震荡15秒，瞬时离心10秒， 排除气泡，记录样本加样情况，将八联排PCR扩增管移到核酸扩增区进行上机检测。
1.4.PCR扩增(核酸扩增区)
1.4.1步骤1.3完成后将八联排PCR扩增管，放置在具有FAM、HEX、ROX、 CY5等通道的荧光定量PCR仪(ABI 7500)样品槽相应位置。并记录放置顺序。
1.4.2打开参数窗口设置循环条件，机器设置采集荧光通道为FAM和HEX，反应 程序如表3所示。
表3反应程序
Figure BDA0002488287100000071
1.5.试剂体系有效性判定：
内标：内标HEX通道应出现S型扩增曲线，且Ct值≤32.0。
阳性质控：FAM通道均满足有典型S型扩增曲线或Ct值≤37。
阴性质控：FAM通道Ct值＞40或无Ct值，线形为直线或轻微斜线，无指数增 长期。
满足以上三个条件判断该批反应有效，并进一步判断检测体系检测2019-nCoV核酸片段的灵敏性。
1.6.标本结果判定
如果待测样本的引物对1和引物对2的FAM通道均满足16≤Ct值≤37，并有明 显指数增长期，且内标通道(即引物对3)出现S型扩增曲线，且Ct值≤32.0，则说 明检测体系正常，即该检测体系样本含有2019-nCoV核酸片段，图1。
如果待测样本的引物对1和引物对2的FAM通道以及引物对3的HEX通道均满足 Ct值＞40或无Ct值，则待测样本为阴性，即该检测体系不含有2019-nCoV核酸片 段或该样本为2019-nCoV核酸片段浓度过低。
如果待测样本的引物对1和引物对2的FAM通道仅有一个满足16≤Ct值≤37， 无论引物对3的Ct值是多少，此时应对该样本进行重复检测，如重复实验结果扔无 法判定为阳性(或阴性)，则该样本为疑似阳性，需要借助其他检测手段来进一步判 定。
当待测样本引物对1和引物对2中至少一个的CT值≤15时，则此样本核酸浓度 过大，应稀释至少100-1000倍进行重新实验检测，样本检测结果需FAM通道满足16≤Ct值≤37。
【检验结果的解释】
1.如果阳性质控的引物对1与其探针以及引物对2与其探针中至少一个不满足检测体系有效性判定，则视为实验失败。
2.如果阴性质控的引物对1与其探针以及引物对2与其探针中至少一个不满足检测体系有效性判定，则视为实验失败。
实施例4、实施例2的试剂盒的灵敏度
以实施例2中的重组质粒pUC57-1、pUC57-2与pUC57-3作为待测样本，采用实施 例2中的试剂盒和体系进行检测，以检测其灵敏度。
将各待测样本利用DEPC水进行稀释，得到不同浓度的待测样本稀释液。
制备含有不同浓度的待测样本的反应体系：待测样本稀释液5μl，PCR反应液20μl，引物探针混合液5μl，PCR反应酶2μl，DEPC水3μl。分别得到重组质粒(pUC57-1、 pUC57-2和pUC57-3)含量分别为1×105拷贝/体系、1×104拷贝/体系、1×103拷贝/ 体系、1×102拷贝/体系和1×101拷贝/体系的反应体系，每种体系均含有三种质粒， 且各质粒浓度相等。设置不加模板的体系作为阴性对照。
将各反应体系置于具有FAM、HEX、ROX、CY5等通道的荧光定量PCR仪(ABI 7500)中，反应程序见表3。
结果显示，pUC57-3在浓度为1×105-1×102拷贝/体系的体系中均出现S型扩增 曲线且Ct值均≤32.0，pUC57-1和pUC57-2在含量均为1×105-1×102拷贝/体系时有 特异扩增(即均满足16≤Ct值≤37，并有明显指数增长期)，在含量均为1×101拷贝/体系时无特异扩增，说明，实施例2的试剂盒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应。 部分结果如图2所示。
实施例5、实施例2的试剂盒的灵敏性
以实施例2中的重组质粒pUC57-1、pUC57-2与pUC57-3作为待测样本，采用实施 例2中的试剂盒和体系进行检测，以检测其灵敏性。
将各待测样本利用DEPC水进行稀释，得到不同浓度的待测样本稀释液。
制备含有不同浓度的待测片段的反应体系：待测样本稀释液5μl，PCR反应液20μl，引物探针混合液5μl，PCR反应酶2μl，DEPC水3μl。分别得到待测片段(pUC57-1、 pUC57-2和pUC57-3)含量分别为1×105拷贝/体系、1×104拷贝/体系、1×103拷贝/ 体系、1×102拷贝/体系和1×101拷贝/体系的反应体系。设置不加模板的体系作为阴 性对照。
将各反应体系置于具有FAM、HEX、ROX、CY5等通道的荧光定量PCR仪(ABI 7500)中，反应程序见表3。
以拷贝数的对数值为横坐标、Ct值为纵坐标作标准曲线，曲线为： y＝-3.354953x+39.734804，R2＝0.997705，实施例2的试剂盒的灵敏性为99.5％，图3。
实施例6、实施例2的试剂盒的精密度
以实施例2中的重组质粒pUC57-1、pUC57-2与pUC57-3作为待测样本，采用实施 例2中的试剂盒和体系进行检测，将各待测样本利用DEPC水进行稀释，得到待测样本 稀释液。
制备反应体系：待测样本稀释液5μl，PCR反应液20μl，引物探针混合液5μl，PCR 反应酶2μl，DEPC水3μl。该体系中pUC57-1、pUC57-2与pUC57-3的含量均为1×105拷贝/体系。制备40个相同的重复实验体系，并设置不加模板的体系作为阴性对照。
将各反应体系置于具有FAM、HEX、ROX、CY5等通道的荧光定量PCR仪(ABI 7500)中，反应程序见表3。
结果(图4)显示，实施例2的试剂盒的检测待测样本的变异系数CV(％)值≤5％。
<110> 北京果壳生物科技有限公司
<120> 一种新型冠状病毒核酸检测成套试剂与试剂盒
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
acttcaacac gtgcatctg 19
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
gcatgactca aacgtct 17
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
ctccagcctg gtccctaca 19
<210> 10
<211> 314
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
tcctttggtg gtgcatcgtg ttgtctgtac tgccgttgcc acatagatca tccaaatcct 60
aaaggatttt gtgacttaaa aggtaagtat gtacaaatac ctacaacttg tgctaatgac 120
cctgtgggtt ttacacttaa aaacacagtc tgtaccgtct gcggtatgtg gaaaggttat 180
ggctgtagtt gtgatcaact ccgcgaaccc atgcttcagt cagctgatgc acaatcgttt 240
ttaaacgggt ttgcggtgta agtgcagccc gtcttacacc gtgcggcaca ggcactagta 300
ctgatgtcgt atac 314
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
ctccagcctg gtccctaca 19
<210> 12
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

Claims (9)

1.一种成套试剂，由用于检测2019-nCoV的成套引物对和成套探针组成；
所述成套引物对包括引物对1和引物对2；
所述引物对1由名称分别为2019-nCoV-F1与2019-nCoV-R1的单链DNA组成，所述2019-nCoV-F1与所述2019-nCoV-R1分别为序列表中序列1和2所示的单链DNA；
所述引物对2由名称分别为2019-nCoV-F2与2019-nCoV-R2的单链DNA组成，所述2019-nCoV-F2与所述2019-nCoV-R2分别为序列表中序列4和5所示的单链DNA；
所述成套探针包括2019-nCoV-P1和2019-nCoV-P2，所述2019-nCoV-P1的序列为序列表中序列3；所述2019-nCoV-P2的序列为序列表中序列6。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套引物对还包括引物对3，所述引物对3由名称分别为2019-nCoV-F3与2019-nCoV-R3的单链DNA组成，所述2019-nCoV-F3与所述2019-nCoV-R3分别为序列表中序列7和8所示的单链DNA；
所述成套探针还包括2019-nCoV-P3，所述2019-nCoV-P3的序列为序列表中序列9。
3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述2019-nCoV-P1由在序列表中序列3所示的单链DNA的5′末端和3′末端分别标记6-FAM和BHQ1得到；
所述2019-nCoV-P2由在序列表中序列6所示的单链DNA的5′末端和3′末端分别标记6-FAM和BHQ1得到；
所述2019-nCoV-P3由在序列表中序列9所示的单链DNA的5′末端和3′末端分别标记HEX和BHQ1得到。
4.根据权利要求1-3中任一所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂为具有如下任一用途的试剂：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段；
X6、制备用于检测或辅助检测2019-nCoV的产品；
X7、制备用于诊断或辅助诊断COVID-19的产品；
X8、制备用于筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者的产品；
X9、制备用于筛查或辅助筛查COVID-19患者的产品；
X10、制备检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段产品。
5.一种试剂盒，含有权利要求1-3中任一所述的成套试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有PCR反应液、PCR反应酶、阳性质控品、阴性质控品和/或内标质控；
所述PCR反应液为进行PCR扩增所需的除引物、模板和酶外的溶液；
所述PCR反应酶为逆转录酶和热启动DNA聚合酶；
所述阳性质控品为序列表中序列10和12所示的两条DNA片段或含量这两种片段的重组质粒；
所述阴性质控品为水；
所述内标质控为序列表中序列11所示的DNA片段或含有该片段的重组质粒。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为具有如下任一用途的试剂盒：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段。
8.权利要求1-3中任一所述成套试剂的下述任一应用：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段；
X6、制备用于检测或辅助检测2019-nCoV的产品；
X7、制备用于诊断或辅助诊断COVID-19的产品；
X8、制备用于筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者的产品；
X9、制备用于筛查或辅助筛查COVID-19患者的产品；
X10、制备检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段产品。
9.权利要求5或6所述试剂盒的下述任一应用：
X1、检测或辅助检测2019-nCoV；
X2、诊断或辅助诊断COVID-19；
X3、筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者；
X4、筛查或辅助筛查COVID-19患者；
X5、检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段；
X6、制备用于检测或辅助检测2019-nCoV的产品；
X7、制备用于诊断或辅助诊断COVID-19的产品；
X8、制备用于筛查或辅助筛查2019-nCoV感染者的产品；
X9、制备用于筛查或辅助筛查COVID-19患者的产品；
X10、制备检测或辅助检测待测样本是否含有2019-nCoV核酸或其核酸片段产品。
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