CN116790817A - 犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法 - Google Patents

犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116790817A
CN116790817A CN202310780855.XA CN202310780855A CN116790817A CN 116790817 A CN116790817 A CN 116790817A CN 202310780855 A CN202310780855 A CN 202310780855A CN 116790817 A CN116790817 A CN 116790817A
Authority
CN
China
Prior art keywords
channel
canine
value
seq
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310780855.XA
Other languages
English (en)
Inventor
王蕾
谭业平
宫英杰
夏兴霞
欧卫军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NANTONG EGENS BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
NANTONG EGENS BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NANTONG EGENS BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical NANTONG EGENS BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN202310780855.XA priority Critical patent/CN116790817A/zh
Publication of CN116790817A publication Critical patent/CN116790817A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒及检测方法。本发明提供的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的；基于该保守序列设计的引物和探针可以特异性检测犬冠状病毒；可以通过内标对待测样本的采集、运输和提取过程中进行监控，避免检测结果的假阴性和假阳性，从而提高检测的准确性、特异性和灵敏度。

Description

犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及 检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)属于冠状病毒科、冠状病毒属，为单链RNA病毒，可感染犬、貂和狐狸等犬科动物，犬冠状病毒致病性不强，引起的临床症状通常较轻，对幼犬或与犬细小等病毒混合感染的所引起的症状比较严重，并且易发生突变，产生新的变异毒株，具有致病性增强的风险。
犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)属于细小病毒科、细小病毒属，为双链DNA病毒，可引起的犬的剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征，发病率高，传染性强，尤其是对于幼犬的伤害，导致幼犬死亡率高，并且CPV对外界的抵抗力较强，是危害养犬业最为严重的传染病之一，可造成严重的经济损失。犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCoV)均是犬类胃肠感染的致病原，引起病犬呕吐、腹泻、厌食、精神不振等症状。两种病毒经常合并感染，造成犬的流行性腹泻。
人们对于生活休闲的形式呈以多样化，更多的倾向于精神上的满足，宠物的发展也成为了社会关切地热点，从而导致宠物行业的发展也迎来的飞速的发展，宠物的健康问题也成为了重中之重，所以病情的诊断或对该动物的病毒毒株的研究也极具重要意义。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒及检测方法，能够准确度高、特异性好、灵敏度高、操作便捷的检测犬冠状病毒与犬细小病毒。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；
第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；
第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的。
可选的，第一组引物和探针，包括：正向引物CCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物CCoV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；探针CCoV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
第二组引物和探针，包括：正向引物CPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物CPV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；探针CPV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
第三组引物和探针，包括：正向引物CRPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物CRPP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；探针CRPP-P，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。
可选的，所述探针CCoV-P、CPV-P和CRPP-P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；所述探针CCoV-P、CPV-P和CRPP-P的荧光基团不同。
可选的，所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、Texas Red和CY3中的至少1种；
和/或，所述荧光淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB中的至少1种。
一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，包括所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物。
可选的，还包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、ROX Dye、PCR增强剂、PCR稳定剂、PCR缓冲液、样本采集液、阴性质控品或阳性质控品。
可选的，样本采集液包括碳酸氢钠浓度范围为5～7g/L、碳酸钠浓度范围为10～14g/L、吐温-20浓度范围为0.01～0.05％v/v、甲酚红浓度范围为0.01～0.05g/100ml、盐酸胍的浓度范围为3M～5M，余量为无菌无酶水。采用所述样本采集液处理样本，可以省略核酸提取的步骤。
可选的，PCR缓冲液为含Tris为10mM-500mM、氯化盐为10mM-500mM、(NH4)2SO4为10mM-500mM、甘油为1v/v％-50v/v％、BSA为0.001mg/mL-1mg/mL、Tween 20为0.1v/v％-10v/v％、二硫苏糖醇为1mM-100mM、甜菜碱为0.1M-3M、DMSO为0.1v/v％-10v/v％，pH值为7.5-9.5；
和/或，阴性质控品为无菌无酶水；
和/或，阳性质控品为分别包含如SEQ ID NO.10～12所示的核苷酸序列的混合阳性参考质粒。
可选的，包括PCR扩增反应体系，以25μL为计：
PCR混合液，体积为12.5μL，含DNA聚合酶，酶活为0.5-1U；dNTP，每种碱基的浓度范围为200-300μM；Mg2+，浓度范围为1.5-2mM；PCR缓冲液，pH值为7.5-9.5；
犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，体积为7.5μL，每条引物浓度为0.1-0.5μM，每条探针的浓度为0.05-0.25μM；
待测样本，体积为5μL。
一种所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物或所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒在制备犬冠状病毒和犬细小病毒检测产品中的用途
一种非疾病诊断的犬冠状病毒和犬细小病毒检测方法，包括如下步骤：
以待测样本为模板，利用权利要求1-4任一项所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物或权利要求5-8任一项所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，配制PCR扩增反应体系，进行荧光定量PCR检测。
可选的，将采集的样本加入样本采集液中处理，得到所述待测样本，可选的，处理时间为0.5-3分钟；
可选的，所述荧光定量PCR检测中，PCR扩增程序为：反转录，50℃保持300秒；预变性，95℃保持30秒；95℃变性5秒，60℃退火、延伸30秒，45个循环；
和/或，所述荧光定量PCR检测中，包括定性或定量检测方法；
所述定性方法为：第一组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为A通道；第二组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为C通道；第三组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为B通道；判定方法为：
若待测样本在A通道中Ct值≤40，B通道中Ct值＜40，C通道中Ct值≤40，则待测样本为犬冠状病毒和犬细小病毒双阳性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞40，B通道中Ct值＜40，C通道中无Ct值或Ct值＞40，则待测样本为阴性；
若待测样本在A通道中Ct值≤40，B通道中Ct值＜40，C通道中无Ct值或Ct值＞40，则待测样本为犬冠状病毒阳性，犬细小病毒阴性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞40，B通道中Ct值＜40，C通道中Ct值≤40，则待测样本为犬冠状病毒阴性，犬细小病毒阳性；
若待测样本在A通道、B通道和C通道中均无Ct值，则进行重新测试；
且，待测样本在A通道、B通道和C通道任意一个的Ct值为35-40范围内时，则进行重复测试，若重复测试后，A通道、B通道和/或C通道Ct值为35-40范围内，且具有明显指数增长期，则判定为A通道、B通道和/或C通道为阳性；
所述定量检测方法为
建立标准曲线：将分别包含如SEQ ID NO.10～11所示的核苷酸序列的各标准品等浓度混合，将得到的混合标准品稀释至不同的浓度；以不同浓度的混合标准品作为模板，进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以混合标准品中各标准品的浓度为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
将待测样本的Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的定量结果。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的；如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列是犬冠状病毒的保守序列，基于该保守序列设计的引物和探针可以特异性检测犬冠状病毒；如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列是犬细小病毒的保守序列，基于该保守序列设计的引物和探针可以特异性检测犬细小病毒；如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列是犬源性样本管家基因CRPP的保守序列，将该序列作为内源性内标，基于该序列设计的引物和探针进行检测，可以通过内标对待测样本的采集、运输和提取过程中进行监控，避免检测结果的假阴性和假阳性，从而提高检测的准确性、特异性和灵敏度。
2、本发明提供了一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，第一组引物和探针，包括：正向引物CCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物CCoV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；探针CCoV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第二组引物和探针，包括：正向引物CPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物CPV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；探针CPV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；第三组引物和探针，包括：正向引物CRPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物CRPP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；探针CRPP-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；通过上述特别设计的引物和探针，避免了引物和探针之间相互干扰，同时尽可能的避免出现发夹结构、引物二聚体，进而可以保证在同一反应体系内进行多重PCR扩增反应，并且保证具有高灵敏度、高准确度和特异性好。
3、本发明提供了一种非疾病诊断的犬冠状病毒和犬细小病毒检测方法，包括如下步骤：以待测样本为模板，利用所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物或所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，配制PCR扩增反应体系，进行荧光定量PCR检测；上述方法的检测原理为：依据目的基因设计合成与之特异性杂交的探针，探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。本发明的方法为多重PCR扩增体系，可以在同一体系内进行检测，缩短了实验时间，且灵敏度高、特异性强、准确度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中犬冠状病毒的标准曲线；
图2是本发明实验例1中犬细小病毒的标准曲线；
图3是本发明实验例1中犬冠状病毒的扩增曲线；
图4是本发明实验例1中犬细小病毒的扩增曲线；
图5是本发明实验例2中临床确诊为犬冠状病毒和犬细小病毒均为阳性的样本核的检测结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中的引物和探针是由通用生物(安徽)股份有限公司合成的。
包含CCoV基因(包含SEQ ID NO.10)的阳性参考质粒是由通用生物(安徽)股份有限公司提供；
包含CPV-II基因(包含SEQ ID NO.11)的阳性参考质粒是由通用生物(安徽)股份有限公司提供；
包含CRPP基因(包含SEQ ID NO.12)的阳性参考质粒是由通用生物(安徽)股份有限公司提供；
下述实施例中涉及的引物和探针由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
实施例1
本实施例提供了一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，包括：
第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计，包括：正向引物CCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物CCoV-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；探针CCoV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的，包括：正向引物CPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物CPV-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；探针CPV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的，包括：正向引物CRPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物CRPP-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；探针CRPP-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其5’端标记有荧光基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
实施例2
本实施例提供了一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，包括利用实施例1的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物构建，所述试剂盒包括独立包装的试剂，如下表：
表1
实施例3
本实施例提供了一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，包括利用实施例1的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物构建，所述试剂盒包括独立包装的试剂，如下表：
表2
实施例4
本实施例提供了一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，包括利用实施例1的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物构建，所述试剂盒包括独立包装的试剂，如下表：
表3
实施例5
本实施例提供了一种非疾病诊断的犬瘟热病毒和犬腺病毒II型检测方法，包括利用实施例2中的试剂盒，所述步骤如下：
样本类型：包括口腔拭子、粪便、肛拭子和其它可疑标本。
样本采集：按照《微生物标本采集手册》要求进行样本采集；
样本保存：标本应在收集后一小时内冷藏(2至8℃或冷冻(-20℃或更低)，并尽快进行检测。能在一周以内检测的标本可置于4℃保存；无法检测的标本，短期可在-20℃中保存，长期应置于-70℃以下保存(收集后＞60天)。全血分离血浆前冷藏(2至8℃),然后-20℃或以下保存。应设立专库或专柜单独保存标本。标本应避免反复冻融。
样本处理：使用试剂盒自带样本采集液，将样本试子浸入样本处理液(5μL)轻柔转动试子5次，作用约1分钟，得到待测样本(约5μL)。阳性质控品和阴性质控品不参与提取，直接作为模板使用。
核酸检测：实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测犬冠状病毒和犬细小病毒核酸(PCR实验室进行)。
(1)反应体系的准备：每反应管中加入主反应液和引物探针液，按照比例配制反应混合液：每次PCR反应，除了检测样本外，应加阴、阳性质控品；所有样本，包括质控品，应设平行的反应管。
表4
(2)加样：每反应管中加入待测样本或质控品各5μL后，盖紧管盖，置于荧光定量PCR检测仪上。
(3)扩增参数设定：
表5
(4)仪器检测通道选择:使用荧光定量PCR检测仪，选择FAM、VIC、CY5三个通道进行实时荧光信号的采集，收集设在60℃具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
(5)本发明反应系统的质量控制，如下表所示:
表6
定性检测结果判定方法，如下表所示：
表7
且，若待测样本在A通道、B通道和C通道中任意一个的Ct值为35-40范围内时，则进行重复测试，若重复测试后，A通道、B通道和/或C通道的Ct值为35-40范围内，且具有明显指数增长期，则判定A通道、B通道和/或C通道为阳性(即认定为A通道Ct值≤40、B通道Ct值＜40和/或C通道Ct值≤40)，然后继续按照上表7进行判断；
定量检测方法为：
建立标准曲线：将分别包含如SEQ ID NO.10～11所示的核苷酸序列的各标准品(前述阳性参考质粒)等浓度混合，将得到的混合标准品稀释至不同的浓度；以不同浓度的混合标准品作为模板，进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以混合标准品中各标准品的拷贝数的对数值(log10)为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
将待测样本的Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的定量结果。
实施例6
本实施例与实施例5的区别在于，利用实施例3的试剂盒进行检测。
实施例7
本实施例与实施例5的区别在于，利用实施例4的试剂盒进行检测。
实验例1
使用犬冠状病毒和犬细小病毒的混合阳性参考质粒，将质粒用去RNA酶水(RNase-Free H2O)进行10倍梯度稀释，混合阳性参考质粒溶液中每种质粒的浓度分别为1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/mL，采用实施例5中的方法进行检测，建立的标准曲线，犬冠状病毒的标准曲线如图1所示，标准曲线方程为y＝-3.149x+38.373，R2＝0.9957，犬细小病毒的标准曲线如图2所示，标准曲线方程为y＝-3.187x+38.189，R2＝0.9985。上述标准曲线的相关系数R2均大于0.99，说明本发明的检测方法的检测结果稳定。
将犬冠状病毒和犬细小病毒阳性临床样本核酸采用去RNA酶水分别稀释到浓度依次为1×106copies/μL～1×100.5copies/μL，采用本发明实施例5的方法检测结果如图3，图4所示，检测均扩增出S型曲线，说明本试剂盒灵敏度高，犬冠状病毒和犬细小病毒最低的检测限为1×101copies/μL。
实验例2
将临床确诊为犬冠状病毒和犬细小病毒均为阳性的样本核酸，采用本发明实施例5进行检测，检测结果如图5所示，检测结果和临床结果一致，说明本发明的试剂盒的准确性较好。
实验例3
应用上述实施例5方法和常规PCR/RT-PCR试剂盒(使用PowerPol 2XPCR Mix试剂盒，由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供，引物和探针采用本发明的SEQ ID NO.1-6，不使用本发明内标的引物和探针SEQ ID NO.7-9)对临床犬消化道疑似患病拭子样本35份进行检测，检测结果如下表所示，对CCoV的检出率为31.4％，对CPV的检出率为25.7％，对CCoV与CPV双阳性的检出率为8.5％，阳性的样品经测序及核酸序列BLAST分析与本发明检测结果一致。该方法相比较普通PCR/RT-PCR检出率更高，假阳性率和假阴性率低。
表8
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，其特征在于，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；
第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；
第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的。
2.根据权利要求1所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，其特征在于，
第一组引物和探针，包括：正向引物CCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物CCoV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；探针CCoV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
第二组引物和探针，包括：正向引物CPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物CPV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；探针CPV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
第三组引物和探针，包括：正向引物CRPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物CRPP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；探针CRPP-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求2所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，其特征在于，所述探针CCoV-P、CPV-P和CRPP-P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；所述探针CCoV-P、CPV-P和CRPP-P的荧光基团不同；
可选的，所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、Texas Red和CY3中的至少1种；
可选的，所述荧光淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB中的至少1种。
4.一种犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、ROX Dye、PCR增强剂、PCR稳定剂、PCR缓冲液、样本采集液、阴性质控品或阳性质控品。
6.根据权利要求5所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，
样本采集液包括碳酸氢钠浓度范围为5～7g/L、碳酸钠浓度范围为10～14g/L、吐温-20浓度范围为0.01～0.05％v/v、甲酚红浓度范围为0.01～0.05g/100ml、盐酸胍的浓度范围为3M～5M，余量为无菌无酶水；
和/或，PCR缓冲液为含Tris为10mM-500mM、氯化盐为10mM-500mM、(NH4)2SO4为10mM-500mM、甘油为1v/v％-50v/v％、BSA为0.001mg/mL-1mg/mL、Tween 20为0.1v/v％-10v/v％、二硫苏糖醇为1mM-100mM、甜菜碱为0.1M-3M、DMSO为0.1v/v％-10v/v％，pH值为7.5-9.5；
和/或，阴性质控品为无菌无酶水；
和/或，阳性质控品为分别包含如SEQ ID NO.10～12所示的核苷酸序列的混合阳性参考质粒。
7.根据权利要求5或6所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增反应体系，以25μL为计：
PCR混合液，体积为12.5μL，含DNA聚合酶，酶活为0.5-1U；dNTP，每种碱基的浓度范围为200-300μM；Mg2+，浓度范围为1.5-2mM；PCR缓冲液，pH值为7.5-9.5；
犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物，体积为7.5μL，每条引物浓度为0.1-0.5μM，每条探针的浓度为0.05-0.25μM；
待测样本，体积为5μL。
8.一种如权利要求1-3任一项所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物或权利要求4-7任一项所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒在制备犬冠状病毒和犬细小病毒检测产品中的用途。
9.一种非疾病诊断的犬冠状病毒和犬细小病毒检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样本为模板，利用权利要求1-3任一项所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物或权利要求4-7任一项所述的犬冠状病毒和犬细小病毒检测试剂盒，配制PCR扩增反应体系，进行荧光定量PCR检测。
10.根据权利要求9所述的非疾病诊断的犬冠状病毒和犬细小病毒检测方法，其特征在于，
将采集的样本加入样本采集液中处理，得到所述待测样本；
和/或，所述荧光定量PCR检测中，PCR扩增程序为：反转录，50℃保持300秒；预变性，95℃保持30秒；95℃变性5秒，60℃退火、延伸30秒，45个循环；
和/或，所述荧光定量PCR检测中，包括定性或定量检测方法；
所述定性方法为：第一组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为A通道；第二组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为C通道；第三组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为B通道；判定方法为：
若待测样本在A通道中Ct值≤40，B通道中Ct值＜40，C通道中Ct值≤40，则待测样本为犬冠状病毒和犬细小病毒双阳性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞40，B通道中Ct值＜40，C通道中无Ct值或Ct值＞40，则待测样本为犬冠状病毒和犬细小病毒双阴性；
若待测样本在A通道中Ct值≤40，B通道中Ct值＜40，C通道中无Ct值或Ct值＞40，则待测样本为犬冠状病毒阳性，犬细小病毒阴性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞40，B通道中Ct值＜40，C通道中Ct值≤40，则待测样本为犬冠状病毒阴性，犬细小病毒阳性；
若待测样本在A通道、B通道和C通道中均无Ct值，则进行重新测试；
且，待测样本在A通道、B通道和C通道中任意一个的Ct值为35-40范围内时，则进行重复测试，若重复测试后，A通道、B通道和/或C通道Ct值为35-40范围内，且具有明显指数增长期，则判定为A通道、B通道和/或C通道为阳性；
所述定量检测方法为
建立标准曲线：将分别包含如SEQ ID NO.10～11所示的核苷酸序列的各标准品等浓度混合，将得到的混合标准品稀释至不同的浓度；以不同浓度的混合标准品作为模板，进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以混合标准品中各标准品的浓度为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲将待测样本的Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的定量结果。
CN202310780855.XA 2023-06-28 2023-06-28 犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法 Pending CN116790817A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310780855.XA CN116790817A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310780855.XA CN116790817A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116790817A true CN116790817A (zh) 2023-09-22

Family

ID=88043568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310780855.XA Pending CN116790817A (zh) 2023-06-28 2023-06-28 犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116790817A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111020064B (zh) 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒
CN112063756A (zh) 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒
CN111286559A (zh) 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒
CN102317474A (zh) 用于检测乙型肝炎病毒的寡核苷酸探针及引物
CN113930547B (zh) 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法
JP4950656B2 (ja) 核酸検出
US20220025434A1 (en) Composition for determining false positives using a unique artificial nucleotide sequence and method for determining false positives using the same
CN112831597A (zh) 用于非洲猪瘟病毒基因鉴别检验的实时荧光pcr扩增引物对、探针引物、及制备的试剂盒
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN116814859A (zh) 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN111647686A (zh) 肠道病毒ev71、ca16、ev通用型核酸检测试剂
CN111378787A (zh) 一种新型冠状病毒的检测方法
CN111206122A (zh) 一种新型冠状病毒核酸检测试剂盒
CN116790817A (zh) 犬冠状病毒和犬细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒以及检测方法
EP3885455A1 (en) Method and kit for the detection of sars-cov-2 virus in a sample based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp)
CN112266978A (zh) 引物探针组合、检测试剂盒及其应用
CN116949213A (zh) 犬瘟热病毒和犬腺病毒ii型检测引物探针组合物、试剂盒及检测方法
JP5215726B2 (ja) マウスニューモシスチス・カリニの検出方法
CN116949214A (zh) 一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒和检测方法
CN116855636A (zh) 一种猫冠状病毒检测引物探针组合物、试剂盒及方法
KR20210073220A (ko) 중증열성혈소판감소증후군 및 쯔쯔가무시증 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트
US20050142536A1 (en) Method and kit for the detection of a novel coronoavirus associated with the severe acute respiratory syndrome (SARS)
KR102496413B1 (ko) 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 d68 동시 검출용 프라이머 세트
CN115141826B (zh) Rpa引物对及其应用、可视化检测pcv4的试剂盒及其应用和检测pcv4方法
KR102496414B1 (ko) 쿠도아충 18S rRNA gene 및 28S rRNA gene 동시 검출용 프라이머 세트

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination