CN116949214A - 一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒和检测方法。本发明提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的；利用上述靶标序列设计的引物探针组合物进行检测时具有更高的灵敏度、准确度、特异性，更低的假阴性和假阳性。

Description

一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒 和检测方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术
猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)是一种有囊膜不分节段的单股正链RNA病毒，FCoV属于尼多病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属。猫冠状病毒分为肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒。猫肠道冠状病毒对猫造成的病症较为温和，而猫传染性腹膜炎病毒可引起猫腹膜的急性、烈性炎症反应。猫细小病毒(Felinepanleμkopeniavirμs，FPV)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒或猫瘟病毒。FPV属细小病毒科，细小病毒亚科，细小病毒属成员，是单股无囊膜的DNA病毒。猫感染FPV后临床主要以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征。感染率达70％，死亡率一般为50％～60％。猫作为人类重要的宠物伴侣，其健康问题越来越受人关注，其中FCoV和FPV是猫重要的致死性传染病，给猫的生命安全造成了巨大威胁。因此，能够快速、准确、高通量的专门鉴别检测该病毒意义重大，无论是对猫的临床诊断或是用于治疗药物的筛选或是对毒株的研究等。
现有的病毒核酸检测方法主要有以下几种：
荧光定量PCR法，主要用于体外定性检测病毒核酸，其样本主要为鼻咽拭子、肛拭子、粪便等。从样本提取到确认检测结果一般4-5小时。其具有灵敏度高，假阳性、假阴性率相对较低；有专家共识；窗口期相对较短；直接针对目标病毒且可以通过相对丰度来判断病毒感染的程度和用药后的效果等优势。
测序法，该方法相对于PCR法时间更长，对实验室和专业的要求更高，检测成本更高，更利于对毒株的变异研究。
恒温扩增法在检测时间上比PCR略短，灵敏度高，但其对引物的设计要求较高，整个行业发展和配套还不如PCR成熟，需要专业人员和设备，且具有更高的假阳性率。
胶体金和化学发光法主要的检测物为血液中特异性的抗体，在临床上其具有检测时间短、速度快、检测成本较低的特点和检测窗口期较长的劣势。胶体金法具有不依赖专业人员和设备，操作简单的优势，也存在特异性差，灵敏度低，假阴性、假阳性率高的缺点。化学发光法相较于胶体金法灵敏度更高，但需要专门的设备和人员。
以上，虽然荧光定量PCR法检测病毒具有速度快、通量大、通用性强和配套成熟的优势，但是在一般情况下，样本需长距离运输，人工在采集样本以及核酸提取过程容易出现操作不规范的情况，以上的情况造成病毒核酸容易被破坏，最终导致检测结果假阴性和假阳性高，准确度、特异性、灵敏度相对较低。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物、试剂盒和检测方法，在检测猫冠状病毒和猫细小病毒方面，具有更高的灵敏度、准确度、特异性，更低的假阴性和假阳性。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；
第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；
第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的。
可选的，第一组引物和探针，包括：正向引物FCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物FCoV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或探针FCoV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
第二组引物和探针，包括：正向引物FPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物FPV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；和/或探针FPV-P，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；
第三组引物和探针，包括：正向引物RPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物RPP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；和/或探针RPP-P，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。
可选的，所述探针FCoV-P、探针FPV-P、RPP-P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述探针FCoV-P、探针FPV-P、RPP-P的荧光基团不同。
可选的，所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、Texas Red和CY3中的至少1种；
和/或，所述荧光淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和MGB中的至少1种。
一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，包括所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物。
可选的，还包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、ROX染料、PCR增强剂、PCR稳定剂、PCR缓冲液、样本采集液、阴性质控品或阳性质控品。
可选的，PCR增强剂为BSA；
和/或，PCR缓冲液含Tris为10mM-500mM、氯化盐为10mM-500mM、(NH4)2SO4为10mM-500mM、甘油为1v/v％-50v/v％、BSA为0.001mg/mL-1mg/mL、Tween 20为0.1v/v％-10v/v％、二硫苏糖醇为1mM-100mM、甜菜碱为0.1M-3M、DMSO为0.1v/v％-10v/v％，pH值为7.5-9.5；
和/或，样本采集液包括碳酸氢钠浓度范围为6-6.5g/L、碳酸钠浓度范围为12-13g/L、吐温-20浓度范围为0.01-0.05v/v％、甲酚红浓度范围为0.01-0.05g/100ml、盐酸胍浓度范围为4-5M，余量为无酶无菌水；采用所述样本采集液处理样本，可以省略核酸提取的步骤；
和/或，阴性质控品为无酶无菌水；
和/或，阳性质控品为分别包含如SEQ ID NO.10～12所示的核苷酸序列的混合质粒标准品。
可选的，包括PCR扩增反应体系，以25μL为计：
PCR混合液，体积为12.5μL，含DNA聚合酶，酶活为0.5-1U；dNTP，每种碱基的浓度范围为200-300μM；Mg2+，浓度范围为1.5-2mM；PCR缓冲液，pH值为7.5-9.5；
猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，体积为7.5μL，每条引物浓度为0.1-0.5μM，每条探针的浓度为0.05-0.25μM；
待测样本，体积为5μL。
一种所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物或所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒在制备猫冠状病毒和猫细小病毒检测产品中的用途。
一种非疾病诊断的猫冠状病毒和猫细小病毒检测方法，包括如下步骤：
以待测样本为模板，利用所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物或所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，配制PCR扩增反应体系，进行荧光定量PCR检测。
可选的，将采集的样本加入样本采集液中处理，得到所述待测样本，可选的，处理时间为0.5-3分钟左右。
可选的，所述荧光定量PCR检测中，PCR扩增程序为：反转录，50℃保持300秒；预变性，95℃保持30秒；95℃变性5秒，60℃退火、延伸30秒，40个循环；
和/或，所述荧光定量PCR检测中，包括定性或定量检测方法；
所述定性方法为：第一组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为A通道；第二组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为C通道；第三组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为B通道；判定方法为：
若待测样本在A通道中Ct值≤39，B通道中Ct值＜39，C通道中Ct值≤39，则待测样本为猫冠状病毒和猫细小病毒双阳性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞39，B通道中Ct值＜39，C通道中无Ct值或Ct值＞39，则待测样本为猫冠状病毒和猫细小病毒双阴性；
若待测样本在A通道中Ct值≤39，B通道中Ct值＜39，C通道中无Ct值或Ct值＞39，则待测样本为猫冠状病毒阳性，猫细小病毒阴性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞39，B通道中Ct值＜39，C通道中Ct值≤39，则待测样本为猫冠状病毒阴性，猫细小病毒阳性；
若待测样本在A通道、B通道和C通道中均无Ct值，则进行重新测试；
且，若待测样本在A通道、B通道和C通道中任意一个的Ct值为35-39范围内时，则进行重复测试，若重复测试后，A通道、B通道和/或C通道的Ct值为35-39范围内，且具有明显指数增长期，则判定为相应通道为阳性；
所述定量检测方法为：
建立标准曲线：将分别包含如SEQ ID NO.10～11所示的核苷酸序列的各标准品等浓度混合，将得到的混合标准品稀释至不同的浓度；以不同浓度的混合标准品作为模板，进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以混合标准品中各标准品的浓度为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
将待测样本的Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的定量结果。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的；上述SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为对应猫冠状病毒7b基因的靶标序列，SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列为对应猫细小病毒VP2基因的靶标序列，SEQID NO.12所示的核苷酸序列为对应猫源性样本管家基因RPP的靶标序列。本发明为了确保猫冠状病毒和猫细小病毒检测结果的准确性，选取病毒基因组中两个基因SEQ ID No.10和SEQ ID No.11作为靶标序列，同时为了排除运输、采集及提取的影响，选择猫源性样本管家基因RPP中的SEQ ID No.12作为内标序列，猫源性样本管家基因RPP普遍存在样本中同时兼具特异性高且高度保守，进而可以通过RPP对样本的采集、运输和提取过程中进行监控，若是病毒核酸被破坏，在检测时则基因RPP无法检测出，从而可以排除假阴性和假阳性结果，可以使得利用上述靶标序列设计的引物探针组合物进行检测时具有更高的灵敏度、准确度、特异性，更低的假阴性和假阳性。
2、本发明提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，第一组引物和探针，包括：正向引物FCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物FCoV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或探针FCoV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第二组引物和探针，包括：正向引物FPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物FPV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；和/或探针FPV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；第三组引物和探针，包括：正向引物RPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物RPP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；和/或探针RPP-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；本发明通过对扩增引物及检测探针的巧妙设计，避免了多个引物对及对应的检测探针之间的相互干扰，可以在同一反应体系内进行多重PCR反应，具有高灵敏度、准确度、特异性，降低假阴性和假阳性。
3、本发明提供了一种非疾病诊断的猫冠状病毒和猫细小病毒检测方法，包括如下步骤：以待测样本为模板，利用所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物或所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，配制PCR扩增反应体系，进行荧光定量PCR检测；上述方法的检测原理为：选择猫冠状病毒和猫细小病毒的7b/VP2基因作为检测靶点。依据检测靶点各设计一套引物探针，探针的5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时，荧光淬灭基团会通过荧光共振能量转移(FRET)显著降低由荧光基团发射的荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，DNA聚合酶(如Taq酶)利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，从而实现对猫冠状病毒和猫细小病毒在核酸水平上的定性、定量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中猫冠状病毒的标准曲线；
图2是本发明实验例1中猫细小病毒的标准曲线；
图3是本发明实验例1中猫冠状病毒的灵敏度检测结果；
图4是本发明实验例1中猫细小病毒的灵敏度检测结果；
图5是本发明实验例2中临床确诊为猫冠状病毒和猫细小病毒阳性的检测结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
阳性质粒采用常规的方法制备，具体如下：将猫冠状病毒的7b基因序列、猫细小病毒VP2基因、猫源性样本管家基因RPP的序列克隆至pUC57载体，转化细菌感受态细胞DH5α，提取质粒，测序验证后作为多重荧光定量PCR的质粒标准品。对应的质粒标准品分别命名为pUC57-FCoV-7b、pUC57-FPV-VP2、pUC57-Rpp。用紫外分光光度计测OD260值，按公式([X(g/μL)DNA/DNA长度(bp)×660]×6.02×1023＝Y(copies/μL))换算成摩尔浓度后，稀释至108copies/μL，-20℃保存，使用前稀释。
实施例1
本实施例提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，具体如下：
为了确保猫冠状病毒和猫细小病毒检测结果的准确性，选取病毒基因组中两个基因SEQ ID No.10和SEQ ID No.11作为靶标序列，设计特异的引物和探针(SEQ ID No.1-6)。
为排除假阴性、假阳性、污染及提取的影响，选择猫基因组DNA(SEQ ID No.12)作为靶标序列，设计特异的引物和探针(SEQ ID No.7-9)。
即猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物包括：
第一组引物和探针，包括：正向引物FCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物FCoV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；探针FCoV-P，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；探针FCoV-P的5’端标记有荧光基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ-1；
第二组引物和探针，包括：正向引物FPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物FPV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；探针FPV-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；探针FPV-P的5’端标记有荧光基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ-2；
第三组引物和探针，包括：正向引物RPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物RPP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；探针RPP-P，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；探针RPP-P的5’端标记有荧光基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
实施例2
本实施例提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，包括利用实施例1中的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，所述试剂盒中包括独立包装的试剂，见表1：
表1
实施例3
本实施例提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，包括利用实施例1中的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，所述试剂盒中包括独立包装的试剂，见下表：
表2
实施例4
本实施例提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，包括利用实施例1中的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，所述试剂盒中包括独立包装的试剂，见下表：
表3
实施例5
本实施例提供了一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测方法，包括利用实施例2中的试剂盒，包括如下步骤：
(1)待测样本的获取：
样本类型：包括口腔拭子、粪便、肛拭子和其它可疑标本。
样本采集：按照《微生物标本采集手册》要求进行样本采集；
样本保存：标本应在收集后一小时内冷藏(2至8℃或冷冻(-20℃或更低)，并尽快进行检测。能在一周以内检测的标本可置于4℃保存；无法检测的标本，短期可在-20℃中保存，长期应置于-70℃以下保存(收集后＞60天)。全血分离血浆前冷藏(2至8℃),然后-20℃或以下保存。应设立专库或专柜单独保存标本。标本应避免反复冻融。
样本处理：使用试剂盒自带样本采集液，将样本试子浸入适量样本处理液轻柔转动试子5次，作用约1分钟，得到待测样本(约5微升)。阳性质控品和阴性质控品不参与提取，直接作为模板使用。
(2)核酸检测：实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测猫冠状病毒和猫细小病毒核酸：
1)反应体系的准备：按照表4配制反应混合液：每次PCR反应，除了待测样本外，应加阴、阳性质控品；所有样本，包括质控品，应设平行的反应管。
表4
反应混合液组份 用量
主反应液 12.5μL
引物探针液 7.5μL
待测样本 5μL
总体积 25μL
2)加样：每反应管中加入待测样本或质控品各5μL后，盖紧管盖，置于荧光定量PCR检测仪上。
3)扩增参数设定按下表设定：
表5
4)仪器检测通道选择:
使用荧光定量PCR检测仪，选择FAM、VIC、CY5三个通道进行实时荧光信号的采集，收集设在60℃，具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
5)本发明反应系统的质量控制，如下表所示:
表6
定性检测结果判定方法，如下表所示：
表7
且，若待测样本在A通道、B通道和C通道中任意一个的Ct值为35-39范围内时，则进行重复测试；若重复测试后，A通道、B通道和/或C通道的Ct值为35-39范围内，且具有明显指数增长期，则判定为A通道、B通道和/或C通道为阳性(即A通道的Ct值≤39、B通道的Ct值＜39和/或C通道的Ct值≤39)，然后继续按照上表7进行判断。
所述定量检测方法为：
建立标准曲线：将分别包含如SEQ ID NO.10～11所示的核苷酸序列的各标准品等浓度混合，将得到的混合标准品稀释至不同的浓度；以不同浓度的混合标准品作为模板，进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以混合标准品中各标准品的浓度(拷贝数的对数(log10))为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线(可参见实验例中的)；
将待测样本的Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的定量结果。
实施例6
本实施例与实施例5的区别在于，利用实施例3的试剂盒进行检测。
实施例7
本实施例与实施例5的区别在于，利用实施例4的试剂盒进行检测。
实验例1稳定性和灵敏度检测
将包含7b基因的质粒标准品(pUC57-FCoV-7b)和包含VP2基因的质粒标准品(pUC57-FPV-VP2)等浓度混合，制得混合标准品溶液，然后采用无菌无酶水按照10倍梯度进行稀释，获得不同浓度的混合标准品溶液，其中，包含7b基因的质粒标准品和包含VP2基因的质粒标准品各自的浓度依次为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL，然后将上述不同浓度的混合标准品作为模板，按照实施例5进行实施，检测结束后，以混合标准品中各标准品的浓度(拷贝数的对数(log10))为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1、图2所示，由图1可以看到，对应FCoV病毒的标准曲线为y＝-3.2791x+41.532，R2＝0.9939；由图2可以看到，对应FPV病毒的标准曲线为y＝-3.643x+41.61，R2＝0.9943。相关性系数R2均大于0.99，说明本发明检测效果稳定。
将猫冠状病毒和猫细小病毒阳性临床样本核酸采用无菌无酶水稀释到1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL作为模板，采用本发明实施例5的方法检测结果如图3，图4所示，检测均扩增出S型曲线，猫冠状病毒和猫细小病毒最低的检测限为1×101copies/μL。
实验例2
将临床确诊的猫冠状病毒、猫细小病毒和阳性质粒标准品(pUC57-Rpp)混合的样本核酸，按照实施例5进行实施，检测结果如图5所示，和临床结果一致，说明本发明的准确性高。
实验例3
应用实施例5方法和常规PCR/RT-PCR方法(使用PowerPol 2XPCR Mix试剂盒，由武汉爱博泰克生物科技有限公司提供，引物和探针采用本发明的SEQ ID NO.1-6，不使用本发明内标的引物和探针SEQ ID NO.7-9)，对25份临床样品进行检测。结果如表8所示，本发明方法对FCoV检出率为36％(9/25)，对FPV的检出率为16％(4/25)，FCoV和FPV共感染的检出率为12％(3/25)，阳性的样品经测序及核酸序列BLAST分析显示与上述检测结果一致。该方法相比较常规PCR/RT-PCR检出率更高，假阳性率和假阴性率低。
表8
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，其特征在于，包括：第一组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列设计的；
第二组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列设计的；
第三组引物和探针，为基于如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列设计的。
2.根据权利要求1所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，其特征在于，
第一组引物和探针，包括：正向引物FCoV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物FCoV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；和/或探针FCoV-P，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
第二组引物和探针，包括：正向引物FPV-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；反向引物FPV-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；和/或探针FPV-P，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；
第三组引物和探针，包括：正向引物RPP-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物RPP-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；和/或探针RPP-P，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。
3.根据权利要求2所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，其特征在于，所述探针FCoV-P、探针FPV-P、RPP-P的5’端标记有荧光基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述探针FCoV-P、探针FPV-P、RPP-P的荧光基团不同；
可选的，所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、ROX、HEX、JOE、NED、Texas Red和CY3中的至少1种；
可选的，所述荧光淬灭基团选自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和MGB中的至少1种。
4.一种猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、ROX染料、PCR增强剂、PCR稳定剂、PCR缓冲液、样本采集液、阴性质控品或阳性质控品。
6.根据权利要求5所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，其特征在于，
PCR增强剂为BSA；
和/或，PCR缓冲液含Tris为10mM-500mM、氯化盐为10mM-500mM、(NH4)2SO4为10mM-500mM、甘油为1v/v％-50v/v％、BSA为0.001mg/mL-1mg/mL、Tween 20为0.1v/v％-10v/v％、二硫苏糖醇为1mM-100mM、甜菜碱为0.1M-3M、DMSO为0.1v/v％-10v/v％，pH值为7.5-9.5；
和/或，样本采集液包括碳酸氢钠浓度范围为6-6.5g/L、碳酸钠浓度范围为12-13g/L、吐温-20浓度范围为0.01-0.05v/v％、甲酚红浓度范围为0.01-0.05g/100ml、盐酸胍浓度范围为4-5M，余量为无酶无菌水；
和/或，阴性质控品为无酶无菌水；
和/或，阳性质控品为分别包含如SEQ ID NO.10～12所示的核苷酸序列的混合质粒标准品。
7.根据权利要求5或6所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，其特征在于，包括PCR扩增反应体系，以25μL为计：
PCR混合液，体积为12.5μL，含DNA聚合酶，酶活为0.5-1U；dNTP，每种碱基的浓度范围为200-300μM；Mg2+，浓度范围为1.5-2mM；PCR缓冲液，pH值为7.5-9.5；
猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物，体积为7.5μL，每条引物浓度为0.1-0.5μM，每条探针的浓度为0.05-0.25μM；
待测样本，体积为5μL。
8.一种如权利要求1-3任一项所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物或权利要求4-7任一项所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒在制备猫冠状病毒和猫细小病毒检测产品中的用途。
9.一种非疾病诊断的猫冠状病毒和猫细小病毒检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测样本为模板，利用权利要求1-3任一项所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测引物探针组合物或权利要求4-7任一项所述的猫冠状病毒和猫细小病毒检测试剂盒，配制PCR扩增反应体系，进行荧光定量PCR检测。
10.根据权利要求9所述的非疾病诊断的猫冠状病毒和猫细小病毒检测方法，其特征在于，
将采集的样本加入样本采集液中处理，得到所述待测样本；
和/或，所述荧光定量PCR检测中，PCR扩增程序为：反转录，50℃保持300秒；预变性，95℃保持30秒；95℃变性5秒，60℃退火、延伸30秒，40个循环；
和/或，所述荧光定量PCR检测中，包括定性或定量检测方法；
所述定性方法为：第一组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为A通道；第二组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为C通道；第三组引物和探针中的探针的荧光基团所对应的通道为B通道；判定方法为：
若待测样本在A通道中Ct值≤39，B通道中Ct值＜39，C通道中Ct值≤39，则待测样本为猫冠状病毒和猫细小病毒双阳性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞39，B通道中Ct值＜39，C通道中无Ct值或Ct值＞39，则待测样本为猫冠状病毒和猫细小病毒双阴性；
若待测样本在A通道中Ct值≤39，B通道中Ct值＜39，C通道中无Ct值或Ct值＞39，则待测样本为猫冠状病毒阳性，猫细小病毒阴性；
若待测样本在A通道中无Ct值或Ct值＞39，B通道中Ct值＜39，C通道中Ct值≤39，则待测样本为猫冠状病毒阴性，猫细小病毒阳性；
若待测样本在A通道、B通道和C通道中均无Ct值，则进行重新测试；
且，若待测样本在A通道、B通道和C通道中任意一个的Ct值为35-39范围内时，则进行重复测试；若重复测试后，A通道、B通道和/或C通道的Ct值为35-39范围内，且具有明显指数增长期，则判定为A通道、B通道和/或C通道为阳性；
所述定量检测方法为：
建立标准曲线：将分别包含如SEQ ID NO.10～11所示的核苷酸序列的各标准品等浓度混合，将得到的混合标准品稀释至不同的浓度；以不同浓度的混合标准品作为模板，进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以混合标准品中各标准品的浓度为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
将待测样本的Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的定量结果。
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