CN112725475A - 一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用 - Google Patents

一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用 Download PDF

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应斌武
刘堂喻亨
赵珍珍
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

本发明提供了一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，所述结核分枝杆菌检测引物和探针组合物至少包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的第二引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的内对照引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针。本发明的引物和探针组合物能够保证结核分枝杆菌检测的高灵敏性和特异性，能够检测到低3copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性问题。

Description

一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及检测试剂技术领域，尤其是涉及一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用。
背景技术
现有的结核分枝杆菌检测方法通常是提取DNA后采用荧光定量PCR、环介导恒温扩增以及基因芯片的方法，还有WHO推荐的Xpert MTB/RIF检测方法，其检测灵敏度及特异性目前能够满足临床的需求，然而现有的结核分枝杆菌检测技术仍需要足够量的样本才能够保证检测的准确性，而在面对非呼吸道样本，如脑脊液、胸水、肺泡灌洗液、浓汁等以及含菌量少的标本时仍然无法解决其检测下限不够，灵敏度、特异性不足而出现假阴性的情况。
数字PCR技术是继第一代普通PCR和第二代荧光定量PCR之后的第三代核酸扩增与检测技术，是目前检测灵敏度最高的核酸检测与定量手段。数字PCR通过将反应液均匀分配到数万个独立的PCR反应单元进行扩增，再对阴、阳性反应单元进行分别计数及泊松分布统计分子，得出检测片段的绝对拷贝数与浓度信息等、该技术不借助Ct值比较，无需标准品和参考曲线，极大提高了检测的便利性与灵敏度。
数字PCR技术的检测步骤包括：反应液制备、液滴生成、核酸扩增、数据分析四个环节。首先，配制基于Taqman探针法的荧光PCR反应液，完整的荧光PCR反应液运用油包水技术，在微流控芯片进行微滴生成。生成的微滴在芯片完成后续的PCR扩增和多通道的荧光检测。最后，由系统配套的分析软件完成液滴的阴阳性判断，数据分析，输出每个荧光通道相应的阳性模板浓度、拷贝值等分析结果，以及一维、二维、三维图像。数字PCR技术具有如下优势：1、单分子PCR扩增，能够轻松实现核酸直接绝对定量；2、无需标准品，消除扩增效率对Ct值影响；3、高灵敏度，特别适合高灵敏度基因检测。因此，在临床诊断领域具有独特的优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用。本发明的引物和探针组合物对结核分枝杆菌的检测具有高灵敏性和特异性，能够检测到低3copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性。
本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，所述结核分枝杆菌检测引物和探针组合物至少包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针，
核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的第二引物对和核苷酸序列如SEQID NO.6所示的探针，以及
核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的内对照引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的探针。
根据一种优选实施方式，所述第一引物对包括：
F:5’-AGGTCGCCCGTCTACTTGG-3’(SEQ ID NO.1)；
R:5’-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3’(SEQ ID NO.2)；
与所述第一引物对对应的探针包括：
P：5’-ACGGTGCGTAAGTGG-3’(SEQ ID NO.3)。
根据一种优选实施方式，所述第二引物对包括：
F：5’-GGCGAACTCAAGGAGCACA-3’(SEQ ID NO.4)；
R：5’-CTCACGGTTCAGGGTTAGCC-3’(SEQ ID NO.5)；
与所述第二引物对对应的探针包括：
P：5’-CCACGCCGCCAAC-3’(SEQ ID NO.6)。
根据一种优选实施方式，所述内对照引物对包括：
F：5’-GCTTCTTGTGGAGCTCGACAA-3’(SEQ ID NO.7)；
R：5’-CCGTCAGCAACTTCGTTTTC-3’(SEQ ID NO.8)；
与所述内对照引物对对应的探针包括：
P：5’-CGCGACGGATCTACGTCACAGCG-3’(SEQ ID NO.9)。
根据一种优选实施方式，所述引物和探针组合物为针对结核分枝杆菌的插入序列IS6110的两个位点和内对照位点的引物和探针组合物。
根据一种优选实施方式，所述两个位点分别具有如SEQ ID NO.10和如SEQ IDNO.11所示的核苷酸序列；
所述内对照位点具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种结核分枝杆菌检测试剂盒，所述试剂盒包括前述的结核分枝杆菌检测引物和探针组合物。
根据一种优选实施方式，所述试剂盒的反应液包括中间组分5×ddPCR Mix和10×MTB-FRP。
根据一种优选实施方式，所述ddPCR Mix包括如下试剂：水、10×PCR缓冲液、dNTP以及Taq DNA聚合酶；
所述MTB-FRP包括如下试剂：水、50×ROX以及结核分枝杆菌检测用引物和探针。
本发明还提供了所述的结核分枝杆菌检测试剂盒在制备检测结核分枝杆菌的试剂中的应用。
基于上述技术方案，本发明的结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用至少具有如下技术效果：
本发明采用结核分枝杆菌检测引物和探针组合物的试剂盒是基于数字PCR平台的试剂盒，本发明所采用的引物和探针组合物能够保证结核分枝杆菌检测的高灵敏性和特异性，能够检测到低3copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是样品NC(阴性对照)的散点图；
图2为样品PC(阳性对照)的散点图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供了结核分枝杆菌检测引物和探针组合物。
引物和探针的设计：
1、查阅文献，查找MTB-IS6110序列，结合引物扩增效率和探针结合效率等因素，分别设计2个位点的特异引物和探针；同时设计1个内对照位点引物探针。
优选地，该结核分枝杆菌检测引物和探针组合物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的第二引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的内对照引物对和核苷酸序列如SEQID NO.9所示的探针。
本实施例的引物和探针组合物为针对结核分枝杆菌的插入序列IS6110的两个位点和内对照位点的引物和探针组合物，两个位点分别具有如SEQ ID NO.10和如SEQ IDNO.11所示的核苷酸序列；内对照位点具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。
如下表1所示，表1中给出了针对两个位点MTB1、MTB2以及内对照位点IC的引物和探针组合物。
表1引物和探针组合物
Figure BDA0002883171280000051
Figure BDA0002883171280000061
2、将各个扩增子序列在NCBI上进行BLAST比对分析，进一步确认引物探针(尤其是探针)的特异性，与人类基因组、常见病原菌与病毒等核酸序列有显著的差异。
3、分别设计用于验证引物探针性能的标准品。
实施例2
本实施例提供了采用实施例1的引物和探针组合物的试剂盒，设计3色4重数字PCR反应液，ROX荧光通道用于液滴定位，VIC通道作为内控通道，检测测数字PCR扩增；FAM通道为检测通道。
PCR反应液的配制如表2所示。
表2PCR反应液的组成
Figure BDA0002883171280000062
将反应条件设置为：98℃5min，【98℃15s，60℃30s】×40。
结果判定：
(1)阴性对照VIC≥100copies，且FAM通道＜3copies或无检出；
(2)阳性对照VIC≥100copies，且FAM通道≥3copies；
(3)临床样本VIC≥100copies；
(3.1)FAM通道＜3copies或无检出，为阴性；
(3.2)FAM通道≥3copies，为阳性。
检测结果如下：
1、标准品检测结果，如表3所示。
表3标准品检测结果
样品 浓度(VIC) 浓度(FAM)
NC(超纯水) 531.036 0
NC(超纯水) 580.128 0
PC 557.398 279.843
PC 539.93 253.885
2、散点图示例，见图1和图2，其中，图1为样品NC(阴性对照)的散点图，图2为样品PC(阳性对照)的散点图。从图1和图2可以看出，样品NC无假阳性，分区正常。
实施例3
本实施例对临床阳性样品进行检测，检测结果如表4所示。
表4临床阳性样品检测结果
Figure BDA0002883171280000071
Figure BDA0002883171280000081
从表4可以看出，阳性样品大致符合10倍稀释的关系。
实施例4
本发明还对引物和探针的特异性进行了检测，结果见表5。
表5特异性检测
Figure BDA0002883171280000082
从表5可以看出，本发明的引物和探针组合物特异性正常，与常见的呼吸道感染菌以及人的基因组无交叉反应。
实施例5
本实施例对实施例2所制备的试剂盒的最低检测限进行了测试。按照实施例2配制反应体系，然后在每个反应体系中分别设置3拷贝/反应体系、6拷贝/反应体系，按照相应的反应条件设置反应参数并进行结果分析，测试结果如表6所示。
表6最低检测限测试结果
Figure BDA0002883171280000083
Figure BDA0002883171280000091
从表6可以看出，本发明实施例所述试剂盒的最低检测限≥3copies/反应。避免了荧光定量可能出现的假阴性，保证了检测的高灵敏性。
本发明开发的针对结核分枝杆菌检测引物和探针组合物以及试剂盒，基于数字PCR平台进行检测，能够保证检测的高灵敏性和特异性，能够检测到低3copies/反应的阳性，避免了荧光定量可能出现的假阴性，同时，通过VIC通道作为内控通道；FAM通道为检测通道，避免了加样过程中可能造成的污染，在结核分枝杆菌临床诊断领域具有较好的应用前景。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用
<130> 2021.01.04
<141> 2021-01-04
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 1
aggtcgcccg tctacttgg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 2
gcggattctt cggtcgtg 18
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 3
acggtgcgta agtgg 15
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 4
ggcgaactca aggagcaca 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 5
ctcacggttc agggttagcc 20
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 6
ccacgccgcc aac 13
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 7
gcttcttgtg gagctcgaca a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 8
ccgtcagcaa cttcgttttc 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 9
cgcgacggat ctacgtcaca gcg 23
<210> 10
<211> 138
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 10
gattcggagt gggcagcgat cagtgaggtc gcccgtctac ttggtgttgg ctgcgcggag 60
acggtgcgta agtgggtgcg ccaggcgcag gtcgatgccg gcgcacggcc cgggaccacg 120
accgaagaat ccgctgag 138
<210> 11
<211> 207
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 11
cgatcgcccc atcgacctac tacgaccaca tcaaccggga gcccagccgc cgcgagctgc 60
gcgatggcga actcaaggag cacatcagcc gcgtccacgc cgccaactac ggtgtttacg 120
gtgcccgcaa agtgtggcta accctgaacc gtgagggcat cgaggtggcc agatgcaccg 180
tcgaacggct gatgaccaaa ctcggcc 207
<210> 12
<211> 887
<212> DNA
<213> 未知()
<400> 12
gacgtctgta aaatggcgtt gatgtggatc gactctatag aggcatctac gaggtctgtg 60
gccgcgtggt caaaagtgcg gctttcgtat ttgctgctcg tctatacttt cacaatcttg 120
acctgcacgg caaagagacg cttcttgtgg agctcgacaa cgcaacaacg cgacggatct 180
acgtcacagc gagtatagtg aaaacgaagt tgctgacggc ggaagcgaca tagggatctg 240
tcagttgtca ttcgcgaaaa acatccgtcc ccgaggggga cagtcactga cgcggttttg 300
catgtctggc tttagaattc agtatagtgc gctgatccga gtcgaattaa aaacaccagt 360
acccaaaacc aggcgggctc gccacgtcgg ctaatcctgg tacattttgt aaacaatgtt 420
ctgaagaaaa tttgtgaaag aaggacgggt catcgcctac taatagcaac aacgatcggc 480
cgcaccttcc attgtcgtgg cgatgcacga cagggtgcgt gtaccagaca accgatagca 540
cgctcggatt acacggcaaa ggtgcttgtg ttccgacagg ctagcatata atcctgaggc 600
gttaccccaa tcgttcaccg tcggatttgc tacagcctcc cattagtcgg cacaggtgga 660
tgtgttgcga tagcccgcta agatattcta aggcgtaacg cagatgaata ttctacagag 720
ttgccatagg cgttgaacgc ttcacggacg ataggaattt gcgtatagag cgggtcatcg 780
aagggttata cactcgtagt taacatctag cccggctcta tcagtacacc agtgccttga 840
atgacatact catcattaaa ctttctcaac agtcaaacga ccaagtg 887

Claims (10)

1.一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，其特征在于，所述结核分枝杆菌检测引物和探针组合物至少包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针，
核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的第二引物对和核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的探针，以及
核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的内对照引物对和核苷酸序列如SEQID NO.9所示的探针。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，其特征在于，所述第一引物对包括：
F:5’-AGGTCGCCCGTCTACTTGG-3’(SEQ ID NO.1)；
R:5’-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3’(SEQ ID NO.2)；
与所述第一引物对对应的探针包括：
P：5’-ACGGTGCGTAAGTGG-3’(SEQ ID NO.3)。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，其特征在于，所述第二引物对包括：
F：5’-GGCGAACTCAAGGAGCACA-3’(SEQ ID NO.4)；
R：5’-CTCACGGTTCAGGGTTAGCC-3’(SEQ ID NO.5)；
与所述第二引物对对应的探针包括：
P：5’-CCACGCCGCCAAC-3’(SEQ ID NO.6)。
4.根据权利要求1所述的结核分支杆菌检测用引物和探针组合物，其特征在于，所述内对照引物对包括：
F：5’-GCTTCTTGTGGAGCTCGACAA-3’(SEQ ID NO.7)；
R：5’-CCGTCAGCAACTTCGTTTTC-3’(SEQ ID NO.8)；
与所述内对照引物对对应的探针包括：
P：5’-CGCGACGGATCTACGTCACAGCG-3’(SEQ ID NO.9)。
5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，其特征在于，所述引物和探针组合物为针对结核分枝杆菌的插入序列IS6110的两个位点和内对照位点的引物和探针组合物。
6.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌检测引物和探针组合物，其特征在于，所述两个位点分别具有如SEQ ID NO.10和如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；所述内对照位点具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。
7.一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括前述权利要求1至6任一项所述的结核分枝杆菌检测引物和探针组合物。
8.根据权利要求7所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应液包括中间组分5×ddPCR Mix和10×MTB-FRP。
9.根据权利要求8所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述ddPCR Mix包括如下试剂：水、10×PCR缓冲液、dNTP以及Taq DNA聚合酶；
所述MTB-FRP包括如下试剂：水、50×ROX以及结核分枝杆菌检测引物和探针组合物。
10.如权利要求7至9任一项所述的结核分枝杆菌检测试剂盒在制备检测结核分枝杆菌的试剂中的应用。
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