CN117965773A - 检测结核分枝杆菌游离核酸的数字pcr试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供检测结核分枝杆菌游离核酸的数字PCR试剂盒,所述数字PCR试剂盒是同时检测结核分枝杆菌IS1081基因、IS6110基因和rpoB基因的多重数字PCR试剂盒。本发明试剂盒通过优化数字PCR扩增缓冲液和引物,达到通过游离核酸更好地检测结核分枝杆菌复合群各靶基因、实现多重检测的目的。
Description
技术领域
本发明涉及数字PCR检测领域,特别涉及检测结核分枝杆菌游离核酸的数字PCR试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染是目前严重危害人类健康的传染病之一,可累及全身多个组织器官引起慢性传染性疾病,以引起肺结核最为常见。根据世界卫生组织发布《2022年全球结核病报告》显示,2021年全球新发结核病患者1060万,中国新发结核病患者数为78万,在30个结核病高负担国家中,我国估算结核病发病数排第三位,占全球结核病例的7.4%。MTB的早期、快速、精准诊断是控制结核疫情的关键环节,但目前结核病的诊断还面临许多问题,据估计约有40%的结核病患者由于诊断率过低而未能及时确诊和报告,漏诊和漏报也较多。
目前结核病的诊断主要采用胸部影像学检查、涂片抗酸染色、结核痰培养或组织病理学检查等传统方法并结合患者症状进行诊断,但上述检测方法往往存在灵敏度差、特异性差或时效性差等缺点,难以满足早期精准诊断结核病的需求,如:结核病患者常见涂片阴性易漏检,涂片阳性但无法区分结核与非结核分枝杆菌易错检,结核培养通常需要4-6周周期较长,部分肺外结核的样本难以获取等。
随着分子生物学的飞速发展,越来越多基于分子生物学技术的诊断方法被应用于结核病临床诊断,结核病的诊断标准也指出结核分子生物学检查结果可作为结核病的诊断依据。现常用的分子生物学方法根据检测靶标的不同有:WHO推荐的GeneXpert MTB/RIF方法(靶标为rpoB基因)、其他已注册上市的基于荧光定量PCR(qPCR)或恒温扩增技术的检测方法(靶标通常为IS6110基因),检测灵敏度为1-100个菌/mL不等。分子生物学检测技术极大提高了结核检测的灵敏度与特异性,但仍然存在部分尚未解决的问题,如:大多数方法适用于包括痰液在内的呼吸道样本或组织样本,对不咳痰或难以获取符合要求的呼吸道样本患者(如儿童)具有局限性,对结核性胸膜炎等肺外结核病不适用。
以结核性胸膜炎为例,结核性胸膜炎是MTB及其代谢产物进入胸膜腔引起的胸膜炎症反应在肺外结核中占第二位,主要涉及待检样本为胸腔积液。胸腔积液为少菌体液样本,样本中查到抗酸杆菌的阳性率不足5%,分枝杆菌培养阳性率不到30%,有研究表明基于已有的分子生物学方法(如GeneXpert MTB/RIF)检测该样本类别的特异型虽好,但灵敏度不足。可能原因之一是此类体液样本中含结核菌量极少,容易低于检测方法的检测下限,该问题同样也出现在血液(血浆)、脑脊液等其他肺外结核常见待检样本。
游离核酸(cell-free DNA,cfDNA),于1948年首次在人类血液中被发现。cfDNA是存在于机体任何体液中的无细胞状态的DNA片段,即将死亡的人类细胞和微生物分解时将cfDNA释放入血液,随着血液循环进入体液的各个部分,可通过PCR或测序进行分析。当前,cfDNA广泛用于病原体检测、早期产前胎儿基因检测、卵巢囊肿、宫颈肿瘤、肝癌或肝相关寄生虫疾病等,且诊断价值较高;对于结核病诊断领域,应用结核cfDNA的临床研究仍相对较少,但已有研究表明人体血液、胸腔积液、脑脊液及尿液等众多体液中可检出结核cfDNA,故认为结核cfDNA检测在结核病诊断领域中具有广阔的应用前景。
数字PCR(digital PCR,dPCR)也被称为第三代PCR技术,是一种核酸分子定量技术,其核心思路是将模板分子稀释并平均分配到无数个独立反应腔室中,进行PCR扩增,通过PCR终点信号“有或无”来实现不依赖于标准曲线和参照样本的单分子绝对定量配。现有的dPCR主要以微孔或微液滴作为独立反应腔室。相比于qPCR,dPCR具有诸多优势:(1)定量结果更为灵敏、精准可靠;(2)善于在大量背景模版的干扰下对罕见模版进行检测;(3)对PCR抑制剂的抗性较强。有报道指出相比其他方法,dPCR技术在游离核酸的检测中优势尤为明显。
根据文献报道,Yang等人基于dPCR技术建立了一种针对肺结核或肺外结核患者的全血样本中肺结核分枝杆菌cfDNA的检测方法,dPCR相比qPCR法进一步提高了结核病的检出率。Shao等人对比了Xpert Ultra和结核cfDNA辅助诊断结核性脑膜炎的阳性率,结核cfDNA法优于Xpert Ultra,且远高于培养法。Che等人对比了针对结核性胸膜炎患者的胸腔积液样本不同结核检测方法的性能,结核cfDNA法的灵敏度远高于GeneXpert MTB/RIF法。上述研究报道均表明结核游离核酸检测在结核病诊断领域具有良好的临床应用价值,且搭配dPCR技术能更好的提高其检测性能。
鉴于目前临床中存在的结核病诊断局限性与临床应用的现实需求,因此我们亟需开发一种用于结核分枝杆菌游离核酸检测的数字PCR试剂盒。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供检测结核分枝杆菌游离核酸的数字PCR试剂盒,所述数字PCR试剂盒是同时检测结核分枝杆菌IS1081基因、IS6110基因和rpoB基因的多重数字PCR试剂盒,所述多重数字PCR试剂盒包括以下引物和探针:
序列名称 | 序列编号 | 序列信息 |
IS1081-F1 | SEQ ID No.7 | 5’-TGCTGCACTCCATCTACGACC-3’ |
IS1081-R1 | SEQ ID No.8 | 5’-TACCCGATCATATTGGGCAACA-3’ |
IS1081-P | SEQ ID No.1 | 5’-AGCCCGACGCCGAATCAGT-3’ |
IS6110-F1 | SEQ ID No.9 | 5’-AACTCAAGGAGCACATCAGCC-3’ |
IS6110-R1 | SEQ ID No.10 | 5’-CTTTGCGGGCACCGTAAACA-3’ |
IS6110-P | SEQ ID No.2 | 5’-CGTCCACGCCGCCAACTACGG-3’ |
rpoB-F1 | SEQ ID No.11 | 5’-GGCTGCTGCGTGCCATCTTC-3’ |
rpoB-R1 | SEQ ID No.12 | 5’-CCTTCAGCGAAGTGTCGCG-3’ |
rpoB-P | SEQ ID No.3 | 5’-CACCTCGCGGGCCTTCTCACC-3’ |
。
在一种实施方式中,所述数字PCR试剂盒还包括扩增缓冲体系,所述扩增缓冲体系包括Tris-HCl、甘油、dNTPs、KCl、MgCl2、Taq DNA聚合酶、UNG酶和甜菜碱,所述扩增缓冲体系中甜菜碱的浓度在0.5M至1.0M之间。
在一种实施方式中,所述扩增缓冲体系中甜菜碱的浓度在0.6M至0.8M之间。
在一种实施方式中,所述扩增缓冲体系中Taq DNA聚合酶的浓度在2.7-4.5U。
在一种实施方式中,所述扩增缓冲体系中Mg2+的浓度在4mM-8mM。
在一种实施方式中,所述扩增缓冲体系中引物工作浓度为400nM-800nM,探针工作浓度为200nM-400nM。
在一种实施方式中,所述扩增缓冲体系中甜菜碱终浓度为0.8M,Taq DNA聚合酶浓度为2.7U,镁离子浓度为6mM、引物浓度和探针浓度分别为600nM和300nM。
在一种实施方式中,所述试剂盒还包括用于质控的内标的引物和探针序列,所述内标的引物和探针序列如下:内标的上游引物SEQ ID No.4:5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATC-3’,内标的下游引物SEQ ID No.5:5’-GACAAACGGGCAACATACC-3’,和内标的探针SEQ ID No.6:5’CY5-CCACCTCGAACGGACTGATCACTG-3’。
在本发明中,扩增时引物序列位置决定扩增子的长度与扩增片段的二级结构,常规的基因组扩增需要对扩增子的二级结构进行控制以提高扩增效率,而游离核酸与基因组不完全相同,通常游离核酸的片段长度较短,因此对扩增子长度有限制,考虑到结核分枝杆菌基因组GC含量较高原因,扩增子过短时易产生二级结构从而影响扩增效率。
分析序列显示,结核分枝杆菌的全基因组GC含量较高(60%以上),本发明中所选择的核分枝杆菌IS1081基因、IS6110基因和rpoB基因各靶基因序列的GC含量也均大于60%,因此更容易产生二级结构,特别是在多重数字PCR中,IS1081基因、IS6110基因和rpoB基因之间互相影响,导致使用常规PCR反应液进行扩增时,扩增效果较差。同时因为本发明选择了3种结核靶基因,与IC体系合并进行了4重检测,以进一步提高对结核分枝杆菌核酸的检出率,并有效质控检测过程,但因GC含量高等原因各靶标间可能更易互相影响(如二级结构等)导致检测效能的下降。
在本发明中优选了一组多重数字PCR扩增的引物组,对于本发明的游离核酸该引物组合扩增效率最高,同时非特异扩增少,信噪比最佳。为了进一步优化本发明扩增体系,提高对游离核酸检测的灵敏度和扩增效率,本发明优化了甜菜碱浓度,在甜菜碱添加终浓度为0.6-0.8M时,液滴数均稳定,结核三个靶标的检测值稳定和扩增效率高。另外,本发明还优化了体系中Taq DNA聚合酶浓度、镁离子和引物探针工作浓度。通过对本发明体系的优化,本发明检测结核分枝杆菌游离核酸的数字PCR试剂盒与对比qPCR试剂相比,线性曲线显示理论检测值与实际检测值的线性关系中,本发明显示出检测结核游离核酸时具有更高的分析灵敏度。本发明试剂盒通过优化数字PCR扩增缓冲液和引物,达到更好地检测结核分枝杆菌复合群各靶基因、实现多重检测的目的。
附图说明
图1为本发明扩增体系中0-2.0M甜菜碱不同靶标的扩增拷贝数结果图;
图2为本发明扩增体系中0.6-0.9M甜菜碱不同靶标的扩增拷贝数结果图;
图3为本发明试剂盒检测IS6110的线性结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
实施例一.结核分枝杆菌游离核酸检测引物组合筛选优化
结核分支杆菌属于高GC含量菌,以结核标准菌株H37Rv为例,其全基因组的G+C含量为65.6%,因此引物或探针设计时需要特别考虑序列的高级结构。首先从NCBI上下载结核分枝杆菌相关靶基因序列进行分析,并使用软件设计相应靶标的荧光检测探针,各靶基因分析结果如下:
靶基因 | 序列长度 | 序列GC含量 | Genbank ID |
IS1081 | 1248bp | 66.43% | NC_000962.3 |
IS6110 | 1360bp | 64.04% | X17348.1 |
rpoB | 3519bp | 64.34% | NC_000962.3 |
此外本试剂盒中包含用于质控的内标(IC)检测体系,IC为完全人工合成序列,与结核分枝杆菌的基因序列无同源性,上述本试剂盒的靶基因探针和IC检测体系的引物和探针序列如下:
表1.
序列名称 | 序号 | |
IS1081探针 | SEQ ID No.1 | 5’FAM-AGCCCGACGCCGAATCAGT-3’BHQ1 |
IS6110探针 | SEQ ID No.2 | 5’HEX-CGTCCACGCCGCCAACTACGG-3’BHQ1 |
rpoB探针 | SEQ ID No.3 | 5’ROX-CACCTCGCGGGCCTTCTCACC-3’BHQ2 |
IC上游引物 | SEQ ID No.4 | 5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATC-3’ |
IC下游引物 | SEQ ID No.5 | 5’-GACAAACGGGCAACATACC-3’ |
IC探针 | SEQ ID No.6 | 5’CY5-CCACCTCGAACGGACTGATCACTG-3’BHQ2 |
1.扩增时引物序列位置决定扩增子的长度与扩增片段的二级结构,常规的基因组扩增需要对扩增子的二级结构进行控制以提高扩增效率,而游离核酸与基因组不完全相同,通常游离核酸的片段长度较短,因此对扩增子长度有限制,考虑到结核分枝杆菌基因组GC含量较高原因,扩增子过短时易产生二级结构从而影响扩增效率。本发明中对检测结核游离核酸的引物组进行了筛选优化,进一步提高检测时的拷贝数,以达到实现对结核游离核酸灵敏检测的目的。引物组序列信息见下表2,检测所使用的探针及内标引物探针见表1,引物工作浓度为600nM,探针工作浓度为300nM,配制成10×引物探针(组1、组2、组3、组4)备用(表3)。
表2.
表3
10×引物探针(组1-4) | 物料浓度 | 工作浓度 | 每测试加入量(μl) |
IS1081-上游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
IS1081-下游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
IS6110-上游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
IS6110-下游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
rpoB-上游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
rpoB-下游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
IC-上游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
IC-下游引物 | 100μM | 6μM | 0.18 |
IS1081探针 | 100μM | 3μM | 0.09 |
IS6110探针 | 100μM | 3μM | 0.09 |
rpoB探针 | 100μM | 3μM | 0.09 |
IC探针 | 100μM | 3μM | 0.09 |
超纯水 | - | - | 补至3μl |
2.根据下表4配制数字PCR的反应体系(30μl/测试):
表4.
选择1例经确认临床结核阳性的胸腔积液样本提取的游离核酸做扩增模板。
3.数字PCR工作流程
(1)微液滴制备:使用液滴生成芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)和样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司),在液滴生成芯片样品孔中加入30μL PCR反应体系,油孔中加入160μL液滴生成油,将芯片和8联排管放入制备仪,盖上胶垫,进行微液滴制备。
(2)PCR扩增:将含有微液滴的8联排管放到PCR仪上进行扩增,扩增程序设定如下表所示:
(3)微液滴检测:PCR完毕后,将8联排管和液滴检测芯片(新羿制造科技(北京)有限公司)放入卡具中,在油孔分别加入430μL和500μL检测油,盖上胶垫,将芯片放入芯片分析仪(新羿制造科技(北京)有限公司)进行液滴检测。
(4)数据分析:通过液滴生成芯片和样本制备仪制备的上万个微液滴每个都是一个独立的PCR反应器,大部分微液滴不含待测目标基因或者含有至少一个待测目标基因,经过PCR扩增后,通过芯片分析仪对每个微液滴进行FAM/HEX/ROX/Cy5/Cy5.5荧光信号检测,记录微液滴信号的峰值高度,含有待测目标基因的液滴将被检测出相应的荧光信号。通过荧光分类阈值将微液滴内的荧光强度数字化,具有较强荧光的微液滴判读为“1”(阳性),具有较弱荧光的微液滴判读为“0”(阴性),统计“1”和“0”的个数,并通过泊松分布模型校正,可计算出投入模板中FAM/HEX/ROX/Cy5/Cy5.5标记的靶基因的检测值。
本试剂盒中主要涉及4个目标基因:
靶标 | 荧光标记 |
IS1081 | FAM |
IS6110 | HEX |
rpoB | ROX |
IC | CY5 |
4.本实验中不同引物组进行3次重复测试,统计检测值,荧光信号值、信噪比,以此评估每组引物的定量值、稳定性和扩增效率。检测值如下表5所示,荧光值统计如表6所示。组1至组4游离核酸的检测均值依次降低,变异系数依次变大,荧光信号值、信噪比依次降低,在相同的扩增条件下,各个扩增的背景值类似,检测值和荧光信号值可以直接反映各个引物扩增效率的高低,检测值和荧光值越高,扩增效率越高;从以上实施例分析,组1的引物组合扩增效率最高,同时非特异扩增少,因此信噪比最佳,因此组1引物探针组合相较于其他三组对结核游离核酸的检测性能更好。
表5
表6
实施例二.体系中甜菜碱终浓度优化
根据已报道研究,PCR反应体系中的甜菜碱能降低二级结构的DNA的变性温度,促进其结构打开,提高引物探针与模板的结合效率,提高GC含量体系的扩增效率,因此,本发明中对体系内的甜菜碱添加浓度进行了优化,使用结分枝杆菌株H37RV提取后的核酸做扩增模板,分别选择了甜菜碱添加浓度为:0M、0.5M、1.0M、1.5M和2.0M的体系,以进一步提高对核酸的检测灵敏度。所用的基础扩增体系为筛选后的包含第一组引物探针的扩增体系,配制方法详见下表7,实验操作步骤同上,评价指标为靶标检测值与液滴数。
表7.
物料名称 | 物料浓度 | 工作浓度 | 每测试加入量(μl) |
Tris-HCl | 1M | 0.05M | 1.5 |
甘油 | 100% | 4% | 1.2 |
dNTPs | 75× | 1× | 0.4 |
KCl | 1M | 0.01M | 0.3 |
MgCl2 | 1M | 0.002M | 0.06 |
Taq DNA聚合酶 | 5U/μL | 0.09U/μL | 0.54 |
UNG酶 | 1U/μL | 0.01U/μL | 0.3 |
10×引物探针(组1) | 10× | 1× | 3.0 |
模板 | - | - | 1.0 |
甜菜碱 | 5M | 0、0.5、1.0、1.5、2.0M | 0、3、6、9、12 |
超纯水 | - | - | 补至30μl |
结果如下表8和图1所示,表明当甜菜碱添加终浓度至0.5M时,反应体系正常扩增且浓度相比不添加甜菜碱时拷贝数有所增加,扩增效率增加,甜菜碱添加到1.5M时,除内标(CY5)外的结核三个靶标(FAM、HEX、ROX)拷贝数均略低于1.0M,扩增效率下降,同时出现液滴数的显著下降,说明此时液滴稳定性受到甜菜碱添加的影响。因此甜菜碱的添加浓度应在0.5M至1.0M之间,应低于1.5M。
表8
以体系1为基础,进一步优化甜菜碱浓度,配制体系6-9,甜菜碱的终浓度分别为0.6、0.7、0.8、0.9M,使用结分枝杆菌株H37RV提取后的核酸做扩增模板,检测步骤同上,检测结果如下表9和图2所示,甜菜碱添加终浓度在0.6-0.9M,液滴数均比较稳定,在甜菜碱添加终浓度为0.6-0.8M时,上述结核三个靶标的检测值稳定,液滴数均稳定,扩增效率高。
表9.
实施例三.体系中Taq DNA聚合酶浓度优化
数字PCR技术是基于荧光信号终点检测,本发明中通过进一步优化体系中Taq DNA聚合酶的浓度以提高检测值和荧光信号的信噪比。以体系8为基础(引物探针组1、甜菜碱终浓度为0.8M),配制体系10-13,调整体系内Taq DNA聚合酶浓度,使用结分枝杆菌株H37RV提取后的核酸做扩增模板,检测步骤同上,评价指标为靶标检测值与荧光信噪比。
检测结果如下表10、表11所示,当Taq DNA聚合酶量从1.8U提高至2.7U时,体系内各靶标(IS1081、IS6110、rpoB、IC)的检测拷贝数相当,但信噪比均有提高(IS1081,7.8-10.2;IS6110,6.7-8.5;rpoB,6.8-8.9;IC,3.2-4.2),进一步将Taq DNA聚合酶浓度增加至3.6U和4.5U,检测拷贝数和信噪比均没有显著变化或提高,因此体系内的聚合酶浓度可为2.7-4.5U较佳。
表10.
表11.
实施例四体系中MgCl2浓度优化
PCR反应体系中的增加MgCl2(镁离子,Mg2+)可促进DNA聚合酶的活性,稳定DNA的双链结构,从而使扩增更加高效、稳定和可靠。PCR反应需在合适的镁离子浓度下进行,过低扩增效率会下降,过高会抑制扩增或降低反应特异性。因此,本发明中对体系内的镁离子添加浓度进行了优化,使用结分枝杆菌标准株H37RV提取后的核酸做扩增模板,分别选择了镁离子添加浓度为:2mM、4mM、6mM、8mM和10mM的体系,以进一步提高体系的检测灵敏度。以体系11为基础(引物探针组1、甜菜碱终浓度为0.8M,Taq DNA聚合酶浓度为2.7U)配制体系14-18,实验操作步骤同上。
检测结果如下表12、表13所示,评价指标为靶标检测值与信噪比,当体系镁离子浓度为2mM-8mM时,各靶标检测值符合预期,当镁离子浓度为10mM时,各靶标值相比其他组均有下降。当镁离子浓度从2mM提升至4mM时各靶标信噪比有显著提高(IS1081,6.4-10;IS6110,6.0-8.9;rpoB,6.2-9.0;IC,2.9-4.2),镁离子浓度在4mM-10mM时各靶标信噪比无显著变化,因此体系内镁离子的浓度为4mM-8mM时较佳。
表12.
表13.
实施例五.体系中引物探针浓度优化
数字PCR为终点法检测,引物探针的浓度可能会略有区别于常规荧光定量PCR,合适的引物探针浓度才能使反应体系达到最佳检测性能。因此,本发明中对体系内的引物探针工作浓度进行了优化,使用结分枝杆菌标准株H37RV提取后的核酸做扩增模板,引物工作浓度分别为200nM、400nM、600nM和800nM,对应探针工作浓度分别100nM、200nM、300nM和400nM,以进一步提高体系的检测性能。以体系16为基础(引物探针组1、甜菜碱终浓度为0.8M,Taq DNA聚合酶浓度为2.7U,镁离子浓度为6mM)配制体系19-22,实验操作步骤同上。
检测结果如下表14、表15所示,评价指标为靶标检测值与信噪比,当体系引物/探针工作浓度从200/100nM提高至400/200nM时,各靶标检测值提高且符合预期,当工作浓度继续提高至800/400nM时,各靶标检测值无显著变化。当体系引物/探针工作浓度从200/100nM提高至400/200nM时,各靶标信噪比有显著提高(IS1081,6.3-10.2;IS6110,5.9-8.8;rpoB,6.1-8.9;IC,2.9-4.0),当工作浓度继续提高至800/400nM时各靶标信噪比无显著变化,因此体系内引物/探针工作浓度为400/200nM–800/400nM时较佳。
表14.
表15.
实施例六.分析灵敏度测试与比较
使用一例已使用数字PCR定值临床结核阳性的胸腔积液样本,以IS6110拷贝数为标准进行2倍梯度稀释(因IS6110拷贝数最高),IS6110的理论拷贝数分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563拷贝/微升,为S1-S7梯度。分别使用本试剂盒与某商业化qPCR法检测试剂盒进行分析灵敏度比较,每个梯度重复两次,用于分析灵敏度的预估。配置体系23(引物探针组1)、体系24(引物探针组2)、体系25(引物探针组3)、体系26(引物探针组4),体系23-26反应内其他组分均按照甜菜碱终浓度为0.8M,Taq DNA聚合酶浓度为2.7U,镁离子浓度为6mM、引物探针浓度为600/300nM进行配置,检测样本为定值样本核酸,模板上样量均为17.5uL,实验操作步骤同上。
检测结果如下表16-17、图3所示,以检出率为标准,体系23-26分别可检测到S7、S6、S5、S5浓度,对比qPCR试剂可检测至S6浓度。体系23-26线性曲线显示理论检测值与实际检测值的线性关系好,R2均大于0.95。由此结果显示本发明中体系23在检测结核游离核酸时的分析灵敏度更具有优势。
表16.
/>
表17.
/>
为进一步验证体系23-26的分析灵敏度性能,根据第一轮分析灵敏度预估验证结果,使用相同的一例已使用数字PCR定值临床结核阳性的胸腔积液样本,体系23选择S6-S8浓度,即理论拷贝数分别为0.3125、0.1563、0.0781拷贝/微升;体系24选择S5-S7,即理论拷贝数分别为0.625、0.3125、0.1563;体系25和26均选择S4-S5,即理论拷贝数分别为1.25、0.625、0.3125,同时使用某商业化qPCR法检测试剂盒选择S6-S8进行分析灵敏度比较,每个梯度重复十次,用于分析灵敏度的验证。实验操作步骤同上。
检测结果如下表18所示,以≥90%检出率为标准,本发明中体系23可检测到S7浓度,体系24可检测到S6,而体系25可检测到S5,体系26可检测到S4(检出率≥90%),对比qPCR试剂可检测至S6浓度(检出率≥90%)。经验证本发明体系23显示出检测结核游离核酸时更高的分析灵敏度。
表18.
/>
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (8)
1.检测结核分枝杆菌游离核酸的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述数字PCR试剂盒是同时检测结核分枝杆菌IS1081基因、IS6110基因和rpoB基因的多重数字PCR试剂盒,所述多重数字PCR试剂盒包括以下引物和探针:
2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述数字PCR试剂盒还包括扩增缓冲体系,所述扩增缓冲体系包括Tris-HCl、甘油、dNTPs、KCl、MgCl2、Taq DNA聚合酶、UNG酶和甜菜碱,所述扩增缓冲体系中甜菜碱的浓度在0.5M至1.0M之间。
3.根据权利要求2所述的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述扩增缓冲体系中甜菜碱的浓度在0.6M至0.8M之间。
4.根据权利要求2所述的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述扩增缓冲体系中TaqDNA聚合酶的浓度在2.7-4.5U。
5.根据权利要求2所述的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述扩增缓冲体系中Mg2+的浓度在4mM-8mM。
6.根据权利要求2所述的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述扩增缓冲体系中引物工作浓度为400nM-800nM,探针工作浓度为200nM-400nM。
7.根据权利要求6所述的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述扩增缓冲体系中甜菜碱终浓度为0.8M,Taq DNA聚合酶浓度为2.7U,镁离子浓度为6mM、引物浓度和探针浓度分别为600nM和300nM。
8.根据权利要求1-7任一所述的数字PCR试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于质控的内标的引物和探针序列,所述内标的引物和探针序列如下:内标的上游引物SEQ IDNo.4:5’-GTGTCTGCGGCGTTTTATC-3’,内标的下游引物SEQ ID No.5:5’-GACAAACGGGCAACATACC-3’,和内标的探针SEQ ID No.6:5’CY5-CCACCTCGAACGGACTGATCACTG-3’。
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