CN108950019A - 肝簇虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法 - Google Patents

肝簇虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法 Download PDF

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Abstract

一种肝簇虫的Real‑time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法，以肝簇虫的18s rRNA基因作为目标基因，该序列高度保守，PCR容易扩增，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，针对Hepatozoon spp.的18s rRNA为靶基因的特异性区域，结合其它孢子虫18srRNA基因的相关信息，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法，患病犬血液提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，该方法可用于肝簇虫病快速检测，应用前景广阔，可以准确、快速的判断牛是否感染了肝簇虫。

Description

肝簇虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与 检测方法
技术领域
本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种肝簇虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与Real-time PCR检测方法。
背景技术
犬肝簇虫是一种胞子虫，在犬体内是无性繁殖，在蜱体内是有性繁殖。该虫普遍分布于非洲、南欧、中东和亚洲，其宿主范围也较广泛，各种脊椎动物均可被感染。犬感染肝簇虫后，一般表现为厌食、消瘦、精神不振、偶有呕吐和腹泻等胃肠道症状；有时步履不稳，步态异常；眼部出现大量黏性分泌物；体重减轻，黏膜苍白，触诊有疼痛反应，偶有皮下出血，牙龈出血和腹部紫癜；当感染严重时机体发热，裂殖体侵害脏器时，相应功能遭到破坏；如侵害肾时，犬出现多尿及烦渴。肝簇虫不仅影响动物的健康及正常活动，而且感染严重时可造成动物死亡，因而引起国内学者的广泛关注。目前我国仅报道家犬感染犬肝簇虫，而对其他犬科、猫科动物的感染情况尚缺乏研究。犬肝簇虫是一种原虫，犬肝簇虫不是通过蜱叮咬传播,而是当犬摄入被犬肝簇虫感染的血红扇头蜱传播。在犬肝簇虫的生活上，蜱是其终极宿主，犬是中间宿主。该虫主要寄生于血液中的中性粒细胞、内脏器官及骨髓。可出现血小板减少贫血，血清肌 酸激酶（CK）、碱性磷酸酶（ALP）浓度增高。嗜中性粒细胞数量随着寄生虫血症水平 波 动。随着病情的发展，裂殖体寄生于内脏及骨髓，引起器官炎症，发生骨髓炎，影响机体的造血功能。对肝簇虫的检测主要有病原学检测、免疫学检测、分子检测三种方法。肝簇虫病的病原学检测手段主要集中于血涂片及肌肉切片镜检两种方式，但是血涂片和肌肉切片镜检效率较低，不能作为一种可信的检测手段。免疫学检测主要是间接ELISA方法，但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过，不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。PCR技术是现有应用最广、可用来确诊肝簇虫病的方法 之一，常规PCR检测技术具有很大的一个缺点，低特异性，扩增时容易产生假阳性，而且在检测肝簇虫的过程中发现，肝簇虫与其它孢子虫之间会出现交叉反应。
Real-time PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR过程，与常规PCR相比，具有特异性更强、敏感性更高、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点。因其需要的取样量少、快速简便等优点，实时荧光PCR检测技术已广泛应用于病原体检测。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种肝簇虫的TaqMan-BHQ
Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与TaqMan-BHQ Real-time PCR检测方法，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法。该方法可用于肝簇虫病快速检测，应用前景广阔。
本发明采用的技术解决方案是：一种肝簇虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR特异性引物和探针，包括设计的引物F、引物R和探针P，所述的引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成DNA片段，具体为：
引物F：5’-TGA-AAA-CAG-GCG-ATA-AAT-CAT-T -3’；
引物R：5’- ACT-GCC-ACG-GTA-AGC-CAA-T-3’；
探针P：5’-FAM-AGT-TTC-TGA-CCT-ATC-AGC-TTT-CGA-CGG-T-BHQ-3’。
一种肝簇虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR检测试剂盒，所述的 TaqMan-
BHQ Real-time PCR检测试剂盒包括以下组分：
(一)Real-time PCR预混液：主要成分为2×TaqMan Universal Master Mix；
(二)权利要求1所述的引物F、引物R和探针P；
(三)阳性对照：所述的阳性对照为该对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质
粒含肝簇虫210bp基因片段；
(四)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；
所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUC57转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴
定及测序后获得阳性重组质粒。
一种采用所述的特异性引物和探针的肝簇虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）被检标本DNA提取：参照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA（天根生化科技（北京）有限公司，北京）。提取的DNA干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙,二胺四乙酸(Tris-EDTA TE)溶解，-20℃保存备用；
(2)以特异性引物和探针进行Real-time PCR反应操作：将2×TaqMan UniversalMaster Mix 12.5μL；25pmol/μL的引物F 1.0μL；25pmol/μL的引物R 1.0μL；12.5pmol/μL的探针P 1.0μL；DNA模板3.0μL；ddH 2O 6.5μL，混匀后稍离心在25μL反应体系中进行荧光PCR反应操作；
(3)pUC-18s rRNA质粒Real-time PCR标准曲线制作：测定质粒D 260nm 值和D 280nm值，用D 260nm /D 280nm 值为1.8～2.0的质粒用于制作标准曲线；
(4)检测患病犬携带的肝簇虫18s rRNA基因：运行本发明中的反应参数，检出患病犬血液DNA中含有肝簇虫18s rRNA基因，通过计算机利用分析软件得到Real-time PCR扩增曲线，与阳性对照的扩增曲线比对，判断是否存在肝簇虫18srRNA基因。
所述的反应参数为UNG酶消除残留污染处理为50℃，15mins；预变性处理为95℃，
2mins；50个循环：变性处理95℃，15s，退火/收集荧光信号处理49℃，20s，延伸 20s。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种肝簇虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与TaqMan-BHQ Real-time PCR检测方法，具体为一种肝簇虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与TaqMan-BHQ Real-time PCR检测方法，以肝簇虫的18s rRNA基因作为目标基因，该序列高度保守，PCR容易扩增，GenBank 数据库中相关序列信息丰富，根据TaqMan实时荧光PCR的基本原理，针对 Hepatozoon spp.的18s rRNA为靶基因的特异性区域，结合其它肝簇虫18s rRNA 基因的相关信息，设计2条特异性引物和1条探针，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法，犬的血液提取的微量基因组DNA 即可作为模板进行鉴定，该方法可用于肝簇虫病快速检测，应用前景广阔，可以准确、快速的判断犬是否感染了肝簇虫。
附图说明
图1为本发明方法对Hepatozoon spp.pUC-18s rRNA质粒进行Real-time PCR敏感性检测的扩增曲线图；其中1为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X10 5 拷贝/μL；2为pUC-18srRNA质粒标准品浓度2X104 拷贝/μL；3为pUC-18s rRNA 质粒标准品浓度2X103 拷贝/μL；4为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X102 拷贝/μL；5为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X101拷贝/μL；6为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X100 拷贝/μL；7为阴性对照。
图2为Hepatozoon spp.pUC-18s rRNA质粒常规PCR的敏感性检测凝胶电泳图；其中1为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X105 拷贝/μL；2为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X104 拷贝/μL；3为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X103 拷贝/μL；4为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X102 拷贝/μL；5为pUC-18s rRNA质粒标准品浓度2X101 拷贝/μL；6为pUC-18srRNA质粒标准品浓度 2X10 0 拷贝/μL；7为阴性对照。
图3为本发明方法对Hepatozoon spp. pUC-18s rRNA质粒进行Real-time PCR扩增建立的标准曲线。
图4为本发明方法对患病犬血液DNA检测Hepatozoon spp. 18s rRNA的Real-timePCR扩增曲线；其中1为阳性对照；2，3为Hepatozoon spp. 18s rRNA；4为阴性对照。
具体实施方式
本发明提供一种肝簇虫的Real-time PCR检测方法，通过以下技术方案实现：
设置Real-time PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：
(1)Real-time PCR反应液：主要成分是2×TaqMan Universal Master Mi；
(2)引物和探针：应用Primer Express3.0.1软件设计Hepatozoon spp.18s rRNA(GenBank accession numbers，LC331053，MG917714和MF797806)特异性引物和探针，引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的DNA片段：
引物F：5’-TGA-AAA-CAG-GCG-ATA-AAT-CAT-T -3’；
引物R：5’- ACT-GCC-ACG-GTA-AGC-CAA-T-3’；
探针P：5’-FAM-AGT-TTC-TGA-CCT-ATC-AGC-TTT-CGA-CGG-T-BHQ-3’；
(3)阳性对照：该对照为含有目的基因片段的重组质粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司构建。其方法是：将扩增产物克隆至pUC57转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，命名为pUC-18s rRNA，该质粒含肝簇虫76bp基因片段；
(4)阴性对照，该对照为去离子水(ddH2O)。
操作程序：
(1)被检标本DNA提取：参照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA（天根生化科技（北京）有限公司，北京）。提取的DNA干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙,二胺四乙酸(Tris-EDTA TE)溶解，-20℃保存备用。
(2)25µL Real-time PCR反应体系：
将2×TaqMan Universal Master Mix 12.5μL；25pmol/μL的引物F 1.0μL；25pmol/μL的引物R 1.0μL；12.5pmol/μL的探针P 1.0μL；DNA模板3.0μL；ddH 2O 6.5μL，混匀后稍离心在25μL反应体系中进行荧光PCR反应操作；
混匀后稍微低速离心。
(3)Real-time PCR反应参数：
所述的反应参数为UNG酶消除残留污染处理为50℃，15mins；预变性处理为95℃，
2mins；50个循环：变性处理95℃，15s，退火/收集荧光信号处理49℃，20s，延伸 20s。
(4)pUC-18s rRNA质粒Real-time PCR标准曲线制作
测定质粒D 260nm 值和D 280nm 值，D 260nm /D 280nm 值在1.8～2.0的质粒用于制作标准曲线。
根据D 260nm 值计算质粒浓度，并换算成拷贝数，以去离子水10倍系列稀释成6个梯度(2X10 5 - 2X10 0拷贝/µL)，以此为模板，建立25µL Real-time PCR反应体系，根据优化的反应参数，在荧光PCR仪上扩增。反应结束后，计算机利用分析软件得到标准曲线。本发明中，荧光PCR仪自带软件分析显示，扩增效率Efficiency＝99.23％、相关系数 R 2 ＝0.999，表明Ct值与标准品之间存在良好线性关系，y＝-4.105x+13.645。
(5)pUC-18s rRNA质粒Real-time PCR敏感性检测
将pUC-18s rRNA质粒标准品浓度分别为2X10 5 、2X10 4 、2X10 3 、2X10 2 、2X101 、2X100拷贝/µL作为模版，分别进行常规PCR和Real-time PCR，比较这2种检测方法的敏感性。结果显示，Real-time PCR的最低检测浓度为2X100 拷贝/µL；常规PCR的最低检测浓度为2X103 拷贝/µL，表明Real-time PCR的检测灵敏度比常规PCR高1000倍。
(6)检测患病犬携带的肝簇虫18srRNA基因
使用本发明中组装的试剂盒，以患病犬的血液DNA作为被检样品，以pUC-18s rRNA质粒为阳性对照，ddH2O为阴性对照，运行本发明中的反应参数，通过计算机分析软件得到Real-time PCR扩增曲线，与阳性对照的PCR扩增曲线比对，判断是否存在肝簇虫18s rRNA基因。如图4所示。
相对于目前对于肝簇虫的鉴定方法，常规PCR检测方法也有诸多报道，但本发明建立了更为敏感的Real-time PCR方法。宠物犬的血液提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定。
目前血涂片镜检技术仍是诊断肝簇虫病最合适的方法，但该方法不能应用于外周血内寄生虫含量很低的动物以及感染耐过后带虫动物的检测。而采集宠物犬体表寄生的蜱，通过提取蜱DNA，利用设计的肝簇虫引物和探针扩增目的基因，可以准确、快速的判断犬是否感染了肝簇虫。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 潍坊德诺泰克生物科技有限公司
<120> 肝簇虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaaaacagg cgataatcat t 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actgccacgg taagccaat 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtttctgac ctatcagctt tcgacggt 28
<210> 4
<211> 76
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
tgaaaacagg cgataaatca ttcaagtttc tgacctatca gctttcgacg gtatggtatt 60
ggcttaccgt ggcagt 76

Claims (5)

1.一种肝簇虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR特异性引物和探针，包括设计的引物F、引物R和探针P，所述的引物F、引物R和探针P分别是按下述碱基序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成DNA片段，具体为：
引物F：5’-TGA-AAA-CAG-GCG-ATA-AAT-CAT-T -3’；
引物R：5’- ACT-GCC-ACG-GTA-AGC-CAA-T-3’；
探针P：5’-FAM-AGT-TTC-TGA-CCT-ATC-AGC-TTT-CGA-CGG-T-BHQ-3’。
2.一种肝簇虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR检测试剂盒，所述的 TaqMan-BHQ Real-time PCR检测试剂盒包括以下组分：
①Real-time PCR预混液：主要成分为2×TaqMan Universal Master Mix；
②权利要求1所述的引物F、引物R和探针P；
③阳性对照：所述的阳性对照为该对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含肝簇虫76bp基因片段；
④阴性对照：所述的阴性对照为去离子水。
3.所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUC57转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒。
4.一种采用所述的特异性引物和探针的肝簇虫的TaqMan-BHQ Real-time PCR检测方法，包括以下步骤：
①被检标本DNA提取：参照全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA（天根生化科技有限公司，北京），提取的DNA干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA TE)溶解，-20℃保存备用；
②以特异性引物和探针进行Real-time PCR反应操作：将2×TaqMan UniversalMaster Mix 12.5μL；25pmol/μL的引物F 1.0μL；25pmol/μL的引物R 1.0μL；12.5pmol/μL的探针P 1.0μL；DNA模板3.0μL；ddH2O 6.5μL混匀（共25μL反应体系）后离心，进行荧光PCR反应操作；
③pUC-18s rRNA质粒Real-time PCR标准曲线制作：测定质粒D 260nm 值和D 280nm值，用D 260nm /D 280nm 值为1.8～2.0的质粒用于制作标准曲线；
④检测患病犬携带的肝簇虫18s rRNA基因：运行本发明中的反应参数，检出患病犬血液DNA中含有肝簇虫18s rRNA基因，通过计算机利用分析软件得到Real-time PCR扩增曲线，与阳性对照的扩增曲线比对，判断是否存在肝簇虫18srRNA基因。
5.所述的反应参数如下：UNG酶消除残留污染50℃，15mins；预变性95℃，2mins；50个循环：变性95℃，15s，退火49℃，20s，延伸并收集荧光信号20s。
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