CN102230013B

CN102230013B - 检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒

Info

Publication number: CN102230013B
Application number: CN 201110167591
Authority: CN
Inventors: 赵飞; 张建中
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2031-06-21
Also published as: CN102230013A

Abstract

本发明通过对肺炎支原体基因测序和比对，提供了用于检测肺炎支原体的遗传标记物、实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，本发明还提供了对肺炎支原体进行定量检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。

Description

检测肺炎支原体的靶序列、引物和探针及其试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测肺炎支原体的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行肺炎支原体检测的方法和试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是引起呼吸道感染的重要致病菌之一，10％～40％的社区获得性肺炎是由肺炎支原体感染引起的。目前国内临床对于肺炎支原体的检测技术有限，造成了抗生素的滥用，增加了医疗负担。由于肺炎支原体分离培养技术复杂且耗时，其检测技术主要依靠血清学检测和核酸检测。近些年出现的荧光PCR检测技术凭借其快捷，高灵敏度和特异度的优势，越来越广泛的应用于临床肺炎支原体感染检测。国外已报道多种肺炎支原体荧光PCR检测体系，检测灵敏度和特异度均已经超过血清学检测技术，荧光PCR检测技术逐渐成为临床肺炎支原体检测的“金标准”。针对肺炎支原体检测的荧光PCR技术主要以TaqMan探针检测体系为主，方法灵敏度高，特异度好。目前报道的检测肺炎支原体的荧光PCR检测的基因主要有ATPase operon gene，RepMP1和CARDStoxin gene，其检测灵敏度在几十CFU到几个CFU之间。(参考文献①Daxboeck，F.，G. Khanakah，C.Bauer，M.Stadler，H.Hofmann，and G.Stanek.2005.Detection of Mycoplasma pneumoniae in serumspecimens from patients with mycoplasma pneumonia by PCR.Int.J.Med.Microbiol.295：279-285；②Dumke，R.，N.Schurwanz，M.Lenz，M.Schuppler，C.Luck，and E.Jacobs.2007.Sensitive detectionof Mycoplasma pneumoniae in human respiratory tract samples byoptimized real-time PCR approach.J.Clin.Microbiol.45：2726-2730；③Winchell，J.M.，K.A.Thurman，S.L.Mitchell，W.L.Thacker，and B.S.Fields.2008.Evaluation of three real-time PCR assays for detection ofMycoplasma pneumoniae in an outbreak investigation.J.Clin.Microbiol.46：3116-3118.)

虽然肺炎支原体荧光PCR检测技术非常成熟，但是基本所有检测方法都是国外学者报道的，其设计探针引物及体系验证均使用的国外菌株。由于NCBI数据库中还没有国内菌株p1基因序列，所以这些方法虽然国内也在使用，但对于中国肺炎支原体菌株检测的灵敏度和特异性缺乏真正意义上的比较。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测肺炎支原体的特异性靶序列；本发明的还在于提供上述靶序列的用途，以提高对中国国内肺炎支原体菌株的检测能力。

为实现上述目的，通过对本实验室分离到的60株国内肺炎支原体p1基因和NCBI数据库已报道的p1基因序列比对，通过BLAST软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，发现了核苷酸完全保守区域262bp：nt 1676-nt 1937(相对于肺炎支原体标准菌株M129)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该靶序列是检测肺炎支原体的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测肺炎支原体的遗传标记物。

进一步，本发明还提供用于特异性扩征上述靶序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。可以使用诸如Primer ExpressVersion 3等软件来设计探针和引物。通常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20-50个碱基，其序列与上述遗传标记物相同或互补，其5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。本发明探针和引物不但适用于已报道的国外肺炎支原体菌株扩增还适用国内肺炎支原体扩增检测。

在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：

MpP1-FP：5’-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3’，

MpP1-RP：5’-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3’；

探针序列为：

(FAM)5’-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3’(BHQ1)。

本发明提供一种肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。

在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于等于38的标本为阳性结果；

Ct值大于40的标本为阴性性结果；

Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。

本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25μl反应体系时，其优选配置为：

本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性10s，55～65℃退火30s，45个循环。

本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性10s，59℃退火30s，45个循环。

本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：

有效扩增：NTC(-)AND POS(+)

无效扩增：NTC(+)AND POS(+)提示体系污染

无效扩增：NTC(-)AND POS(-)提示体系错误或者试剂失效。

只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否者试验需要重复。

在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：

Ct值小于等于38的标本为阳性结果；

Ct值大于40的标本为阴性结果；

本发明提供了一种用于肺炎支原体检测的试剂盒，其包括上述遗传标记物或其特异性片段的特异性引物以及配合引物使用的Taqman探针。

本发明试剂盒的引物序列为：

MpP1-FP：CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT，

MpP1-RP：AACGAGTTCCCTACCAACGAAC，

探针序列为：FAM-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-BHQ1。

本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为肺炎支原体基因组DNA，例如浓度为1.62ng/ul的肺炎支原体基因组DNA。

本发明在实施例6对试剂盒的检测时间和检测灵敏度进行了比较：实验发现与现有两种商品化试剂盒检测时间相比，本发明试剂盒检测时间可缩短半小时左右，并且其实际检测灵敏度比前两者高一个数量级。可见对于实际标准品的检测灵敏度本发明的试剂盒优于上述两种产品化试剂盒。

本发明提供了用于检测肺炎支原体的p1基因保守区域靶序列，以及以该序列为基础设计的引物和探针，具有较强的特异性，利用该引物和探针进行肺炎支原体的荧光定量PCR检测方法进一步简化肺炎支原体的检测的程序、缩短检测周期，用于检测国内的分离肺炎支原体株，可作为检测临床标本的手段，提高肺炎支原体检测的阳性率。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性阳性对照，该试剂盒的推广应用有利于快速、准确地鉴定肺炎支原体的感染情况。

附图说明

图1为荧光定量PCR检测体系优化结果，图1a为不同镁离子浓度体系优化检测结果；图1b为不同退火温度体系优化检测结果；

图2为MpP1体系标准曲线图，其中横坐标为阳性模板浓度的对数值，纵坐标为MpP1体系检测不同浓度阳性模板的Ct值，R²＝0.996；

图3.MpP1体系real-time PCR的特异度检测，除阳性模板对照外，其余表1中所有模板均无扩增。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

60株肺炎支原体临床分离株p1基因全长扩增，测序，序列比对和探针、引物设计。

普通PCR引物序列为：

P1primer-F：5’-ATGCACCAAACCAAAAAAACTGCCT-3’

P1primer-R：5’-CTAAGCGGGTTTTTTAGGTGGTTGC-3’

使用TAKARALA Taq kit(DRR200A)扩增，反应体系：

扩增条件：

扩增产物由华大基因公司(BGI)测序及序列拼接，将拼接并经人工校对后的60条p1基因序列及NCBI数据库所有已报道p1基因序列使用Vector NTI Suite 6软件序列比对，寻找出保守区域。p1基因是肺炎支原体本身特有的功能性基因序列，通过对60株国内肺炎支原体p1基因和NCBI数据库已报道的p1基因序列比对，发现了核苷酸完全保守区域262bp：nt 1676～nt 1937(相对于标准菌株M129)，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

使用Primer Express Version 3软件在保守序列区域设计探针及引物：MpP1-FP：5’-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3’，MpP1-RP：5’-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3’；MpP1-探针：(FAM)5’-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3’(BHQ1)。

虽然引物和探针与靶序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5’端)的情况下，也能够特异性的扩增出所需的片段。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明的范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明的靶序列或其片段。

实施例2

实时荧光定量PCR实验参数的优化

(1)体系镁离子浓度优化：将体系中MgCl₂从0.5ul依次递增为4ul，每次增幅0.5ul，每个浓度梯度做3个平行样。结果MgCl₂添加量为2ul(MgCl₂终浓度为4mM)时体系扩增效果最好(图1a)。

(2)体系退火温度优化：体系退火温度从55℃-65℃改变，结果显示59℃左右体系扩增效果最好(图1b)

(3)MpP1实时荧光定量PCR扩增体系及扩增条件的优化

扩增条件：

实施例3

体系标准曲线的制作

以标准浓度模板的1g值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标，绘制MpP1体系的real-time PCR标准曲线。结果显示：阳性模板量在8.1fg-8.1ng这个范围内时，其的对数值与Ct值具有非常好的相关性(R²＝0.996)。见图2。

实施例4

MpP1荧光PCR检测体系的灵敏度、特异度及检出限评价

1.灵敏度评价

灵敏度，又称真阳性率，即实际上是肺炎支原体并按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的肺炎支原体MpP1检测体系的real-time PCR检测体系检测8株ATCC标准株和实验室保存的100株肺炎支原体临床分离株DNA。结果，除NTC对照外，所有108株肺炎支原体MpP1体系检测结果呈阳性。

2.特异度评价

特异度，又称真阴性率，即实际上不是肺炎支原体而按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的real-time PCR检测呼吸道常见菌株20种及人类染色体(表1)，以肺炎支原体为阳性对照。结果除阳性对照外，其余21种非肺炎支原体模板均为阴性(图3)。

表1用于检测MpP1荧光PCR体系特异性模板

ATCC，美国模式培养物集存库

3.检测下限的评价

检测下限即以该优化的检测方法从一系列倍比稀释的阳性模板中检测，结果为阳性的能力。

以肺炎支原体标准菌株ATCC29342模板系列浓度梯度1.62ng/ul～0.162fg/ul为模板，每个浓度梯度取5μl检测，使用阳性模板量对应为8.1ng～0.81fg。按照优化的反应体系和反应条件进行real-time PCR，每个浓度梯度做3个平行样。

当体系标准模板量为8.1ng～8.1fg时，每个浓度梯度的3个平行样均扩增阳性，模板浓度为0.81fg时，此浓度梯度的3个平行样只有1个样本出现扩增。所以，肺炎支原体MpP1体系real-time PCR检测体系的检测下限为8.1fg，约3CFU。

实施例5

MpP1real-time PCR方法与已报道的real-time PCR方法对临床标本的实际应用评价比较

Mp181体系，位于CARDS毒素基因，是2008年美国疾病预防控制中心最新报道的检测肺炎支原体的较为灵敏特异的方法。用本发明建立的方法和Mp181体系的荧光定量PCR方法分别检测40份肺炎支原体阳性临床标本(阳性标本定义为培养阳性标本)和100份肺炎支原体阴性临床标本(阴性标本定义为培养阴性且RepMP1体系检测阴性的标本)，检测结果见表2、表3。

MpP1体系对于阳性临床标本检测率为100％，高于Mp181体系的85％，经统计学计算存在显著性差异(0.01＜P＜0.05，卡方检验)，说明MpP1体系对于阳性标本的检测优于Mp181体系。MpP1与Mp181体系对于阴性标本检测率分别为98％和99％，两者无统计学差异。

表2.使用Mp181体系和MpP1体系对临床标本检测结果

表3.MpP1方法和Mp181方法检测肺炎支原体阳性临床标本Ct值

^aN，为阴性

实施例6

选择2种商品化肺炎支原体检测试剂盒，分别是上海之江生物科技有限公司生产的肺炎支原体检测试剂盒(RD-0100-02)，中山大学达安基因股份有限公司生产的肺炎支原体检测试剂盒(DA-B064)。

以肺炎支原体标准菌株ATCC29342模板系列浓度梯度1.62ng/ul～1.62fg/ul为模板，每个浓度梯度取5μl检测，使用阳性模板量对应为8.1ng～8.1fg，对本发明试剂盒与两种商品化试剂盒进行检测。结果显示本发明试剂盒对标准浓度模板检测的标准曲线R²＝0.998，斜率为-3.572，最高荧光信号值约13000，扩增效率为90.5％，最低检测限为8.1fg(约3个CFU)；上海之江生物科技有限公司生产的肺炎支原体检测试剂盒对标准浓度模板检测的标准曲线R²＝0.999，斜率为-4.419，最高荧光信号值约5800，扩增效率为68.4％，最低检测限为81fg(约30个CFU)；中山大学达安基因股份有限公司生产的肺炎支原体检测试剂盒对标准浓度模板检测的标准曲线R²＝0.996，斜率为-3.826，最高荧光信号值约4800，扩增效率为82.5％，最低检测限为81fg(约30个CFU)。三种试剂盒对肺炎支原体标准菌株ATCC29342模板系列浓度梯度(8.1ng～8.1fg)检测Ct值见表4。结果可见，本发明提供的检测肺炎支原体试剂盒比目前国内两种试剂盒实际检测灵敏度高一个数量级。可见对于实际标准品的检测灵敏度本发明的试剂盒优于上述两种商品化试剂盒。

表4.三种试剂盒对梯度稀释肺炎支原体DNA标准品检测Ct值

通过对三种试剂盒的检测时间的比较：发现中山大学达安基因股份有限公司生产的肺炎支原体检测试剂盒，其检测时间为3420s；上海之江生物科技有限公司生产的肺炎支原体检测试剂盒，其检测时间为3240s；本发明提供的试剂盒，检测肺炎支原体的时间为1980s，与现有试剂盒检测时间相比，本发明试剂盒检测时间缩短半小时左右。

Claims

1.一种用于检测肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）的遗传标记物，其为SEQ ID NO.1所示的序列，该序列由下述引物扩增获得，

MpP1-FP:5’-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3’，

MpP1-RP:5’-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3’。

2.用于扩增权利要求1所述遗传标记物的特异性引物，其核苷酸序列为：

MpP1-FP:5’-CAATAACCGCTGGTTTGAATATGT-3’，

MpP1-RP:5’-AACGAGTTCCCTACCAACGAAC-3’。

3.与权利要求2所述引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列为：

FAM5’-CCACGGATGGCAGTTGCTGG-3’BHQ1。

4.含有权利要求2所述引物和/或权利要求3所述探针的试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其还包括：荧光定量反应液、阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为0.162fg/μl～1.62ng/μl的肺炎支原体基因组DNA。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，工作反应体系为：

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，工作程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性10s，59℃退火30s，45个循环。