CN109666752A

CN109666752A - 一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量lamp引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN109666752A
Application number: CN201910106459.2A
Authority: CN
Inventors: 李军; 吴翠兰; 冯世文; 马春霞; 潘艳; 彭昊; 陈忠伟; 陶立; 李常挺; 钟舒红; 胡帅; 贺会利; 谢永平
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2019-02-02
Filing date: 2019-02-02
Publication date: 2019-04-23

Abstract

本发明公开一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组及试剂盒，所述LAMP引物组如SEQ ID NO：1~5所示；所述LAMP引物组用于制备检测绵羊肺炎支原体的LAMP扩增试剂盒，该试剂盒提供的LAMP检测方法具有高度的特异性和敏感性，重复性好，可信度高，特异性检测出绵羊肺炎支原体的特异性核苷酸片段，并且可对绵羊肺炎支原体拷贝数进行定量检测，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测绵羊肺炎支原体带来便利，本发明解决了传统鉴别方法耗时费力等不足，适合基层使用，可作为绵羊肺炎支原体实验室快速检测鉴别的一种快速、准确、简便的检测工具。

Description

一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速并且可实时定量检测绵羊肺炎支原体的LAMP引物组及试剂盒。

背景技术

绵羊传染性胸膜肺炎是由绵羊肺炎支原体（mycoplasma ovipneumoniae，MO）引起的一种绵羊慢性呼吸道传染病，主要危害1-3月龄的羔羊，以咳嗽、喘气、渐进性消瘦及慢性增生性间质性肺炎为特征。该病发生于世界许多国家，是危害绵羊的主要传染病之一。MO于1963年由Mackay等首先分离出，继后Cottw又在澳大利亚绵羊病肺中发现，Carmicheal等证明了这种支原体的致病性，并建议命名为绵羊肺炎支原体。四川畜牧兽医研究所于1979年在四川阿坝首次发现该病由新西兰和澳大利亚进口的边区莱斯特种羊带入，经病原分离和鉴定，确定为绵羊传染性胸膜肺炎，此后先后在十几个省区均有此病报道。感染绵羊肺炎支原体引起羊群咳嗽、气喘、消瘦等，常规治疗无效，发病率和死亡率很高，个别羊场死亡率达到50％，造成了巨大的经济损失。

目前，绵羊肺炎支原体的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是传统的病原分离鉴定，即通过对病原的表型特征和生化指标进行鉴定，绵羊肺炎支原体对培养基营养要求高，分离率低，常规鉴定方法费时费力。聚合酶链式反应（PCR）法等虽然特导性和敏感性都较高，但却需要昂贵的PCR仪、电泳槽等精密仪器，不适用于基层开展。因此，建立一种可以快速、准确检测和鉴定绵羊肺炎支原体的方法具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种快捷准确检测鉴别绵羊肺炎支原体的方法，公开一种快速、实时定量检测绵羊肺炎支原体的LAMP引物组及应用。

为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组，所述的LAMP引物组为SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2为内引物FIP和BIP；

所述SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4为外引物F3和B3；

所述SEQ ID NO：5为环引物LF。

优选地，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中同源性为60%以上的序列。

优选地，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中进行杂交的序列。

优选地，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列进行转录的序列。

优选地，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列进行优化截短的序列。

本发明还提供一种如以上所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP试剂盒，包括LAMP引物组、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、RNase-Free water和绵羊肺炎支原体DNA模板。

优选地，所述2×反应缓冲液由Buffer、dNTPs、Mg²⁺组成。

优选地，所述LAMP试剂盒的反应体系为25 μL：其中包括12.5 μL的2×反应缓冲液，1 μL的Bst DNA聚合酶，5 pmol的SEQ ID NO：1，5 pmol的SEQ ID NO：2，40 pmol的SEQID NO：3，40 pmol的SEQ ID NO：4，25 pmol的SEQ ID NO：5，2 μL的绵羊肺炎支原体DNA模板，再加入超纯水补足25 μL。

优选地，所述LAMP试剂盒的应程序为：63℃恒温保持60 min，扩增结束后85℃灭活5 min。

本发明的显著进步是：

1）特异性强

所检测的阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来。

2）灵敏度高

利用本发明的绵羊肺炎支原体LAMP扩增引物组建立的LAMP 检测方法具有高度敏感性，检测限约为8.50×10^-3ng/μL。

3）迅速得出结果

绵羊肺炎支原体难于分离培养，需要特制的培养基，在特制培养基上需要48小时以上才长出明显菌落，生化试验通常耗时24-72小时，做出正确的鉴定需要3-5天时间。本发明提供的LAMP检测方法反应在20-30分钟间出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且扩增结束即可判断结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析，从样品的基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。

4）准确性高

目前建立的大多数LAMP方法，在反应结束后打开反应管加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电泳的方法进行结果判定，无法区分特异性扩增与非特异性扩增，因此增加了假阳性诊断结果的几率；而且对于弱阳性反应，通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，能够避免上述的缺陷，具有更高的准确性。

此外，利用本发明的绵羊肺炎支原体LAMP扩增引物组建立的LAMP 检测方法具有高度敏感性，高灵敏度保证了在样品DNA含量极低的情况下，使用本发明绵羊肺炎支原体的LAMP扩增引物也可以扩增出目的DNA片段，检测结果更准确。

5）不造成污染

常规的LAMP方法在反应结束后通过凝胶电泳的方法来判读结果，或者开盖加入荧光染料进行判断，凝胶电泳使用的染料对环境也造成污染，且打开反应管容易造成实验室气溶胶污染。本方法通过浊度仪实时监控反应管的扩增情况，反应结束即可获得结果，不需要打开反应管的盖子，能有效避免气溶胶污染。

6）可实时定量

本发明利用Tubidimeter real-time LA-320 浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同标准样品浓度的负对数及其对应的浊度值达到0.1所需的时间成线性关系，由此绘制标准曲线，获得标准曲线方程，即可进行定量检测。

附图说明

图1是本发明LAMP扩增引物组的特异性检测结果：只有绵羊肺炎支原体的反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，6个对照菌反应管和水对照反应均无扩增，为阴性结果。

图2是本发明LAMP扩增引物组的敏感性检测结果，图3是使用PCR检测的敏感性检测结果；其中1：8.50×10⁰ng/μL；2：8.50×10^-1ng/μL；3：8.50×10^-2ng/μL；4：8.50×10^- ³ng/μL；5：8.50×10^-4ng/μL；6：8.50×10^-5ng/μL；7：8.50×10^-6ng/μL。绵羊肺炎支原体DNA的起始浓度为8.50×10⁰ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP和PCR扩增，结果显示LAMP法检测限约为8.50×10^-3ng/μL，而PCR检测限为8.50×10^-2ng/μL（图3），LAMP敏感性是PCR的10倍。

图4是本发明定量检测绵羊肺炎支原体LAMP方法的标准曲线：不同标准样品浓度的负对数及其对应的浊度值达到0.1所需的时间成线性关系，由此绘制标准曲线，获得标准曲线方程，即可进行定量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到

1、材料的准备

绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、牛支原体、化脓隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌，为广西壮族自治区兽医所分离鉴定和保存。BstDNA 聚合酶购自北京蓝谱生物科技有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

2 、LAMP引物组的设计与合成

根据GenBank 中的绵羊肺炎支原体hsp70基因序列，进行基因序列比对，选取保守区域，设计特异性LAMP引物，其中F3、B3 为外引物，FIP、BIP 为内引物，LF为环引物，其中

F3 CATCTAATTGACCGAACAAGA （SEQ ID NO：1）

B3 AATTGCAGCACCAATTGC （SEQ ID NO：2）

FIP AGAAGAACTTCATCAAGCTCACTTGAAACCAATTGTTGACGCC （SEQ ID NO：3）

BIP TGGTGGATCAACACGTATGCCGGATTTATTGAACGATTTGGCT（SEQ ID NO：4）

LF AGCTGTTCAGACAATGATTGAACAC （SEQ ID NO：5）。

3、细菌基因组DNA提取

取适量病原菌培养物至于灭菌离心管中，若为液体培养物，则离心后去上清，取沉淀，再使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌基因组DNA。

4、LAMP反应体系建立

按25μl体系配置：

2×反应缓冲液 12.5 μL

BstDNA 聚合酶 1 μL

F3 5 pmol

B3 5 pmol

FIP 40 pmol

BIP 40 pmol

LF 25 pmol

绵羊肺炎支原体DNA 2 μL

超纯水补足25 μL。

5、LAMP反应程序

LAMP反应在实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司) 密闭进行，浊度仪实时监控扩增情况，反应程序为63℃保持60 min，反应结束后85℃灭活5 min。

6、结果判定

实时浊度仪实时监测反应扩增情况，仪器通过读取反应管的浊度值绘制浊度曲线，出现浊度上升曲线的为阳性结果，没有出现浊度上升曲线的为阴性结果。反应结束，即可获得结果，避免通过人为肉眼观察的主观判断失误。

7、LAMP扩增引物组在LAMP扩增试剂中的使用

7.1 标准品制备

抽提绵羊肺炎支原体纯培养物的基因组DNA作为标准样品，测定其浓度，-70℃保存备用。

7.2 特异性检测

分别提取绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、牛支原体、化脓隐秘杆菌、多杀巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌的基因组DNA作为模板，检验LAMP方法的特异性。

7.3 敏感性检测

取标准样品绵羊肺炎支原体基因组DNA，测定其起始浓度，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释7个稀释度，取各稀释度2 μL作为模板进行LAMP扩增和PCR扩增，进行敏感性检测。

7.4定量检测

设置对照：浓度为1:8.50×10⁰ng/μL；2：8.50×10^-1ng/μL；3：8.50×10^-2ng/μL；4:8.50×10^-3ng/μL的绵羊肺炎支原体基因组DNA标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，即可对未知样品的基因拷贝数进行定量检测。

结果：

1、 LAMP扩增引物组的特异性试验结果

对绵羊肺炎支原体、6株阴性对照菌和水对照进行LAMP扩增，结果如图1所示，绵羊肺炎支原体反应管在25 min左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，6株阴性对照菌反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。

2、LAMP扩增引物组的敏感性试验结果

绵羊肺炎支原体基因组DNA标准样品起始浓度为8.50×10⁰ng/μL，经10倍倍比稀释后进行LAMP扩增，结果如图2所示，LAMP法检测限约为8.50×10^-3ng/μL，而PCR检测限为8.50×10^-2 ng/μL。

3、绘制定量检测绵羊肺炎支原体的定量标准曲线

设置对照：浓度为1:8.50×10⁰ng/μL；2：8.50×10^-1ng/μL；3：8.50×10^-2ng/μL；4:8.50×10^-3ng/μL的绵羊肺炎支原体基因组DNA标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y = 0.3673x - 9.4286，如图3所示，相关系数R² =0.9918，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10^-y，再乘以基数8.5，即为8.50 ×10^-y ng/μL。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，从而达到定量的效果。

表1 标准样品浓度负对数与对应反应管浊度值为0.1的时间

时间(min)	26	28	31	34
					标准值（-LOG）	0	1	2	3

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组及试剂盒

<141> 2019-02-02

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 1

catctaattg accgaacaag a 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 2

aattgcagca ccaattgc 18

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 3

agaagaactt catcaagctc acttgaaacc aattgttgac gcc 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 4

tggtggatca acacgtatgc cggatttatt gaacgatttg gct 43

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<400> 5

agctgttcag acaatgattg aacac 25

Claims

1.一种检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组，其特征在于，所述的LAMP引物组为SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2为内引物FIP和BIP；

所述SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：4为外引物F3和B3；

所述SEQ ID NO：5为环引物LF。

2.根据权利要求1所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组，其特征在于，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中同源性为60%以上的序列。

3.根据权利要求1所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组，其特征在于，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列中进行杂交的序列。

4.根据权利要求1所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组，其特征在于，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列进行转录的序列。

5.根据权利要求1所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP引物组，其特征在于，所述的LAMP引物组具有与SEQ ID NO：1~5所示的核苷酸序列进行优化截短的序列。

6.一种如权利要求1所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP试剂盒，其特征在于，包括LAMP引物组、2×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、RNase-Free water和绵羊肺炎支原体DNA模板。

7.根据权利要求6所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP试剂盒，其特征在于，所述2×反应缓冲液由Buffer、dNTPs、Mg²⁺组成。

8.根据权利要求6所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒的反应体系为25 μL：其中包括12.5 μL的2×反应缓冲液，1 μL的Bst DNA聚合酶，5 pmol的SEQ ID NO：1，5 pmol的SEQ ID NO：2，40 pmol的SEQ ID NO：3，40 pmol的SEQ ID NO：4，25 pmol的SEQ ID NO：5，2 μL的绵羊肺炎支原体DNA模板，再加入超纯水补足25 μL。

9.根据权利要求6所述的检测绵羊肺炎支原体的实时定量LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒的应程序为：63℃恒温保持60 min，扩增结束后85℃灭活5 min。