CN104726575A

CN104726575A - 一种快速检测禽源样品中沙门菌的lamp试剂盒

Info

Publication number: CN104726575A
Application number: CN201510111606.7A
Authority: CN
Inventors: 龚建森; 许明; 刘加圣; 庄林林; 张笛; 王成明; 朱春红; 刘学贤; 徐步; 窦新红; 童海兵; 邹剑敏
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2015-06-24

Abstract

本发明公开了一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，该试剂盒包括：10×LAMP缓冲液；8000U/mL BstDNA聚合酶；10mM dNTPs；外引物为F3和B3；内引物为FIP和BIP；环引物为LF和LB；无菌去离子水；荧光染料：10×SYBR Green I；阳性对照：肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA；阴性对照：无菌去离子水。本发明试剂盒具有快速、简单、特异性强、灵敏度高、适合现场检测的优点，具有广阔的市场前景，适于推广应用。

Description

一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，具体为一种快速检测禽源样品中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌的LAMP试剂盒。

背景技术

沙门菌(Salmonella)是肠杆菌科中最常见的人畜共患病原菌，常寄生于动物和人体肠道内。由沙门菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高，危害最广的一种。沙门菌感染的禽群，是那些能够通过食物链传给人的沙门菌最为常见的储存库之一。从家禽和禽产品中分离出沙门菌的报道明显多于其它动物，造成这一结果的主要原因是由于沙门菌在被感染的家禽中能通过水平传播和垂直传播造成广泛流行，同时也反映出家禽的饲养数量十分庞大。大量的研究数据表明，不同宿主来源的沙门菌血清型存在较大的差异，对禽源沙门菌的流行病学研究表明，其优势血清型主要集中于鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等几种严重危害家禽养殖业与人类健康的血清型，因而针对上述禽源优势血清型沙门菌开发特异性的检测技术对于防控禽源沙门菌的传播具有重要的意义。

由于传统的沙门菌检测技术上存在诸多缺陷，如：操作步骤烦琐耗时，现行的国家标准或行业标准中对沙门菌的检测通常需要4-6天，已不能满足及时有效的质量监测和疾病防控需求；灵敏度较低，当样品中沙门菌含量较低时，易造成假阴性结果；准确度不高，尤其是加工后的食品受加热、干燥、高盐和冷冻等因素的作用，易导致沙门菌形成营养缺陷型，用传统方法不易检出。因此，迫切需要研发操作简便、准确快速的检测技术。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的分子检测方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换型DNA聚合酶，能在等温条件下(60～65℃)、1h内特异地扩增出10⁹～10¹⁰拷贝靶序列。在保持传统PCR技术优点的基础上，进一步提高了反应的特异性，同时缩短了检测时间。现已被应用于多种病原微生物的检测和研究，并具有良好的发展前景。

发明内容

本发明针对现有沙门菌检测技术上存在诸多缺陷，旨在提供一种简单、快速、准确的检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点。

本发明另一目的在于提供一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，包括：

1)10×LAMP缓冲液；

2)8000U/mL BstDNA聚合酶；

3)10mM dNTPs；

4)LAMP引物组：外引物浓度为5pmol/μL，外引物为F3和B3；内引物浓度为40pmol/μL，内引物为FIP和BIP；环引物浓度为20pmol/μL，环引物为LF和LB；

5)无菌去离子水；

6)荧光染料：10×SYBR Green I；

7)阳性对照：肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA；

8)阴性对照：无菌去离子水。

所述的10×LAMP缓冲液含有200mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。

所述的外引物F3和B3序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的内引物FIP和BIP序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述的环引物LF和LB序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明待检样品基因组DNA按常规方法提取或试剂盒提取。

本发明试剂盒LAMP检测反应体系为：每25μL反应液中，5pmol/μL的F3和B3各1μL，40pmol/μL的FIP和BIP各1μL，20pmol/μL的LF和LB各1μL，Bst DNA聚合酶1μL，10mmol/L的dNTPs 3.5μL，待检样品DNA 2～3μL，无菌去离子水适量。

本发明试剂盒采用荧光目视法时，需在反应体系中添加10×SYBR Green I 2.5μL，反应体系总量保持25.0μL不变。

本发明LAMP反应条件为：66℃恒温反应50min，并在80℃持续10min。

本发明所述的沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌中的一种或几种。

本发明试剂盒反应完成后肉眼观察液体变混浊(如果加入荧光染料则颜色由橙色变为绿色)，则说明样品中含有鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌中的一种或几种；或使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。

本发明还提供了一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组，包括：外引物F3和B3；内引物FIP和BIP；环引物LF和LB。

所述的沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌中的一种或几种。

本发明的试剂盒LAMP检测方法具有以下优点：

1)快速高效：整个扩增过程仅需35～50min，扩增产量可达10⁹～10¹⁰个拷贝靶序列；

2)操作便捷：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要普通水浴锅即可进行检测；

3)特异性强：本发明根据三种禽源沙门菌(鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌)含有的特异基因序列设计6条特异性引物，应用上述引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，确保反应的顺利进行；

4)灵敏度高：最低检测极限可达到0.5～0.6pg/管，比普通PCR高1-2个数量级；

5)适合现场检测：肉眼观察液体变浑浊即为阳性，澄清透明则为阴性；若采用荧光目视法观察颜色变化，颜色变为绿色为阳性，橙色为阴性；或使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性可呈现典型的特异梯状条带，阴性无此现象。

本发明的LAMP检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高、适合现场检测等优点，不需要配置相关检测仪器，为禽源沙门菌的检测提供了新的技术支撑，可用于畜牧业生产单位、兽医检测实验室、屠宰场、出入境和各疾病预防控制中心筛查和检测，具有广阔的市场前景，适于推广应用。

附图说明

图1为本发明LAMP检测方法的外引物与内引物比例优化试验结果图；M为DL-5000marker，泳道号1-6分别为外、内引物比1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，泳道7为阴性对照；

图2为本发明LAMP检测方法的外引物与环引物比例优化试验结果图；M为DL-5000marker，泳道号1-6为外、环引物比1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，泳道7为阴性对照；

图3为本发明LAMP检测方法的引物缺省试验结果图；M为DL-5000marker；1-11分别为引物内外环引物全有、；无上游外引物F3；无下游外引物B3；无上、下游外引物F3、B3；无上游内引物FIP；无下游内引物BIP；无上、下游内引物FIP、BIP；无上游环引物LF；无下游环引物LB；无上、下游环引物LF、LB；内外环引物都无；泳道12为阴性对照；

图4为本发明LAMP检测体系中不同浓度Mg²⁺试验结果图；M为DL-5000marker；1-6分别为浓度5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM的MgSO₄；7为阴性对照；

图5为本发明LAMP检测体系中不同浓度Bst DNA聚合酶试验结果图；M为DL-5000marker；1-6分别对应BstDNApolymerase添加量依次为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL；7为阴性对照；

图6为本发明LAMP检测体系中不同浓度dNTPs试验结果图；M为DL-5000marker；1-7分别对应反应体系中的dNTPs的浓度依次为0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mmol/L；8为阴性对照；

图7为本发明LAMP检测条件的不同反应温度试验结果图；M为DL-5000marker；1-7分别对应温度梯度为61.0℃、62.0℃、63.0℃、64.0℃、65.0℃、66.0℃、67.0℃；8为阴性对照；

图8为本发明LAMP检测方法的灵敏度结果图；M为DL-5000marke；1为阳性对照；2～10分别为DNA量为5.2×10⁶pg/管，5.2×10⁵pg/管，5.2×10⁴pg/管，5.2×10³pg/管，5.2×10²pg/管，5.2×10¹pg/管，5.2×10⁰pg/管，5.2×10^-1pg/管，5.2×10^-2pg/管；11为阴性对照；

图9为本发明LAMP外引物进行PCR检测方法的灵敏度结果图；M为DL-5000marker；1～8分别为DNA量为5.2×10⁶pg/管，5.2×10⁵pg/管，5.2×10⁴pg/管，5.2×10³pg/管，5.2×10²pg/管，5.2×10¹pg/管，5.2×10⁰pg/管；9为阴性对照；

图10为本发明LAMP方法特异性实验中检测24株沙门菌标准株电泳结果图；1-24分别为肠炎沙门菌ATCC13076、肠炎沙门菌CMCC50041、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、鼠伤寒沙门菌CMCC50015、纽波特沙门菌ATCC6962、鸡白痢沙门菌ATCC10398、鸡白痢沙门菌ATCC19945、鸡白痢沙门菌CMCC50047、鸡白痢沙门菌CMCC50771、蒙特维的亚沙门菌ATCC8387、波茨坦沙门菌CICC21500、圣保罗沙门菌CICC21486、布洛克利沙门菌CICC21489、海德尔堡沙门菌CMCC50111、鸡伤寒沙门菌ATCC9184、鸡伤寒沙门菌CMCC50770、肯塔基沙门菌CICC21488、婴儿沙门菌CMCC50348、汤卜逊沙门菌CMCC50023、阿贡纳沙门菌CICC21586、山夫登堡沙门菌CMCC50051、亚利桑那沙门菌CMCC50166、火鸡沙门菌沙门菌CMCC50329和科特布斯沙门菌CMCC50123；

图11为本发明LAMP方法特异性实验中检测24株非沙门菌标准株的电泳结果图；25-48分别为禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801、鸭疫里默氏杆菌CVCC3542、副鸡嗜血杆菌CVCC3005、宋内氏志贺氏菌ATCC9290、福氏志贺氏菌ATCC12022、痢疾志贺氏菌ATCC13313、鲍氏志贺氏菌ATCC8704、摩氏摩根氏菌ATCC25830、粘质沙雷氏菌ATCC13880、蜡样芽孢杆菌ATCC14579、地衣芽孢杆菌ATCC12759、枯草芽孢杆菌ATCC6633、粪肠球菌ATCC29212、鸟肠球菌ATCC14025、鸡肠球菌ATCC700425、奇异变形杆菌ATCC12453、副溶血性弧菌ATCC17802、单核增生李斯特菌ATCC19115、大肠埃希氏菌ATCC25922、大肠埃希氏菌ATCC35218、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、空肠弯曲杆菌ATCC12022和肺炎克雷伯氏菌ATCC700603；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1检测鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌的LAMP引物的设计

根据GenBank数据库中已有的不同血清型沙门氏菌的基因组DNA序列，通过分析比对后筛选鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌所共有的特异基因序列，按照LAMP反应的原理进行引物组的设计，结果优化得到三组引物对，F3和B3为第一组，FIP和BIP为第二组，LF和LB为第三组，具体引物序列如表1。

表1 LAMP检测引物序列

实施例2鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌与肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立

用实施例1获得的LAMP检测引物组对肠炎沙门菌标准株ATCC13076的基因组DNA进行LAMP检测，以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下：

一、最适反应体系的确定

1、引物间比例优化和缺省实验

1)引物间比例的优化

以肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA为模板，在实施例1获得的三对引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μL LAMP反应体系包括：ATCC13076基因组DNA 2-3μL，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，体积百分浓度为0.1％的曲拉通X-100，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM的MgSO₄，1.4mMdNTPs，8000U/mL Bst DNA polymerase 1μL(购自NEB公司)，外引物和内引物的浓度比的优化为：将外引物的浓度设定为5pmol/μL，依次按照以下比例添加内引物：1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，选择最佳浓度比。固定外引物和内引物的选择最佳浓度比，外引物与环引物浓度比的优化：依次按照以下比例加入环引物：1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，选择最佳浓度比。其它成分：F3、B35pmol/μL；FIP、BIP 40pmol/μL；dNTPs 1.4mmol/L；反应条件为置于66℃恒温环境中50min，并于80℃持续10min。使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。

结果如图1所示，在各反应体系中，均可产生梯形条带，当外引物与内引物的比例为1:8时，反应最好，所以选择外引物和内引物的浓度比为1:8的反应体系。固定内、外引物的浓度比，通过改变环引物的浓度，使环引物的浓度与内引物的浓度比例介于1/8～6/8之间，结果如图2所示，当外引物浓度与环引物浓度的比例为5:8时，可产生较亮的扩增条带。所以，确定外引物、内引物和环引物的浓度比为1:8:4。

2)引物缺省试验

为验证单条及单套引物对LAMP反应的影响设计了引物缺省试验，反应体系中引物依次添加如下：引物内外环引物全有，无上游外引物F3，无下游外引物B3，无上、下游外引物F3、B3，无上游内引物FIP，无下游内引物BIP，无上、下游内引物FIP、BIP，无上游环引物LF，无下游环引物LB，无上、下游环引物LF、LB，内外环引物都无，阴性对照，分析关键结合位点及其对应引物在LAMP反应中的作用。

结果如图3所示，内引物对试验起到了主要作用，而且只添加单条内引物也不能启动LAMP反应进行。外引物的缺省对LAMP反应影响没有内引物明显，添加单条外引物也能启动LAMP反应，环引物的缺省对LAMP的启动没有影响，只是改变LAMP反应的效率。

2、最适Mg²⁺浓度的确定

在反应体系中添加不同浓度的Mg²⁺，以确定最佳Mg²⁺浓度，包括以下步骤：

1)以肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA为模板，在实施例1获得的三对引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μLLAMP反应体系包括：ATCC13076基因组DNA 2-3μL，20mMTris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，体积百分浓度为0.1％的曲拉通X-100，0.8M甜菜碱(betaine)，分别添加(5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM)的MgSO₄，1.4mM dNTPs，8000U/mL Bst DNApolymerase，加入的引物量为：5pmol F3和B3，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB；反应条件为置于66℃恒温环境中50min，并在80℃持续10min。使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。

2)在上述含有不同浓度Mg²⁺的反应体系中，结果如图4所示，含有8mM MgSO₄的反应体系的检测效果最好。

3、最适BstDNApolymerase反应浓度的确定

以肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA为模板，在实施例1获得的三对引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μL LAMP反应体系包括：ATCC13076基因组DNA2-3μL，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，体积百分浓度为0.1％的曲拉通X-100，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM的MgSO4，1.4mmol/L dNTPs，8000U/mL Bst DNA polymerase(购自NEB公司)，设计酶添加量依次为0.0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL进行优化探索，加入的引物量为：5pmol F3和B3，40pmol FIP和BIP，20pmolLF和LB；反应条件为置于66℃恒温环境中35～50min，并在80℃持续10min。使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。

在含有不同浓度Bst DNA polymerase的反应体系中，由图5可看出，8000U/mL BstDNApolymerase添加量为1.0μL时效果最好。

4、最适dNTPs浓度的确定

以肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA为模板，在实施例1获得的三对引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μL LAMP反应体系包括：ATCC13076基因组DNA 2-3μL，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)₂SO₄，体积百分浓度为0.1％曲拉通X-100，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM的MgSO₄，分别加入dNTPs(10mmol/L)2μL、2.5μL、3μL、3.5μL、4μL、4.5μL、5μL，将反应体系中的dNTPs的浓度依次调整为0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mmol/L，8000U/mL BstDNApolymerase(购自NEB公司)，加入的引物量为：5pmol F3和B3，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB；反应条件为置于66℃恒温环境中50min，并在80℃持续10min。使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。

在含有不同浓度dNTPs的反应体系中，由图6可看出，dNTPs浓度从0.8-2.0mmol/L均能扩增出靶基因DNA，但是在1.4mmol/L即能得到均一、稳定的条带。由此，最佳dNTPs浓度确定为1.4mmol/L。

综上所述，最适反应体系确定为：外引物、内引物和环引物的浓度比为1:8:4，Mg2+浓度为8mM，8000U/mL Bst DNA polymerase在25μL体系中添加量为1.0μL，最佳dNTPs浓度确定为1.4mmol/L。

二、最适反应温度的确定

以肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA为模板，在实施例1获得的三对引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μL LAMP反应体系包括：ATCC13076基因组DNA 2-3μL，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)₂SO₄，0.1％曲拉通X-100，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM的MgSO₄，1.4mmol/L dNTPs，8000U/mLBst DNApolymerase(购自NEB公司)，加入的引物量为：5pmol F3和B3，40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB；反应条件为分别置于温度梯度为61.0℃、62.0℃、63.0℃、64.0℃、65.0℃、66.0℃、67.0℃的恒温环境中50min，并在80℃持续10min。2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异性梯状条带，阴性则无此现象。

从图7中可以看出，1～7泳道都产生了梯形条带，说明61.0℃～67.0℃温度下都能进行反应，当66.0℃条带最亮，因此选择66.0℃作为最适温度。

实施例3灵敏度评价实验

将培养后的细菌(原始核酸含量为5.2×106pg)进行10倍梯度稀释，按照实施例2中的方法提取DNA，分别进行LAMP和PCR检测，其中PCR引物为LAMP方法的外引物(F3和B3)，同时将稀释的菌液进行平板培养计数，将平板培养计数结果与本试剂盒LAMP的最低灵敏度进行对比。其中：LAMP检测反应体系如表2所示。

表2 LAMP检测反应体系

上述反应体系配制于PCR管中，同时设置阳性对照和阴性对照；LAMP反应条件：将上述配置完成的含反应体系的PCR管混匀后瞬时离心，置于水浴锅中66℃反应50min，并在80℃持续10min。

PCR检测体系如表3所示：

表3 PCR检测体系

上述反应体系配制于PCR管中，同时设置阳性对照和阴性对照；PCR反应条件：将上述配置完成的含反应体系的PCR管混匀后离心，PCR检测体系扩增参数具体为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性20s，55℃退火15s，72℃延伸15s；共32个循环；循环结束后，72℃延伸10min，4℃保存。

结果判断：将上述反应管分别置于水浴锅和普通PCR仪中各自条件反应，本次LAMP反应结束产物使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。PCR反应产物使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳，阳性结果在201bp大小处可见清晰的特异性条带，阴性则没有。

电泳结果见图8，在第9条泳道可以看到较清晰的条带，所对应DNA浓度为0.52pg/管，而第10条泳道之后完全看不到扩增条带。因此，本试剂盒的LAMP检测方法最低检出限0.52pg/反应，具有较高的灵敏度和应用价值。

如图9所示，在第7条泳道可以看到略暗的条带，所对应DNA浓度为52pg/管，而第8条泳道完全看不到扩增条带，因此，CR检测方法的最低检出限为56pg/反应，结果表明本发明试剂盒具有很高的灵敏度和临床检测价值。

实施例4特异性验证实验

用实施例2的方法进行LAMP检测方法的特异性评估，所用菌株及菌株编号参见表4。将试验菌株进行富集培养后、提取基因组DNA，按照实施例1进行LAMP检测，66℃反应50min，结果如图10和图11所示只有鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌显示出特异性扩增，其他血清型沙门菌以及非沙门菌菌株均无非特异性扩增。

表4 本发明评价试验中涉及的菌株信息

注：表格结果一栏中：“+”表示阳性；“-”表示阴性。

实施例5LAMP检测试剂盒制备

将10×LAMP buffer、8000U/mL BstDNA聚合酶、10mM dNTPs、检测引物组(外引物F3和B3：5pmol/μL，内引物FIP和BIP：40pmol/μL，环引物LF和LB：20pmol/μL)、无菌去离子水、荧光染料(10×SYBR Green I)、阳性对照、阴性对照，其中：10×LAMP buffer含有200mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和1％曲拉通X-100，以及作为阳性对照的沙门菌的基因组DNA2μL，作为阴性对照的不含DNA的LAMP扩增体系(无菌去离子水)共同包装，再配以产品使用说明书(注明染色法和电泳法两种检测方法)，组成LAMP检测试剂盒。

实施例6临床实际样品检测

1)样品采集：所述样品取自鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等家禽排泄物以及市售的禽肉或禽蛋制品。

2)待检样品基因组DNA的提取：按常规方法提取或试剂盒提取。

3)LAMP检测反应体系如表5所示。

表5 LAMP检测反应体系

上述反应体系配制于PCR管中，同时设置阳性对照和阴性对照；

LAMP反应条件：将上述配置完成的含反应体系的PCR管混匀后离心，置于水浴锅中66℃反应50min，并在80℃持续10min。

4)结果判断：将上述反应管置于水浴锅反应，本次LAMP反应结束产物使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。统计结果见表6。

表6 734份禽源样品的检测结果

5)734例禽源样本中，以沙门菌国标检测方法(GB 4789.4–2010)所需时间为4-5天，采用本发明试剂盒检测全程所用时间约为4小时。由表6可以发现，以国标检测方法共检出71例阳性，而采用本发明试剂盒的检测方法检出80例阳性，且采用国家标准检出的阳性样品在LAMP检测结果中均为阳性。上述结果表明本发明试剂盒所建立的检测方法在临床实际检测中的灵敏度高于传统细菌学检测方法。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于包括：1)10×LAMP缓冲液；2)8000U/mL BstDNA聚合酶；3)10mM dNTPs；4)LAMP引物组：外引物浓度为5pmol/μL，外引物为F3和B3；内引物浓度为40pmol/μL，内引物为FIP和BIP；环引物浓度为20pmol/μL，环引物为LF和LB；5)无菌去离子水；6)荧光染料：10×SYBR Green I；7)阳性对照：肠炎沙门菌标准株ATCC13076基因组DNA；8)阴性对照：无菌去离子水。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述的10×LAMP缓冲液含有200mMTris-HCl(pH 8.8，25℃)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述的外引物F3和B3序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的内引物FIP和BIP序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示，所述的环引物LF和LB序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求1所述的一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于：该试剂盒LAMP检测反应体系为：每25μL反应液中，5pmol/μL的F3和B3各1μL，40pmol/μL的FIP和BIP各1μL，20pmol/μL的LF和LB各1μL，BstDNA聚合酶1μL，10mmol/L的dNTPs 3.5μL，待检样品DNA2～3μL，无菌去离子水适量。

5.根据权利要求4所述的一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于：试剂盒采用荧光目视法时，反应体系中还包括10×SYBR Green I 2.5μL，反应体系总量保持25.0μL不变。

6.根据权利要求4所述的一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于：LAMP反应条件为：66℃恒温反应50min，并在80℃持续10min。

7.根据权利要求4所述的一种快速检测禽源样品中沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于：所述的沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌中的一种或几种。

8.一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组，其特征在于包括：外引物F3和B3；内引物FIP和BIP；环引物LF和LB。

9.根据权利要求8所述的一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组，其特征在于：所述的沙门菌为鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌或肠炎沙门菌中的一种或几种。

10.根据权利要求8所述的一种用于检测沙门菌的通用LAMP引物组，其特征在于：所述的外引物F3和B3序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述的内引物FIP和BIP序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述的环引物LF和LB序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。