CN102643919A - 一种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括10×反应缓冲液；BstDNA聚合酶；dNTPs；MgSO4；DNase/RNase-FreeddH2O；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；叠氮溴化乙锭；1000×SYBRGreenI荧光染料。检测步骤：（1）动物性水产品及其制品，经样品前处理后接种于氯化钠碱性蛋白胨水过夜培养；（2）取过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭，暗处放置，整个光激发过程在冰上进行；（3）采取DNA快速提取法提取样品DNA，即将叠氮溴化乙锭处理过的菌悬液煮沸，离心，取离心后上清液作为环介导等温扩增反应的DNA模板，对其进行环介导等温扩增反应。本发明具有快速、高效、准确性高、灵敏度高、现场应用方便，可广泛适用于食品，卫生，出入境等检测。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒，同时还涉及一种食品中副溶血弧菌活菌的检测方法。适用于动物性水产品、动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味品，及其他加工食品。本发明适用于水产品养殖企业、水产品加工企业、超市、农贸市场、水产品批发市场的快速检测及国家相关职能检测机构实验室检测。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibio parahemolyticus)广泛分布于江河、海洋及热带和温带沿海地区，主要寄生于浮游生物、鱼、虾蟹、贝类等水产品中，给水产养殖业造成巨大的经济损失。直接或间接食用被该菌污染的食品会引发肠胃功能紊乱、急性胃肠炎、浅表创伤感染、败血病等疾病，是引起食物中毒的重要病原体之一。在细菌性食物中毒的构成中，以副溶血弧菌引起的急性肠炎占首位。副溶血弧菌产生的毒素有溶血素和尿素酶。其致病因子主要有耐热直接溶血毒素、耐热直接相关溶血毒素、不耐热溶血毒素。因此，快速灵敏的检测手段是预防控制副溶血弧菌传播的关键。通常传统鉴定方法是分离培养、镜检观察、生化鉴定及嗜盐性试验等，这些检测手段不仅耗时而且操作复杂、灵敏度较低。近年来，有大量研究是基于PCR检测方法，PCR检测方法在操作时间，检测的特异性和灵敏度方面较常规方法均有较大提高，但PCR检测方法需要精密的PCR仪，它的检测时间也较长(2～4h)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地快速检测的需求。另外还有一些检测方法，比如免疫色谱法、DNA杂交法，虽然检测灵敏度高，但是所需设备和操作过程比较复杂，也不能满足实地快速检测的需求。
环介导等温扩增法(LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30～60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
现有技术中已经有副溶血弧菌检测试剂盒和检测方法，但在实际使用过程中存在着无法区分副溶血弧菌活体菌与死菌，对检测结果准确性影响很大，常出现假阳性结果。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒，能快速检测食品中副溶血弧菌活菌，与PCR检测方法相比较，EMA-LAMP检测方法提高了检测特异性、灵敏度和准确性。与传统LAMP检测方法相比较，EMA-LAMP检测方法可以区分试样中的活菌和死菌，只检测样本中存在的副溶血弧菌活菌，检测结果更加准确，极大的降低了假阳性结果产生。同时传统LAMP检测方法其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，而本发明对传统LAMP检测方法进行了创新，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异性引物，使得检测特异性、灵敏度和准确性均有较大的提高。
本发明的另一个目的是在于提供了一种食品中副溶血弧菌活菌的检测试剂盒的检测方法，方法易行，操作简便，快速、灵敏的检测食品中副溶血弧菌活体菌，该方法在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种副溶血弧菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒它包括以下成分：10×反应缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；MgSO4；DNase/RNase-Free ddH2O；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；叠氮溴化乙锭；1000×SYBR Green I荧光染料。
10×反应缓冲液配方：200mM Tris-HCl、100mM KCl、10mM(NH4)2SO4、1.0％(质量体积比)Tritonx-100。
引物F3：5’AGCTACTCGAAAGATGATCC 3’
引物B3：5’GGTTGTATGAGAAGCGATTG 3’
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引物BIP：5’ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG 3’
引物Loop-F：5’ACCAGTAGCCGTCAATG 3’
引物Loop-R：5’TTAGATTTGGCGAACGAGA 3’
副溶血弧菌的环介导等温扩增，具体步骤在装有23μL的LAMP反应试的200μL PCR管中加入2μL待检样品DNA模板，于63℃恒温水浴箱放置60min；扩增结果的检测方法主要有以下3种，方法1∶2％(质量体积比)的琼脂糖电泳检测是否产生连续的DNA扩增；方法2：采用浊度仪检测管内浊度变化，可进行实时定量检测；方法3：反应产物中加入SYBRGreen I荧光染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。本发明采用方法1和方法3进行检测结果的判定。
一种食品中副溶血弧菌活菌的检测方法，其步骤是：
(1)动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取25g(25mL)样品，加入装有225mL 3.5％(质量体积比)灭菌盐水，用均质器打碎，取10mL接种于100mL 3％(质量体积比)氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养基内，于37℃培养8h～16h。
(2)取1mL过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭(EMA)至终浓度为150μg/mL，暗处放置10-15min，随后将整个EP管暴露在500W卤素灯下4-6min，卤素灯离样品约15cm。整个光激发过程在冰上进行，以防止温度的升高。
(3)采取DNA快速提取法提取样品中的DNA，即将叠氮溴化乙锭(EMA)处理过的菌液煮沸8-12min，短暂离心，取离心后的上清液为环介导等温扩增法(LAMP)反应的模板DNA。此方法提取DNA较简单，适用于现场采样检测，无需特殊设备。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明解决了现有技术检测副溶血弧菌所需周期长、检测成本高、现有副溶血弧菌检测试剂盒无法区分检测样本中副溶血弧菌是否是活菌的不足，本专利提供一套快速检测食品中副溶血弧菌活体菌的EMA-LAMP法检测试剂盒，具有快速、高效、准确性高、灵敏度高、现场应用方便等特点，可广泛适用于食品，卫生，出入境等检测领域。实验室EMA-LAMP检测副溶血弧菌的最低检测限为1×10CFU/mL，在现场采样检测中EMA-LAMP检测副溶血弧菌的最低检测限一般可达1×10～1×102CFU/mL，现场检测可在1.5h内完成整个检测过程，与中华人民共和国国家标准GB/T4789.7-2008的检测方法进行对比，其检测结果准确性一致。
附图说明
图1为一种副溶血弧菌PCR和LAMP检测结果示意图。
PCR与LAMP扩增在2％琼脂糖电泳结果。泳道1～9分别以1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10CFU/mL菌悬液为模板的PCR扩增产物；泳道10为marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道11～19分别以1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10CFU/mL菌悬液为模板的LAMP扩增产物。
图2为一种EMA-LAMP特异性检测结果示意图。
EMA-LAMP扩增在2％琼脂糖电泳结果。泳道1为marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道2～7分别以6株副溶血弧菌菌悬液(1×103CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物；泳道8～12分别以5株非副溶血弧菌的菌悬液(1×103CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物；泳道13为阴性对照。
图3为一种热致死细胞、活细胞的EMA-LAMP扩增示意图。
EMA-LAMP扩增在2％琼脂糖电泳结果。图3A(左)：泳道1为marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道2～5分别为未经过EMA处理的死菌菌悬液(1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。泳道6～9分别为经EMA处理的死菌菌悬液(1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。图3B(右)：泳道1为marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道2～5分别为未经EMA处理的活菌菌悬液(1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。泳道6～9分别为经EMA处理的活菌菌悬液(1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL)为模板的LAMP扩增产物。
具体实施方式
实施例1：EMA-LAMP检测试剂盒
一种副溶血弧菌EMA-LAMP检测试剂盒，该试剂盒它包括以下成分：10×反应缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、10mM(NH4)2SO4、1.0％(质量体积比)Tritonx-100，pH 8.8)、Bst DNA聚合酶(New England Biolabs LTD)、10mM dNTPs(New England Biolabs LTD)、100mM MgSO4(New England Biolabs LTD)、去离子水、引物(引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R)、1.5mg/mL EMA(Sigma公司)，1000×SYBR Green I荧光染料。
表1引物序列表
以上引物有上海生工生物工程有限公司合成。
实施例2：EMA-LAMP检测试剂盒检测方法
一种食品中副溶血弧菌活菌的检测方法，检测方法分为两种情况，第一种情况是现场快速检测，第二种情况是实验室检测。适用于现场快速检测主要步骤分为EMA处理样品，DNA模板快速提取，EAM-LAMP扩增反应，采用实施例2中方法3对检测结果进行判定。适用于实验室检测主要步骤分为样品富集培养，EMA处理样品，DNA模板快速提取，EAM-LAMP扩增反应，采用实施例2中方法1或方法3对检测结果进行判定。具体步骤如下：
样品富集培养：动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味品及其他加工食品均应经过前增菌。即以无菌操作取25g(25mL)样品，加入装有225mL 3.5％(质量体积比)灭菌盐水，用均质器打碎，取10mL接种于100mL 3％(质量体积比)氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养基内，于37℃培养8h或10或12或14或16h。
EMA处理样品：取1mL过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭(EMA)至终浓度为150μg/mL，暗处放置10或12或14或15min，随后将整个EP管暴露在500W卤素灯下4或5或6min，卤素灯离样品约15cm。整个光激发过程在冰上进行，以防止温度的升高。
样品DNA模板快速提：将叠氮溴化乙锭(EMA)处理过的菌液煮沸8或9或10或11或12min，短暂离心，取离心后的上清液为环介导等温扩增法(EMA-LAMP)反应的模板DNA。此方法提取DNA较简单，适用于现场采样检测，无需特殊设备。
副溶血弧菌的环介导等温扩增，具体步骤如下：EMA-LAMP反应体系(25μL)：在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer 2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物(引物FIP和BIP终浓度为1.6μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为0.8μM)，样品DNA模板和DNase/RNase-Free ddH2O。在63℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。
EMA-LAMP反应体系包括：
扩增结果的检测方法主要有以下3种，方法1∶2％(质量体积比)的琼脂糖电泳检测是否产生连续的DNA扩增；方法2：采用浊度仪检测管内浊度变化，可进行实时定量检测；方法3：反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。本发明采用方法1和方法3进行检测结果的判定。
方法1适用于实验室检测，方法3适用于现场快速检测。方法1具体步骤如下：待63℃水浴中反应60min后，将反应管放入85℃水浴中温浴10min，使BstDNA聚合酶失活。扩增产物在2％(质量体积比)琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为8μL/上样孔。当反应体系中存在副溶血弧菌DNA时，LAMP法扩增反应会产生大量的、大小不等的DNA重复序列，凝胶上呈现典型的梯型电泳条带。方法3具体步骤如下：待63℃水浴中反应60min后，将反应管放入85℃水浴中温浴10min，使Bst DNA聚合酶失活。向反应管中加入1000×SYBR Green I荧光染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。
实施例3：副溶血弧菌的PCR检测试验
根据GenBank公布的副溶血弧菌tlh基因序列(Accession number：M36437)，应用Primer 5设计特异性引物。上游引物为F1：AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG；下游引物F2为：GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC，扩增片段大小约为450bp。20μL的扩增体系包括：2μL 10×反应液，1μL DNA模板，上下游引物各1μL(0.2μM)，2μL dNTP mixture，1μLKOD-Plus Taq酶，1μL 25mM MgSO4，11μL DNase/RNase-Free ddH2O。PCR反应体系：94℃预变性5min，30个循环，每个循环94℃30s、55℃30s、68℃30s，68℃5min。扩增产物在2％(质量体积比)琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为8μL/上样孔。
实施例4：副溶血弧菌LAMP法检测灵敏度试验
为了检验LAMP反应的灵敏性和LAMP反应的最低检测限，挑取副溶血弧菌ATCC17802(购于广州省微生物研究所)的单菌落，接种于富集培养基中，即3％(质量体积比)氯化钠碱性蛋白胨水(蛋白胨10.0g、氯化钠30.0g，加去离子水定容至1000mL，经过121℃15min灭菌，备用)，36℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后的菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取一定量0.1mL菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度为1×109CFU/mL，依次稀释为1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10CFU/mL的菌悬液，在100℃沸水中煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清液作为DNA模板备用。
以上述各稀释浓度的菌悬液上清为DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer 2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物(引物FIP和BIP终浓度为1.6μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为0.8μM)，DNA模板和DNase/RNase-Free ddH2O。在63℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。扩增产物在2％(质量体积比)琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为8μL/上样孔。
结果验证：当反应体系中存在副溶血弧菌DNA时，LAMP法扩增反应会产生大量的、大小不等的DNA重复序列，凝胶上呈现典型的梯型电泳条带。检测结果如图1所示。由图1可知，LAMP检测副溶血弧菌ATCC17802的最低限为1×10CFU/mL。
同时将上述各稀释浓度的菌悬液上清为DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入2μL10×反应液，1μL DNA模板，上下游引物各1μL(0.2μM)，2μL dNTP mixture，1μL KOD-PlusTaq酶，1μL 25mM MgSO4，11μL DNase/RNase-Free ddH2O。PCR反应体系：94℃预变性5min，30个循环，每个循环94℃30s、55℃30s、68℃30s，68℃5min。扩增产物在2％(质量体积比)琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为8μL/上样孔。
结果验证：当反应体系中存在副溶血弧菌DNA时，PCR法扩增反应会产生特异大小条带，即凝胶上呈现典型的特异电泳条带。检测结果如图1所示。由图1可知，PCR检测副溶血弧菌ATCC17802的最低限为1×103CFU/mL。
实施例5：副溶血弧菌LAMP法检测特异性试验
将6株副溶血弧菌单菌落，接种于3％(质量体积比)氯化钠碱性蛋白胨水中，36℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后的菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取0.1mL菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度为1×103CFU/mL。同时将大肠埃希氏菌ATCC8739(购于广州省微生物研究所)、单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115(购于广州省微生物研究所)、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028(购于广州省微生物研究所)、金黄色葡萄球菌ATCC6538(购于广州省微生物研究所)、铜绿假单胞杆菌ATCC9027(购于广州省微生物研究所)落接种于LB液体培养基(胰化蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。121℃高压(0.115兆帕)，灭菌15分钟备用。)中，37℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取一定量菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度为1×103CFU/mL。分别取上述调整后的菌悬液1mL，加入EMA至终浓度为150μg/mL，暗处放置15min，随后将整个EP管暴露在500W卤素灯下5min，卤素灯离样品约15cm。整个光激发过程在冰上进行，以防止温度的升高。将EMA处理过的菌液短暂离心，取上清液为LAMP反应的模板DNA。以上述菌悬液上清为DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer 2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物(引物FIP和BIP终浓度为1.6μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为0.8μM)，DNA模板和DNase/RNase-Free ddH2O。在63℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。扩增产物在2％(质量体积比)琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为8μL/上样孔。
结果验证：6株副溶血弧菌在凝胶上呈现典型的梯型电泳条带，5株非副溶血弧菌在凝胶上无均无扩增条带，去离子水作为阴性对照，也无扩增条带。上述试验结果表明，6株副溶血弧菌均呈阳性反应结果，其他5株非副溶血弧菌均为呈阴性反应结果(图2)。
实施例6：EMA-LAMP鉴别样品中活细胞
挑取副溶血弧菌ATCC17802的单菌落，接种于3％(质量体积比)氯化钠碱性蛋白胨水中，36℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后的菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取一定量菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度依次为1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL，依次取0.5mL菌悬液于1.5mL离心管中，高温(121℃)高压(0.115兆帕)处理15min，将经高压(0.115兆帕)高温(121℃)处理的菌悬液(0.1mL)室温放置冷却至室温(20-25℃)后涂布于弧菌显色培养基平板，36℃培养24h检测是否仍有活菌存在。经过高温高压灭菌后检测后无副溶血弧菌ATCC17802活菌存在。将EMA(1.5mg/mL)依次加入装有0.5mL经过上述热致死副溶血弧菌ATCC17802菌悬液(1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL)离心管中，使EMA终浓度为150μg/mL；不加EMA的作为对照。同时将EMA(1.5mg/mL)依次加入装有0.5mL副溶血弧菌活菌(1×104、1×103、1×102、10CFU/mL)离心管中，使EMA终浓度为150μg/mL。不加EMA的作为对照。将经EMA处理的菌悬液在暗室中室温放置15min，然后将离心管开盖放置冰上，卤钨灯(500W)约15cm，曝光时间为5min。以试验组1和试验组2处理的菌悬液上清为EMA-LAMP反应的DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer 2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物(引物FIP和BIP终浓度为1.6μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为0.8μM)，DNA模板和DNase/RNase-Free ddH2O。在63℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。扩增产物在2％(质量体积比)琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为8μL/上样孔。
结果验证：试验组1试验结果如图3A所示。由图3A可知，热致死细胞的菌悬液经质量浓度为150μg/mL EMA处理后，热致死细胞的DNA的LAMP扩增被完全抑制。而对照组未经EMA处理的细胞DNA的LAMP扩增没有受到影响。试验组2试验结果如图3B所示。由图3B可知，活细胞的菌悬液经浓度为150μg/mL EMA处理后LAMP扩增没有受到影响，在凝胶上呈现典型的梯型电泳条带。
Claims (2)
1.一种副溶血弧菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括以下成分：10×反应缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；MgSO4；DNase/RNase-Free ddH2O；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；叠氮溴化乙锭；1000×SYBR Green I 荧光染料；
所述的10×反应缓冲液配方：200 mM Tris-HCl、100 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、1.0% 质量体积比Tritonx-100；
所述的引物F3：5，AGCTACTCGAAAGATGATCC 3，；
所述的引物B3：5，GGTTGTATGAGAAGCGATTG 3，；
所述的引物FIP：5，ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT 3，；
所述的引物BIP：5，ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG 3，；
所述的引物Loop-F：5，ACCAGTAGCCGTCAATG 3，；
所述的引物Loop-R：5，TTAGATTTGGCGAACGAGA 3，。
2.权利要求1所述的一种食品中副溶血弧菌活菌的检测方法，其步骤是：
（1）动物性水产品干制品、腌醉制生食动物性水产品、食藻类食品、鱼糜制品水产食品和水产调味品及加工食品经过前增菌，即以无菌操作取25 g样品，加入装有225 mL 3.5%质量体积比灭菌盐水中，用均质器打碎，取10 mL接种于100 mL 3%质量体积比氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养基内，于37℃培养8h～16h；
（2）取1 mL过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭至终浓度为150 μg/mL，暗处放置10-15 min，随后将整个EP 管暴露在500 W卤素灯下4-6 min，卤素灯离样品15 cm，整个光激发过程在冰上进行；
（3）采取DNA快速提取法提取样品中的DNA，将叠氮溴化乙锭处理过的菌液煮沸8-12 min，离心，取离心后的上清液为环介导等温扩增反应的模板DNA，提取的模板DNA适用于现场采样检测及实验室检测。
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