CN105803057A

CN105803057A - 一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂

Info

Publication number: CN105803057A
Application number: CN201510833778.5A
Authority: CN
Inventors: 于佳; 魏玉西; 刘寅; 何雨蓉; 陈双; 张文嘉
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2016-07-27

Abstract

本发明涉及一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂，该试剂通过对等温环介导扩增所使用的引物组中的前内引物标记一种抗原同时对后内引物标记另一种抗原，能够在扩增副溶血弧菌特异性16S-23S rRNA基因间区序列的同时进行标记，后使用配套的胶体金试纸检测扩增产物，从而检测副溶血弧菌。由于在设计针对16S-23S rRNA基因间区序列的引物是进行RNA二级结构预测，尽可能避免使用其他蛋白基因和盲目使用rRNA基因中突变对检测灵敏度和特异性的影响，本发明的检测试剂特异性强、灵敏度高。

Description

一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂

技术领域

本发明涉及一种应用于核酸检测的试剂，具体讲，涉及一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂。

背景技术

副溶血弧菌是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血弧菌的快速检测对其引起的疾病防控具有重要的意义。

环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification）是一种新型的核酸检测技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，在60℃～65℃恒温扩增，60分钟左右即可实现10⁹～10¹⁰倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强等特点。该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应。其扩增结果可以通过凝胶电泳、肉眼观察焦磷酸镁沉淀或加入荧光物质后的颜色改变来做初步的判断。但该方法也有一定的缺陷，主要表现在扩增结果检测环节，凝胶电泳检测容易造成污染，焦磷酸镁沉淀检测灵敏度较差，荧光物质变色方法受到荧光物质的成本或者需要使用检测仪器的限制。因此，在产物检测环节的限制，影响了该技术的推广应用。

本发明公开了一种新型的等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂，该试剂针对副溶血弧菌的16S-23SrRNA基因间区序列进行引物设计，在引物设计之前进行了RNA二级结构预测，尽可能避免使用其他蛋白基因和盲目使用rRNA基因中突变对检测灵敏度和特异性的影响。该方法具有本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高，结果判断更准确的优势。。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂。

本发明的第二发明目的在于提供一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测方法。

本发明的第三发明目的在于提供这种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂盒的应用。

发明的主要技术方案为：

1.等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂的组成为：

（1）核酸恒温标记扩增反应试剂

核酸恒温扩增反应液中含有前外引物、后外引物、前促环引物、后促环引物、前内引物、后内引物、dNTPs溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶（如：BstDNA聚合酶等）、MgSO₄、无菌双蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。

环介导等温扩增的缓冲液的最终工作浓度为20mMTris-HCl、10mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mMMgSO₄以及质量浓度为0.1%TritonX-100，缓冲液的pH值为8.8。

其中前外引物、后外引物、前内引物、后内引物均为人工合成的脱氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列为SEQIDNO:1、后外引物的核苷酸序列为SEQIDNO:2、前内引物的核苷酸序列为SEQIDNO:3、后内引物的核苷酸序列为SEQIDNO:4，上述引物分别与待测基因的相应位置互为反义互补序列，上述引物能够在等温条件下以环介导的方式检测待测基因。将前内引物的5’端标记上生物素基团，将后内引物的5’端标记上异硫氰酸荧光素基团。

各引物的具体核苷酸序列如下：

SEQIDNO:15’-TTTAACAATTTGGAAAGCTG-3’,

SEQIDNO:25’-CCATACAACCCGAGGAGTT-3’,

SEQIDNO:35’-GAACGCTTGAATGTGTTTTTGTTGTTTGTAAAGTTCTCAA-3’,

SEQIDNO:45’-CTTGGAATTTGAGTCGGCATTTAGTCACCAAAGTTGTCTGC-3’。

引物的设计参见附图1，其中SEQIDNO:1为F3序列，SEQIDNO:2为B3序列，SEQIDNO:3为F2和F1序列的组合，SEQIDNO:4为B2和B1序列的组合，上述序列即不处于高突变的突出环部分，也不像编码蛋白产物的基因那样由于同义密码子突变不会引起蛋白产物的变异，而产生基因多样性，导致引物设计时不能和全部基因型匹配。极大的提高了检测的灵敏度和特异性。

（2）标记核酸胶体金检测试纸条

该试纸条的组成包括样品垫、金胶垫、醋酸纤维素膜（膜上由相应的抗体组成的检测线和质控线）和吸水垫等，具体组成参见附图2。该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒，胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体，胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。

2.使用等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂的具体步骤为：

（1）将待检测的DNA溶液，加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中；在对照PCR管中分别加入阳性对照试剂和阴性对照试剂，将上述PCR管在60～65℃下扩增反应30～60分钟，优选条件为60℃下扩增反应60分钟。

（2）利用标记核酸胶体金检测试纸条，检测PCR管中反应后的核酸扩增产物。

下面对本发明的技术方案作进一步的解释和说明：

等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂能够在60～65℃下将副溶血弧菌的DNA进行扩增，在扩增的同时，由于前内引物和后内引物分别标记有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团，因此在DNA扩增产物上同时含有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团。

上述扩增产物滴加在核酸胶体金检测试纸条的样品垫上，在层析作用下，扩增产物在经过金胶垫时双标记的核酸扩增产物由于携带有生物素基团和异硫氰酸荧光素基团，因此能够和标记有金颗粒的抗生物素抗体结合形成核酸抗体复合物；核酸抗体复合物在醋酸纤维素膜上层析，经过检测线时该复合物由于带有异硫氰酸荧光素基团，因此能够和检测线上的抗异硫氰酸荧光素抗体结合，形成复合物，该复合物由于携带有有色的标记物（纳米金颗粒呈红色），此时检测线呈现红色；当核酸抗体复合物或者单独的标记抗生物素抗体经过质控线时，由于质控线上含有能够结合抗生物素抗体的二抗，所以只要有标记的抗生物素抗体层析至质控线，无论该抗体是否结合有标记的核酸，均能够形成二抗和标记抗体的复合物，该复合物由于携带有有色的标记物（纳米金颗粒呈红色），此时质控线呈现红色。

本发明的相对传统环介导等温核酸扩增技术具有灵敏度更高，结果判断更准确的优势。首先，本发明的新型恒温环介导核酸标记检测试剂，使用标记的引物，使得环介导等温扩增后，扩增产物携带了两种抗原标记物。这样的双标记核酸扩增产物，能够被制备好的胶体金试纸条检测出来。当含有双标记扩增产物的样本在胶体金试纸上层析时，双标记产物能够结合携带有有色颗粒标记的抗体，在检测线上呈现红色，这样目的扩增产物可以通过试纸上检测线的颜色改变显示出来。即使有很少的扩增产物也能够进行准确的检测，因此有效地提高了检测灵敏度。其次，检测反应的结果通过胶体金检测试纸的检测线得到，相对于浊度观察法和荧光燃料变色法读取结果更加准确，避免了由于检验人员主观判断带来的结果偏差。上述检测方法扩大了该检测试剂的应用范围，使之可以广泛应用于野外现场等特殊环境。此方法操作简单、时间短，同时也降低了检测成本，使得检测结果更加快速、可靠，具有免疫与核酸诊断试剂各自的优点。该技术由于操作简单、快速、低廉的成本和防止核酸扩增物对实验室的污染，对于病原体的检测具有重大意义。

附图说明

附图1引物设计

F3区域为SEQIDNO:1的来源，B3序列为SEQIDNO:2的来源，F2和F1序列的组合为SEQIDNO:3的来源，B2和B1序列的组合为SEQIDNO:4的来源。

附图2胶体金试纸条的组成。

该试纸条的组成包括样品垫（1）、金胶垫（2）、醋酸纤维素膜（3）、质控线（4）、检测线（5）和吸水垫（6）。该胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒，胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体，胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。

附图3副溶血弧菌标记扩增检测结果

加入的扩增DNA模板如下，1号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10⁴拷贝；2号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10³拷贝；3号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10²拷贝；4号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10¹拷贝；5号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10⁰拷贝；6号为待测样品；7号条为加入的双蒸水进行阴性对照。

下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明。

具体实施方式

本发明的具体实施方式仅对本发明做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容进行限制。

实施例1：副溶血弧菌DNA基因组梯度稀释标记扩增检测

取浓度已知的副溶血弧菌DNA基因组对其进行10倍梯度稀释，稀释至副溶血弧菌DNA中的目的基因终浓度为10⁰拷贝/μL，取副溶血弧菌DNA模板标准品制备的阳性参照物，阴性参照物，以及副溶血弧菌DNA梯度稀释液（在PCR管中副溶血弧菌特异性目的基因的终浓度分别为10⁴拷贝、10³拷贝、10²拷贝、10¹拷贝和10⁰拷贝），做为模板进行标记扩增检测。

等温扩增中的各组分构成比例如下：

1倍缓冲液中各物质组成如下：20mMTris-HCl、10mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mMMgSO₄以及质量浓度为0.1%TritonX-100，缓冲液的pH值为8.8，10倍缓冲液的各组份浓度是1倍缓冲液中各组份浓度的10倍。

将上述混合物加入到PCR管中，在水浴锅中进行等温扩增，扩增步骤为：60℃，30分钟；80℃，2分钟。

将扩增产物加于胶体金检测试纸条上，在15分钟之内读取结果，当检测线和质控线都呈现红色时为阳性结果；当检测线无色、质控线呈现红色时为阴性结果；当质控线无色时，实验失败，需要重新进行实验。

浓度已知的副溶血弧菌DNA基因组进行梯度稀释，分别加入为副溶血弧菌DNA模板标准品制备的阳性参照物、10⁴-10⁰拷贝目的基因的副溶血弧菌DNA和用于做参照的无菌水，扩增结果为其中阳性参照物和10⁴-10⁰拷贝目的基因的扩增产物均为阳性，阴性参照物的扩增结果为阴性。

实施例2：副溶血弧菌的检测

样本：某DNA样本怀疑为副溶血弧菌。

取该样本进行等温标记扩增检测扩增，扩增的同时使用副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10⁴拷贝~10⁰拷贝的DNA样本和无菌双蒸水的阴性对照同时进行检测。

实施例2的结果见附图3所示，各扩增产物中加入的DNA模板如下，1号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10⁴拷贝；2号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10³拷贝；3号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10²拷贝；4号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10¹拷贝；5号条为副溶血弧菌DNA模板标准品其中含目的基因约10⁰拷贝；6号为待测样品；7号条为加入的双蒸水进行阴性对照。

<110>青岛大学

<120>一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂

<160>4

<170>patentversion2.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>1

tttaacaatttggaaagctg

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>2

ccatacaacccgaggagtt

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>3

gaacgcttgaatgtgtttttgttgtttgtaaagttctcaa

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>4

cttggaatttgagtcggcatttagtcaccaaagttgtctgc

Claims

1.一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包括副溶血弧菌等温环介导核酸标记扩增反应液，该反应液中含有前外引物、后外引物、5’端标记生物素基团的前内引物、5’端标记异硫氰酸荧光素基团的后内引物、dNTPs溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶（如：BstDNA聚合酶）、MgSO₄、无菌双蒸水以及环介导等温扩增的缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂，其特征在于，使用的前外引物、后外引物、前内引物和后内引物是使用副溶血弧菌16S-23SrRNA基因序列设计的，并且在设计之前通过预测RNA二级结构，避免基因多样性引起的引物与突变型不匹配的现象，上述引物的序列如下：

SEQIDNO:15’-tttaacaatttggaaagctg-3’,

SEQIDNO:25’-ccatacaacccgaggagtt-3’,

SEQIDNO:35’-gaacgcttgaatgtgtttttgttgtttgtaaagttctcaa-3’,

SEQIDNO:45’-cttggaatttgagtcggcatttagtcaccaaagttgtctgc-3’。

3.根据权利要求1所述的一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂，其特征在于，使用该试剂，能够在扩增目的基因的同时将扩增产物DNA上标记生物素基团和异硫氰酸荧光素基团。

4.根据权利要求1所述的一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂，其特征在于，将提取得到的待测DNA溶液作为扩增模板加入到装有核酸恒温标记扩增反应液的PCR管中，在60～65℃下扩增反应30～60分钟，优选60℃下扩增反应60分钟。

5.一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂所使用的胶体金检测试纸，其特征在于，胶体金检测试纸的金胶垫上含有标记后抗生物素抗体的金颗粒，胶体金检测试纸层析膜的检测线上包被有抗异硫氰酸生物素抗体，胶体金检测试纸层析膜的质控线上包被有能和金颗粒上标记的抗生物素抗体结合的二抗。

6.根据权利要求4所述的一种新型等温环介导副溶血弧菌核酸标记检测试剂所使用的胶体金检测试纸，其特征在于，将待测标记扩增产物滴加在检测试纸的样品垫上，当检测线和质控线都呈现红色时表明DNA样品中含有副溶血弧菌的待测基因，当检测线无色而质控线呈现红色表明DNA样品中不含有副溶血弧菌的待测基因。