CN105039598A

CN105039598A - 一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒

Info

Publication number: CN105039598A
Application number: CN201510501378.4A
Authority: CN
Inventors: 张文超; 孙嘉鹏; 赵赫
Original assignee: Heilongjiang Bio-Captain Biotech Co Ltd
Current assignee: Heilongjiang Bio-Captain Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-08-14
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明涉及一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒，基于由环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒检测方法。是一种基于环介导等温扩增技术原理对样本中中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因进行核酸检测。通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术平台扩增靶基因ORF1a2，在一系列和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对样本中的中东呼吸综合征冠状病毒进行筛查或检测。本发明的方法具有简便、经济、快速、灵敏和特异的特点，克服了现有技术费时费力成本高的缺陷，具有广阔的应用前景。

Description

一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒

技术领域

本发明属于临床医学领域，生物诊断试剂，涉及一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2（MERS-CoV）基因检测试剂盒，是一种基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法。

背景技术

冠状病毒是一大类能导致人类疾病的病毒，其临床表现涵盖了从普通感冒到严重急性呼吸综合征（SARS）的一个很大的范围。该类病毒也能在许多种动物中引起疾病。2012年底，在中东居民身上发现了一种新的冠状病毒，这种冠状病毒以往从未在人类中发现过。该病毒被命名为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），现已发现至少50多例实验室确诊的人类感染病例。目前，所有感染MERS-CoV的病例都和中东地区有直接或间接的联系，但是在其他国家近期前往中东旅行的人群中已发现局部的非持续的人际传播发生。所有MERS-CoV感染病例主要表现为呼吸道疾病，也有一些后续并发症报道，如急性肾功能衰竭，多器官功能衰竭，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和消耗性凝血病等。此外，许多病例出现胃肠道症状，如腹泻。超过一半的病例死亡。大多数病例至少存在一种合并的疾病，但许多病例既往身体健康。很小一部分病例合并感染有其他病原体，如流感病毒，副流感病毒，单纯疱疹病毒和肺炎球菌等。截至2013年6月6日，实验室确诊病例的平均年龄为56岁（范围2–94岁），且多数是男性（72%）。MERS-CoV被认为是一种动物病毒，偶尔感染人类并导致有限的人际传播。该病毒已被证明在过去通常用于诊断性病毒培养的细胞中生长良好。

目前基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的基因检测技术，检测方法主要包括PCR（聚合酶链式反应）技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以PCR技术应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等方法。普通定性PCR方法检测效率低，尤其检测多基因对象时更加费时费力；巢式PCR虽然提高了检测的灵敏度，但同样存在检测效率的问题；多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但常规的电泳检测结果很难判断，容易出现假阳性和假阴性结果；荧光定量PCR方法灵敏度高，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。基因芯片也是常用的转基因产品检测技术，目前一般采用玻璃片作为固相支持物，实验过程需要相应的点样仪和芯片识读仪，同样成本较高。

2000年日本学者Notomi在NucleicAcidsRes杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即环介导等温扩增反应(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)。其特征是针对靶基因的8个区域设计6种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（BstDNApolymerase）在恒温条件（65℃）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，短时间扩增效率达到10⁹-10¹⁰个拷贝。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或显色反应进行判断是否发生反应。该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，LAMP法具有高特异性、高效性、快速廉价（不需要特定的贵重检测设备，至于要简单结构的恒温箱）、易检测（直接进行目测判断）等特点。

通过该项技术可以达到以下目的：一是检测能力进一步提高，LAMP检测技术的检测限高于涂片法100-200倍，这样就有利的解决了传统的抗酸染色阳性检出率较低的问题（有文献表明30%左右）；二是由于经典聚合酶链反应（PCR）扩增技术对仪器设备要求较高（如PCR扩增仪，琼脂凝胶电泳系统等）、技术较为复杂，而LAMP检测技术具有仪器设备要求简单（只需要简单结构的恒温箱）、检测时间短（0.5-1.0小时）、特异性高（针对8个区域设计6种特异引物）等特点，因此，该检测方法简便、经济、快速、灵敏和特异，将具有非常好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，为了克服现有技术费时费力成本高的缺陷，提供一种简便、经济、快速、灵敏和特异的中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒。

本发明这样实现的：一种基于环介导等温扩增技术原理对样本中中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因进行核酸检测。通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术平台扩增靶基因ORF1a2的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对样本中的中东呼吸综合征冠状病毒进行筛查或检测。

所述的LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域是指中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因的特定靶赫酸序列区域。

进一步地，在本发明所述的筛查检测方法中，在LAMP对样本筛查过程中引入了阴阳性对照检测系统，阳性对照质控品为相同于扩增冠状病毒靶基因ORF1a2的RNA，阴性对照质控品为不相同于扩增冠状病毒靶基因ORF1a2的RNA，并使用时间分辨浊度法或Smartgreen荧光染料紫外灯下显色法同时检测阴阳对照和中东呼吸综合征冠状病毒靶基因扩增产物。

在现有的LAMP技术的公开文献中，没有将LAMP用于中东呼吸综合征冠状病毒筛查的报道。本发明通过使用特异性引物，利用环介导等温扩增技术平台扩增靶基因ORF1a2的特定区域，在一系列和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对样本中的中东呼吸综合征冠状病毒进行筛查或检测。

本发明具有严格的鉴别筛查诊断体系，以保证检测结果的准确性。该鉴别筛查诊断系统由阳性和阴性质控品，内对照质控品以及相关扩增和检测体系组成。

本发明中鉴别筛查诊断系统的阳性和阴性质控品是每批试验检测结果是否有效的重要标志。对于每批试验，必须引入一个阴性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阳性结果；对于每批实验，必须引入一个中东呼吸综合征冠状病毒阳性质控品的检测，以保证反应体系不会出现假阴性结果。针对中东呼吸综合征冠状病毒的阳性质控品是人工构建的包含中东呼吸综合征冠状病毒待检靶序列的质粒DNA。

本发明鉴别诊断系统中的特异性扩增产物均通过核酸合成设备制备。核酸合成设备可选用不同厂家，不同型号的产品，也可委托相关的基因公司合成。所有引物按照LAMP引物设计原则，通过日本荣研化学网站（www.eiken.co.jp）上引物设计软件设计。本发明鉴别诊断系统中的LAMP体系及反应程序均由发明人设计，中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因的核酸特异性引物序列、LAMP反应体系及反应程序如下：

引物设计

通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因片段，针对该片段的六个位点设计出LAMP引物并合成，得到如下的引物；引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成：

FOP：GTTTGCACTTATGCCATC

BOP：TCATAGACACCCATAGGTGC

FIP：ATAATAAAAGTATCATCTTCTTTTTTGCTTACTCACCACAGC

BIP：CACATGTTTAGGTTTCATGTTTTTTAAGCTTAAGGTTCAAAGAGA

FLP：CTTCCGGAAACACAAGTGTA

BLP：ACTTGCTATTTGGTGTC

反应体系（反应总体积为25μl)

FIP/BIP1.6μmol/L

FOP/BOP0.8μmol/L

FLP/BLP0.2μmol/L

10X的BstDNA聚合酶反应体系buffer2.5μL

10mM脱氧核糖核苷酸dNTP1μL

氯化镁25mMMgCl₂4.5μL

BstDNA聚合酶1.0μL

模板2.0μL

超纯水补至25μL

扩增反应：65℃水浴20-60分钟。

检测：荧光显色：LAMP扩增的每个管中加入1.0μL20XSmartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下（波长302nm）显影。通过浊度仪获得实时的反应液中浊度的变化数据，并进行图像处理，判定结果。

本发明的优点是：方法具有简便、经济、灵敏和特异的特点，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

鉴别诊断系统的检测方法，依次按下述步骤进行：

（1）病毒RNA提取：采用传统RNA提取试剂盒提取，也可使用提取试剂盒提取；

（2）反转录：按常规反转录方法进行；

（3）LAMP反应：准备上述反应体系，将反应体系混匀，分装到0.2ml的PCR反应管中，每管23μl，PCR反应管中分别加入（2）步骤反转录的模板，每管2μl，阳性对照品和阴性对照品个2μl，分别作阳性对照、阴性对照，混合均匀。放入实时浊度仪或恒温水浴箱，设定反应条件：65℃，60分钟；80℃，5分钟终止反应，4℃保存，加Smartgreen荧光染料混匀，在紫外灯下显影（波长302nm）；

（4）结果判定：本发明扩增产物的检测采用浊度法。在Mg²⁺作用下，LAMP扩增产生的长链核酸分子能相互交联成絮状沉淀，且沉淀的量随扩增产物的增加而增加。因此实验结果的判定有如下两种方法：

定性观察：在反应结束后，实验结果可以通过肉眼观察Smartgreen荧光染料在（见图1）。

实时监测：可以通过浊度仪获得实时的反应液中浊度的变化数据，并进行图像处理，判定结果（见图2）。

附图说明

附图1显示了LAMP反应Smartgreen荧光染料在紫外灯下（波长302nm）显影，肉眼观察结果，左侧样品为阳性，右侧样本为阴性。

附图２显示了通过浊度仪获得实时的反应液中浊度的变化数据。1-4号为不同浓度的阳性样本，5，6号为阴性样本。

SEQUENCELISTING

<110>黑龙江博腾生物科技有限公司

<120>一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒

<160>6

<210>1　

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

GTTTGCACTTATGCCATC18

<210>2　

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

TCATAGACACCCATAGGTGC20

<210>3　

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ATAATAAAAGTATCATCTTCTTTTTTGCTTACTCACCACAGC42

<210>4　

<211>45

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

CACATGTTTAGGTTTCATGTTTTTTAAGCTTAAGGTTCAAAGAGA45

<210>5　

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CTTCCGGAAACACAAGTGTA20

<210>6　

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

ACTTGCTATTTGGTGTC17

Claims

1.一种环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸检测方法，利用环介导等温扩增技术来进行，其特征在于，通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因ORF1a2基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内对照检测体系的辅助下，从分子水平对样本中的中东呼吸综合征冠状病毒进行筛查或检测。

2.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于所述的LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域是指中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因的特定靶核酸序列区域。

3.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于所述的阴阳性对照检测体系中，阳性对照质控品为相同于扩增冠状病毒靶基因ORF1a2的RNA，阴性对照质控品为不相同于扩增冠状病毒靶基因ORF1a2的RNA，并使用时间分辨浊度法或Smartgreen荧光染料紫外灯下显色法同时检测阴阳对照和中东呼吸综合征冠状病毒靶基因扩增产物。

4.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于，所述的特异性引物为：

FOP：GTTTGCACTTATGCCATC

BOP：TCATAGACACCCATAGGTGC

FIP：ATAATAAAAGTATCATCTTCTTTTTTGCTTACTCACCACAGC

BIP：CACATGTTTAGGTTTCATGTTTTTTAAGCTTAAGGTTCAAAGAGA

FLP：CTTCCGGAAACACAAGTGTA

BLP：ACTTGCTATTTGGTGTC。

5.根据权利要求1所述的基于环介导等温扩增技术的中东呼吸综合征冠状病毒核酸筛查方法，其特征在于，所用的LAMP反应体系是由下述一系列通过优化的反应成分组成：

FIP/BIP0.2-2μmol/L

FOP/BOP0.1-1μmol/L

FLP/BLP0.1-1μmol/L

10X的BstDNA聚合酶反应体系buffer2.5μL

10mM脱氧核糖核苷酸dNTP0.5-1.5μL

氯化镁25mMMgCl₂4.5μL

BstDNA聚合酶1.0μL

模板2.0μL

超纯水补至25μL。