JP6936674B2 - デジタルポリメラーゼ連鎖反応における反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法 - Google Patents

Description

本発明は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）における反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法、およびｄＰＣＲを用いて、試料中の関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法に関する。

多くの生物学的、生化学的、診断または療法目的のため、試料中の核酸の量または濃度を正確にそして的確に決定することが必要である。ｄＰＣＲは、核酸の絶対定量化および稀なアレルの検出のための、慣用的なリアルタイム定量的ＰＣＲに対する代替法を提供する、核酸検出および定量化のためのかなり新しいアプローチである。ｄＰＣＲは、核酸試料を、多くの個々の平行ＰＣＲ反応に分配することによって働き；これらの反応のいくつかは、ターゲット分子を含有する（陽性）一方、他のものは含有しない（陰性）。ＰＣＲ分析に続いて、陰性反応分画を用いて、試料中のターゲット分子数の絶対計測を行う。リアルタイムＰＣＲに勝るｄＰＣＲの重要な利点の１つは、定量化のより優れた正確さである。この利点は、定量化が陽性分配の正確な計数および理論的分配体積の知識のみを必要とする（計測数はＰＣＲ効率にそれほど感受性ではない）ため、ｄＰＣＲの生得的な特性に頼る。定量化標準は必要ではない。これによって、標準自体によって引き起こされる潜在的な定量化誤差が取り除かれる。

先行技術は、正しくない陽性または陰性計数を同定し、そして小滴に基づくアッセイにおけるシグナルを較正するかまたは規準化するための方法を提供する（ＵＳ ２０１３／０３０２７９２ Ａ１）。この規準化は、陽性および陰性計数の間の分離を改善するはずである。したがって、規準化は、偽陽性および偽陰性計測のリスクを減少させる。最終的な目的は、核酸に関して得られるシグナルを補正することによって、核酸濃度決定の正確さおよび的確さを改善することである。

しかし、先行技術の方法は、ｄＰＣＲ反応領域中の真の体積が予期されるものまたは意図されるものと異なる状況による、ＰＣＲにおける定量化誤差を考慮しない。
したがって、反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるｄＰＣＲによって、関心対象の核酸を定量化する方法に関する必要性がある。本発明の目的はこれらの方法を提供することである。

この目的は、各反応領域中の体積が定量化され、そして関心対象の核酸の量または濃度の計算に含まれる、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）に基づく方法によって、解決された。これは、充填対照マーカーを各反応領域に添加することによって実行可能である。

したがって、本発明は、ｄＰＣＲによって核酸を定量化する非常に正確でそして的確な方法だけではなく、試料中の関心対象の核酸の量または濃度のより的確でそして正確な決定を可能にする、ｄＰＣＲ中で用いられる体積も提供する。特に、上記方法は、例えば、不均一な反応領域サイズまたは平均反応領域体積の偏差のための定量化誤差の補正を可能にする。さらに、無効な（例えば空のまたはほぼ空の）反応領域によって引き起こされる定量化誤差を排除可能である。

図１は、（ａ）光源（１）が、対照マーカー（２）で充填されたｄＰＣＲアレイを照射する、ｄＰＣＲアッセイにおける充填反応領域の高さを評価するための例示的なセットアップを例示する。個々の反応領域から生じる対照マーカーの蛍光シグナルが検出装置（３）に到達し、これは本質的に、各反応領域中の液体の高さに比例する。（ｂ）較正のため、同じ対照マーカー溶液で充填された周知の高さ（４）を持つ較正キュベットを用いて、高さを決定する。実験（ａ）におけるものと同じ条件下でシグナルを記録する。 図２は、有効および無効反応領域の模式的提示を示す。無効な反応領域を核酸の量または濃度の計算から外す。 ａ）有効陽性反応領域 ｂ）有効陽性反応領域（閾値より高い充填レベル） ｃ）有効陰性反応領域 ｄ）有効陰性反応領域（閾値より高い充填レベル） ｅ）無効反応領域（反応混合物が存在しない） ｆ）無効反応領域（閾値より低い充填レベル）

１つの側面において、本発明は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）における反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法であって、関心対象の核酸の量または濃度を反応領域のアレイにおいて定量化し、該方法が
ａ）充填対照マーカーを、ｄＰＣＲにおいて用いる反応領域アレイの各反応領域に添加し；
ｂ）各反応領域において、反応体積を定量化し；そして
ｃ）１つの体積におけるまたは体積あたりの、ｄＰＣＲによって決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する、ここで体積が工程ｂ）において決定されるような反応体積の総計である
工程を含む、前記方法に関する。

上に詳述するように、核酸の量または濃度を、信頼性を持って決定する方法は、いくつかの産業適用において、例えば医学分野において、特に関連がある。いくつかの側面に関して、試料中に核酸が存在するかどうかを明瞭にすることが必要であるだけでなく、試料、例えば患者または産物から得た試料において、核酸の量または濃度を、可能な限り的確にそして正確に決定する必要がある可能性もある。これは、例えば疾患の重症度の診断において、あるいは例えば混入物質または不純物を定義するために、環境技術または製品の品質管理において、関心が持たれる可能性もある。

現在のｄＰＣＲ法は、意図される体積中に存在する核酸の数を決定することに重点を置く。しかし、特定の体積中の問題の核酸の量、または体積あたりのその濃度を決定するためには、実際のそして正しい体積を知る必要もある。本発明のｄＰＣＲ法を用いると、核酸の数（すなわち関心がある場合、核酸のコピー数）ならびに核酸が含有される体積が、同時に決定され、したがって、より正確な結果が提供される。

ｄＰＣＲ（デジタルポリメラーゼ連鎖反応、デジタルＰＣＲ反応混合物またはＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ）は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物を含む核酸を直接定量化し、そして場合によってクローン性に増幅するために使用可能な、慣用的ポリメラーゼ連鎖反応法のバイオテクノロジー改良法である。ｄＰＣＲおよび伝統的ＰＣＲ（例えばｑＰＣＲ）の間の重要な相違は、核酸量を測定する方法にあり、前者はＰＣＲよりもより的確でそして正確な方法であるが、また、経験を積んでいない使用者の管理下では、より誤りやすい傾向がある。ｄＰＣＲのより小さいダイナミックレンジは、試料の希釈を必要としうる。ｄＰＣＲはまた、試料内で単一の反応を実行するが、試料を多数の分配または反応領域に分離し、そして反応を各分配または反応領域において、個々に行う。この分離は核酸量のより信頼性がある収集および高感度の測定を可能にする。さらに、該方法は、正確な定量化を可能にする。

上に詳述するとおり、ｄＰＣＲ試料を分配して、試料内の個々の核酸分子が、多くの別個の領域（反応領域）内に局在し、そして濃縮されるようにする。試料の分配は、分子集団がポアソン分布にしたがうと仮定することによって、核酸数の概算を可能にする。その結果、各部分は、陰性または陽性反応（それぞれ「０」または「１」）を含有するであろう。ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ最終産物陽性反応を含有する領域を計数することによって、核酸を定量化することも可能である。慣用的な定量化ＰＣＲにおいて、定量化結果は、ＰＣＲプロセスの増幅効率に依存しうる。しかし、ｄＰＣＲは、最初の試料量を決定するために、増幅サイクルの数には依存せず、ターゲット核酸を定量化するために、不確かな指数データへの依存を排除し、そしてしたがって、絶対定量を提供する。

本発明の第一の側面は、反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法に関する。
反応体積偏差は、反応領域における不均一な体積を生じうる。領域のサイズ分布の幅は、計測率、そしてしたがって計算される核酸濃度の正確さに影響を及ぼす。この定量化誤差は、領域あたりの低コピー数では無視できるが、領域あたりの高コピー数では大きくなりうる。この効果は、１つの領域が非常に広い一方、すべての他のものがゼロに向かって収縮する思考実験によって例示されうる。この場合、陽性係数は、明らかに１に向かう傾向があり、極端な過少定量化を生じるであろう。

あるいはまたはさらに、反応体積偏差は、平均反応領域体積が、意図されるものまたは予期されるもの、例えば較正値によってあらかじめ決定されるようなものとは異なるという事実のためでありうる。

小滴に基づくｄＰＣＲ系およびアレイに基づくｄＰＣＲ系の両方において、平均分配体積の不確定性は、現在の系における正確性誤差の主な原因であることが見出された（Ｄｏｎｇら， ２０１５， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ５， １３１７４およびＤｏｎｇら， ２０１４， Ａｎａｌ． Ｂｉｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ４０６， １７０１−１７１２）。

平均反応領域体積は、反応混合物組成中の変化（ｄＰＣＲアレイの場合、界面活性剤が、反応混合物およびシーリング液の界面に形成されるメニスカスに影響を有する）、アレイの産生プロセスによって引き起こされる反応領域深度の変化（例えばアレイを産生するために用いる成形型の変化が、反応領域の幾何学的変化と関連しうる）または充填速度による反応領域の充填度の変化のため、変化する可能性もある。

第一の側面の方法の第一の工程において、反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるため、ｄＰＣＲに用いる反応領域アレイの各反応領域に、充填対照マーカーを添加する。充填対照マーカーは、各反応領域中の反応体積の定量化を可能にする、任意の物質または組成物であってもよい。

したがって、充填対照マーカーは、任意の検出可能標識からなってもまたはこうした標識を含んでもよい。用語「標識」は、本明細書において、一般的に、反応領域中の体積を視覚化し、検出し、分析し、そして／または定量化するために使用可能な任意の種類の物質または剤を指す。標識は、例えば、体積を光学的に検出可能にし、そして／または光学的に区別可能にする色素であってもよい。標識は、各反応領域の、例えばとりわけ、流動流中、マルチウェルプレート中、チップ上、アレイ中または視野中の体積を示す。マーカーは、各反応領域中、任意の適切な均一または不均一分布を有してもよい。例えば、マーカーは、反応領域全体に実質的に均一に分布していてもよいし、反応領域の周辺に局在していてもよいし（例えば小滴を被包する外表面（ｓｋｉｎ）または例えばウェル中の反応領域を覆う表面に局在していてもよい）、あるいは反応領域内の１またはそれより多い別個の局在を有してもよい（例えばマーカーが粒子（例えばとりわけビーズまたは量子ドット）である場合）。

本発明にしたがった標識には、限定されるわけではないが、放射性同位体、例えば^３５イオウ（^３５Ｓ）、^３２リン（^３２Ｐ）、^３３リン（^３３Ｐ）、^３Ｈまたは^１４Ｃ、任意の着色（例えば２，４−ジニトロフェノール）あるいは発光分析手段によって検出され、そして／または視覚化されることが可能である、例えば、限定されるわけではないが、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、およびヘキサクロロフルオレセインを含むフルオレセイン色素、ローダミン色素、例えばカルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、テキサスレッドおよびテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、シアニン色素、例えばプリリウムシアニン色素、ＤＹ５４８、クエーサー５７０、またはＣｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ ５６８等などの、発光、好ましくは蛍光分子または吸光度マーカー（非蛍光または蛍光）が含まれてもよい。蛍光標識は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ（ＵＳＡ）を含む、多様な供給業者から商業的に入手可能である。

標識の選択は、典型的には、物理特性（例えばスペクトル特性）によって、検出装置の利用可能性によって、そしてｄＰＣＲ中の核酸検出に用いる標識（単数または複数）によって、決定される。標識ならびにその検出戦略は、当業者に周知である。

例えば、シグナルは蛍光シグナルであってもよい。２またはそれより多い異なる蛍光シグナルが各反応領域から測定される（１つはＰＣＲ用そして１つは充填対照マーカーとして）場合、シグナルは、例えば、別個の波長または波帯で検出可能である。あるいは、とりわけ、光の異なる波長または波帯での励起（例えば異なる時点または異なる位での励起）後、蛍光シグナルを同じ波長／波帯で測定してもよい。それぞれの別個のフルオロフォアを通じて、２またはそれより多い蛍光シグナルを検出してもよい。

いくつかの態様において、充填対照マーカーは増幅反応とカップリングされず、そしてしたがって、受動的参照として働く可能性もある。いくつかの態様において、充填対照マーカーは、さらに、対照増幅反応から検出される対照シグナルとして使用可能である。対照増幅反応は、外因性または内因性テンプレートの増幅を測定可能である。好ましくは、標識は、方法の間、安定であり、退色にはさらされず、増幅反応および／または温度とは独立に、不変である。

第一の側面の方法の第二の工程において、各反応領域中の反応体積を定量化する。充填対照マーカーによって提供されるシグナルに基づいて、反応体積を定量化する。各反応領域中で検出される充填対照マーカーの量または濃度に基づいて、反応領域の体積を決定することも可能である。マーカーの量または濃度を決定するための方法は、用いるマーカーに依存するであろうし、そしてこうした方法は当該技術分野に周知である。例えば、放射性同位体を用いる場合、放射能を測定してもよい。好ましくは、蛍光によって検出および／または定量化可能な蛍光マーカーを用いる。

体積の決定に加えて、充填対照マーカーを、ｄＰＣＲのために得られるシグナルに関する標準化因子として、そして／または無効な試料を決定から排除するために用いてもよい（以下もまた参照されたい）。

第三の工程として、１つの体積中のまたは体積あたりの、ｄＰＣＲによって決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算し、ここで体積は第二の工程において決定するような反応体積の総計である。さらなる詳細を以下に提供する。

第二の側面において、本発明は、試料における関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法であって：
ａ）関心対象の核酸を含有すると推測される試料を提供し；
ｂ）反応領域アレイの各反応領域における試料を用いて、ｄＰＣＲを行い；
ｃ）各反応領域中の反応体積を定量化し；そして
ｄ）１つの体積中のまたは体積あたりの、工程ｂ）において決定されるような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する、ここで体積が工程ｃ）において決定されるような反応体積の総計である
工程を含む、前記方法に関する。

本発明の方法の第一の工程において、関心対象の核酸を含有すると推測される試料を提供する。
試料は、被験体由来の試料を含めて、問題の核酸を含有すると推測される任意の試料であってもよい。試料は、その物質（単数または複数）と同一であり、そしてそのより多い量を代表すると意図される、限定された量の物質である。試料を得る作業は、人によって、または自動的に実行可能である。試験、分析、検査、調査、実証、または試行使用のために、試料を採取するかまたは提供することも可能である。ある場合、試料採取は連続的に進行中であってもよい。試料は、個体、液体または気体を含むかまたはこれらからなってもよい；試料は、ゲルまたは痰、組織、生物またはこれらの組み合わせなどの、何らかの中間特性を持つ物質であってもよい。好ましくは、試料は、容易な分布を可能にする液体または懸濁物である。

物質試料が個々のアイテムとして計数できない場合であっても、試料の量はなお、体積、質量、サイズ、または他のこうした寸法に関して記述可能である。固形試料は、１つのまたはいくつかの別個の片として入手可能であるし、あるいは断片化されるか、顆粒であるかまたは粉末化されることも可能である。

現在の文脈の試料は、検出するかまたは測定しそして定量化しようとする、１またはそれより多い核酸を含有すると推測される、ある量の物質である。本明細書において、該用語には、限定されるわけではないが、標本（例えば生検または医学的標本）、培養物（例えば微生物学的培養）または環境試料、例えば水または土が含まれる。試料は被験体、例えば動物またはヒト由来であってもよいし、液体、固体（例えば糞便）、懸濁物または組織であってもよい。用語「被験体由来の試料」には、任意の所定の被験体から単離された、生物学的液体、排泄物および組織のすべてが含まれる。好ましくは、被験体は動物、より好ましくは哺乳動物、またはさらにより好ましくはヒトである。試料は、限定されるわけではないが有蹄動物、クマ、魚類、齧歯類等の動物を含む、家畜動物、ならびに野生動物の多様な科のすべてから得られてもよい。

試料の例には、限定されるわけではないが、細胞または組織培養物、血液、血清、血漿、針吸引物、尿、精液、精漿、前立腺液、排泄物、涙、唾液、汗、生検、腹水、脳脊髄液、胸水、羊水、腹水、間質液、痰、ミルク、リンパ液、鼻および他の洗浄液試料、または組織抽出物試料が含まれる。試料供給源は、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織試料または生検または吸引物由来などの固形組織；あるいは被験体の妊娠または発生における任意の時点に由来する細胞であってもよい。

試料は、天然の試料の供給源と天然には混合されていない化合物、例えば保存剤、抗凝血剤、緩衝剤、固定液、栄養素、抗生物質等を含有してもよい。
試料がｄＰＣＲのための準備ができていないかまたは適していない場合、ｄＰＣＲに使用する前に、さらなるプロセシングが必要である可能性もある。通常、試料は、例えば試料を希釈して（ｄＰＣＲを可能にする核酸濃度を得る）、妨害構成要素を除去し、ｄＰＣＲに必要な試薬を添加するなどにより、ｄＰＣＲのためにプロセシングされる必要がある。プロセシングは、多数の異なる工程および技術を含むことも可能であり、これらは、試料の性質、関心対象の核酸のタイプ、および用いるｄＰＣＲ法を含む、多様な側面に応じるであろう。典型的には、プロセシングには、精製工程および／または希釈または濃縮工程が含まれる。核酸を精製するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、限定されるわけではないが、ホモジナイズ、洗浄、遠心分離、抽出等が含まれる。例えば試料を破壊することによって、保存剤を添加することによって、試料を凍結することによってまたは乾燥させることによって、試料を保存することが必要である可能性もある。得た試料を破壊するため、物理的な力（例えばポリトロン、粉砕または凍結）または化学的方法（例えば細胞の溶解）を用いてもよい。ホモジナイズのために界面活性剤またはカオトロープを用いてもよい。酸フェノール／クロロホルム、フィルター、ガラス粒子またはクロマトグラフィ（例えば結合パートナーとして適切な核酸を用いて）の使用によって、核酸を抽出してもよい。プロセシングの任意の時点で（プロセシングの開始時、プロセシング中、および／またはプロセシング終了時）、試料を保存することが必要である可能性もある。このため、適切な培地、例えば緩衝生理食塩水を添加することが必要であるかまたは適切である可能性もある。関心対象でないか、または妨害しうる、混入物質および／または核酸を除去することが必要である可能性もある。混入物質を除去するため（例えばＤＮアーゼ、ＲＮアーゼおよび／またはプロテイナーゼ）、または関心対象の核酸を保護するため（例えばＤＮアーゼ阻害剤またはＲＮアーゼ阻害剤）、酵素を用いてもよい。酵素を不活性化するため、加熱工程が適切である可能性もある。望ましくない構成要素、例えば二価カチオン（Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋）を取り除くため、除去剤を用いてもよい。培地を交換するために、洗浄工程が必要である可能性もある。

上に詳述するように、ｄＰＣＲのため、関心対象の核酸は、ｄＰＣＲ中、適切な量または濃度で存在する必要がある。したがって、適切な希釈または濃縮工程が必要である可能性がある。核酸希釈は、通常、溶媒（例えば続く工程のための適切な培地、例えばｄＰＣＲ培地またはｄＰＣＲ緩衝液）を添加することによって行われる。例えば、望ましくない構成要素の除去、または特定の最終濃度を得るための濃縮が、意図されるかまたは必要である場合、これには、洗浄工程が伴ってもよい。濃縮は、任意の濃縮法、例えば免疫捕捉、遠心分離、アルコール沈殿、および結合マトリックスの使用のいずれによって行ってもよい。プロセシング後、試料はｄＰＣＲの準備ができており、これは、第二の側面にしたがった本発明の方法の工程ｂ）にしたがうことである。

上に詳述するように、試料は関心対象の核酸を含有し、その量または濃度を、本発明の方法において決定するものとする。核酸は、すべての既知の生命の形に必須であるバイオポリマーである。したがって、核酸は、特定の生物に関する指標として使用可能であるが、また、例えば、突然変異または天然存在変異体の場合には、疾患に関する指標としても使用可能である。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含む核酸は、ヌクレオチドとして知られる単量体から作製される。各ヌクレオチドは３つの構成要素：五炭糖、リン酸基、および窒素性塩基を有する。糖がデオキシリボースである場合、ポリマーはＤＮＡである。糖がリボースである場合、ポリマーはＲＮＡである。核酸は、最も重要な生物学的巨大分子の１つである。これらは、すべての生物中に豊富に見られ、ここで、遺伝情報をコードし、伝達し、そして発現する際に機能し、言い換えると、情報は、核酸配列、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ分子内のヌクレオチドの順序を通じて伝達される。核酸の実験研究は、現代生物学および医学研究の主要部分を構成し、そしてゲノムおよび法医学科学ならびにバイオテクノロジーおよび薬学産業の基礎を形成する。したがって、本発明の方法は、これらの分野のいずれにおいて使用することも可能である。

核酸は、微生物（例えば病原体）の指標であることも可能であり、そして疾患、例えば感染の診断において有用でありうる。感染は、細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫または他の核酸含有対象によって引き起こされることも可能である。病原体は、外因性（環境または動物供給源から、あるいは他のヒトから獲得される）であっても、または内因性（正常フロラ由来）であってもよい。試料は、徴候および症状に基づいて選択されてもよく、疾患プロセスの代表であるべきであり、そして抗微生物剤の投与前に収集されるべきである。プロセシングされない試料中の核酸の量は、疾患の重症度の指標でありうる。

あるいは、核酸は、遺伝子障害の指標であってもよい。遺伝子障害は、ゲノム中の１またはそれより多い異常によって引き起こされる遺伝的問題、特に誕生時から存在する状態（先天性）である。大部分の遺伝子障害は、非常に稀であり、そして数千または数百万人に１人が罹患する。遺伝子障害は、遺伝性、すなわち親の遺伝子から伝達されるものであってもまたはなくてもよい。非遺伝性遺伝子障害において、欠損は、ＤＮＡに対する新規突然変異または変化によって引き起こされてもよい。こうした場合、生殖系列で生じた場合、欠損は遺伝性のみであろう。同じ疾患、例えばいくつかの型の癌は、ある人々では遺伝性遺伝子状態によって、他の人々では新規突然変異によって、そして主に、さらに他の人々においては環境的原因によって、引き起こされうる。明らかに、突然変異を含む核酸の量は、疾患状態の指標でありうる。

本発明の方法において、核酸の量または濃度を決定する。物質量は、標準で定義される量である。国際単位系（ＳＩ）は、物質量を、存在する基本的実体の数に比例するよう定義し、アボガドロ定数の逆数が比例定数である（単位はｍｏｌ）。物質量に関するＳＩ単位はモルである。モルは、同位体炭素１２の１２ｇにある原子と等しい数の基本的実体を含有する物質の量と定義される。したがって、試料の物質量は、試料質量を物質のモル質量で割ったものとして計算される。この文脈において、「量」は、通常、関心対象の核酸配列のコピー数を指す。

物質の濃度は、構成要素の存在量を混合物の総体積で割ったものである。いくつかのタイプの数学的説明：質量濃度、モル濃度、数濃度、および体積濃度が、区別可能である。用語、濃度は、任意の種類の化学的混合物に適用可能であるが、最も頻繁には、これは溶液中の溶質および溶媒を指す。モル（量）濃度は、正常濃度および浸透圧濃度などの変数を有する。好ましくは、濃度は、数で与えられた構成要素の量を、混合物の総体積で割ったものである。本発明の背景において、濃度は通常、「体積あたりのコピー数」である。

好ましくは、提供される試料は液体中にあり、これはさらなる方法工程を容易にする。
次の工程として、反応領域アレイの各反応領域中の試料を用いて、ｄＰＣＲを行う。ｄＰＣＲにおいて、問題の核酸を増幅し、そして検出し、ここで、多くの個々の分子は、各々、別個の反応領域に単離される。各反応領域（ウェル、チャンバー、ビーズ、エマルジョン等）は、出発分子が存在しない場合は陰性結果、またはターゲットとされる出発分子が存在する場合は、増幅および検出に関して陽性結果のいずれかを有するであろう。これは、反応の一部がテンプレート分子を持たず、そして陰性増幅結果を与えるように、多くの別個のＰＣＲ反応に渡って、試料の限界希釈を行う技術である。反応終点で、陽性ＰＣＲ反応混合物反応の数を計数する際、元来の試料に存在する個々のテンプレート分子を１つ１つ計数する。ＰＣＲに基づく技術は、増幅可能である分子を計数するだけであるさらなる利点を有し、例えばこれは、配列決定ワークフローにおける、大規模な平行ＰＣＲ工程に適している。デジタルＰＣＲに基づく方法において、分析しようとする核酸を多くの異なる反応領域（例えばウェル、ビーズ、エマルジョン、ゲルスポット、微少流体デバイス中のチャンバー等）に分配する。いくつかであるがすべてではない反応領域が少なくとも１つの分子を含有することが重要である。典型的には、各反応領域は、１つまたはゼロの分子を含有するであろう。実際、反応領域、例えばウェルには、分子のランダムな分布があるであろう。反応領域のある割合（例えば８０％）が陽性である場合、多くの領域は、１またはそれより多い分子（例えばウェルあたり平均２．２分子）を含有するであろう。統計法を用いて、異なる反応領域の数および陽性の数に基づいて、試料中の分子の予期される総数を計算することも可能である。これは、異なる反応領域に適用された、部分中の核酸の計算量または濃度を生じるであろう。試料採取および確率に基づくいくつかの統計法を用いて、この濃度に到達することも可能である。こうした分析の例は、ａｒｘｉｖ．ｏｒｇ、引用ａｒＸｉｖ：０８０９．１４６０ｖ２［ｑ−ｂｉｏ．ＧＮ］に見られる、２００８年９月８日に最初にアップロードされた、Ｄｕｂｅら， ａｒＸｉｖ：０８０９．１４６０ｖ２ 「デジタルＰＣＲを用いた、ナノ流体デバイス上でのコピー数偏差の最大解像度の計算（２００８）」に提供される。該刊行物は、デジタルＰＣＲアレイ中で用いられる反応領域の数および陽性結果の数に基づいて、分子濃度および統計信頼区間を概算するために使用可能な一連の等式を提供する。このタイプの計算の別の例は、米国特許出願ＵＳ ２００９／０２３９３０８ Ａ１に見出されうる。

通常、ポアソン分布は、単一のＤＮＡアンプリコンのみが、ランダムに離散化された体積の反応装置中に存在して、反応体積あたり、関心対称のＤＮＡアンプリコンが１つのみであることを支持する場合のデジタル体制を予測するために用いられる。この方式で、各反応装置体積から放出されるＰＣＲ増幅シグナル（例えば蛍光）は、１つのアンプリコンのみの産物であり、そしてすべての他の別個の反応体積からは分離されている。次いで、どれだけ多くのデジタル反応装置が、挿入色素または特定のＤＮＡポリメラーゼプローブ配列に対応する増幅された蛍光シグナルを放出するかを計数することによって、定量化を達成する。デジタル体制において、各反応装置体積は、単一のＤＮＡ鎖より多くを含まないように限定されているため、その１つのＤＮＡ鎖ならびに対応するプライマーおよびプローブセットのみから増幅された蛍光シグナルの１００％が生じると正しく仮定することが可能である。しかし、非常に低濃度の体制は、結果が不正確になるため、通常、好ましくない。

ｄＰＣＲに関するいくつかの方法論が存在する。例えば、クローン性に増幅されたＤＮＡを伴う小ビーズを調製するエマルジョンＰＣＲが用いられてきており、本質的には、各ビーズは、ｄＰＣＲの１つのタイプのアンプリコンを含有する。ＰＣＲ産物に対して「ｉｎ ｓｉｔｕで」（すなわち同じウェル中で）実行可能な蛍光プローブに基づく技術は、この適用に特によく適している。米国特許第６，４４０，７０５号は、この増幅法のより詳細な説明を含有する。これらの増幅を、エマルジョンまたはゲル中、ビーズ上またはマルチウェルプレート中で実行することも可能である。

ｄＰＣＲにはまた、チャネルおよびポンプを用いて、分子をいくつかの反応領域に送達する、微少流体に基づく技術も含まれる。適切な微少流体デバイスが当該技術分野に知られる。

ｄＰＣＲは、本質的に慣用的ＰＣＲのように行われる。適切な培地中の核酸（参照または関心対象）を、プライマー、プローブおよび熱安定性ポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）と接触させ、そして熱サイクリングを実行する（鎖の分離および酵素的複製のための、反応の反復加熱および冷却サイクル）。培地は通常、デオキシヌクレオチド、緩衝溶液およびイオン（例えばＭｇ^２＋）を含有する。ＰＣＲの選択性は、特定の熱サイクリング条件下で、増幅のためにターゲティングされる領域に相補的であるプライマーの使用から生じる。生じた増幅産物を、通常は標識、例えば蛍光標識されている、適切なプローブの使用によって検出する。ｍＲＮＡに基づくＰＣＲのため、ＲＮＡ試料をまず、逆転写酵素で、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写する。

典型的には、ＰＣＲプロセスは、２５〜５０回反復される一連の温度変化からなる。これらのサイクルは、通常、３つの段階からなる:第一の約９５℃は、核酸二重鎖の分離を可能にし；第二の約５０〜６０℃の温度は、ＤＮＡテンプレートとプライマーの結合を可能にし；第三の６８〜７２℃の間の温度は、ＤＮＡポリメラーゼによる重合を促進する。断片サイズが小さいことにより、酵素が整列段階および変性段階の間の変化中に断片の数を増加させることが可能であるため、このタイプのＰＣＲにおいては、最後の工程は、通常、省略される。さらに、非特異的色素を用いる際、プライマー二量体の存在によって引き起こされるシグナルを減少させるため、シグナル、例えば蛍光を、例えば８０℃の温度で測定する。用いる温度およびタイミングは、非常に多様なパラメーター、例えば：ＤＮＡを合成するために用いる酵素、反応中の二価イオンおよびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の濃度、ならびにプライマーの結合温度に依存する。

１つの態様において、ユニークなプローブ配列各々をコードする、多数の色、時間的および強度の組み合わせを用いることによって、より多数の蛍光プローブ配列（例えばＴａｑＭａｎプローブ配列）を同定するユニークな能力を可能にするｄＰＣＲ法を提供する。さらに、より高価でない非ＴａｑＭａｎプローブリアルタイムＰＣＲ増幅指標、例えばＳＹＢＲまたはＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いて、時間的キューのみ、強度キューのみ、または強度および時間的キューの組み合わせに基づく多重ｄＰＣＲを達成し、こうして有意なコスト減少を伴って、より高い度合いでプライマー対を区別することも可能である。これらはまた、望ましい場合、より高い正確さに向けて、対照を増進し、そして結果を標準化するために用いることも可能である。典型的な五重ｑＰＣＲからの典型的な多重化限界は、蛍光レポーターを用いて、限定されるスペクトルバンドを伴う百重ｄＰＣＲまで増加させることが可能である。

ｄＰＣＲ前に、ｄＰＣＲと同時に、またはｄＰＣＲ後に、各反応領域中の反応体積を定量化する。体積の定量化は当該技術分野に周知である。
体積は、物体（すなわち固体、液体、気体、またはプラズマ）が占める三次元空間に関する。体積は、寸法、例えば物体が占める空間の長さ、幅、および高さに基づいて計算可能である。これらは、通常、ＳＩ単位で表され、例えば立方センチメートル（ｃｍ^３）、立方メートル（ｍ^３）、リットル（Ｌ）、ミリリットル（ｍＬ）等である。

したがって、寸法が知られている場合、体積を決定可能である。ｄＰＣＲを、アレイ、例えば筒状のウェルを持つマルチウェルプレート上で行う場合、ウェル中の液体の体積は、体積＝π ＊ ｒ^２ ＊ 充填する高さとして計算することも可能である。半径はアレイの供給者によって提供されるか、または測定されることも可能である。他の形状（例えば錐体または立方体）のアレイに関する式もまた知られる。

しかし、ｄＰＣＲアレイの反応領域中の液体体積は、主に、高さで変化するため、反応領域中の液体の高さを決定すれば十分である可能性もある。例えば分光計を伴う多様な光学法が使用可能である。

１つの例示的な態様において、周知の高さ、対照色素（例えば平面（ｆｉｅｌｄ ｐｌａｎｅ）における領域あたりのフルオロフォアの数に比例するシグナルを生じる）、および光路における受動的対照色素の高さに比例したシグナルを生じる検出系を用いた、較正測定が伴う。アレイの反応領域中の液体の高さは、同じ条件下で測定された較正キュベットのものと、シグナルを比較することによって、計算される。該方法を図１に例示する。

あるいは、密度が知られている場合、質量に基づいて、体積を決定することも可能である。質量を密度で割ることによって、体積が決定可能である。別の態様において、充填対照マーカーを用いる。充填対照マーカーに関する詳細は、上に提供されている。

次の工程として、１つの体積中のまたは体積あたりの、工程ｂ）において決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算し、ここで体積は工程ｃ）において決定されるような反応体積の総計である。上に詳述するように、最先端技術の方法において、問題の核酸の量または濃度は、各反応領域中の意図されるまたは予期される体積に基づいて計算される。そのために用いられる充填対照マーカーは、無効な反応領域を排除するために、そして偽陽性または偽陰性結果を修正するために用いられてきている。本発明の方法において、充填対照マーカーは、各反応領域中の真の体積を決定するために、そしてしたがってｄＰＣＲによって分析される全体のそして真の体積を決定するために用いられる。正しい体積を知ることは、問題の核酸の正しい量またはその濃度を決定するために重要であることが明らかである。総体積は、反応領域中の体積の総計である。核酸数の量は、ｄＰＣＲによって得られる。核酸濃度は、通常、核酸数／体積、例えばμｌとして、提供される。

したがって、コピー数Ｎ_ｃを、試料採取した液体体積で割ることによって、濃度を計算することも可能である。コピー数Ｎ_ｃは、ポアソン補正を適用した後、陽性反応領域の計数から得られる。試料採取した液体体積Ｖは、実験において評価した反応領域すべての体積の総計に等しい。

さらにそして反応領域体積の分布に基づく濃度計算の全体の補正に加えて、有効な陽性および有効な陰性を同定し、そして無効な反応領域を排除するために、充填対照マーカーを各反応領域の規準化に用いてもよい。

したがって、関心対象の核酸の濃度は、
反応体積分布が狭く、そして分配あたりのコピー数が＜＜１である場合、

によって、またはより一般的に

によって与えられ、
式中、Ｐはポアソン補正因子である。これは、有効陽性および有効陰性の比に依存し、そして１より多いコピー数の核酸を含有する反応領域の可能性を考慮する。反応領域あたりの低コピー数比（有効陽性＜＜有効陰性）で、Ｐ＝１であり、そして
Ｃは体積分布補正因子である。これは、反応領域あたりのコピー数比、および平均反応領域体積に比較した反応領域体積の変動に依存する。反応領域あたりの低コピー数比および相対反応領域体積偏差＜１０％で、Ｃ＝１である。

さらに、別の補正因子を追加しなければならない。ｄＰＣＲにおいて使用する前に試料をプロセシングする、例えば希釈する場合、分析する試料中の関心対象の核酸の量または濃度を得るためには、プロセシングおよび希釈工程を計算に含めなければならない。

本発明の方法の好ましい態様において、特に、充填対照マーカーのシグナルが、反応領域中の反応体積に比例する場合、各反応領域中に存在する充填対照マーカーを定量化することによって、反応体積を定量化する。充填対照マーカーおよびその定量化に関する詳細を本明細書に提供する。しかし、充填対照マーカーを用いる場合、そのシグナルは、反応領域中の反応体積に比例し、有効反応領域体積は、以下のように計算可能である：
有効反応領域体積［ｉ］＝（参照反応領域体積）＊（対照色素の強度）＊定数。

より好ましくは、各反応領域に関する補正因子は、測定した充填対照マーカーのシグナルおよび予期される充填対照マーカーのシグナルに基づき計算する、そしてここで、反応体積偏差を考慮する補正因子を、それぞれの反応領域に適用する。本発明は、全体の体積の測定値として、充填対照マーカーのシグナルを用いる。しかし、これはまた、ｄＰＣＲの結果を規準化するためにも使用可能である。ＵＳ ２０１３／０３０２７９２ Ａ１に詳述されるように、陽性および陰性を正しく同定するために、色素シグナルを用いて、ｄＰＣＲにおいて得られるシグナルを補正することも可能である。また、空反応領域は空と認識され（または油が充填されていてもよく）、そしてしたがって、試料の総体積には付加されないが、付加されれば、ターゲットＤＮＡの最終的に見出される濃度における誤りを導くであろう。したがって、有効試料の体積は、個々の内容体積を持つ各個々のウェルの総計である。補正は、さらに、ｄＰＣＲでの定量化の正確さおよび的確さを増加させ、ここですべての反応領域が有効陽性、有効陰性または無効反応領域と分類される：
−有効陽性反応領域は、適切に反応混合物で充填され、そして増幅後、陽性ＰＣＲシグナルを生成する。

−有効陰性反応領域は、適切に反応混合物で充填され、そして増幅後、ＰＣＲシグナルを生成しない。
−無効反応領域は、反応混合物で充填されず（または不十分にしか充填されず）またはアーチファクトに寄与する他の特性のため、排除される。

総有効体積の正確な測定を有することによって、関心対象の核酸の非常に絶対的な定量化を実行することを可能にするｄＰＣＲ法が提供される。
さらに、方法はまた、不均一な反応領域体積によって引き起こされる定量化誤差を排除することもまた可能にする。これは以下のように実行可能である：
ａ）反応領域体積の分布を、較正実験において決定する。それによって、それぞれの反応領域体積に比例する、各反応領域からの充填対照マーカーのシグナルを評価する。

ｂ）反応領域体積のこの分布によって引き起こされる定量化誤差を考慮する、補正因子を評価する。
ｃ）補正因子Ｃ（反応領域あたりのコピー数比、および反応領域体積の相対変動に依存する。上記を参照されたい）を、この実験セットアップで決定される各濃度に適用する。

この解決法は、反応領域体積の分布が実験間で一定のままであるという仮定に頼る。アレイの産生プロセスおよび充填プロセスが非常に安定である場合、これが当てはまる。
これが当てはまらない場合、より高度な計算を適用してもよい：
ａ）反応領域体積の分布を各実験で決定する。

ｂ）分布をモデル曲線に適合させる。
ｃ）モデル曲線を用いて、この特定の実験で測定された濃度に関する補正因子を評価する。

ｄＰＣＲアレイの反応領域中の液体体積は、主に高さが変化しうるため（メニスカス効果およびウェル深度変動のため）液体反応領域の高さを決定することが十分である可能性もある。

解決法は、以下を用いた較正測定からなる
−周知の高さを持つ較正キュベット
−充填対照マーカー（平面における領域あたりのフルオロフォアの数に比例するシグナルを生じる）
−充填対照マーカーの高さに比例するシグナルを生じる検出系。

試料アレイ（ａ）の液体反応領域の高さは、同じ条件下で測定した較正キュベットのものと、シグナルを比較することによって計算する。
したがって、本発明の方法の別の好ましい態様において、各反応領域中の反応体積を、反応領域中、特にウェル中の反応体積の高さに基づいて、好ましくは充填対照マーカーを用いることによって、定量化する。これに関連するさらなる詳細は、上に提供されている。

本発明の方法の別の好ましい態様において、反応領域中の充填対照マーカーの量が下限閾値より低い場合、または場合によって上限閾値よりも高い場合、反応領域は無効と同定される。

上に詳述するように、無効な反応領域を同定することが重要である。ｄＰＣＲより前の充填または分布プロセスが、空のまたは不十分に充填された反応領域（図２のウェルｅ）およびｆ）を参照されたい）を含むアレイの反応領域を生じうるため、反応領域は無効になりうる。もしこれらが核酸を含まない充填ウェル（陰性）と誤って解釈された場合、試料体積Ｖは過大評価され、そして濃度は過小評価される。例えば、充填対照マーカーのシグナルが、閾値下限未満であり、そして計算から排除される場合、充填対照マーカーを用いて、これらの反応領域を同定することも可能である。あるいはまたはさらに、特定の反応領域からの充填対照マーカーのシグナルレベルが、あらかじめ定義した閾値値より高い場合、この反応領域を、ターゲット濃度計算から排除してもよい。通常、反応領域は、最大の高さを超えて充填することが不可能である。より大きいシグナルレベルは、蛍光化ダスト粒子および他の混入物質から生じうる、アーチファクトを示す。

明らかに、充填対照マーカーを、異なる時点で、また、アッセイ設計、用いる充填対照マーカーおよびその特性に応じて、反応領域に添加することも可能である。一般的に、充填対照マーカーを、ｄＰＣＲを実行する前または後に、反応領域に添加してもよい。

例えば、充填対照マーカーは、ｄＰＣＲを実行するために必要な試薬を添加する前に、反応領域中に存在してもよい。１つの例において、アレイが産生されるかまたは製造される際に、アッセイマーカーをアレイに分布させてもよい。例えば、マーカーの高さを、例えばマルチウェルプレートにおいて、検出する場合、このオプションを選択してもよい。

あるいは、マーカーを、ｄＰＣＲ試薬とともに、反応領域に分布させてもよい。これは、充填対照マーカーの量または濃度を測定する際に特に適している。本発明の方法において、充填対照マーカーは、好ましくは、反応領域に分布される前に、ＰＣＲ反応混合物に添加される。

本発明の方法の別の好ましい態様において、充填対照マーカーは、蛍光マーカーまたは吸光度マーカーである。
広範囲の蛍光マーカーが、本発明にしたがった充填対照マーカーとして使用可能である。各蛍光マーカーは、特徴的なピーク励起および放出波長を有し、そして放出スペクトルは、しばしば、重複する。その結果、ｄＰＣＲに用いる蛍光マーカーおよび充填対照の組み合わせは、蛍光色素を励起するために用いるランプ（単数または複数）またはレーザー（単数または複数）の波長、利用可能な検出装置およびマーカーの特性に応じる。

６０１０系を用いて検出可能な例示的な蛍光色素には、フルオレセイン誘導体、例えばカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、およびＰＵＬＳＡＲ ６５０色素（Ｒｕ（ｂｐｙ）３の誘導体）が含まれる。ＦＡＭは、比較的小さいストークス・シフトを有し、一方、ＰＵＬＳＡＲ ６５０色素は、非常に大きいストークス・シフトを有する。ＦＡＭおよびＰＵＬＳＡＲ ６５０色素はどちらも、およそ４６０〜４８０ｎｍの光で励起させることが可能である。ＦＡＭは、約５２０ｎｍで最大の光を放出し（そして６５０ｎｍでは実質的に放出せず）、一方、ＰＵＬＳＡＲ ６５０色素は、約６５０ｎｍで最大の光を放出する（そして５２０ｎｍでは実質的に放出しない）。カルボキシフルオレセインは、プローブ中で、例えばＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ消光剤^ＴＭ１色素と対形成可能であり、そしてＰＵＬＳＡＲ ６５０色素は、プローブ中で、例えばＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ消光剤^ＴＭ２色素と対形成可能である。

より好ましくは、充填対照マーカーの蛍光および／または吸光特性は、１またはそれより多いｄＰＣＲプローブ（単数または複数）のものとは異なるはずである。これは、充填対照マーカーおよび蛍光ｄＰＣＲプローブ（単数または複数）を都合よく区別することを可能にするため、好都合である。しかし、充填対照マーカーが、ｄＰＣＲ中で用いるターゲットプローブ蛍光マーカーと同一の励起波長または放出波長を有する場合、検出をさらに単純化することも可能である。この方式で、充填対照は、検出系の色多重化能を減少させない。例として、系は、４つの励起および４つの放出チャネルを有しうる。ストークス・シフトが大きい色素は、励起波長１によって励起され、そして放出は、放出チャネル４から収集され、これはまたｄＰＣＲにも用いられる。

別のより好ましい態様において、充填対照マーカーは、少なくとも１００ｎｍ、好ましくは少なくとも１５０ｎｍのストークス・シフトを有する。ストークス・シフトは、同じ電子遷移の吸光および放出スペクトルのバンド最大値の位置の間の相違（波長の）である。分子が光子を吸収した際、エネルギーを得て、そして励起状態に入る。その結果、光子を放出し、したがってエネルギーを失う。放出された光子が、吸収された光子よりも少ないエネルギーを有する場合、このエネルギー相違がストークス・シフトである。より大きいストークス・シフトは、吸光および放出の間のスペクトル重複を排除し、そして蛍光の検出を可能にしながら干渉を減少させる。主な利点は、ストークス・シフトが大きい色素を、類似の励起または放出スペクトルのいずれかを有する他の色素とともに使用可能であることである。しかし、両方のスペクトルの１つは、ストークス・シフトが小さい色素および大きい色素の間で重複しないため、スペクトルクロストークは小さい。

好ましい充填対照マーカーには、ＡＴＴＯ ４３０ＬＳおよびＡＴＴＯ ４９０ＬＳ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ ＧｍｂＨ、ドイツ・ジーゲンより入手可能）、特にＡＴＴＯ ４９０ＬＳが含まれる。どちらも、水に優れた溶解性を示し、そして１００ｎｍより大きいストークス・シフトを示し、これは、高いストークス・シフトが、検出中のシグナルの重複を最小限にするため、多数の蛍光マーカーを用いた方法において、特に有用である。ＡＴＴＯ ４９０ＬＳは、ＦＡＭの励起波長およびＣｙ５の放出波長を有する。ＦＡＭおよびＣｙ５を組み合わせた際、ＡＴＴＯ ４９０ＬＳを測定するためのさらなるフィルターは必要とされない。

第一および第二の側面にしたがった、本発明の方法の別の好ましい態様において、関心対象の核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群より選択される核酸であるか、または任意の他のタイプの核酸である。

上に詳述するように、関心対象の核酸は、ｄＰＣＲに適した任意の核酸であってもよい。核酸は、適切な長さを有するべきである。核酸は、非核酸構成要素を含有してもよい。核酸は、天然存在であっても、化学的に合成されても、またはバイオテクノロジー的に操作されていてもよい。好ましくは、核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群より選択される。

本発明の方法は、診断または療法監視などの医学分野において特に関心が持たれ、そしてこれを、特定の微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患の指標となる、関心対象の核酸を検出し、そして／または定量化するために使用してもよい。これにしたがって、病原体の検出において、方法を用いてもよい。病原体は、疾患を引き起こす潜在能力を有する。典型的な病原体を用いて、ウイルス、細菌、プリオン、真菌、またはさらに別の微生物などの感染性病原体を記載する。もちろん、本発明の方法を用いて、非病原性微生物を検出することもまた可能である。

例示的な病原体には、限定なしに、以下が含まれる：
−細菌：連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、エシェリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）
−ウイルス：アデノウイルス、単純ヘルペス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ＴＢＥウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、ロタウイルスおよびエボラウイルス
−真菌：カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）およびスタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）
−寄生虫：原生動物寄生虫、蠕虫動物寄生虫および節足動物寄生虫。

第二の側面にしたがった本発明の方法のさらに別の好ましい態様において、試料は、細胞培養または混入が推測される供給源、特に体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床標本、臓器試料または組織試料または被験体、特にヒト、動物または植物、特にヒトから得られている。

上に詳述するように、「試料」は、定量化しようとする関心対象の核酸を含有すると推測される物質の量を意味する。本明細書において、該用語には、標本（例えば生検または医学的標本）または培養物（例えば微生物学的培養物）が含まれる。試料は、ヒトを含めて、植物または動物由来であってもよく、液体、固体（例えば糞便）または組織であってもよい。試料には、患者から採取された物質が含まれてもよく、限定されるわけではないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、ミルク、リンパ液、痰、精液、針吸引物等が含まれる。試料は、限定されるわけではないが有蹄動物、クマ、魚類、齧歯類等の動物を含む、家畜動物、ならびに野生動物の多様な科のすべてから得られてもよい。ヒト試料または「組織試料」または「患者試料」または「患者細胞または組織試料」または「標本」に関して、各々は、被験体または患者の組織から得られる、類似の細胞あるいは生物学的または生化学的化合物のコレクションを意味する。組織試料の供給源は、新鮮、凍結および／または保存臓器または組織試料または生検または吸引物由来などの固形組織；血液または任意の血液構成要素；体液、例えば脳脊髄液、羊水、腹水、または間質液；あるいは被験体の妊娠または発生における任意の時点に由来する細胞であってもよい。組織試料は、天然の組織と天然には混合されていない化合物、例えば保存剤、抗凝血剤、緩衝剤、固定液、栄養素、抗生物質等を含有してもよい。

ｄＰＣＲにおいて、反応領域は、チップ上、キャピラリー中、核酸結合表面上またはビーズ上、特にマイクロアレイ中またはチップ上の、マイクロアレイまたはナノアレイの小型化されたチャンバー、微少流体デバイスのチャンバー、マイクロウェルまたはナノウェルであってもよい。

本発明で使用可能な、利用可能なｄＰＣＲ系は多数ある。商業化されているデジタルＰＣＲプラットホームには、Ｆｌｕｉｄｉｇｍのマイクロウェルチップに基づくＢｉｏＭａｒｋ（登録商標） ｄＰＣＲ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのスルーホールに基づくＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ１２ｋ ｆｌｅｘ ｄＰＣＲおよび３Ｄ ｄＰＣＲ、ならびにＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）の小滴に基づくｄｄＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ） ＱＸ１００およびＱＸ２００、ならびにＲａｉｎＤａｎｃｅ（登録商標）のＲａｉｎＤｒｏｐが含まれる。微少流体チップに基づくｄＰＣＲは、パネルあたり最大数百の反応領域を有しうる。小滴に基づくｄＰＣＲは、通常、およそ２０，０００の分配された小滴を有し、そして反応あたり、最大１０，０００，０００を有しうる。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ ｄＰＣＲは、サブアレイあたり６４の反応領域を含有し、そして総数４８のサブアレイを含有し、アレイあたり総数３０７２反応領域に等しい、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）プレート上で、デジタルＰＣＲ分析を行う。

小滴ｄＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、水−油エマルジョン小滴技術に基づく。試料を多数の小滴（例えば約２０，０００）に分画し、そしてテンプレート分子のＰＣＲ増幅が、各個々の小滴において起こる。ｄｄＰＣＲ技術は、小滴形成化学を含む最も標準的なＴａｑＭａｎプローブに基づくアッセイに関して用いるものと類似の試薬およびワークフローを用いる。また、挿入試薬、例えばＥｖａｇｒｅｅｎを用いてもよい。大規模な試料反応分配は、ｄｄＰＣＲ技術の重要な側面である。非球状分配（例えばナノウェル）は、実際に、同じ数の球体分配よりも、試料体積あたり、より広い領域を有する。

典型的には、より多い数の反応領域を用いることによって、ｄＰＣＲによる決定の正確さおよびより重要には的確さが改善されうる。およそ１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、７００またはそれより多い反応領域を用いることが可能であり、これらは、ＰＣＲによって問題の量または濃度を決定するために用いられる。第一および第二の側面にしたがって、本発明の方法の好ましい態様において、少なくとも１００の反応領域、特に少なくとも１，０００の反応領域、特に少なくとも５，０００の反応領域で、同一にｄＰＣＲを行う。第一および第二の側面にしたがって、本発明の方法の好ましい態様において、少なくとも１０，０００の反応領域、特に少なくとも５０，０００の反応領域、特に少なくとも１００，０００の反応領域で、同一にｄＰＣＲを行う。

好ましくは、ｄＰＣＲは、関心対象の１またはそれより多い核酸を検出するため、特に消光剤と組み合わせた、または分子ビーコンとして、または加水分解プローブとして、１またはそれより多い蛍光ｄＰＣＲプローブの使用を伴う。

ＰＣＲ適用（例えばリアルタイムＰＣＲ）において、蛍光はしばしば、増幅産物を検出するために用いられる。通常、各試料を少なくとも１つの明記する波長の光ビームで照射し、そして励起されたフルオロフォアによって放出される蛍光を検出する能力を伴う、サーマルサイクラー中でこれを実行する。サーマルサイクラーはまた、試料を迅速に加熱し、そして冷却することが可能であり、それによって、核酸およびＤＮＡポリメラーゼの物理化学特性を利用する。

ｄＰＣＲは、関心対象の核酸および／または参照核酸を検出するため、特に消光剤と組み合わせた、または分子ビーコンとして、または加水分解プローブとして、１またはそれより多い蛍光プローブの使用を伴うことも可能である。

しばしば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がｑＰＣＲ中で検出される。ＦＲＥＴは、２つの分子間、本発明の場合、２つのプローブ間の相互作用を測定するための技術である。この技術において、２つの異なる蛍光分子（フルオロフォアまたは標識）を、核酸の検出に適したプローブ対に遺伝子融合させる。ＦＲＥＴの原理は、２つの標識の組み合わされた特性に基づく。標識が特定の波長（吸収周波数）の光で励起される場合、これは、異なる波長（放出周波数）でエネルギーを再放出する。ＦＲＥＴにおいて、第一の標識が励起され、これが次に、放出周波数を有する光を放出する。第一の標識（ドナー）の放出ピークが第二の標識（アクセプター）の励起ピークと重複している場合、第一の標識がエネルギーを第二の標識に移動させ、そして第二の標識が、それ自体の放出周波数の光を放出するため、２つの標識が近接していることを決定可能である。正味の結果は、通常放出するであろうエネルギーよりも少ないエネルギーをドナーが放出する（光として放射するエネルギーのある程度が、その代わり、アクセプターに移動するため）一方、アクセプターはその励起周波数で、より多くの光エネルギーを放出する（ドナーフルオロフォアから余分なエネルギーインプットを得ているため）。消光剤と蛍光色素の組み合わせもまた使用可能である。消光剤が、蛍光色素に近接していれば、蛍光放出が排除される。蛍光部分が消光剤から分離されれば、第一の蛍光部分の放出は、適切な波長の光での励起後に、検出可能である。分子ビーコンは、内在性に消光されたフルオロフォアを持つヘアピン状のプローブであり、その蛍光は、これらがターゲット核酸配列に結合した際に回復する。検出しようとする核酸が、ループ中の鎖に相補性である場合、核酸およびループの間で形成される二重鎖は、ステムのものよりより安定であり、これは前者の二重鎖がより多くの塩基対を含むためである。これは、フルオロフォアおよび消光剤の分離を引き起こす。フルオロフォアがひとたび消光剤から離れると、光でハイブリッドを照射した際、蛍光放出が生じる。放出の存在は、ハイブリダイゼーション事象が起こったことを報告し、そしてしたがって、ターゲット核酸配列は、試験試料中に存在する。加水分解プローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５’端に共有結合したフルオロフォアおよび３’の消光剤からなる。フルオロフォアおよび消光剤が近接している限り、消光は、いかなる蛍光シグナルも阻害する。プローブは、プライマーの特異的セットによって増幅されるＤＮＡ領域内にアニーリングするように設計されている。ポリメラーゼがプライマーを伸長させ、そして新生鎖を合成するに連れて、ポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性は、テンプレートにアニーリングしているプローブを分解する。プローブの分解は、そこからフルオロフォアを放出し、そして消光剤と近接しないようにし、したがって、消光効果から解き放ち、そしてフルオロフォアからの蛍光発光を可能にする。したがって、検出される蛍光は、問題の核酸の存在の指標である。

ＦＲＥＴ技術における多様なアクセプター蛍光部分とともに使用可能な代表的なドナー蛍光部分には、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートエフェニル）−４−メチルクーマリン、スクシニミジル１−ピレンブチレート、および４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体が含まれる。代表的なアクセプター蛍光部分には、用いたドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ−レッド６１０、ＬＣ−レッド６４０、ＬＣ−レッド６７０、ＬＣ−レッド７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リザミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、五酢酸ジエチレントリアミンまたはランタニドイオン（例えばユーロピウムまたはテルビウム）の他のキレートが含まれる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得られうる。

好ましくは、蛍光プローブは、フルオレセイン、ローダミンおよび／またはシアニンを含む。例えば、ドナー蛍光部分は、フルオレセインであってもよく、そして／またはアクセプター蛍光部分は、ＬＣ−レッド６１０、ＬＣ−レッド６４０、ＬＣ−レッド６７０、ＬＣ−レッド７０５、Ｃｙ５、およびＣｙ５．５からなる群より選択されてもよく、好ましくはＬＣ−レッド６１０またはＬＣ−レッド６４０である。より好ましくは、ドナー蛍光部分はフルオレセインであり、そしてアクセプター蛍光部分はＬＣ−レッド６４０またはＬＣ−レッド６１０である。

いくつかの好ましいフルオロフォア（例えば６−カルボキシフルオレセイン、頭字語：ＦＡＭ、またはテトラクロロフルオレセイン、頭字語：ＴＥＴ）および消光剤（例えばテトラメチルローダミン、頭字語：ＴＡＭＲＡ）が入手可能である。

本発明の第一の側面の方法の背景において行う定義および実施例はまた、第二の側面のものにも当てはまり、そして逆も当てはまる。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語、ならびに任意の頭字語は、本発明の技術分野の一般的な当業者によって、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊行， １９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）； Ｋｅｎｄｒｅｗら（監修）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．刊行， １９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（監修）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．刊行， １９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出されうる。

本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコル、および試薬には限定されず、これはこれらが多様でありうるためである。本明細書に記載するものと類似のまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の実施において使用可能であるが、好ましい方法および材料を本明細書に記載する。さらに、本明細書で用いる用語は、特定の態様のみを記載する目的のためであり、そして本発明の範囲を限定することを意図されない。

本明細書において、そして付随する請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」および「ｅｎｃｏｍｐａｓｓ」は、排他的であるよりも包括的であるように解釈されるものとする。同様に、単語「ｏｒ」は、文脈が明らかに別に指示しない限り、「ａｎｄ」を含むと意図される。用語「複数」は、２またはそれより多くを指す。

実施例および図は、本発明の多様な態様を例示するよう意図される。こうしたものとして、論じる特定の修飾は、本発明の範囲に対する限定とは見なされないものとする。本発明の範囲から逸脱することなく、多様な同等物、変化、および修飾を実行可能であることが当業者には明らかであり、そしてしたがって、こうした同等の態様は、本明細書に含まれるものとすることが理解されるものとする。

図面
図１は、（ａ）光源（１）が、対照マーカー（２）で充填されたｄＰＣＲアレイを照射する、ｄＰＣＲアッセイにおける充填反応領域の高さを評価するための例示的なセットアップを例示する。個々の反応領域から生じる対照マーカーの蛍光シグナルが検出装置（３）に到達し、これは本質的に、各反応領域中の液体の高さに比例する。（ｂ）較正のため、同じ対照マーカー溶液で充填された周知の高さ（４）を持つ較正キュベットを用いて、高さを決定する。実験（ａ）におけるものと同じ条件下でシグナルを記録する。

図２は、有効および無効反応領域の模式的提示を示す。無効な反応領域を核酸の量または濃度の計算から外す。
ａ）有効陽性反応領域
ｂ）有効陽性反応領域（閾値より高い充填レベル）
ｃ）有効陰性反応領域
ｄ）有効陰性反応領域（閾値より高い充填レベル）
ｅ）無効反応領域（反応混合物が存在しない）
ｆ）無効反応領域（閾値より低い充填レベル）

実施例１：本発明にしたがったｄＰＣＲ測定を実行するための典型的な工程
核酸を含有する精製試料のよく定義された体積を、任意のｑＰＣＲ実験において用いられるようなマスターミックス構成要素のよく定義された体積と混合する。

マイクロアレイに基づくｄＰＣＲの場合、標準的なｑＰＣＲマスターミックスと比較して、組成物の何らかのマイナーな修飾が必要となる可能性もある。これらには、マイクロアレイの湿潤特性を調整するための、他の界面活性剤または異なる濃度の界面活性剤が含まれてもよい。例えば、核酸、ポリメラーゼ、または他の構成要素の、チップ表面への吸着を回避するため、他の界面活性物質を添加する必要がある可能性もある。いくつかの場合、マスターミックスバックボーンでの試料の希釈が必要である可能性もある。バックボーンは、マスターミックスと同じ緩衝剤構成要素を含有するが、ポリメラーゼ、ヌクレオチドおよびプライマー／プローブを含まない。次いで、試料およびマスターミックスを含有する反応混合物を、手動でｄＰＣＲマイクロアレイプレートの入口ポート内にピペッティングする。

ｄＰＣＲプレートは、標準マイクロウェルプレートの形式（ＳＢＳ形式）内に、１〜８の反応混合物（試料）を保持してもよい。ｄＰＣＲプレート内の１〜８試料の位置の各々は、例えばプレートの位置Ａ１での入口ポート、位置Ａ１〜Ａ１２の間の微小構造部分、および位置Ａ１２の出口ポートからなることも可能である。次のプロセス工程として、分配液を入口各々に添加する。これは、単一または８チャネルピペットを用いて、手動で、または自動化分配ステーションを用いることによって、行ってもよい。分離または分配液は、反応混合物に関して、混和不能でそして非反応性である、疎水性液体、例えば長鎖フッ素化炭化水素またはシリコン油である。反応混合物を含有する個々の反応領域の分離（または分配）は、受動的に、または入口ポートに過度の圧を適用することによって、または出口ポートに過少の圧を適用することによって、行うことも可能である。受動分離は、低粘度の分離液を用いる場合、またはプロセスを上昇した温度で行う場合、働く可能性がある。より高い粘度では、約１分以内に分離プロセスを完了するためには、典型的には１００〜１０００ｍｂａｒの過度の圧を適用しなければならない。分離プロセスを自動化デバイスで行う場合、そして分離速度が試料間で多様でありうる場合、監視センサーは、分離が完了した際、すなわち分離液が出口ポートに到達した際、プロセスが停止することを確実にしなければならない。その後、ｄＰＣＲプレートをサーマルサイクラー装置に移す。移動は、プレートごとに行ってもよいし、またはプレートのスタックを一度に移動させることによってもよい。移動プロセスは、完全に自動化されていてもよいし、またはプレートのスタックの移動は手動であり、一方、熱サイクリングおよび読み取りを含む残りのｄＰＣＲプロセスが完全に自動化されてもよい。熱サイクリングプロセスは、任意の終点熱サイクリングプロセスと類似であり、典型的には３０〜６０熱サイクルであり、各サイクルは、９２〜９６℃で１０〜３０ｓの変性工程、および５５〜６０℃で４０〜６０ｓのアニーリング／伸長工程からなる。９２〜９６℃で３０〜３００ｓのプレＰＣＲサイクル、および３０〜４０℃へのクールダウンサイクルまたは下降（ｒａｍｐｄｏｗｎ）もまた必要でありうる。マイクロアレイ内の泡（空気または水蒸気の）の生成および拡大を抑制するため、上昇した温度で熱サイクリングを実行することが必要である可能性もある。この場合、ｄＰＣＲプレートの最初の加熱前に、圧を構築する必要があり、そしてｄＰＣＲプレートを冷却した後に、圧を緩める必要がある。ｄＰＣＲ結果のハイスループットが必要な場合、本質的に平行に作動する、いくつかのサーマルサイクラー装置を有する必要がある可能性もある。

熱サイクリングプロセスの完了後、ｄＰＣＲプレートを続いて読み取り装置に移し、そして読み取り後、自動化ｄＰＣＲ分析装置内の出力スタック位置に移す。蛍光読み取り装置は、隣接する反応領域からの蛍光シグナルを区別するために十分な解像度を必要とする可能性もあり、そして試料に属する微小構造領域が大きい（典型的には６ｍｍｘ９０ｍｍ）ため、試料あたりいくつかの蛍光画像が必要である可能性もある。この目的のため、蛍光画像化装置またはｄＰＣＲプレートを異なる画像位置に移動させなければならない。全体の読み取り時間を短く維持するため、好ましい読み取り態様は、大きな視野を持ち、理想的には同じ位置で２つの試料レーンの画像化を可能にする。各画像化位置において、オートフォーカス調整が必要である可能性もある。これは、蛍光モードで、明視野または暗視野モードで行うことも可能である。また、カメラ平面および反応領域を含有する画像平面の間の傾きを修正する必要がある可能性もある。さらに、充填対照マーカーを含む、異なる蛍光マーカーの獲得のため、励起および放出フィルター位置の多様な組み合わせが必要である可能性もある。

Claims (19)

1. デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）における反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法であって、関心対象の核酸の量または濃度を反応領域のアレイにおいて定量化し、該方法が
   ａ）充填対照マーカーを、ｄＰＣＲにおいて用いる反応領域アレイの各反応領域に添加し；
   ｂ）各反応領域において、反応体積を定量化し；そして
   ｃ）工程ｂ）において決定される各反応領域における反応体積における、または工程ｂ）において決定される反応体積の総計の体積あたりの、ｄＰＣＲによって決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する
   工程を含む、前記方法。
2. 試料における関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法であって：
   ａ）関心対象の核酸を含有すると推測される試料を提供し；
   ｂ）反応領域アレイの各反応領域における試料を用いて、ｄＰＣＲを行い；
   ｃ）各反応領域中の反応体積を定量化し；そして
   ｄ）工程ｃ）において決定される各反応領域における反応体積中の、または工程ｃ）において決定される反応体積の総計の体積あたりの、工程ｂ）において決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する
   工程を含む、前記方法。
3. 各反応領域中に存在する充填対照マーカーを定量化することによって、反応体積を定量化する、請求項１または２の方法。
4. 充填対照マーカーのシグナルが、反応領域中の反応体積に比例する、請求項３の方法。
5. 測定した充填対照マーカーシグナルおよび予期される充填対照マーカーシグナルに基づいて、各反応領域に関する補正因子を計算し、そして反応体積偏差を考慮する補正因子を、それぞれの反応領域に適用する、請求項３または４の方法。
6. 反応領域中の、反応体積の高さに基づいて、各反応領域中の反応体積を定量化する、請求項１〜５のいずれか１項の方法。
7. 反応領域がウェルである、請求項６の方法。
8. 反応領域中の充填対照マーカーの量が、下限閾値より低い場合、または場合によって上限閾値より高い場合、反応領域を無効と同定する、請求項１〜７のいずれか１項の方法。
9. 反応領域に分配する前に、充填対照マーカーをＰＣＲ反応混合物に添加する、請求項１〜８のいずれかの方法。
10. 充填対照マーカーが蛍光マーカーまたは吸光度マーカーである、請求項１〜９のいずれか１項の方法。
11. 充填対照マーカーが
    −１またはそれより多いｄＰＣＲプローブのものとは異なる蛍光および／または吸光特性を有し；そして／または
    −ｄＰＣＲにおいて用いるターゲットプローブ蛍光マーカーと同一の励起波長または放出波長を有し；そして／または
    −少なくとも１００ｎｍ、または少なくとも１５０ｎｍのストークス・シフトを有する
    請求項１０の方法。
12. 関心対象の核酸が
    −ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混合物からなる群より選択される核酸であり；そして／または
    −微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患の指標である
    請求項１〜１１のいずれか１項の方法。
13. 試料を、混入が推測される細胞培養物または供給源から得ている、請求項２〜１２のいずれか１項の方法。
14. 試料を、体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床標本、臓器試料、組織試料、被験体、ヒト、動物、または植物から得ている、請求項２〜１３のいずれか１項の方法。
15. 反応領域が、チップ上、キャピラリー中、核酸結合表面上またはビーズ上、マイクロアレイ中またはチップ上の、マイクロアレイまたはナノアレイの小型化されたチャンバー、微少流体デバイスのチャンバー、マイクロウェルまたはナノウェルである、請求項１〜１４のいずれか１項の方法。
16. 反応領域のアレイが
    −少なくとも１００反応領域、少なくとも１，０００反応領域、または少なくとも５，０００反応領域；および／または
    −少なくとも１０，０００反応領域、少なくとも５０，０００反応領域、少なくとも１００，０００反応領域
    を含む、請求項１〜１５のいずれか１項の方法。
17. ｄＰＣＲが、関心対象の１またはそれより多い核酸を検出するため、１またはそれより多い蛍光ｄＰＣＲプローブの使用を伴う、請求項１〜１６のいずれか１項の方法。
18. ｄＰＣＲが、関心対象の１またはそれより多い核酸を検出するため、１またはそれより多い蛍光ｄＰＣＲプローブの、消光剤と組み合わせた、または分子ビーコンとしてのまたは加水分解プローブとしての使用を伴う、請求項１〜１７のいずれか１項の方法。
19. 蛍光ｄＰＣＲプローブが、フルオレセイン、ローダミンおよび／またはシアニンを含む、請求項１７または１８の方法。

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