JP2018046819A - デジタルポリメラーゼ連鎖反応における反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)における反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法であって、関心対象の核酸の量または濃度を反応領域のアレイにおいて定量化し、該方法が、a)充填対照マーカーを、dPCRにおいて用いる反応領域アレイの各反応領域に添加する工程と、b)各反応領域において、反応体積を定量化する工程と、c)1つの体積における又は体積あたりの、dPCRによって決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量又は濃度を計算する、ここで体積が工程b)において決定されるような反応体積の総計である工程とを含む、方法。
【選択図】なし
Description
したがって、反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるdPCRによって、関心対象の核酸を定量化する方法に関する必要性がある。本発明の目的はこれらの方法を提供することである。
a)充填対照マーカーを、dPCRにおいて用いる反応領域アレイの各反応領域に添加し;
b)各反応領域において、反応体積を定量化し;そして
c)1つの体積におけるまたは体積あたりの、dPCRによって決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する、ここで体積が工程b)において決定されるような反応体積の総計である
工程を含む、前記方法に関する。
反応体積偏差は、反応領域における不均一な体積を生じうる。領域のサイズ分布の幅は、計測率、そしてしたがって計算される核酸濃度の正確さに影響を及ぼす。この定量化誤差は、領域あたりの低コピー数では無視できるが、領域あたりの高コピー数では大きくなりうる。この効果は、1つの領域が非常に広い一方、すべての他のものがゼロに向かって収縮する思考実験によって例示されうる。この場合、陽性係数は、明らかに1に向かう傾向があり、極端な過少定量化を生じるであろう。
a)関心対象の核酸を含有すると推測される試料を提供し;
b)反応領域アレイの各反応領域における試料を用いて、dPCRを行い;
c)各反応領域中の反応体積を定量化し;そして
d)1つの体積中のまたは体積あたりの、工程b)において決定されるような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する、ここで体積が工程c)において決定されるような反応体積の総計である
工程を含む、前記方法に関する。
試料は、被験体由来の試料を含めて、問題の核酸を含有すると推測される任意の試料であってもよい。試料は、その物質(単数または複数)と同一であり、そしてそのより多い量を代表すると意図される、限定された量の物質である。試料を得る作業は、人によって、または自動的に実行可能である。試験、分析、検査、調査、実証、または試行使用のために、試料を採取するかまたは提供することも可能である。ある場合、試料採取は連続的に進行中であってもよい。試料は、個体、液体または気体を含むかまたはこれらからなってもよい;試料は、ゲルまたは痰、組織、生物またはこれらの組み合わせなどの、何らかの中間特性を持つ物質であってもよい。好ましくは、試料は、容易な分布を可能にする液体または懸濁物である。
試料がdPCRのための準備ができていないかまたは適していない場合、dPCRに使用する前に、さらなるプロセシングが必要である可能性もある。通常、試料は、例えば試料を希釈して(dPCRを可能にする核酸濃度を得る)、妨害構成要素を除去し、dPCRに必要な試薬を添加するなどにより、dPCRのためにプロセシングされる必要がある。プロセシングは、多数の異なる工程および技術を含むことも可能であり、これらは、試料の性質、関心対象の核酸のタイプ、および用いるdPCR法を含む、多様な側面に応じるであろう。典型的には、プロセシングには、精製工程および/または希釈または濃縮工程が含まれる。核酸を精製するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、限定されるわけではないが、ホモジナイズ、洗浄、遠心分離、抽出等が含まれる。例えば試料を破壊することによって、保存剤を添加することによって、試料を凍結することによってまたは乾燥させることによって、試料を保存することが必要である可能性もある。得た試料を破壊するため、物理的な力(例えばポリトロン、粉砕または凍結)または化学的方法(例えば細胞の溶解)を用いてもよい。ホモジナイズのために界面活性剤またはカオトロープを用いてもよい。酸フェノール/クロロホルム、フィルター、ガラス粒子またはクロマトグラフィ(例えば結合パートナーとして適切な核酸を用いて)の使用によって、核酸を抽出してもよい。プロセシングの任意の時点で(プロセシングの開始時、プロセシング中、および/またはプロセシング終了時)、試料を保存することが必要である可能性もある。このため、適切な培地、例えば緩衝生理食塩水を添加することが必要であるかまたは適切である可能性もある。関心対象でないか、または妨害しうる、混入物質および/または核酸を除去することが必要である可能性もある。混入物質を除去するため(例えばDNアーゼ、RNアーゼおよび/またはプロテイナーゼ)、または関心対象の核酸を保護するため(例えばDNアーゼ阻害剤またはRNアーゼ阻害剤)、酵素を用いてもよい。酵素を不活性化するため、加熱工程が適切である可能性もある。望ましくない構成要素、例えば二価カチオン(Ca2+およびMg2+)を取り除くため、除去剤を用いてもよい。培地を交換するために、洗浄工程が必要である可能性もある。
次の工程として、反応領域アレイの各反応領域中の試料を用いて、dPCRを行う。dPCRにおいて、問題の核酸を増幅し、そして検出し、ここで、多くの個々の分子は、各々、別個の反応領域に単離される。各反応領域(ウェル、チャンバー、ビーズ、エマルジョン等)は、出発分子が存在しない場合は陰性結果、またはターゲットとされる出発分子が存在する場合は、増幅および検出に関して陽性結果のいずれかを有するであろう。これは、反応の一部がテンプレート分子を持たず、そして陰性増幅結果を与えるように、多くの別個のPCR反応に渡って、試料の限界希釈を行う技術である。反応終点で、陽性PCR反応混合物反応の数を計数する際、元来の試料に存在する個々のテンプレート分子を1つ1つ計数する。PCRに基づく技術は、増幅可能である分子を計数するだけであるさらなる利点を有し、例えばこれは、配列決定ワークフローにおける、大規模な平行PCR工程に適している。デジタルPCRに基づく方法において、分析しようとする核酸を多くの異なる反応領域(例えばウェル、ビーズ、エマルジョン、ゲルスポット、微少流体デバイス中のチャンバー等)に分配する。いくつかであるがすべてではない反応領域が少なくとも1つの分子を含有することが重要である。典型的には、各反応領域は、1つまたはゼロの分子を含有するであろう。実際、反応領域、例えばウェルには、分子のランダムな分布があるであろう。反応領域のある割合(例えば80%)が陽性である場合、多くの領域は、1またはそれより多い分子(例えばウェルあたり平均2.2分子)を含有するであろう。統計法を用いて、異なる反応領域の数および陽性の数に基づいて、試料中の分子の予期される総数を計算することも可能である。これは、異なる反応領域に適用された、部分中の核酸の計算量または濃度を生じるであろう。試料採取および確率に基づくいくつかの統計法を用いて、この濃度に到達することも可能である。こうした分析の例は、arxiv.org、引用arXiv:0809.1460v2[q−bio.GN]に見られる、2008年9月8日に最初にアップロードされた、Dubeら, arXiv:0809.1460v2 「デジタルPCRを用いた、ナノ流体デバイス上でのコピー数偏差の最大解像度の計算(2008)」に提供される。該刊行物は、デジタルPCRアレイ中で用いられる反応領域の数および陽性結果の数に基づいて、分子濃度および統計信頼区間を概算するために使用可能な一連の等式を提供する。このタイプの計算の別の例は、米国特許出願US 2009/0239308 A1に見出されうる。
体積は、物体(すなわち固体、液体、気体、またはプラズマ)が占める三次元空間に関する。体積は、寸法、例えば物体が占める空間の長さ、幅、および高さに基づいて計算可能である。これらは、通常、SI単位で表され、例えば立方センチメートル(cm3)、立方メートル(m3)、リットル(L)、ミリリットル(mL)等である。
反応体積分布が狭く、そして分配あたりのコピー数が<<1である場合、
式中、Pはポアソン補正因子である。これは、有効陽性および有効陰性の比に依存し、そして1より多いコピー数の核酸を含有する反応領域の可能性を考慮する。反応領域あたりの低コピー数比(有効陽性<<有効陰性)で、P=1であり、そして
Cは体積分布補正因子である。これは、反応領域あたりのコピー数比、および平均反応領域体積に比較した反応領域体積の変動に依存する。反応領域あたりの低コピー数比および相対反応領域体積偏差<10%で、C=1である。
有効反応領域体積[i]=(参照反応領域体積)*(対照色素の強度)*定数。
−有効陽性反応領域は、適切に反応混合物で充填され、そして増幅後、陽性PCRシグナルを生成する。
−無効反応領域は、反応混合物で充填されず(または不十分にしか充填されず)またはアーチファクトに寄与する他の特性のため、排除される。
さらに、方法はまた、不均一な反応領域体積によって引き起こされる定量化誤差を排除することもまた可能にする。これは以下のように実行可能である:
a)反応領域体積の分布を、較正実験において決定する。それによって、それぞれの反応領域体積に比例する、各反応領域からの充填対照マーカーのシグナルを評価する。
c)補正因子C(反応領域あたりのコピー数比、および反応領域体積の相対変動に依存する。上記を参照されたい)を、この実験セットアップで決定される各濃度に適用する。
これが当てはまらない場合、より高度な計算を適用してもよい:
a)反応領域体積の分布を各実験で決定する。
c)モデル曲線を用いて、この特定の実験で測定された濃度に関する補正因子を評価する。
−周知の高さを持つ較正キュベット
−充填対照マーカー(平面における領域あたりのフルオロフォアの数に比例するシグナルを生じる)
−充填対照マーカーの高さに比例するシグナルを生じる検出系。
したがって、本発明の方法の別の好ましい態様において、各反応領域中の反応体積を、反応領域中、特にウェル中の反応体積の高さに基づいて、好ましくは充填対照マーカーを用いることによって、定量化する。これに関連するさらなる詳細は、上に提供されている。
広範囲の蛍光マーカーが、本発明にしたがった充填対照マーカーとして使用可能である。各蛍光マーカーは、特徴的なピーク励起および放出波長を有し、そして放出スペクトルは、しばしば、重複する。その結果、dPCRに用いる蛍光マーカーおよび充填対照の組み合わせは、蛍光色素を励起するために用いるランプ(単数または複数)またはレーザー(単数または複数)の波長、利用可能な検出装置およびマーカーの特性に応じる。
−細菌:連鎖球菌属(Streptococcus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、バークホルデリア属(Burkholderia)、ミコバクテリウム属(Mycobacterium)、クラミドフィラ属(Chlamydophila)、エシェリキア属(Ehrlichia)、リケッチア属(Rickettsia)、サルモネラ属(Salmonella)、ナイセリア属(Neisseria)、ブルセラ属(Brucella)、ミコバクテリウム属(Mycobacterium)、ノカルディア属(Nocardia)、リステリア属(Listeria)、フランシセラ属(Francisella)、レジオネラ属(Legionella)、およびエルシニア属(Yersinia)
−ウイルス:アデノウイルス、単純ヘルペス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、TBEウイルス、HIV、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、ロタウイルスおよびエボラウイルス
−真菌:カンジダ属(Candida)、アスペルギルス属(Aspergillus)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、ヒストプラズマ属(Histoplasma)、ニューモシスチス属(Pneumocystis)およびスタキボトリス属(Stachybotrys)
−寄生虫:原生動物寄生虫、蠕虫動物寄生虫および節足動物寄生虫。
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的および科学的用語、ならびに任意の頭字語は、本発明の技術分野の一般的な当業者によって、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press刊行, 1994(ISBN 0−19−854287−9); Kendrewら(監修), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.刊行, 1994(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A. Meyers(監修), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.刊行, 1995(ISBN 1−56081−569−8)に見出されうる。
図1は、(a)光源(1)が、対照マーカー(2)で充填されたdPCRアレイを照射する、dPCRアッセイにおける充填反応領域の高さを評価するための例示的なセットアップを例示する。個々の反応領域から生じる対照マーカーの蛍光シグナルが検出装置(3)に到達し、これは本質的に、各反応領域中の液体の高さに比例する。(b)較正のため、同じ対照マーカー溶液で充填された周知の高さ(4)を持つ較正キュベットを用いて、高さを決定する。実験(a)におけるものと同じ条件下でシグナルを記録する。
a)有効陽性反応領域
b)有効陽性反応領域(閾値より高い充填レベル)
c)有効陰性反応領域
d)有効陰性反応領域(閾値より高い充填レベル)
e)無効反応領域(反応混合物が存在しない)
f)無効反応領域(閾値より低い充填レベル)
核酸を含有する精製試料のよく定義された体積を、任意のqPCR実験において用いられるようなマスターミックス構成要素のよく定義された体積と混合する。
Claims (14)
- デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)における反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるための方法であって、関心対象の核酸の量または濃度を反応領域のアレイにおいて定量化し、該方法が
a)充填対照マーカーを、dPCRにおいて用いる反応領域アレイの各反応領域に添加し;
b)各反応領域において、反応体積を定量化し;そして
c)1つの体積におけるまたは体積あたりの、dPCRによって決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する、ここで体積が工程b)において決定されるような反応体積の総計である
工程を含む、前記方法。 - 試料における関心対象の核酸の量または濃度を決定するための方法であって:
a)関心対象の核酸を含有すると推測される試料を提供し;
b)反応領域アレイの各反応領域における試料を用いて、dPCRを行い;
c)各反応領域中の反応体積を定量化し;そして
d)1つの体積中のまたは体積あたりの、工程b)において決定するような核酸の数として、関心対象の核酸の量または濃度を計算する、ここで体積が工程c)において決定されるような反応体積の総計である
工程を含む、前記方法。 - 各反応領域中に存在する充填対照マーカーを定量化することによって、反応体積を定量化する、特に、充填対照マーカーのシグナルが反応領域中の反応体積に比例する、請求項1または2の方法。
- 測定した充填対照マーカーシグナルおよび予期される充填対照マーカーシグナルに基づいて、各反応領域に関する補正因子を計算し、そして反応体積偏差を考慮する補正因子を、それぞれの反応領域に適用する、請求項3の方法。
- 反応領域中の、特にウェル中の反応体積の高さに基づいて、各反応領域中の反応体積を定量化する、請求項1〜4のいずれかの方法。
- 反応領域中の充填対照マーカーの量が、下限閾値より低い場合、または場合によって上限閾値より高い場合、反応領域を無効と同定する、請求項1〜5のいずれかの方法。
- 反応領域に分配する前に、充填対照マーカーをPCR反応混合物に添加する、請求項1〜6のいずれかの方法。
- 充填対照マーカーが蛍光マーカーまたは吸光度マーカーである、請求項1〜7のいずれかの方法。
- 充填対照マーカーが
−1またはそれより多いdPCRプローブのものとは異なる蛍光および/または吸光特性を有し;そして/または
−dPCRにおいて用いるターゲットプローブ蛍光マーカーと同一の励起波長または放出波長を有し;そして/または
−少なくとも100nm、好ましくは少なくとも150nmのストークス・シフトを有し;そして/または
−ATTO 430 LSまたはATTO 490 LS、好ましくはATTO 490 LSである
請求項8の方法。 - 関心対象の核酸が
−DNA、cDNA、RNAおよびその混合物からなる群より選択される核酸であり;そして/または
−微生物、細胞、ウイルス、細菌、真菌、哺乳動物種、遺伝子状態または疾患の指標である
請求項1〜9のいずれかの方法。 - 試料を、混入が推測される細胞培養物または供給源、特に体液、血液、血漿、血清、尿、胆汁、脳脊髄液、スワブ、臨床標本、臓器試料および組織試料または被験体、特にヒト、動物および植物、特にヒトから得ている、請求項2〜10のいずれかの方法。
- 反応領域が、チップ上、キャピラリー中、核酸結合表面上またはビーズ上、特にマイクロアレイ中またはチップ上の、マイクロアレイまたはナノアレイの小型化されたチャンバー、微少流体デバイスのチャンバー、マイクロウェルまたはナノウェルである、請求項1〜11のいずれかの方法。
- 反応領域のアレイが
−少なくとも100反応領域、特に少なくとも1,000反応領域、特に少なくとも5,000反応領域;および/または
−少なくとも10,000反応領域、特に少なくとも50,000反応領域、特に少なくとも100,000反応領域
を含む、請求項1〜12のいずれかの方法。 - dPCRが、関心対象の1またはそれより多い核酸を検出するため、1またはそれより多い蛍光dPCRプローブの、特に消光剤と組み合わせた、または分子ビーコンとしてのまたは加水分解プローブとしての使用を伴い、そして/または特に蛍光dPCRプローブがフルオレセイン、ローダミンおよび/またはシアニンを含む、請求項1〜13のいずれかの方法。
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