CN107868815B - 减少由数字聚合酶链式反应中的反应体积偏差引起的定量误差的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种减少由数字聚合酶链式反应(dPCR)中的反应体积偏差引起的定量误差的方法以及用dPCR确定样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法。

Description

减少由数字聚合酶链式反应中的反应体积偏差引起的定量误 差的方法
本发明涉及一种减少由数字聚合酶链式反应(dPCR)中的反应体积偏差引起的定量误差的方法以及用dPCR确定样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法。
出于许多生物、生物化学、诊断或治疗目的，有必要准确且精密地确定样品中核酸的量或浓度。dPCR是一种相当新的核酸检测和定量方法，提供了一种可替代传统的实时定量PCR的核酸绝对定量和稀有等位基因检测方法。dPCR是通过将核酸样品分区(partition)成多个单独的平行PCR反应；这些反应中的一些包含靶分子(阳性)，而其他反应不包含靶分子(阴性)。在PCR分析后，使用阴性反应的分数来产生样品中靶分子数目的绝对计数。dPCR相比于实时PCR的关键优点之一是其优异的定量准确性。这个优点依赖于dPCR的固有特性，因为定量只需要正确统计阳性分区数且知晓理论分区体积(统计数对PCR效率不太敏感)。不需要定量标准品。这消除了由标准品本身引起的潜在定量误差。
现有技术提供了用于在基于液滴的测定中鉴定不正确的阳性或阴性计数以及用于校准或归一化信号的方法(US 2013/0302792 A1)。这种归一化会改善阳性计数和阴性计数之间的分离。因此，归一化可降低假阳性或假阴性计数的风险。最终的目标是通过校正对核酸获得的信号来提高核酸浓度测定的准确度和精密度。
然而，现有技术的方法没有考虑到由于某些情况下dPCR反应区中的真实体积与期望或预期的体积不同而造成的PCR中的定量误差。
因此，需要这样的通过dPCR定量感兴趣的核酸的方法：其可减少由反应体积偏差引起的定量误差。本发明的目的是提供这些方法。
这个目的借助一种基于数字聚合酶链式反应(dPCR)的方法而实现，其中每个反应区中的体积被定量、并被包括在感兴趣的核酸的量或浓度的计算中。这可以通过向每个反应区添加填充对照标志物(fill control marker)来完成。
因此，本发明提供的方法不仅可高度准确和精密地通过dPCR定量核酸，而且可定量dPCR中使用的体积，使得更精密和准确地确定样品中感兴趣的核酸的量或浓度成为可能。具体而言，上述方法允许校正例如由于不均匀的反应区大小或反应区平均体积的偏差所致的定量误差。而且，可以消除由无效(例如空的或几乎空的)反应区引起的定量误差。
在第一个方面，本发明涉及减少由数字聚合酶链式反应(dPCR)中的反应体积偏差引起的定量误差的方法，其中在反应区阵列中的感兴趣的核酸的量或浓度被定量，该方法包括：
a)向dPCR中使用的反应区阵列的每个反应区中加入填充对照标志物；
b)定量每个反应区中的反应体积；和
c)计算通过dPCR确定的一定体积内或每体积的核酸数目作为感兴趣的核酸的量或浓度，其中所述体积是在步骤b)中确定的反应体积的总和。
如上面详述的，可靠地确定核酸的量或浓度的方法在若干行业应用中(例如，在医疗领域中)具有特别意义。在若干方面，可能不仅需要弄清样品中是否存在核酸，而且可能需要尽可能精密和准确地确定样品，例如从患者或产品获得的样品中的核酸的量或浓度。这在诊断疾病的严重性或环境技术或产品的质量控制方面可能是有意义的，例如，为了限定污染物或杂质。
目前的dPCR方法着重于确定意图的体积中存在的核酸数目。然而，为了确定有关核酸在特定体积中的量或其每体积的浓度，还需要知道实际和正确的体积。利用本发明的dPCR方法，可同时确定核酸数目(即感兴趣的核酸的拷贝数)以及包含它们的体积，从而提供更准确的结果。
dPCR(数字聚合酶链式反应，数字PCR，或称DigitalPCR)是常规的聚合酶链式反应方法的一种生物技术优化，可用于直接定量且任选地克隆扩增核酸，包括DNA、cDNA、RNA或其混合物。dPCR和传统PCR(例如qPCR)的关键区别在于测量核酸量的方法，前者是比PCR更精密和准确的方法，但没有经验的使用者也更容易犯错。dPCR的较小动态范围(dynamicrange)可能需要稀释样品。dPCR同样在一个样品内进行单一反应，但将样品分割成很多分区(partitions)或反应区(reaction areas)，并且在每份或每个反应区中单独进行反应。这种分割使得更可靠的收集和更灵敏的核酸量测量成为可能。而且，该方法使得精密定量成为可能。
如上详述，将dPCR样品分区，使得样品中的各个核酸分子在多个分隔的区域(反应区)内定位和浓缩。样品的分区使得能够通过假定分子群体遵循泊松分布来估计核酸的数目。结果，每个部分将包括阴性或阳性反应(分别为“0”或“1”)。在PCR扩增后，可通过计数含有PCR终产物阳性反应的区域来定量核酸。在常规的定量PCR中，定量结果可能取决于PCR过程的扩增效率。然而，dPCR不依赖于扩增循环的数量来确定初始样品量，无需依赖不确定的指数数据来定量靶核酸，因此可提供绝对定量。
本发明的第一方面涉及减少由反应体积偏差引起的定量误差的方法。
反应体积偏差可能导致反应区中的体积不均匀。这些区的大小分布的宽度影响计数率(count rate)，从而影响计算得到的核酸浓度的准确性。在每区的拷贝数(copies perarea)低时，该定量误差可忽略不计，但是在每区拷贝数高时，该定量误差可能变大。这种效应可以通过一个思想实验来说明：一个区变得非常大，而所有其他区缩减趋向零。在这种情况下，阳性计数显然会趋向1，导致极端的定量过低(under-quantification)。
替代地或另外地，反应体积偏差可能是由于反应区平均体积不同于意图的或预期的反应区平均体积(例如通过校准值预定的)所致的。
在基于液滴和基于阵列的dPCR系统中，平均分区体积的不确定性都被认为是当前系统中精度误差的主要来源(Dong等人，2015,Sci.Rep.5,13174和Dong等人，2014,Anal.Bioanal.Chem.406,1701–1712)。
反应区平均体积可能由于下列因素而变化；反应混合物组成的变化(在dPCR阵列的情况下，去污剂对反应混合物和密封流体的界面处的弯液面形成有影响)、由阵列的生产过程导致的反应区深度的变化(例如用于生产阵列的成型工具的变化可能与反应区的几何变化有关)或由于填充速度引起的反应区的填充程度的变化。
在第一方面的方法的第一步中，向dPCR中使用的反应区阵列的每个反应区添加填充对照标志物，以减少由反应体积偏差引起的定量误差。填充对照标志物可以是任何允许定量每个反应区中的反应体积的物质或组合物。
因此，填充对照标志物可包含任何可检测标记物或由任何可检测标记物组成。如本文中使用的术语“标记物”一般性地指可用于可视化、检测、分析和/或定量反应区中的体积的任何种类的物质或作用剂。标记物可以例如是使体积在光学上可检测和/或在光学上可区分的染料。标记物指示每个反应区[例如在流动流中，在多孔板(multiwall-plate)中，在芯片上，在阵列或视野中，等等]的体积。标记物在每个反应区中可以具有任何合适的均匀或非均匀分布。例如，标志物可以基本上均匀地分布在整个反应区中，可以局在于反应区的周边(例如，局在于封装液滴的皮或覆盖反应区的表面，例如在孔中)，或者可以在反应区内具有一个或多个离散的定位(例如，如果标志物是颗粒(比如珠子或量子点等))。
根据本发明的标记物可以包括但不限于，放射性同位素，例如35硫(35S)、32磷(32P)、33磷(33P)、3H或14C；任何可以通过发光分析例如荧光素染料检测和/或可视化的有色(例如2,4-二硝基苯酚)或发光分子，优选荧光分子或光吸收标志物(非荧光或荧光)，如荧光染料，包括但不限于羧基荧光素(FAM)、6-羧基-4′,5′-二氯-2′7′-二甲氧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四氯荧光素(TET)和六氯荧光素；罗丹明染料，例如羧基-X-罗丹明(ROX)、德克萨斯红和四甲基罗丹明(TAMRA)；花菁染料如吡喃鎓花菁染料、DY548、Quasar570或Cy3、Cy5、Alexa 568等。荧光标记物可从多家供应商商购获得，包括例如，InvitrogenTM(USA)。
标记物的选择通常由以下因素确定：其物理特性(例如光谱特性)、检测设备的可用性和在dPCR中的核酸检测中使用的标记物。标记物以及它们的检测策略是本领域技术人员熟知的。
例如，信号可以是荧光信号。如果测量来自每个反应区的两个或更多个不同的荧光信号(一个针对PCR，一个为填充对照标志物)，则各信号可以，例如，在不同的波长或波段检测。或者，可以在用不同的波长或波段的光(例如，在不同时间或不同位置的激发)等激发之后，在相同的波长/波段测量荧光信号。可以通过对应的不同荧光团检测两个或更多个荧光信号。
在一些实施方案中，填充对照标志物可以不与扩增反应偶联，因此用作被动参考(passive reference)。在一些实施方案中，填充对照标志物可另外作为从对照扩增反应检测的对照信号使用。对照扩增反应可以测量外源或内源模板的扩增。优选地，标记物在该方法过程中是稳定的，不经漂白，不依赖于扩增反应和/或不随温度变化。
在第一方面的方法的第二步中，定量每个反应区中的反应体积。反应体积的定量基于填充对照标志物提供的信号进行。可以基于每个反应区中检测到的填充对照标志物的量或浓度来确定反应区的体积。用于确定标志物的量或浓度的方法将取决于所用的标志物，并且是本领域熟知的。例如，如果使用放射性同位素，则可以测量放射性。优选使用荧光标志物，其可以通过荧光手段进行检测和/或定量。
除了确定体积之外，填充对照标志物可以用作获得的dPCR信号的归一化因子和/或用于从测定中剔除无效样品(另参见下文)。
作为第三步，计算以一定体积中或每体积的通过dPCR测定的核酸数目作为感兴趣的核酸的量或浓度，其中所述体积是在第二步中确定的反应体积的总和。进一步的细节在下文给出。
在第二方面，本发明涉及用于确定样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供疑似含有感兴趣的核酸的样品；
b)使用该样品在反应区阵列的每个反应区中进行dPCR；
c)定量每个反应区中的反应体积；和
d)计算在一定体积中或每体积的如步骤b)中测定的核酸的数目作为感兴趣的核酸的量或浓度，其中所述体积是在步骤c)中确定的反应体积的总和。
在本发明方法的第一步中，提供疑似含有感兴趣的核酸的样品。
该样品可以是任何疑似含有所述核酸的样品，包括来自受试者的样品。样品是有限量的某种材料，其预期其与更大量的此种材料相同并且代表此种材料。获得样品的行动可以由人完成或自动完成。可以为了进行测试、分析、检验、调查、演示或试用而采集或提供样品。有时，采样可以持续进行。样品可以包含固体、液体或气体或由其组成；样品可以是具有一些中间特征的材料，例如凝胶或痰(sputum)、组织、生物或它们的组合。优选地，样品是便于分配的液体或悬浮液。
即使材料样品无法以个体(individual items)计数，但样品的量仍可以根据其体积、质量、大小或其他类似单位加以描述。固体样品可以是一个或几个离散的碎片，或者可以是片段化的、颗粒状的或粉末状的。
在本上下文中的样品是一定量的疑似含有待检测或测量和定量的一种或多种核酸的材料。如本文中使用的，该术语包括但不限于：标本(例如活组织检查或医学标本)、培养物(例如微生物培养物)或诸如水或土壤的环境样品。样品可以来自受试者，例如动物或人，它们可以是流体、固体(例如粪便)、悬浮液或组织。术语“来自受试者的样品”包括从任何给定受试者分离的所有生物流体、排泄物和组织。优选地，受试者是动物，更优选哺乳动物，或进一步更优选人。样品可以从所有不同类群的家畜、以及野化(feral)或野生动物获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等的动物。
样品的实例包括但不限于细胞或组织培养物、血液、血清、血浆、针吸活组织、尿液、精液、精液、精浆、前列腺液、排泄物、泪液、唾液、汗液、活组织检查、腹水、脑脊液、胸膜液、羊水、腹膜液、间质液、痰、乳汁、淋巴、支气管灌洗样品和其他灌洗样品、或组织提取物样品。样品来源可以是来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物的固体组织；或来自受试者妊娠或发育中的任何时间的细胞。
样品可含有与样品的来源天然不混在的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养剂、抗生素等等。
如果样品未准备好dPCR或不适合于dPCR，则可能需要在用于dPCR之前进一步处理。通常，需要处理样品后用于dPCR，例如通过稀释样品(以得到允许dPCR的核酸浓度)，去除干扰成分，加入dPCR所需的试剂等等。处理可以包括众多不同的步骤和技术，这将取决于若干方面，包括样品的性质、感兴趣的核酸的类型和所用的dPCR方法而定。典型地，处理包括纯化步骤和/或稀释或浓缩步骤。纯化核酸的方法是本领域熟知的，包括但不限于均质化、洗涤、离心、提取等。可能需要，例如，通过破碎样品，通过加入防腐剂，通过冷冻或干燥样品来保存样品。为了破碎获得的样品，可以使用物理力(例如，polytron组织均质机处理、研磨或冷冻)或化学方法(例如，裂解细胞)。洗涤剂或离液剂可用于均质化。可以通过使用酸性苯酚/氯仿、过滤器、玻璃颗粒或色谱(例如，用适当的核酸作为结合配偶体)提取核酸。在处理的任何时间(开始时，在处理期间和/或结束时)可能需要储存样品。为此，添加适当的介质，比如缓冲盐水可能是必需的或合适的。可能需要除去不感兴趣或可能造成干扰的核酸和/或污染物。可以使用酶除去污染物(比如使用DNA酶、RNA酶和/或蛋白酶)或保护感兴趣的核酸(比如使用DNA酶抑制剂或RNA酶抑制剂)。为了使酶失活，加热步骤可能是适当的。可以使用去除剂，以便除去不期望的组分，比如二价阳离子(Ca2+和Mg2+)。可能需要洗涤步骤来更换介质。
如上文详述的，对于dPCR，感兴趣的核酸在dPCR过程中必须以适当的量或浓度存在。因此，可能需要适当的稀释或浓缩步骤。通常通过加入溶剂(比如适合于后随步骤的介质，例如dPCR介质或dPCR缓冲液)来进行核酸的稀释。可以伴随有洗涤步骤，例如，如果意图或者需要去除不需要的成分或浓缩以获得一定的终浓度的话。浓缩可以通过任何富集程序进行，例如免疫捕获、离心、醇沉淀和使用结合基质。在处理之后，样品已准备好用于dPCR，dPCR接下来在第二方面的本发明方法的步骤b)中进行。
如上文详述的，样品含有感兴趣的核酸，所述核酸的量或浓度将在本发明的方法中确定。核酸是所有已知生命形式必需的生物聚合物。因此，核酸可以用作特定生物的指示物，而且，例如在突变或天然存在的变体的情况下，还可以用作疾病的指示物。核酸，包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)，是由被称为核苷酸的单体组成的。每个核苷酸有三个组成部分：5-碳糖、磷酸基和含氮碱基。如果所述糖为脱氧核糖，则该聚合物为DNA。如果所述糖为核糖，则该聚合物为RNA。核酸是最重要的生物大分子之一。它们在所有活生物体中都大量存在，在活生物体中发挥编码、传递和表达遗传信息的功能——换言之，通过核酸序列，或DNA或RNA分子中核苷酸的顺序，传递信息。核酸的实验研究是现代生物和医学研究的一个重要部分，并且构成基因组和法医学以及生物技术和制药行业的一个支柱。因此，本发明的方法可以用于任何这些领域。
核酸可以指示微生物(比如病原体)，并且可用于诊断疾病，比如感染。感染可能是由细菌、病毒、真菌、和寄生虫或其他含有核酸的物体引起的。病原体可以是外源性的(从环境或动物来源或从其他人获得)或内源性的(来自正常菌群)。可以基于体征和症状选择样品，样品应该代表疾病过程，并且应该在给予抗微生物剂之前采集。未处理样品中核酸的量可以指示疾病的严重程度。
或者，核酸可以指示遗传障碍。遗传障碍是由基因组中一种或多种异常引起的遗传问题，特别是从出生(先天性)就存在的病症。大多数遗传障碍是非常罕见的，每数千或数百万人中累及一人。遗传障碍可以是可遗传的，也可以是不可遗传的，可遗传的即为从父母的基因传下来。在可遗传的遗传障碍中，缺陷可能由DNA的新突变或变化引起。在这些情况下，缺陷只有发生在生殖细胞系中才是可遗传的。同样的疾病，如某些形式的癌症，在一些人中由遗传来的遗传状况引起，在另一些人中由新的突变引起，在又另一些人中主要由环境原因引起。显然，具有突变的核酸的量可以指示疾病状态。
在本发明的方法中，确定核酸的量或浓度。物质的量是标准规定的量。国际单位制(SI)规定物质的量与存在的基本单元数成正比，其中比例常数为阿伏伽德罗常数的倒数(以mol为单位)。物质的量的SI单位是摩尔。摩尔定义为含有与12克同位素碳12中的原子数相同的数量的基本单元的物质的量。因此，样品的物质的量以样品质量除以物质的摩尔质量来计算。在该语境中，“量”通常是指感兴趣的核酸序列的拷贝数。
物质的浓度为组分的丰度除以混合物的总体积。可以区分几种类型的数学描述：质量浓度、摩尔浓度、数量浓度和体积浓度。术语“浓度”可以应用于任何种类的化学混合物，但它最常见地是指溶液中的溶质和溶剂。摩尔(量)浓度具有标准浓度和渗透浓度等变体。优选地，浓度是以数字给出的成分的量除以混合物的总体积。在本发明的上下文中，浓度通常是“每体积的拷贝数”(copies per volume)。
优选地，所提供的样品是液态(in a liquid)，这简化了进一步的方法步骤。
作为下一步，使用样品在反应区阵列的每个反应区中进行dPCR。在dPCR中，扩增并检测相关核酸，其中若干单独的分子各自被隔离在分别的反应区中。每个反应区(孔、室、珠子、乳液等)如果不存在起始分子，将产生阴性结果，或者如果存在目标起始分子，则扩增和检测为阳性结果。dPCR是这样一种技术，其中在多个分别的PCR反应中进行样品的有限稀释(limiting dilution)，使得部分反应没有模板分子并产生阴性扩增结果。在反应终点计数阳性PCR反应数时，对原始样品中存在的单独的模板分子进行逐一计数。基于PCR的技术具有的额外优点是，仅计数能够被扩增的分子，例如，与测序工作流程中的大规模平行PCR步骤相关的分子。在基于数字PCR的方法中，将待分析的核酸分配到多个不同的反应区(例如孔、珠子、乳液、凝胶点、微流体装置中的室等)中。重要的是，一些反应区，但不是全部反应区，含有至少一个分子。通常，每个反应区将含有一个或零个分子。在实践中，分子将会随机分配到反应区(诸如孔)中。在一定百分比(例如，80％)的反应区为阳性的情况下，若干个区将含有一个或多个分子(例如，平均每孔2.2个分子)。可以使用统计方法根据不同反应区的数量和阳性数量来计算预期的样品中的总分子数。这将得出施加到不同反应区的部分中的核酸的计算量或浓度。可以使用多种基于抽样和概率的统计方法来得到该浓度。在Dube等人，arXiv:0809.1460v2“Computation of Maximal Resolution of Copy NumberVariation on a Nanofluidic Device using Digital PCR(2008)”中给出了这种分析的例子，这篇文章出处在Arxiv.org，引证arXiv:0809.1460v2[q-bio.GN]，首次于2008年9月8日上传。该文献提供了一系列等式，可用于根据数字PCR阵列中使用的反应区数目和阳性结果数来估计分子浓度和统计置信区间。这种类型的计算的另一个例子可以在美国专利申请US 2009/0239308 A1中找到。
通常，使用泊松分布来预测这样的数字限制条件(digital regime)，其中，在一个随机离散化的体积反应器中仅存在单个DNA扩增子，从而有利于每反应体积仅一个感兴趣的DNA扩增子。以这种方式，由每个反应器体积发出的PCR扩增信号(例如，荧光)是仅仅一个扩增子的产物，并且与所有其他离散的反应器体积隔离。然后通过计数有多少个数字反应器发射对应于嵌入染料或特定DNA聚合酶探针序列的扩增荧光信号来实现定量。由于在数字限制条件中每个反应器体积被限制为不超过单独一条DNA链，可以正确地假定其100％的扩增荧光信号仅来自这一条DNA链和相应的引物和探针组。然而，就结果的不精密性而言，极低浓度的限制条件通常是不利的。
dPCR方法学有多种。例如，已经使用乳液PCR来制备含有克隆扩增的DNA的小珠-实质上，每个珠子含有一种类型的dPCR扩增子。基于荧光探针的技术可以在“原位”(即在同一孔中)对PCR产物实施，特别适用于本申请。美国专利No.6,440,705包含更详细的对该扩增程序的描述。这些扩增可以在乳液或凝胶中、在珠子上或在多孔板中进行。
dPCR还包括基于微流体的技术，其中使用通道和泵将分子递送到多个反应区。适合的微流体装置是本领域已知的。
dPCR基本上作为常规PCR来进行。使合适的培养基中的核酸(参考核酸或感兴趣的核酸)与引物、探针和热稳定聚合酶(例如Taq聚合酶)接触，进行热循环(反复的加热和冷却反应的循环，用于链分离和酶促复制)。培养基通常含有脱氧核苷酸、缓冲溶液和离子(例如Mg2+)。PCR的选择性是使用可在特定热循环条件下与靶向扩增区域互补的引物的结果。通过使用合适的探针来检测生成的扩增产物，探针通常是标记的，例如荧光标记的。对于基于mRNA的PCR，首先用逆转录酶将RNA样品逆转录成互补DNA(cDNA)。
通常，PCR过程由重复25至50次的一系列温度变化组成。这些循环通常由三个阶段组成：第一阶段，在约95℃，允许核酸的双链分离；第二阶段，在约50至60℃的温度下，允许引物与DNA模板结合；第三阶段，在68至72℃之间，促进由DNA聚合酶进行的聚合作用。由于片段的尺寸小，在这种类型的PCR中通常省略最后一步，因为在对准阶段和变性阶段之间的变化过程中，酶能够增加它们的数目。另外，在例如80℃的温度下测量信号(例如，荧光)，以便减少在使用非特异性染料时由引物二聚体的存在引起的信号。使用的温度和时限取决于多种多样的参数，例如：用于合成DNA的酶、在反应中的二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度以及引物的结合温度。
在一个实施方案中，提供了一种dPCR方法，它具有独特的能力，即通过使用多种颜色、时间和强度的组合来编码每一个独特探针序列，能够识别更多数量的荧光探针序列(例如，TaqMan探针序列)。此外，可以使用较便宜的非TaqMan探针实时PCR扩增指示剂如SYBR-或PicoGreen，实现基于单独的时间线索、单独的强度线索、或强度与时间线索的组合的多重dPCR，从而以更高的程度区分引物对，显著降低成本。如果需要，这些也可以用于增强控制和将结果标准化，以提高准确性。使用具有有限谱带的荧光报告基因，可以将典型的5重qPCR的典型多重化限制提升到多达100重的dPCR。
在dPCR之前、同时或之后，定量每个反应区中的反应体积。体积的定量是本领域熟知的。
体积与物体(即固体、液体、气体或等离子体)占据的三维空间有关。体积可以基于尺寸，例如，被物体占据的空间的长度、宽度和高度来计算。它们通常以SI单位表示，例如，立方厘米(cm3)、立方米(m3)、升(L)、毫升(mL)等。
因此，当尺寸已知时，可以确定体积。如果在阵列，例如具有圆柱形孔的多孔板上运行dPCR，则孔中液体的体积可以计算为：体积＝π*r2*填充高度。半径可以由阵列供应商提供或通过测量获得。关于具有其他形状(例如锥体或立方体)的阵列的公式也是已知的。
然而，由于dPCR阵列的反应区中的液体体积主要在高度上变化，所以确定反应区中液体的高度可能就足够了。可以使用例如涉及光谱仪的各种光学方法。
在一个示例性实施方案中，涉及校准测量，其使用具有公知高度的校准杯(cuvette)、对照染料(例如，对照染料产生与场平面中每个区的荧光团数目成比例的信号)，以及产生与光路中的被动对照染料的高度成比例的信号的检测系统。通过将信号与在相同条件下测量的校准杯的信号进行比较来计算阵列的反应区中液体的高度。该方法展示在图1中。
或者，如果密度是已知的，则可以基于质量来确定体积。可以用质量除以密度求出体积。在另一个实施方案中，使用填充对照标志物。上文给出了关于填充对照标志物的详细信息。
作为下一步，计算一定体积中或每体积的如步骤b)中确定的核酸的数目作为感兴趣的核酸的量或浓度，其中所述体积是在步骤c)中确定的反应体积的总和。如上文详述的，在现有技术的方法中，相关核酸的量或浓度是基于每个反应区中的意图或预期体积来计算的。迄今为止使用的填充对照标志物是为了消除无效反应区并用于校正假阳性或假阴性结果而使用的。在本方法中，填充对照标志物是用于确定每个反应区中的真实体积，从而用于确定通过dPCR分析的总体积和真实体积。很显然，知晓正确的体积对于确定相关核酸的正确量或其浓度是重要的。总体积是反应区中的体积的总和。通过dPCR获得以数目表示的核酸的量。核酸的浓度通常作为核酸数目/体积(例如μl)给出。
因此，可以通过用拷贝数Nc除以采样的液体体积来计算浓度。拷贝数Nc是从应用泊松校正后的阳性反应区的计数得到的。采样的液体体积V等于实验中评估的所有反应区的体积的总和。
而且，除了基于反应区体积分布对浓度计算的总体校正之外，可以使用填充对照标志物来归一化每个反应区，以鉴定有效阳性反应区和有效阴性反应区并排除无效反应区。
因此，感兴趣的核酸的浓度由下式给出：
条件是反应体积的分布是窄的，并且每分区拷贝数<<1
或更一般地为
其中P是泊松校正因子。其取决于有效阳性数和阴性数的比率，用于应对(accountfor)反应区包含多于一个核酸拷贝的可能性。在每反应区拷贝数比例(copies-per-reaction ratio)低时(有效阳性数<<“有效阴性数”)，P＝1，并且
其中C是体积分布校正因子。其取决于每反应区拷贝数比例和反应区体积相对于平均反应区体积的变化。在每反应区拷贝数比例低且相对反应区体积变化<10％时，C＝1。
另外，必须增加另一个校正因子。如果样品在dPCR中使用之前已经过处理(例如，稀释)，则处理和稀释步骤应包括在计算中，以获得所分析的样品中感兴趣的核酸的量或浓度。
在本发明方法的优选实施方案中，通过定量存在于每个反应区中的填充对照标志物来定量反应体积，具体而言，其中填充对照标志物的信号与反应区中的反应体积成比例。本文中给出了关于填充对照标志物及其定量的详细信息。然而，如果使用其信号与反应区中的反应体积成比例的填充对照标志物，则可以如下计算有效反应区体积：
有效反应区体积[i]＝(参考反应区体积)*(对照染料的强度)*常数
更优选地，基于所测得的填充对照标志物的信号和预期的填充对照标志物的信号，计算每个反应区的校正因子，并且其中将应对(account for)反应体积偏差的校正因子应用于各个反应区。本发明使用填充对照标志物的信号作为总体积的量度。然而，它也可以用于归一化dPCR结果。如在US 2013/0302792 A1中详细描述的，可以使用染料的信号来校正在dPCR中获得的信号，以便正确地识别阳性和阴性。同样，空的反应区被识别为空(或者可以用油填充)，因此不会增加样品的总体积，否则会导致最终求得的靶DNA浓度错误。因此，有效样品的体积是每个单独的孔的单独内含物体积的总和。该校正进一步增加了使用dPCR进行定量的准确度和精密度，其中所有反应区被分类为有效阳性区、有效阴性区或无效反应区：
-有效阳性反应区被反应混合物适当填充，扩增后产生阳性PCR信号。
-有效阴性反应区被反应混合物适当填充，扩增后未产生PCR信号。
-无效反应区未(或不充分地)被反应混合物填充，或者由于其他归因于伪差的特征而被剔除。
具有了对总有效体积的准确度量，就可提供能够对感兴趣的核酸进行高度绝对定量(highly absolute quantification)的dPCR方法。
而且，该方法还能够消除由不均匀反应区体积引起的定量误差。这可以如下进行：
a)在校准实验中确定反应区体积的分布。由此评估来自每个反应区的填充对照标志物的信号，其与各个反应区体积成比例。
b)评估校正因子，其反映由反应区体积的这种分布引起的定量误差。
c)将校正因子C(其取决于每反应区拷贝数比例和反应区体积的相对变化，参见上文)应用于用该实验设置确定的每一浓度。
这种解决方案依赖于一个假设：反应区体积分布在各实验之间保持不变。如果阵列的生产过程和填充过程非常稳定，就是这种情况。
如果不是这种情况，可以应用更高级的计算：
a)在每个实验中确定反应区体积的分布。
b)将该分布拟合为模型曲线。
c)使用该模型曲线评估在该特定实验中测量的浓度的校正因子。
由于dPCR阵列的反应区中的液体体积可能主要在高度上变化(由于弯液面效应和孔深度变化)，所以确定液体反应区的高度可能就足够了。
该解决方案包括校准测量，其使用：
-具有公知高度的校准杯
-填充对照标志物(产生与场平面中的每区荧光团数目成比例的信号)
-产生与填充对照标志物的高度成比例的信号的检测系统。
通过将信号与在相同条件下测量的校准杯的信号进行比较来计算样品阵列的液体反应区的高度。
因此，在本发明方法的另一个优选实施方案中，基于反应区中特别是在孔中的反应体积的高度，优选通过使用填充对照标志物，来定量每个反应区中的反应体积。上文提供了与其相关的进一步细节。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，如果反应区中的填充对照标志物的量低于下限阈值，或任选地高于上限阈值，则反应区被鉴定为无效。
如上文详述的，识别无效的反应区是重要的。反应区无效可能是因为在dPCR之前的填充或分布过程可能导致阵列的反应区具有空的或填充不足的反应区(参见图2的孔e)和f))。如果它们被错误解读为没有核酸的填充孔(阴性)，则取样体积V被高估，并且浓度被低估。可以使用填充对照标志物来识别这些反应区(例如，如果填充对照标志物的信号低于下限阈值)，并将它们从计算中剔除。替代地或另外地，如果来自特定反应区的填充对照标志物的信号水平高于预定阈值，则可以将该反应区从目标浓度的计算中弃去。通常，反应区的填充不可能超过其最大高度。更大的信号水平指示可能源于荧光粉尘颗粒和其他污染的伪差。
显然，可以在不同时间将填充对照标志物添加到反应区，这也取决于测定设计、使用的填充对照标志物及其性质。一般而言，填充对照标志物可以在dPCR进行之前或之后添加到反应区。
例如，填充对照标志物可以在加入进行dPCR所需的试剂之前存在于反应区中。在一个实例中，可以在生产或制造阵列时将测定标志物分配到该阵列中。例如，如果检测标志物的高度，例如在多孔板中，则可以选择该选项。
或者，标志物可以与dPCR试剂一起被分配到反应区中。如果测量填充对照标志物的量或浓度，这是特别适合的。在本发明的方法中，填充对照标志物优选在被分配到反应区之前加入到PCR反应混合物中。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，填充对照标志物是荧光标志物或光吸收标志物。
根据本发明，可以使用多种多样的荧光标志物作为填充对照标志物。每种荧光标志物具有特征峰激发和发射波长，且各发射光谱常常重叠。因此，用于dPCR和填充对照的荧光标志物的组合取决于用于激发荧光染料的灯或激光的波长、可用的检测器和标志物的特性。
可以使用系统6010检测的示例性荧光染料包括荧光素衍生物，比如羧基荧光素(FAM)和PULSAR 650染料(Ru(bpy)3的衍生物)。FAM具有相对较小的斯托克斯位移，而PULSAR 650染料具有非常大的斯托克斯位移。FAM和PULSAR 650染料两者都可以用约460-480nm的光激发。FAM发射的光在约520nm处最大(并且在650nm基本不发光)，而PULSAR 650染料发射的光在约650nm处最大(并且在520nm基本不发光)。羧基荧光素可以在探针中与例如BLACK HOLE QuencherTM1染料配对，并且PULSAR 650染料可以在探针中与例如BLACKHOLE QuencherTM2染料配对。
更优选地，填充对照标志物的荧光和/或光吸收特性应该与一种或多种dPCR探针的荧光和/或光吸收特性不同。其优点在于能够方便地区分填充对照标志物和荧光dPCR探针。然而，如果填充对照标志物与dPCR中使用的靶探针荧光标志物具有相同的激发波长或发射波长，则可以进一步简化检测。这样，填充对照不会降低检测系统的颜色多重化能力(color multiplexing capability)。作为实例，该系统可以具有4个激发频道和4个发射频道。以激发波长1来激发斯托克斯位移大的染料，并且从发射频道4收集发射，这也用于dPCR。
在另一个更优选的实施方案中，填充对照标志物具有至少100nm，优选至少150nm的斯托克斯位移。斯托克斯位移是在相同电子跃迁的吸收光谱和发射光谱的带最大值的位置之间的差(以波长计)。当分子吸收光子时，其获得能量并进入激发态。结果它发射光子，从而失去其能量。当发射的光子比吸收的光子具有更少的能量时，该能量差就是托克斯位移。大的斯托克斯位移可消除吸收和发射之间的光谱重叠，使得荧光能够被检出，同时减少干扰。主要的优点是可以将斯托克斯位移大的染料与其他具有类似激发或发射光谱的染料一起使用。然而，由于两个光谱之一在斯托克斯位移小的染料与斯托克斯位移大的染料之间不重叠，所以光谱串扰很小。
优选的填充对照标志物包括ATTO 430LS和ATTO 490LS(可获自ATTO-TEC GmbH，Siegen，DE)，特别是ATTO 490LS。两者都显示出良好的水溶性和大于100nm的斯托克斯位移，其特别适用于具有多种荧光标志物的方法，因为高斯托克斯位移使检测过程中的信号重叠最小化。ATTO 490LS具有FAM的激发波长和Cy5的发射波长。如果与FAM和Cy5结合，则不需要额外的测量ATTO 490LS的滤光片。
在根据第一和第二方面的本发明方法的另一个优选实施方案中，感兴趣的核酸是选自DNA、cDNA、RNA及其混合物的组的核酸，或为任何其他类型的核酸。
如上文详述的，感兴趣的核酸可以是适用于dPCR的任何核酸。核酸必须具有适当的长度。它可以含有非核酸组分。它可以是天然存在的、化学合成的或生物技术改造的。优选地，核酸选自DNA、cDNA、RNA及其混合物的组。
本发明的方法在诸如诊断或治疗监测中的医学领域是特别感兴趣的，并且可以用于检测和/或定量指示特定微生物、细胞、病毒、细菌、真菌、哺乳动物物种、遗传状态或疾病的感兴趣的核酸。据此，所述方法可用于检测病原体。病原体具有引起疾病的潜力。病原体通常用于描述传染原，比如病毒、细菌、朊病毒、真菌或甚至其他微生物。当然，本发明的方法也可用于检测非病原微生物。
示例性病原体包括但不限于：
-细菌：链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、分枝杆菌属、衣原体属、埃里希体属、立克次体属、沙门菌属、奈瑟球菌属、布鲁杆菌属、分枝杆菌属、诺卡菌属、利斯特菌属、弗朗西斯菌属、军团菌属和耶尔森菌属
-病毒：腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、TBE病毒、HIV、流感病毒、拉沙病毒、轮状病毒和埃博拉病毒
-真菌：念珠菌属、曲霉菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、肺囊虫属和葡萄穗霉属
-寄生虫：原生动物寄生虫、蠕虫寄生虫和节肢动物寄生虫
在根据第二方面的本发明方法的又另一个优选实施方案中，样品获自细胞培养物或疑似被污染的来源，特别是体液、血液、血浆、血清、尿、胆汁、脑脊液、拭子、临床标本、器官样品或组织样品或受试者，特别是人、动物或植物，尤其是人。
如上文详述的，“样品”是指一定量的疑似含有待定量的感兴趣的核酸的材料。如本文中使用的，该术语包括标本(例如活组织检查或医学标本)或培养物(例如微生物培养物)。样品可以来自植物或动物，包括人，可以是流体、固体(例如粪便)或组织。样品可以包括从患者获取的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、针吸出物等。样品可以从所有不同类群的家畜、以及野化动物或野生动物获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等的动物。关于人样品或“组织样品”或“患者样品”或“患者细胞或组织样品”或“标本”，都是指从受试者或患者的组织获得的类似细胞或生物化合物或生物化学化合物的集合。组织样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸物的固体组织；血液或任何血液成分；体液如脑脊髓液、羊水、腹膜液、或间质液；或来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。组织样品可含有在自然界中与该组织天然不混在的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等等。
在dPCR中，反应区可以是微阵列或纳米阵列的微型化室、微流体装置的室、微孔或纳米孔、在芯片上、在毛细管中、在核酸结合表面上或珠子上，特别是在微阵列中或芯片上。
有大量的dPCR系统可供使用，这些dPCR系统可用于本发明。商业化的数字PCR平台包括来自Fluidigm的基于微孔芯片的dPCR、基于通孔的QuantStudio12k flexdPCR和来自Life Technologies的3D dPCR、以及来自/>的基于液滴的ddPCR(ddPCR)QX100和QX200和来自/>的RainDrop。基于微流控芯片的dPCR每个面板可以有多达几百个反应区。基于液滴的dPCR通常具有约20,000个分区的液滴，并且每个反应可以具有多达10,000,000个液滴。QuantStudio 12k dPCR在/>板上执行数字PCR分析，每子阵列包含64个反应区，总共有48个子阵列，相当于每个阵列总共3072个反应区。
液滴dPCR(ddPCR)建立在水-油乳液液滴技术的基础上。将样品分成大量液滴(例如约20,000个)，并且模板分子的PCR扩增在每个单独的液滴中发生。ddPCR技术使用的试剂和工作流程与用于大多数标准的基于TaqMan探针的测定法相似，包括液滴形成化学。同样，可以使用嵌入染料，比如Evagreen。大量样品反应分区是ddPCR技术的一个关键方面。非球形分区(例如纳米孔)与相同数目的球形分区相比，单位样品体积实际上具有更大的面积。
一般来说，通过使用更多数量的反应区可以提高dPCR的测定准确度，更重要的是，可以提高dPCR的测定精密度。可以使用约100至200个、200至300个、300至400个、700个或更多个反应区，用于通过PCR确定相关的量或浓度。在根据第一和第二方面的本发明方法的优选实施方案中，dPCR在至少100个反应区，特别是至少1,000个反应区，特别是至少5,000个反应区中相同地进行。在根据第一和第二方面的本发明方法的优选实施方案中，dPCR在至少10,000个反应区，特别是至少50,000个反应区，特别是至少100,000个反应区中相同地进行。
优选地，dPCR可能涉及使用一种或多种荧光dPCR探针，以便检测一种或多种感兴趣的核酸，特别是与淬灭剂组合或用作分子信标或用作水解探针。
在PCR应用(如实时PCR)中，经常使用荧光来检测扩增产物。这通常在热循环仪中进行，热循环仪能够用具有至少一个规定波长的光束照射每个样品并检测由激发的荧光团发出的荧光。热循环仪还能够迅速加热和冷却样品，从而利用核酸和DNA聚合酶的物理化学性质。
dPCR可能涉及使用一种或多种荧光探针，以便检测感兴趣的核酸和/或参考核酸，特别是与淬灭剂组合或用作分子信标或用作水解探针。
通常在qPCR中检测荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一种用于测量两种分子(在本案中为两种探针)之间的相互作用的技术。在这种技术中，两种不同的荧光分子(荧光团或标记)与适合于检测核酸的一对探针遗传融合。FRET的原理建立在两种标记的组合特征的基础之上。如果标记被特定波长(吸收频率)的光激发，它会以不同的波长(发射频率)重新发射该能量。在FRET中，第一标记被激发，其进而发射出具有发射频率的光。如果第一标记(供体)的发射峰与第二标记(受体)的激发峰重叠，则可以确定两种标记的接近度，因为第一标记将能量传递给第二标记，并且第二标记以其自身的发射频率发射出光。净结果是，供体发射的能量会比其通常情况下发射的少(因为随着光转而转移到受体，一些能量会被辐射掉)，而受体在其激发频率下发射的光能更多(因为它正在获得来自供体荧光团的额外能量输入)。也可以使用荧光染料与淬灭剂的组合。如果淬灭剂在荧光染料附近，则荧光发射被省略(omitted)。如果荧光部分与淬灭剂分开，则可以在用适当波长的光激发后检测第一荧光部分的发射。分子信标是发夹形探针,具有被内部淬灭的(internally quenched)荧光团，当它们结合靶核酸序列时，其荧光被恢复。如果待检测的核酸与环中的链互补，则在核酸和环之间形成的双链体比茎的双链体更稳定，因为前一种双链体包括更多的碱基对。这导致荧光团和淬灭剂分离。一旦荧光团离开淬灭剂，则光照射该杂合体会导致荧光发射。发射的存在表明，杂交事件已经发生，且因此靶核酸序列在测试样品中是存在的。水解探针由共价连接到寡核苷酸探针的5’端的荧光团和3’端的淬灭剂组成。只要荧光团和淬灭剂接近，淬灭就会抑制任何荧光信号。探针被设计成使得它们在被特定的引物组扩增的DNA区域内退火。当聚合酶延伸引物并合成新生链时，聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性会降解已退火到模板的探针。探针的降解使荧光团从其中释放出，并破坏了与淬灭剂的紧密靠近，从而减轻了淬灭效应并允许荧光团发出荧光。因此，检测到的荧光指示相关核酸的存在。
可用于FRET技术中各种受体荧光部分的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄(Lucifer Yellow)、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS(Lucifer Yellow VS)、4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸酯苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(succinimdyl 1-pyrenebutyrate)和4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC-Red 610、LC-640、LC-Red 670、LC-705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异氰酸酯、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸酯或镧系离子(如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(Junction City,OR)或Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)获得。
优选地，荧光探针包含荧光素、罗丹明和/或花菁。例如，供体荧光部分可以是荧光素和/或受体荧光部分可以选自LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red670、LC-Red 705、Cy5和Cy5.5的组，优选LC-Red 610或LC-Red 640。更优选地，供体荧光部分是荧光素，受体荧光部分是LC-Red 640或LC-Red 610。
有几种不同的荧光团(例如6-羧基荧光素，首字母缩写词：FAM或四氯荧光素，首字母缩写词：TET)和淬灭剂(例如四甲基罗丹明，首字母缩写词：TAMRA)可用。
在本发明的第一方面的方法的背景下进行的定义和实例也适用于第二方面的方法，反之亦然。
除非另外定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语以及任何首字母缩写词具有与本发明领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下文献中找到分子生物学中常见术语的定义：Benjamin Lewin,Genes V,由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of MolecularBiology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
本发明不限于本文中描述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以变化。尽管可以在本发明的实践中使用类似于或等同于本文中所描述的那些的任何方法和材料，但本文中描述了优选的方法和材料。此外，本文中使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围。
如本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确地指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。类似地，词语“包含”("comprise")、“含有”("contain")、以及“包括”("encompass")将被解释为开放式的含义，而不是封闭式的含义。类似地，除非上下文另外清楚指出，词语“或/或者”意图包括“和/及/以及”。术语“多个”是指两个或更多个。
实施例和附图旨在说明本发明的各种实施方案。正因为如此，所论述的具体修改不应被解释为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本发明范围的情况下产生各种等同方案、改变和修改，并且因此应当理解，这样的等效实施方案将被本文涵盖。
附图说明
图1说明了用于评估dPCR测定中填充的反应区的高度的示例性设置(a)，光源(1)照亮填充有对照标志物(2)的dPCR阵列。到达检测器(3)的来源于单独的反应区的对照标志物的荧光信号实质上与每个反应区中液体的高度成比例。(b)为了校准，使用以相同对照标志物溶液填充的具有公知高度(4)的校准杯来确定高度。在与实验(a)相同的条件下记录信号。
图2显示了有效反应区和无效反应区的示意图。将无效反应区从核酸的量或浓度的计算中弃去。
a)有效阳性反应区
b)有效阳性反应区(填充水平高于阈值)
c)有效阴性反应区
d)有效阴性反应区(填充水平高于阈值)
e)无效反应区(不存在反应混合物)
f)无效反应区(填充水平低于阀值)
实施例
实施例1：用于进行根据本发明的dPCR测量的典型步骤
将具有一定的明确体积的含有核酸的纯化样品体积与任何qPCR实验中使用的具有一定的明确体积的反应预混物(master mix)组分混合。
在基于微阵列的dPCR的情况下，与标准qPCR反应预混物相比，可能需要对组成进行一些微小修改。这些修改可能包括其他洗涤剂或不同浓度的洗涤剂以调节微阵列中的润湿性。可能需要加入其他表面活性物质，以便，例如，避免将核酸、聚合酶或其他组分吸附到芯片的表面上。在一些情况下，可能需要用反应预混物骨架(master mix backbone)稀释样品。骨架含有与反应预混物相同的缓冲组分，但不含聚合酶、无核苷酸、无引物/探针。然后将含有样品和反应预混物的反应混合物人工移液到dPCR微阵列板的入口端口中。
在标准微孔板格式(SBS格式)中，一块dPCR板可以容纳1-8份反应混合物(样品)。dPCR板内的1-8个样品位置中的每一个可由入口端口(例如，在板的位置A1处)、在位置A1和A12之间的微结构化部分、和在位置A12处的出口端口构成。作为下一个处理步骤，将分区流体添加到每个入口。这可以使用单通道或8通道移液器手动完成，或使用自动分配站完成。分离或分区液体是与反应混合物不混溶且不起反应的疏水性液体，例如长链氟化烃或硅油。各个含有反应混合物的反应区的分离(或分区)可以以被动方式实现，或者可以通过在入口端口处施加超压、或者通过在出口端口处施加负压来实现。如果使用低粘度分离液，或者如果该过程在升高的温度下进行，则被动分离可能可行。在较高的粘度下，必须施加一般为100-1000毫巴的超压，以在约1分钟内完成分离过程。如果用自动化装置进行该分离过程，并且如果分离速度可能随样品而异，则则监测传感器必须确保当分离完成时，即分离流体已经到达出口端口时，该过程停止。此后，将dPCR板转移到热循环仪单元。可以一板一板地转移，或者一次转移一叠板。该转移过程可以是全自动化的，或者可以是这样：成叠的板是手动转移的，而dPCR工艺的其余部分(包括热循环和读出)都是全自动化的。热循环过程类似于任何终点热循环(end-point thermal cycling)过程，通常具有30-60个热循环，每个循环由92-96℃持续10-30秒的变性步骤、以及在55℃-60℃持续40-60秒的退火/延伸步骤组成。也可能需要在92-96℃持续30-300秒的预PCR循环、以及冷却循环或逐渐降温至30-40℃。热循环可能需要在升高的压力下进行，以抑制微阵列内(空气和水蒸汽形成的)气泡的产生和膨胀。在这种情况下，必须在dPCR板的第一次加热之前建立压力，并在dPCR板冷却之后释放压力。如果需要高通量的dPCR结果，可能需要使多个热循环仪单元基本上并行地工作。
在完成热循环过程之后，dPCR板依次转移到自动化dPCR分析仪内的读取器单元，并在读出之后转移到输出堆叠位置。由于荧光读取器可能需要足够的分辨率来区分来自相邻反应区的荧光信号，并且由于属于样品的微结构化区较大(通常为6mm×90mm)，因此每个样品可能需要几个荧光图像。为此目的，必须将荧光成像仪或dPCR板移动到不同的图像位置。为了保持较低的总读取时间，一个优选的读取器实施方案将具有大视野，理想地允许在相同位置上成像两条样品泳道。在每个成像位置，可能需要自动对焦调整。这可以在明视野或暗视野模式下以荧光模式来进行。也可能需要校正在相机平面与包含反应区的图像平面之间的倾斜。此外，可能需要激发和发射滤光片位置的各种组合来捕获不同的荧光标志物，包括填充对照标志物。

Claims (20)

1.一种减少由数字聚合酶链式反应(dPCR)中的反应体积偏差引起的定量误差的方法，其中感兴趣的核酸的量或浓度在反应区阵列中被定量，所述方法包括：
a)向dPCR中使用的反应区阵列的每个反应区中加入填充对照标志物；
b)定量每个反应区中的反应体积；和
c)计算一定体积中或每体积的通过dPCR确定的核酸数目作为感兴趣的核酸的量或浓度，其中所述体积是在步骤b)中确定的反应体积的总和，
其中所述方法不用于诊断目的。
2.一种用于确定样品中感兴趣的核酸的量或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供疑似含有感兴趣的核酸的样品；
b)使用该样品在反应区阵列的每个反应区中进行dPCR；
c)定量每个反应区中的反应体积；和
d)计算一定体积中或每体积的在步骤b)中确定的核酸数目作为感兴趣的核酸的量或浓度，其中所述体积是在步骤c)中确定的反应体积的总和，
其中所述方法不用于诊断目的。
3.权利要求1或2的方法，其中通过定量每个反应区中存在的填充对照标志物来定量所述反应体积，具体而言，其中填充对照标志物的信号与反应区中的反应体积成比例。
4.权利要求3的方法，其中基于所测得的填充对照标志物的信号和预期的填充对照标志物的信号为每个反应区计算校正因子，并且其中将应对反应体积偏差的所述校正因子应用于各个反应区。
5.权利要求1或2的方法，其中基于反应区中的反应体积的高度来定量每个反应区中的反应体积。
6.权利要求1或2的方法，其中如果反应区中的填充对照标志物的量低于下限阈值或任选地高于上限阈值，则反应区被鉴定为无效。
7.权利要求1或2的方法，其中填充对照标志物在被分配到反应区之前加入到PCR反应混合物中。
8.权利要求1或2的方法，其中填充对照标志物是荧光标志物或光吸收标志物。
9.权利要求8的方法，其中该填充对照标志物
-具有与所述一种或多种dPCR探针的荧光和/或光吸收特性不同的荧光和/或光吸收特性；和/或
-具有与所述dPCR中使用的靶探针荧光标志物相同的激发波长或发射波长；和/或
-具有至少100nm的斯托克斯位移；和/或
-为ATTO 430LS或ATTO 490LS。
10.权利要求1或2的方法，其中所述感兴趣的核酸
-是选自DNA、cDNA、RNA及其混合物的核酸；和/或
-指示微生物、细胞、病毒、细菌、真菌、哺乳动物物种、或遗传状态。
11.权利要求2的方法，其中样品获自疑似被污染的来源或细胞培养物或受试者。
12.权利要求1或2的方法，其中所述反应区是微阵列或纳米阵列的微型化室、微流体装置的室、微孔或纳米孔、在芯片上、在毛细管中、在核酸结合表面上或珠子上。
13.权利要求1或2的方法，其中所述反应区阵列包括
-至少100个反应区；和/或
-至少10,000个反应区。
14.权利要求1或2的方法，其中所述dPCR涉及使用一种或多种荧光dPCR探针以便检测一种或多种感兴趣的核酸。
15.权利要求5的方法，其中所述反应区是孔。
16.权利要求11的方法，其中样品获自体液、拭子、临床标本、器官样品或组织样品。
17.权利要求16的方法，其中所述体液为血液、血浆、血清、尿、胆汁或脑脊液。
18.权利要求11的方法，其中所述受试者为人、动物或植物。
19.权利要求14的方法，其中所述dPCR涉及使用一种或多种荧光dPCR探针与淬灭剂组合或用作分子信标或用作水解探针。
20.权利要求19的方法，其中所述荧光dPCR探针包含荧光素、罗丹明和/或花菁。
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