CN104450965A - 用于检测鹅细小病毒的lamp引物与试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鹅细小病毒的LAMP引物与试剂盒及其应用。本发明所提供的用于检测鹅细小病毒的LAMP引物，为由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成的引物组A，或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成的引物组B；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明为鹅细小病毒的检测提供了一个新的技术平台，可用于畜牧业生产单位筛查和检测鹅细小病毒，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Description

用于检测鹅细小病毒的LAMP引物与试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，涉及一种用于检测鹅细小病毒的LAMP引物与试剂盒及其应用。
背景技术
小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose parvovirus GPV)引起的雏鹅的一种急性或亚急性的败血性传染病，主要侵害4-20日龄的雏鹅，尤其对10日龄以内的雏鹅具有极强的致死性。该病的主要特点是严重的肠炎、小肠粘膜脱落、坏死，形成特征性的肠内栓塞(急性型)。由于该病具有传播速度快、发病率和死亡率高的特点，因而给养殖鹅带来了严重的危害，多年来一直倍受关注。一般认为，小鹅瘟根据流行病学、临床特征和剖检特点，可以做出初步诊断。但是，最急性型小鹅瘟、小鹅流感、鹅病毒性肠炎以及近年来新发现的鹅副粘病毒病等疾病均具有相似的临床和剖检特征。为此，开展小鹅瘟的实验室诊断研究具有重要意义。目前用于小鹅瘟诊断的实验室方法很多，如病毒的分离鉴定、免疫荧光抗体技术、ABC-ELISA试验和琼脂扩散试验等，其中琼脂扩散试验简便、快速，常用于小鹅瘟病毒或血清的检查，但是其敏感性较低，很难在临床上推广应用。为此，急需建立一种敏感、准确、快速、简便的小鹅瘟实验室诊断方法。虽然基于PCR技术的检测方法也已建立，但PCR需要昂贵的仪器，而且操作繁琐。
环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T,Okayama H,MasubuchiH,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res2000；28(12):63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection bynewly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method.J Virol Methods.2007；141(2):173-80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N,Arai R,Tada S,Taguchi H,Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp.yeasts with aloop-mediated isothermal amplification method.Food Microbiol.2007；24(7-8):778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测鹅细小病毒的LAMP专用引物与试剂盒问世。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物组。
本发明所提供的检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物组，具体可为引物组A或引物组B；
所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
所述引物1(FIP)、所述引物2(BIP)、所述引物3(F3)、所述引物4(B3)、所述引物5(LF)和所述引物6(BF)的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
序列1由43个核苷酸组成，序列2由42个核苷酸组成，序列3由18个核苷酸组成，序列4由19个核苷酸组成，序列5由20个核苷酸组成，序列6由20个核苷酸组成。
本发明的第二个目的是提供一种检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂。
本发明所提供的检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg2+和所述引物组。
当所述引物组为所述引物组A时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为40pmol：40pmol：5pmol：5pmol：20pmol：20pmol：35nmol：250nmol：8U：20μmol。
当所述引物组为所述引物组B时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为40pmol：40pmol：5pmol：5pmol：35nmol：250nmol：8U：20μmol。
在本发明中，所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
在本发明的一个实施例中，所述检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂组成如下：每23μl所述试剂中含有各40pmol的所述引物1和所述引物2、各5pmol的所述引物3和所述引物4、各20pmol的所述引物5和所述引物6、35nmol的dNTP、250nmol的MgSO4、8U的Bst DNA聚合酶、20μmol的甜菜碱、500nmol的Tris·HCl(pH 8.8)、250nmol的KCl、250nmol的(NH4)2SO4、0.25μl的Tween20；余量为水。
本发明的第三个目的是提供一种检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂盒。
本发明所提供的检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂盒，含有所述的引物组或所述试剂。
所述试剂盒中还可含有荧光显色剂。
所述荧光显色剂可为含有钙黄绿素和MnCl2的水溶液；所述荧光显色剂中，所述钙黄绿素和所述MnCl2的配比为0.5mmol：10mmol。在本发明的一个实施例中，所述荧光显色剂具体为含有0.5mmol/L的钙黄绿素和10mmol/L的MnCl2的水溶液。
所述试剂盒中还可含有记载有检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的环介导等温扩增方法的说明书；
所述检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的环介导等温扩增方法，包括如下(a)和(b)的步骤：
(a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用所述引物组进行环介导等温扩增；
(b)根据步骤(a)的扩增结果，按照如下(b1)或(b2)的方法确定所述待测样品中是否含有鹅细小病毒：
(b1)反应结束后，若所述待测样品反应液出现白色沉淀物，则所述待测样品中含有或候选含有鹅细小病毒；反之，则所述待测样品不含或候选不含有鹅细小病毒；
(b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入所述荧光显色剂，然后观察所述反应液的颜色变化；
若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有鹅细小病毒；若所述待测样品反应液为橙色，则所述待测样品中不含有或候选不含有鹅细小病毒。
在本发明中，所述环介导等温扩增反应具体为63℃-65℃(如65℃)条件下的恒温反应60min。
在本发明中，进行所述环介导等温扩增时，所述引物1和所述引物2在反应体系中的终浓度为1.6μM，所述引物3和所述引物4在反应体系中的终浓度为0.2μM，所述引物5和所述引物6在反应体系中的终浓度为0.8μM。所述反应体系具体可由2μl所述基因组DNA与23μl所述试剂组成；在所述(b2)中，所述荧光显色剂与所述待测样品的反应液的体积配比具体可为1:25。
如下a)或b)的应用也属于本发明的保护范围：
a)所述的引物组在制备所述试剂或所述试剂盒中的应用；
b)所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的产品中的应用。
所述待测样品可为病毒样品或鹅囊液等。
在本发明中，所述鹅细小病毒具体为鹅细小病毒JLDA株。
本发明具有以下优点：
1)高特异性：6条引物对鹅细小病毒靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性；
2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高100倍；
3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；
4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入63-65℃恒温水浴锅中60分钟后就可以判断结果；
5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，能将目标片段扩增108-109倍。
综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到鹅细小病毒，不需要复杂仪器，为鹅细小病毒的检测提供了一个新的技术平台，可用于畜牧业生产单位筛查和检测鹅细小病毒，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
附图说明
图1为5套引物组合的LAMP扩增曲线。
图2为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果。
图3为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果。
图4为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果。
图5为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂染色检测结果。
图6为本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果。目标片段为209bp，DNA Marker为D2000。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
鹅细小病毒JLDA株：记载于“李琳,王楠,邵洪泽等.鹅细小病毒JLDA株主要结构蛋白VP3基因的克隆及序列分析比较.上海畜牧兽医通讯,2009年06期”一文，公众可从吉林省畜牧兽医科学研究院获得。
实施例1、检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物的设计与合成
从美国基因数据库检索获得鹅细小病毒序列(GenBank Accession No.U25749)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得鹅细小病毒的特异性保守靶序列，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对鹅细小病毒进行LAMP检测的引物，设计出5套引物(GV-0、GV-1、GV-4、GV-5、GV-6)，经过实验对比，最终选取了由6条引物组成的引物组合GV-1，引物序列如表1所示。
表1检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物
引物名称 序列(5'-3')
FIP TCGCAATGCCAATTTCCCGAGGTTTGGAGCTATGGGCGACTCT(序列1)
BIP GACCACCAGAACCTGGGTCCTTTGCATCTTGAGAGGTTCCGC(序列2)
F3 TGATGGCAGAGGGAGGAG(序列3)
B3 CCCAGGGGGTACTGTATCC(序列4)
LF TACCCACTCCATCGGCACCC(序列5)
LB TGCCAAGCTACAACAACCAC(序列6)
实施例2、本发明鹅细小病毒的LAMP检测方法的建立
用实施例1获得的用于对鹅细小病毒进行LAMP检测的六条引物组合GV-1对鹅细小病毒进行LAMP检测，以获得最佳反应体系及反应条件，同时以其它4套引物(GV-0、GV-4、GV-5、GV-6)为对照，具体方法如下：
一、最佳反应体系的确定
1、方法
在相同反应条件(置65℃恒温60min)下进行反应，对反应体系中各物质的用量进行优化。
反应结束后按照如下方法进行结果判定：
反应结束后，向反应液(25μl)中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂(含有0.5mmol/L的钙黄绿素和10mmol/L的MnCl2的水溶液)，根据反应液的颜色变化判断结果(原理：钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg2+的变化。)，绿色表示待测样品中存在鹅细小病毒(阳性)，橙色表示待测样品中不存在鹅细小病毒(阴性)；或者
不添加钙黄绿素颜色指示剂，直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理：LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)，浊度上升表示待测样品中存在鹅细小病毒(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在鹅细小病毒(阴性)。
2、结果
扩增产物的浊度变化检测结果如图1所示，由图可以看出，GV-1的扩增效果最好，因此将GV-1引物组合定为本发明用于对鹅细小病毒进行LAMP检测的专用引物。
在GV-1引物组合的引导下，将本发明最佳的鹅细小病毒的LAMP检测体系定为(25μL)：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％(体积分数)Tween20，0.8M甜菜碱，8mM MgSO4，1.4mM dNTPeach，8U Bst DNA聚合酶，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3。其中，各浓度为相应物质在反应体系中的终浓度。
二、最佳反应条件的确定
在步骤一确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对含鹅细小病毒的基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，具体方法包括以下步骤：
以含鹅细小病毒的基因组DNA为模板，在实施例1获得的六条引物组合GV-1的引导下进行LAMP扩增，其中，25μL LAMP反应体系为步骤一确定的最佳反应体系。将温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃和66℃依次递增，多次重复试验后确定最佳反应温度。
反应结束后，用与步骤一相同的方法进行结果判定。检测结果表明，本发明最佳的鹅细小病毒LAMP扩增条件为：置65℃恒温60min。
实施例3、本发明鹅细小病毒的LAMP检测方法的特异性、灵敏性检测
一、本发明鹅细小病毒的LAMP检测方法的特异性检测
以鹅细小病毒JLDA株、自家GPV、当地GPV、A-GPV基因组作为模板，并用鹅囊液(临床上确认未被GPV感染的鹅囊液)，大肠杆菌，沙门氏菌基因组DNA为模板。以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳的鹅细小病毒的LAMP检测方法的特异性，反应体系和反应条件参见实施例2中确定的最佳反应体系和最佳反应条件，结果判定方法见实施例2。
本发明鹅细小病毒LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果如图2所示，从图中可以看出，只有鹅细小病毒(鹅细小病毒JLDA株、自家GPV、当地GPV、A-GPV)发生了LAMP反应，其余均未发生；本发明鹅细小病毒LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果如图3所示(从左到右：阴性对照、鹅细小病毒JLDA株、自家GPV、当地GPV、A-GPV、鹅囊液、大肠杆菌、沙门氏菌)，只有鹅细小病毒(鹅细小病毒JLDA株、自家GPV、当地GPV、A-GPV)的反应液是绿色(阳性)，其余均为橙色(阴性)，可见钙黄绿素指示剂染色方法和浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明的鹅细小病毒的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到鹅细小病毒。
二、本发明鹅细小病毒的LAMP检测方法的灵敏度检测
检测本发明LAMP检测方法和普通PCR方法检测鹅细小病毒的灵敏度，方法为：提取鹅细小病毒JLDA株的基因组DNA后定量，然后以10倍梯度(1倍、10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍)进行稀释使8份模板中总DNA的浓度分别为130ng/μl、13ng/μl、1.3ng/μl、130pg/μl、13pg/μl、1.3pg/μl、0.13pg/μl、0.013pg/μl、0.0013pg/μl，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法(引物序列为F3和B3)进行灵敏度检测。同时以双蒸水为阴性对照。反应体系和反应条件参见实施例2中确定的最佳反应体系和最佳反应条件，结果判定方法见实施例2。
本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图4所示，本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂颜色反应检测结果如图5所示(从左到右模板浓度分别为：130ng/μl、13ng/μl、1.3ng/μl、130pg/μl、13pg/μl、1.3pg/μl、0.13pg/μl、0.013pg/μl、0.0013pg/μl、阴性对照)，本发明鹅细小病毒LAMP检测方法灵敏度的PCR检测结果如图6所示(两侧泳道为Marker，中间泳道从左到右模板浓度分别为：130ng/μl、13ng/μl、1.3ng/μl、130pg/μl、13pg/μl、1.3pg/μl、0.13pg/μl、0.013pg/μl、0.0013pg/μl、阴性对照，M为DNA marker D2000)。可以看出，本发明鹅细小病毒的LAMP检测方法可检测到1.3pg/μl，而普通PCR方法仅能检测到130pg/μl，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明鹅细小病毒的LAMP检测方法比普通PCR检测方法的灵敏度高100倍。

Claims (10)

1.检测鹅细小病毒的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2.检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg2+和权利要求1或2所述的引物组。
3.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为40pmol：40pmol：5pmol：5pmol：20pmol：20pmol：35nmol：250nmol：8U：20μmol；或
所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为40pmol：40pmol：5pmol：5pmol：35nmol：250nmol：8U：20μmol。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于：所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。
5.检测鹅细小病毒的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的引物组，或权利要求2-4中任一所述的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光显色剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光显色剂为含有钙黄绿素和MnCl2的水溶液；
所述荧光显色剂中，所述钙黄绿素和所述MnCl2的配比为0.5mmol：10mmol。
8.根据权利要求5-7中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有记载有检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的环介导等温扩增方法的说明书；
所述检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的环介导等温扩增方法，包括如下(a)和(b)的步骤：
(a)以从待测样品中提取的基因组DNA为模板，用权利要求1所述引物组进行环介导等温扩增；
(b)根据步骤(a)的扩增结果，按照如下(b1)或(b2)的方法确定所述待测样品中是否含有鹅细小病毒：
(b1)反应结束后，若所述待测样品反应液出现白色沉淀物，则所述待测样品中含有或候选含有鹅细小病毒；反之，则所述待测样品不含或候选不含有鹅细小病毒；
(b2)反应结束后，向所述待测样品的反应液中加入权利要求7中所述的荧光显色剂，然后观察所述反应液的颜色变化；
若所述待测样品反应液为绿色，则所述待测样品中含有或候选含有鹅细小病毒；若所述待测样品反应液为橙色，则所述待测样品中不含有或候选不含有鹅细小病毒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述录环介导等温扩增反应为63-65℃条件下的恒温反应60min。
10.如下a)或b)的应用：
a)权利要求1所述的引物组在制备权利要求2-4中任一所述试剂或权利要求5-9中任一所述试剂盒中的应用；
b)权利要求1所述的引物组，或权利要求2-4中任一所述的试剂，或权利要求5-9中任一所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有鹅细小病毒的产品中的应用。
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