CN109182595A - 一种检测小鹅瘟病毒的lf-rpa可视化试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测小鹅瘟病毒的lf-rpa可视化试剂盒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109182595A
CN109182595A CN201711011630.9A CN201711011630A CN109182595A CN 109182595 A CN109182595 A CN 109182595A CN 201711011630 A CN201711011630 A CN 201711011630A CN 109182595 A CN109182595 A CN 109182595A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
detection
reaction
nucleic acid
agent box
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711011630.9A
Other languages
English (en)
Inventor
刘文俊
杜思敏
黄运茂
田允波
许丹宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Original Assignee
Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongkai University of Agriculture and Engineering filed Critical Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority to CN201711011630.9A priority Critical patent/CN109182595A/zh
Publication of CN109182595A publication Critical patent/CN109182595A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种快速检测小鹅瘟病毒的LF‑RPA可视化试剂盒及其应用，该试剂盒包括一套引物组和核酸检测试纸条，该试剂盒的使用方法如下：首先配制LF‑RPA反应体系，LF‑RPA反应体系包含水、反应缓冲液、GPV上游引物、GPV下游引物、LF Probe、醋酸镁、RPA聚合酶以及待测样品DNA；然后将配好的RPA反应体系置于37℃温度反应10min；把反应后的LF‑RPA反应体系通过一次性核酸检测装置检测后进行结果判读，结果判断为：若核酸检测试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)，则结果为阳性；若核酸检测试纸条仅在质控区有一条色条带，则结果为阴性。该试剂盒在常温下即可进行反应，操作简单，反应快速，结果易于观察，特异性好，易于大范围推广应用。

Description

一种检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒及应用。
背景技术
目前，小鹅瘟(Gosling plague)是以渗出性肠炎、肝、肾、心等实质器官炎症为特征，由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。1956年在我国发现该病后，苏联、德国、匈牙利、荷兰、法国、英国、意大利、以色列、南斯拉夫和越南等国陆续报道了小鹅瘟的存在。该病长期以来在我国乃至全世界鹅群中广泛流行，致病性强，死亡率高，造成了较大的损失，严重地影响养鹅业的发展。1961年我国学者方定一研制出的高免血清，有效地控制了该病的发生。但病毒依然在不断的变异，近年来，有跨物种传播的倾向，2015年在山东、江苏和安徽等地肉鸭群中出现了感染GPV导致的鸭短喙长舌综合征。该病病原GPV属细小病毒科，细小病毒亚，细小病毒属。外观呈圆形或六角无囊膜二十面体对称直径约20-25nm。基因组为单链、线状DNA，长度约为3434个核苷酸，含有正极性链的病毒粒子和含有负极性链的病毒粒子数目基本相等。GPV基因组中有两个主要的阅读框(ORF)。5′-ORF(LORF)编码非结构蛋白(NS)，3′-ORF(RORF)编码3种结构蛋白VP1，VP2和、VP3，其中VP2和VP3是主要结构蛋白。
养鹅业的模式相对于其他禽类较为粗放、落后。近年来，蛋子瘟、鹅新城疫、小鹅瘟、禽流感等鹅病的发病率居高不下。如何有效的防控疾病的发生成为当前养鹅业的重要挑战，建立快速、高效的检测方法是临床的迫切需求。鹅场多在偏远的农村，条件简陋，交通不便捷。这要求建立的检测方法具有较高的稳定性和便携性。目前，常用于检测小鹅瘟病毒的方法包括病原的分离鉴定、直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、琼脂扩散试验和链式聚合酶扩增法。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；直接免疫荧光法和间接免疫荧光法虽操作简单准确性高，但并不适合基层人员使用。琼脂扩散试验方法简便，适宜于基层推广和应用，但灵敏度不高，需要高效价抗血清及多倍浓缩的尿囊液。链式聚合酶扩增法是目前监测小鹅瘟的通用方法，但存在依赖PCR仪，不适合在现场使用的缺点。
重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。自2006年首次报道以来，RPA已经在医疗诊断、食品致病菌和转基因农作物等检测分析以及生物安全方面崭露头角。特别是在2014年，RPA商业化试剂盒的问世直接推动RPA技术突飞猛进的发展。LF-RPA(侧流层析试纸条检测)探针的设计是通过一对特定的抗体固定含有两个抗原标签的物质(羧基荧光素FAM和生物素biotin)实现检测。其中，5′生物素引物及其互补的序列保证了与探针结合目标物的有效扩增。Nfo识别含有1个5′-FAM标签的探针、内部THF和1个3′保护基团的扩增双链序列中的THF位点，并进行剪切(形成聚合酶Bsu催化延伸的3′羟基底物，使探针剩余的部分延伸，以固定其与含生物素标签的对应链的结合)最终完成含有生物素以及FAM的双标记扩增子可以通过侧流层析实验鉴定实验结果。采用这两种探针在很大程度上减少了扩增中产生的非特异性信号，提高了RPA反应的灵敏度和特异性。LF-RPA可视化试剂盒，具有检测速度快、敏感性高、操作简便，便携且结果容易判读等优点，适合基层人员使用，具有较高的应用价值和转化前景。
发明内容
本发明首要目的是提供一具有高灵敏度、高特异性、高效、可视化、操作方法简单的适用于检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供实现上述检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒的使用方法。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。
一种检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，其特征在于，它包含引物组和核酸检测试纸条；
所述引物组包含三条引物，所述三条引物分别为：
GPV上游引物：5’-cttcagggggtgccgatggagtgggtaatg-3’；
GPV下游引物：5’-(biotin)gggtctgattccccaatggttgttgataag-3’；
LF Probe：5’-(FAM)gggaaacacagtcatcacaaagaccaccag(ids p)aacctgggtcctgccaag(spc3)-3’。
为了进一步实现本发明，还包含反应缓冲液、醋酸镁和RPA聚合酶。
为了进一步实现本发明，所述醋酸镁为280mM醋酸镁。
为了进一步实现本发明，所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。
为了进一步实现本发明，所述RPA聚合酶为冻干的重组酶干粉。
本发明还提供一种检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒的应用，所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒的应用使用上述任一项所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，它包含以下步骤：
1)配制LF-RPA反应体系：反应缓冲液的体积为29.5μL，LF Probe的体积为0.6μL，GPV上游引物的体积为2.1μL，GPV下游引物的体积为2.1μL，水的体积为12.2μL；将所有组分混合后，加入至一管RPA聚合酶中并混匀，混匀后依次按顺序加入体积为1μL的待测样品DNA以及体积为2.5μL的醋酸镁。
2)LF-RPA反应：将步骤1)配制好的LF-RPA反应体系置于30-37℃的恒温条件下进行反应。
3)通过一次性核酸检测装置对LF-RPA反应的结果进行判读：
若一次性核酸检测装置的核酸检测试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，说明待测样品含有小鹅瘟病毒；若一次性核酸检测装置的核酸检测试纸条仅出现一条红色条带，且该红色条带位于质控区，说明待测样品不含小鹅瘟病毒。
为了进一步实现本发明，步骤2)中，所述LF-RPA反应体系的反应时间为10min。
为了进一步实现本发明，步骤2)中，所述LF-RPA反应体系的反应温度为37℃。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1)本发明提供的LF-RPA试剂盒可常温反应，静置10min即可完成反应，反应迅速，在13min内即可观察到结果，操作简便，无需借助任何仪器。
2)本发明提供的LF-RPA试剂盒得到的反应结果易于观察，阳性反应的试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)。
3)本发明提供的LF-RPA试剂盒特异性好，对H9禽流感、新城疫、黄病毒(坦布苏病毒)等都呈阴性反应；灵敏度高，最低可以检测到20pg的DNA模版，即使是几个病毒粒子，也能被快速准确地检测。
4)本发明提供的LF-RPA试剂盒可快速、灵敏地检测小鹅瘟病毒，其操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及水禽养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
图1为LF-RPA反应条件优化结果图，其中：
A为不同温度的LF-RPA反应结果图，1为反应温度为30℃的产物，2为反应温度为35℃的产物，3为反应温度为37℃的产物，4为反应温度为40℃的产物，5为反应温度为45℃的产物，6为反应温度为50℃的产物，7为Control(C线)，即质控区，8为Test(T线)，即检测区；
B为不同时间的LF-RPA反应结果图，1为反应时间为5min的产物，2为反应时间为10min的产物，3为反应时间为15min的产物，4为反应时间为20min的产物，5为反应时间为25min的产物，6为Control(C线)，即质控区，7为Test(T线)，即检测区。
图2是以不同病毒基因组为模版的LF-RPA反应结果图，其中：
泳道1为以小鹅瘟病毒基因组为模版的LF-RPA反应产物，泳道2为以H9禽流感病毒基因组为模版的LF-RPA反应产物，泳道3为以黄病毒(坦布苏病毒)基因组为模版的LF-RPA反应产物，泳道4为以新城疫病毒基因组为模版的LF-RPA反应产物，泳道5为阴性对照，6为Control(C线)，即质控区，7为Test(T线)即检测区。
图3A是以不同浓度GPV DNA为模板的LF-RPA反应结果图，其中：
1为GPV DNA浓度为20ng的反应产物，2为GPV DNA浓度为2ng的反应产物，3为GPVDNA浓度为200pg的反应产物，4为GPV DNA浓度为20pg的反应产物，5为GPV DNA浓度为2pg的反应产物，6为GPV DNA浓度为200fg的反应产物，7为阴性对照(NTC)，8为Control(C线)，即质控区，9为Test(T线)，即检测区。
图3B是以不同浓度GPV DNA为模板的PCR反应结果图，其中：
泳道1为DNA Marker DL2000，泳道2为GPV DNA浓度为20ng的反应产物，泳道3为GPV DNA浓度为2ng的反应产物，泳道4为GPV DNA浓度为200pg的反应产物，泳道5为GPV DNA浓度为20pg的反应产物，泳道6为GPV DNA浓度为2pg的反应产物，泳道7为GPV DNA浓度为200fg的反应产物，泳道8为阴性对照(NTC)，9为2000bp的位置，10为1000bp位置，11为750bp的位置，12为500bp的位置，13为250bp的位置，14为100bp的位置。
图4为阴阳性结果对照图，其中：1为反应呈阳性结果，2为反应呈阴性结果，3为Control(C线)，即质控区，4为Test(T线)，即检测区。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所用的引物、探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。RPA聚合酶、Rehydration Buffer和醋酸镁购自TwistDx公司；一次性核酸检测装置购自优思达公司。
一、基因的选择和引物设计
依据LF-RPA引物设计原则，根据GenBank中已经公布的GPV VP3基因保守序列设计引物，用primer5.0设计一套引物(三条引物，如表1所示)，该套引物包括1对GPV引物(GPV上游引物和GPV下游引物)和探针。该套引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成10μmol/L溶液，-20℃保存。
ATGGCAGAGGGAGGAGGCGGAGCTTTGGGCGACGCTTCAGGGGGTGCCGATGGAGTGGGTAATGCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCC
GPV上游引物
AATGGATGGGAAACACAGTCATCACAAAGACCACCAGAACCTGGG
LF Probe
TCCTGCCAAGCTACAACAACCACATCTACAAAGCGATACACTTCTCCCCTAGAGACTGGCAGAGACTTA TCAACAACCATTGGGGAATCAGA
GPV下游引物
CCCAAGTCTCTT；
下划线标示的为该套引物在基因中的位置。
表1 可视化LF-RPA的引物
二、LF-RPA反应
1、病毒DNA的抽提：
病毒DNA抽提按酚氯仿法进行。在病毒DNA抽提的过程中所用离心管等耗材均经0.1％DEPC处理，确保所用离心管等耗材均无DNA酶的污染。
(1)取100mg待检测组织样本，加入200μL的TE，用匀浆器充分混匀，如果是血液样本(或病毒液)直接取200μL置于离心管中，然后在该离心管中加入400μL细胞裂解液(含10％SDS 25μL和20mg/mL蛋白酶K 3μL)，将该离心管置于55℃的温度下，期间偶尔混匀，30min后在该离心管中加入等体积的Tris-饱和酚，轻摇混匀。
(2)将步骤(1)处理后的离心管置于离心机中以12000rpm离心5min。
(3)取出经步骤(2)处理后的离心管，小心吸取上层水相置于新的离心管中；将等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)加入保存有该上清液的离心管中，涡旋，12000rpm离心5min。
(4)将步骤(3)处理后的离心管的上清液置于另一个新的离心管，然后加入0.6倍体积的冷异丙醇(-20℃)或2倍体积的冷无水乙醇(-20℃)。
(5)在经步骤(4)处理后的离心管中加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，然后将该离心管置于-20℃环境下静置30min。
(6)将步骤(5)处理后的离心管置于离心机中以12000rpm离心10min。
(7)倒弃经步骤(6)处理后的离心管中的液体，使该离心管中留下沉淀，用70％乙醇洗涤该离心管中的沉淀。
(8)将步骤(7)处理后的离心管置于离心机以12000rpm离心10min。
(9)倒弃经步骤(8)处理后的离心管中的液体，使该离心管中留下沉淀，然后将该离心管真空干燥。
(10)将步骤(9)处理后的离心管中加入体积为50-100μL的TE，37℃孵育2h，复溶该离心管中的沉淀，-20℃保存分装后的液体。
2、LF-RPA检测体系的建立：
参照TwistDx提供的方法构建50μL LF-RPA检测体系的LF-RPA反应体系，该反应体系为：
表2反应体系
如上表，反应缓冲液的体积为29.5μL，LF Probe的体积为0.6μL，GPV上游引物的体积为2.1μL，GPV下游引物的体积为2.1μL，水的体积为12.2μL；将所有组分混合后，加入至一管RPA聚合酶中并混匀，混匀后依次按顺序加入体积为1μL的待测样品DNA以及体积为2.5μL醋酸镁。其中，本发明使用的RPA聚合酶为冻干的重组酶干粉，每管RPA聚合酶的成分和质量一致，均由TwistDx公司设计合成。
3、LF-RPA检测体系反应条件的优化
为了得到最优化的反应温度，将配制好的LF-RPA反应体系分别置于30℃、35℃、37℃、40℃、45℃及50℃的温度条件下，反应时间为10min，反应体系如表2所示，经过多次重复试验，确定最佳反应温度。每次配置LF-RPA反应体系的同时设水为阴性对照，将LF-RPA反应体系反应后通过一次性核酸检测装置判读结果，确定最佳反应温度，结果如图1A所示；图1A的结果说明：LF-RPA检测体系的最佳反应温度为37℃。
在最佳反应温度(37℃)下，将配置好的LF-RPA反应体系的反应时间分别设置为5min、10min、15min、20min、25min，LF-RPA反应体系如表2所示，经过多次重复试验，并将LF-RPA反应体系反应后通过一次性核酸检测装置判读结果，确定最佳反应时间，结果如图1B所示；图1B的结果说明：LF-RPA检测体系的最佳反应时间是10min。
综上，优化后LF-RPA检测体系的反应条件为37℃恒温条件，放置10min。
4、LF-RPA检测体系特异性、灵敏性分析
(1)LF-RPA检测体系的特异性分析
使用本实验室分离保存的新城疫病毒、小鹅瘟病毒、H9禽流感病毒、黄病毒(坦布苏病毒)为模版检测LF-RPA检测体系的特异性。本发明所用到的新城疫病毒、小鹅瘟病毒、H9禽流感病毒、黄病毒(坦布苏病毒)的病毒DNA模板均采用上述LF-RPA反应步骤中的病毒DNA的抽提过程获得的。
LF-RPA检测体系的反应体系如表2所示，LF-RPA检测体系的反应条件为步骤3中LF-RPA检测体系的优化确定的条件，将LF-RPA反应体系反应后通过一次性核酸检测装置判读结果，结果如图2所示。
图2结果显示LF-RPA检测体系的特异性良好，可特异地检测到小鹅瘟病毒。
(2)LF-RPA检测体系的灵敏性分析
将鹅的小鹅瘟病毒液通过上述LF-RPA反应中步骤1病毒DNA的抽提的过程提取小鹅瘟病毒DNA，在紫外分光光度计上测定其DNA的含量，将小鹅瘟病毒DNA样品用灭菌的H2O进行稀释，使稀释后的样品浓度分别为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg。
以不同浓度的小鹅瘟病毒DNA(其浓度分别为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg)为模版，用GPV上游引物和GPV下游引物进行LF-RPA检测。
LF-RPA检测的反应体系如表2所示，LF-RPA检测体系的反应条件为步骤3中LF-RPA检测体系的优化确定的条件，将LF-RPA反应体系反应后通过一次性核酸检测装置判读结果，结果如图3中A所示。
以不同浓度的小鹅瘟病毒DNA(其浓度分别为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg)为模版，用GPV上游引物和GPV下游引物进行PCR检测，PCR体系如表3所示：
表3PCR体系
PCR程序如下：94℃预变性2min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 2min为一个循环，运行30个循环，之后72℃延伸5min，最后4℃保存；该PCR反应的产物经琼脂糖凝胶电泳后在紫外线检测仪的照射下得到如图3中B的结果图。
比较上述两种检测方法(LF-RPA检测和PCR检测)的灵敏度，如图3所示，结果表明：可视化的LF-RPA检测体系能检测到的GPV基因组DNA的最低限度比PCR的高10倍，最低可以检测到20pg的GPV DNA。可见，本发明提供的可视化LF-RPA更灵敏，而且用时更短，操作更加简单，结果比较直观，易于检测，无需电泳。
5、LF-RPA检测体系的结果鉴定
若一次性核酸检测装置的核酸检测试纸条上出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T线)，则LF-RPA检测体系的检测结果为阳性；若一次性核酸检测装置的核酸检测试纸条仅出现一条红色条带，且该红色条带位于质控区，则LF-RPA检测体系的检测结果为阴性，如图4所示。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，其特征在于，它包含引物组和核酸检测试纸条；
所述引物组包含三条引物，所述三条引物分别为：
GPV上游引物：5’-cttcagggggtgccgatggagtgggtaatg-3’；
GPV下游引物：5’-(biotin)gggtctgattccccaatggttgttgataag-3’；
LF Probe：5’-(FAM)gggaaacacagtcatcacaaagaccaccag(ids p)aacctgggtcctgccaag(spc3)-3’。
2.根据权利要求1所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，其特征在于，还包含反应缓冲液、醋酸镁和RPA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，其特征在于，所述醋酸镁为280mM醋酸镁。
4.根据权利要求2所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。
5.根据权利要求2所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，其特征在于，所述RPA聚合酶为冻干的重组酶干粉。
6.一种检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒的应用，其特征在于，所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒的应用使用权利要求1～5任一项所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒，它包含以下步骤：
1)配制LF-RPA反应体系：反应缓冲液的体积为29.5μL，LF Probe的体积为0.6μL，GPV上游引物的体积为2.1μL，GPV下游引物的体积为2.1μL，水的体积为12.2μL；将所有组分混合后，加入至一管RPA聚合酶中并混匀，混匀后依次按顺序加入体积为1μL的待测样品DNA以及体积为2.5μL醋酸镁。
2)LF-RPA反应：将步骤1)配制好的LF-RPA反应体系置于30-37℃的恒温条件下进行反应。
3)通过一次性核酸检测装置对LF-RPA反应的结果进行判读：
若一次性核酸检测装置的核酸检测试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，说明待测样品含有小鹅瘟病毒；若一次性核酸检测装置的核酸检测试纸条仅出现一条红色条带，且该红色条带位于质控区，说明待测样品不含小鹅瘟病毒。
7.根据权利要求6所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒的应用，其特征在于，步骤2)中，所述LF-RPA反应体系的反应时间为10min。
8.根据权利要求6所述的检测小鹅瘟病毒的LF-RPA可视化试剂盒的应用，其特征在于，步骤2)中，所述LF-RPA反应体系的反应温度为37℃。
CN201711011630.9A 2017-10-24 2017-10-24 一种检测小鹅瘟病毒的lf-rpa可视化试剂盒及应用 Pending CN109182595A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711011630.9A CN109182595A (zh) 2017-10-24 2017-10-24 一种检测小鹅瘟病毒的lf-rpa可视化试剂盒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711011630.9A CN109182595A (zh) 2017-10-24 2017-10-24 一种检测小鹅瘟病毒的lf-rpa可视化试剂盒及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109182595A true CN109182595A (zh) 2019-01-11

Family

ID=64948436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711011630.9A Pending CN109182595A (zh) 2017-10-24 2017-10-24 一种检测小鹅瘟病毒的lf-rpa可视化试剂盒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109182595A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110093452A (zh) * 2019-03-12 2019-08-06 融智生物科技（青岛）有限公司 基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103866048A (zh) * 2014-02-27 2014-06-18 广东省农业科学院动物卫生研究所 番鸭细小病毒和鹅细小病毒的hrm鉴别方法、试剂盒和引物组
CN104450965A (zh) * 2014-12-05 2015-03-25 吉林省畜牧兽医科学研究院 用于检测鹅细小病毒的lamp引物与试剂盒及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103866048A (zh) * 2014-02-27 2014-06-18 广东省农业科学院动物卫生研究所 番鸭细小病毒和鹅细小病毒的hrm鉴别方法、试剂盒和引物组
CN104450965A (zh) * 2014-12-05 2015-03-25 吉林省畜牧兽医科学研究院 用于检测鹅细小病毒的lamp引物与试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TWISTDX: "TwistAm DNA Amplifcation Kits Combined Instruction Manual", 《TWISTDX》 *
YANG YANG等: "Rapid and specific detection of porcine parvovirus by isothermal recombinase polymerase amplification assays", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *
李书光等: "小鹅瘟的实验室诊断及生物制品研究进展", 《中国家禽》 *
秦立得等: "重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病原快速检测中的应用", 《中国动物检疫》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110093452A (zh) * 2019-03-12 2019-08-06 融智生物科技（青岛）有限公司 基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法
CN110093452B (zh) * 2019-03-12 2022-05-20 融智生物科技（青岛）有限公司 基于定点基因质谱检测的鸭源病毒检测试剂盒及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104450966B (zh) 一种用于同时检测反刍动物携带的四种病毒的多重pcr试剂盒
CN107299155A (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
CN103255229B (zh) 一管pcr式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒
CN106811551A (zh) 荧光定量PCR检测FAdV‑4型禽腺病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
CN104328218A (zh) 同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法
CN106399585A (zh) 检测ⅰ群禽腺病毒的通用pcr引物、方法及检测试剂盒
CN109609688A (zh) 鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重pcr检测引物对及检测方法和应用
CN107955840A (zh) 用于检测猪口蹄疫病毒与塞内加谷病毒的双重pcr引物、检测方法及试剂盒
CN107828914A (zh) 传染性皮下及造血组织坏死病毒（ihhnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN104388594B (zh) 一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒
CN104673934A (zh) 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
Liu et al. Identification of the σ C-encoded gene of avian reovirus by nested PCR and restriction endonuclease analysis
CN107699635A (zh) 猪流行性腹泻病毒荧光rpa检测方法
Zhang et al. Rapid detection of white spot syndrome virus in Penaeus vannamei based on real-time enzymatic recombinase amplification
CN108624714A (zh) 一种检测禽流感病毒的rpa-lfd可视化试剂盒及其应用
CN103352088A (zh) 用于检测禽流感病毒h7亚型的引物对、探针、试剂盒及检测方法
CN109182595A (zh) 一种检测小鹅瘟病毒的lf-rpa可视化试剂盒及应用
CN108384893A (zh) 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
Hakhverdyan et al. Evaluation of a single-tube fluorogenic RT-PCR assay for detection of bovine respiratory syncytial virus in clinical samples
CN108315481A (zh) 一种应用直扩法检测猪流行性腹泻病毒的诊断方法和专用试剂盒
CN107190103A (zh) 同时检测三种鱼类病毒的多重pcr引物组、试剂盒及方法
CN107287352A (zh) 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法
CN106939357A (zh) H4亚型、h6亚型和h9亚型aiv三重rt‑pcr引物组合、试剂盒及其应用
CN110257561A (zh) 用于鹿流行性出血热病毒检测的试剂、检测方法及应用
CN106435041A (zh) 一种检测仔猪脐带血中猪细小病毒的实时荧光pcr试剂盒及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190111

RJ01 Rejection of invention patent application after publication