CN103866048A - 番鸭细小病毒和鹅细小病毒的hrm鉴别方法、试剂盒和引物组 - Google Patents

番鸭细小病毒和鹅细小病毒的hrm鉴别方法、试剂盒和引物组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM鉴别方法、试剂盒和引物组，所述检测方法包括如下步骤：（1）设计一组可同时扩增番鸭细小病毒和鹅细小病毒的通用PCR引物；（2）从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA；（3）利用步骤（1）的引物组对模板DNA进行PCR扩增；（4）对扩增产物进行HRM分析，鉴别MDPV和GPV。本发明方法：可快速、有效鉴别MDPV和GPV；检测速度快且高通量：5～10分钟即可完成96/384孔板的PCR产物检测，极大缩短了检测时间；对PCR产物无损害，检测后还可以进行后续分析，如测序和凝胶电泳等。

Description

番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM鉴别方法、试剂盒和引物组
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）的HRM鉴别方法、鉴别试剂盒和引物组。
背景技术
番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）和鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）是两种水禽病毒。MDPV和GPV两种病毒粒子的理化特性、形态结构非常相似，因此很难通过显微观察将这两种病毒鉴别区分开来。其基因组同源性达81. 9 %，氨基酸同源性达到88. 96 %，其中结构蛋白VP1的同源性达87. 57 % ，从而决定了它们在抗原性上的高度同源，同时也使这两种病毒的抗血清之间存在交叉保护性。所以，在乳胶凝集试验、琼脂扩散试验、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验等常规的血清学检测方法中，只有应用MDPV 和GPV 单克隆抗体才能将这两种病毒区分开来。这无疑提高了鉴别的成本和操作复杂性。
虽然国内的许多学者已经针对MDPV和GPV基因组分别设计特异性的引物，建立了鉴别MDPV和GPV的PCR检测技术，但是该方法通常需要设计2对特异性的引物，而且判定结果需要进行凝胶电泳，所以该方法在进行高通量的检测任务时会显得费时费力。
高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，其技术原理主要是基于核酸分子物理性质的不同：不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。 HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明通过分析MDPV和GPV 基因组，在VP3基因中找出了一段相对保守序列，针对该序列设计了一对既能扩增MDPV又能扩增GPV的通用引物，我们利用该引物对MDPV和GPV DNA进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者熔解曲线的不同来鉴别MDPV和GPV。
因此，本发明的一个目的在于提供一种快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM方法。
本发明的另一个目的在于提供一组用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的引物。
本发明的另一个目的在于提供一种用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM方法，其步骤包括：
（1）设计一组可同时扩增番鸭细小病毒和鹅细小病毒的通用PCR引物；
（2）从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA；
（3）利用步骤（1）的引物组对模板DNA进行PCR扩增；
（4）对扩增产物进行HRM分析，鉴别MDPV和GPV。
作为优选的，所述PCR引物的序列如下所示：
MGV-P1：ATGGCAGAGGGAGGAAGC（SEQ ID NO:1）；
MGV-P2：TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC（SEQ ID NO:2）。
所述PCR扩增的反应体系为：
ddH2O 4.6μl
5×Q5 Reaction buffer   2μl
2.5 mM dNTP         0.8μl
MGV-P1             0.5μl
MGV-P2            0.5μl
模板DNA  1μl
Q5 High-Fidelity 
DNA Polymerase      0.1μl
LC green染料             0.5μl
Total   10μl。
所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸2min。
一组用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的引物，其核苷酸序列分别如下所示：
MGV-P1：ATGGCAGAGGGAGGAAGC（SEQ ID NO:1）；
MGV-P2：TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC（SEQ ID NO:2）。
一种用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组、Taq DNA聚合酶、 PCR反应缓冲液、dNTP、荧光染料，阳性对照和阴性对照。
所述荧光染料为LC green饱和荧光染料。
所述阳性对照为含有MDPV的VP3基因序列（SEQ ID NO:3）的质粒和含有GPV的VP3基因序列（SEQ ID NO:4）的质粒；所述阴性对照为ddH2O。
本发明的有益效果是：
（1）本发明方法和试剂盒的稳定性和重复性高，可准确、有效鉴别MDPV和GPV，且检测速度快且高通量，5～10分钟即可完成96/384孔板的 PCR 产物检测，极大缩短了检测时间，降低鉴别成本；
（2）本方法不需要进行PCR产物的分离，真正实现了闭管操作，避免污染；
（3）对PCR产物无损害，检测后还可以进行后续分析，如测序和凝胶电泳等。
附图说明
图1是MDPV和GPV质粒样品标准化熔解曲线图；
图2是MDPV和GPV质粒样品峰型化熔解曲线图；
图3是MDPV和GPV临床样品PCR的电泳图；
图4是MDPV和GPV 临床样品DNA标准化熔解曲线图；
图5是MDPV和GPV 临床样品DNA峰型化熔解曲线图；
图6是MDPV和GPV 临床样品DNA差异化熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）的HRM快速鉴别试剂盒的建立：
1、引物设计：以MDPV-FM和GPV-B的VP3基因（GenBank登录号分别为U22967和U25749）为靶基因，设计一对引物，序列如下：
MGV-P1：ATGGCAGAGGGAGGAAGC（SEQ ID NO:1）；
MGV-P2：TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC（SEQ ID NO:2）。
2、PCR反应液：Taq DNA聚合酶；5×PCR反应缓冲液；2.5 mM dNTP；荧光饱和染料；
3、阳性对照为MDPV和GPV的阳性质粒，阴性对照为ddH2O。
其中阳性质粒的制备方法如下：
用TaKaRa公司的试剂盒将MDPV的VP3基因（SEQ ID NO:3）和GPV的VP3基因（SEQ ID NO:4）分别连接至pMD-18T载体中，通过氨苄筛选、测序，筛选得到阳性克隆子即为阳性对照。
实施例2建立番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）HRM快速鉴别方法
利用实施例1的试剂盒快速鉴别番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）的方法，包括如下步骤：
1、对实施例1制备的MDPV和GPV的阳性质粒进行DNA浓度测定，使PCR起始模板浓度相对一致。
2、PCR扩增反应
（1）PCR反应体系：5×Q5 Reaction buffer 2μl，2.5 mM dNTP 0.8μl，MGV-P1（10μM）0.5μl，MGV-P1（10μM）0.5μl，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.1μl，质粒DNA 0.5μl，LC Green 0.5μl，用超纯水补齐到10μl；将配制好的反应管混匀、离心后上机。
（2）PCR反应程序如下：
98℃预变性30s；
98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；
72℃终延伸2min。
HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/s；
3、质粒PCR扩增产物的HRM分析：
  利用Rotor-Gene Q(Qiagen)进行PCR扩增和HRM分析。番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）阳性质粒的HRM 分析图见图1～2。从质粒标准化和峰型化熔解曲线图可以看出， MDPV和GPV质粒PCR扩增产物具有各自特有的熔解曲线，表明本发明的方法可以有效区分MDPV和GPV。
实施例3番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）HRM快速鉴别方法的应用评价
1、待检样品基因组DNA的提取：用试剂盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0提取样品中的MDPV和GPV的基因组DNA。本发明的样品为病毒的尿囊液和细胞上清。
2、普通PCR扩增反应：
（1）PCR反应体系：25μl反应体系：5×Q5 Reaction buffer 5μl，2.5 mM dNTP 2μl，MGV-P1（10μM）1.25μl，MGV-P1（10μM）1.25μl，Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.25μl，待测样品DNA 1μl，用超纯水补齐到25μl；将配制好的反应管混匀、离心后上机。
（2）PCR反应程序：
98℃预变性30s；
98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；
72℃终延伸2min。
3、将上述普通PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析，其电泳图如图3所示。图中，M为DL1000 DNA marker，1-3为MDPV待检样品，4-6为GPV的待检样品，7为阴性对照。从图中可以看出，所设计的通用引物均能对MDPV和GPV DNA进行扩增，并得到目的片段大小为371bp的扩增条带。
4、样品扩增产物HRM分析：
DNA的PCR扩增与实施例2的质粒PCR扩增操作相同，每个DNA样品重复2次。利用Rotor-Gene Q(Qiagen)进行PCR扩增和HRM分析。3株MDPV（M1，M2，M3）和3株GPV（G1，G2，G3）序列HRM结果分别如图4～6所示。图4、图5和图6分别为标准化熔解曲线图、峰型化熔解曲线图和差异化熔解曲线图。从3种不同形式的熔解曲线图上可看出MDPV和GPV HRM图相互分开，已达到鉴别两种病毒的目的。标准化熔解曲线图是由原始熔解曲线图经过标准化处理后得到，最大限度地消除了由于起始模板浓度不同而造成荧光信号值的差异。峰型化熔解曲线图是对标准化熔解曲线图进行导数化处理后得到，峰型化熔解曲线图更加明显地反应出了MDPV和GPV VP3序列的差异。为了更直观地区分MDPV和GPV，对熔解曲线图进行差异化处理，即使G1的信号变化设为零并与其它5个毒株比较。从图6上可看出3个MDPV和3个GPV的毒株明显地分开。以上3种不同形式的熔解曲线图是由Rotor-Gene Q software version 2.1.0软件完成。
从图4～6可以看出，同一样品具有基本相同的HRM曲线，说明本发明方法具有很好地稳定性和可重复性。从图2和图5可以看出，质粒的熔解曲线和实际DNA样本熔解曲线的形状基本相同，具有很好的符合性。
从上述HRM结果来看，3株MDPV和3株GPV可以通过HRM区分， 尽管3株MDPV在Tm值有细微差异，但是熔解曲线基本一致；3株GPV的Tm值和熔解曲线基本一致。
综上所述，MDPV和GPV具有各自特异性的HRM曲线，且该HRM曲线具有很好的稳定性，通过简单对比，可以快速有效地鉴别MDPV和GPV。
<110>  广东省农业科学院动物卫生研究所
<120>  番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM鉴别方法、试剂盒和引物组
<130> 
<160>  4    
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
atggcagagg gaggaagc                                                     18
 
 
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
tgcgtcgtga cttctttaac ttgc                                              24
 
 
<210>  3
<211>  371
<212>  DNA
<213>  Muscovy duck parvovirus
<400>  3
atggcagagg gaggaagcgg agctatgggc gactctgcag ggggtgccga tggagtgggt       60
aatgcctcag gaaattggca ttgcgattcc caatggctgg gagacacagt cattaccaag      120
actacaagaa cctgggtcct gccaagctac aacaaccaca tctacaaagc catcacaagc      180
ggaacaaacc cagactcaaa tacccaatat gctggataca gcaccccctg ggggtacttt      240
gatttcaaca gattccactg ccatttctct ccaagagact ggcagagact catcaacaac      300
cattggggga ttagaccgaa agcactcaaa ttcaagatat tcaatgtgca agttaaagaa      360
gtcacgacgc a                                                           371
 
 
<210>  4
<211>  371
<212>  DNA
<213>  goose parvovirus
<400>  4
atggcagagg gaggaagcgg agctatgggc gactctgcag ggggtgccga tggagtgggt       60
aatgcctcag gaaattggca ttgcgattcc caatggctgg gagacacagt catcacaaag      120
accaccagaa cctgggtcct gccaagctac aacaaccaca tctacaaagc gattaccagt      180
ggaacctctc aagatgcaaa tgtccagtat gcaggataca gtaccccctg ggggtacttt      240
gatttcaaca gatttcactg ccacttctct ccaagagact ggcagagact tatcaacaac      300
cattggggaa tcagacccaa gtctcttaaa ttcaagatct tcaatgtcca agtcaaagaa      360
gtcacaacgc a                                                           371

Claims (10)

1.一种快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM方法，其步骤包括：
（1）设计一组可同时扩增番鸭细小病毒和鹅细小病毒的通用PCR引物；
（2）从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA；
（3）利用步骤（1）的引物组对模板DNA进行PCR扩增；
（4）对扩增产物进行HRM分析，鉴别MDPV和GPV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR引物是以番鸭细小病毒和鹅细小病毒的VP3基因为靶基因设计的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR引物的序列如下所示：
MGV-P1：ATGGCAGAGGGAGGAAGC（SEQ ID NO:1）；
MGV-P2：TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC（SEQ ID NO:2）。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
ddH2O   4.6μl
5×Q5 Reaction buffer   2μl
2.5 mM dNTP         0.8μl
MGV-P1             0.5μl
MGV-P2             0.5μl
模板DNA   1μl
Q5 High-Fidelity
DNA Polymerase      0.1μl
LC green染料          0.5μl
Total  10μl。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火20s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸2min；HRM分析设定的熔解速率为0.3℃/s。
6.一组用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的引物，其核苷酸序列分别如下所示：
MGV-P1：ATGGCAGAGGGAGGAAGC（SEQ ID NO:1）；
MGV-P2：TGCGTCGTGACTTCTTTAACTTGC（SEQ ID NO:2）。
7.一种用于快速鉴别番鸭细小病毒和鹅细小病毒的HRM试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求6所述的引物组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有Taq DNA聚合酶、 PCR反应缓冲液、dNTP、荧光染料，阳性对照和阴性对照。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为LC green饱和荧光染料。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有番鸭细小病毒VP3基因序列的质粒和含有鹅细小病毒VP3基因序列的质粒；所述阴性对照为ddH2O。
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