CN105331740B - 一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型pcr-hrm的引物和方法 - Google Patents
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型pcr-hrm的引物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR‑HRM引物和方法,该方法首先构建了DHAV‑1和DHAV‑3相应目的片段的质粒样品作为阳性质粒,然后从样品中提取病毒RNA并反转录为cDNA,再以cDNA为模板,利用所设计的特异性引物对cDNA进行PCR‑HRM扩增;对扩增产物进行HRM分析,确定病毒类型。本发明操作简单,只需在普通PCR反应之前加入荧光饱和染料;检测快速且高通量,整个操作过程需约3.5小时,即可完成96/384孔板的PCR产物检测,极大缩短了检测时间;费用低,不需要多条引物和特异性探针;敏感性高、特异性和重复性好,有利于在临床上的推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,具体涉及一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物和方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)的病原包括鸭甲肝病毒(Duckhepatitis A virus,DHAV)( 包括DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3) 和鸭星状病毒(Duckastrovirus,DAstV)(包括DAstV-1和DHV-3)。据国内学者研究表明,鸭甲肝病毒(DHAV-1和DHAV-3)流行最为广泛,二者所表现的流行病学、临床症状、病理变化类似,已有两者混合感染的报道,临床上很难做到鉴别诊断。国内外对鸭甲肝病毒的病原检测传统方法主要有中和试验、琼脂扩散试验、凝集试验、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验和单克隆抗体技术,这些方法在实际应用中,存在程序操作繁琐、试验结果敏感性和稳定性差、耗费时间长等特点。尽管国内学者建立了二重RT-PCR的检测方法用于鉴别DHAV-1和DHAV-3,但此方法需要设计2对特异性的引物,而且判定结果需要进行凝胶电泳,所以该方法在进行高通量的检测任务时会显得费时费力,限制了其在临床上的推广应用。因此,寻找和建立一种操作相对简易、检测结果可靠且检测高通量和成本低廉的鉴别DHAV-1和DHAV-3的方法显得十分紧迫。本专利根据DHAV-1和DHAV-3在3D基因上的双碱基突变,利用HRM技术对DHAV-1和DHAV-3进行基因分型。
发明内容
为了解决上述存在的问题,本发明建立了一种快速区分鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的PCR-HRM引物和方法,该方法操作简易、快速、检测结果可靠、检测高通量且成本低廉,有利于在临床实上的推广应用。
本发明的目的在于提供一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物和方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物,其核苷酸序列如下所示:
P1:5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’(SEQ ID NO:1);
P2:5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’(SEQ ID NO:2)。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM试剂盒,该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM方法,包括以下步骤:
1)从样品中提取病毒RNA;
2)将RNA反转录为cDNA;
3)以cDNA为模板,用上述所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物;
4)对扩增产物进行HRM分析,确定病毒基因型。
进一步的,步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为:
Vazyme 2×Taq Plus Master Mix 5μl
引物P1 0.5μl
引物P2 0.5μl
模板 1μl
STO-9染料 0.5μl
ddH2O 至10μl。
进一步的,步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性20s,43℃退火20s,72℃延伸10s;循环35次;72℃终延伸8min;55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
进一步的,步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程为:
1)以DHAV-1阳性质粒样品为对照时,若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-1;
2)以DHAV-3阳性质粒样品为对照时,若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-3。
本发明的有益效果是:
1)本发明首次建立了一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM引物和方法,该方法操作简单,只需在普通 PCR 反应之前加入荧光饱和染料;检测快速且高通量:整个操作过程需约3.5小时,即可完成96/384孔板的 PCR 产物检测,极大缩短了检测时间;费用低,不需要多条引物和特异性探针;敏感性高、特异性好,有利于在临床上的推广应用。
2)本发明的PCR-HRM引物,能高效扩增DHAV-1和DHAV-3,有助于提高PCR 的效率,缩短病毒鉴别分型的时间。
3)本发明的PCR-HRM引物特异性好,除可以特异性扩增DHAV-1和DHAV-3外,不与其他常见禽类病毒核酸结合,有利于提高本发明对基因型分析的准确性。
附图说明
图1是DHAV-1和DHAV-3质粒样品标准化熔解曲线图;
图2是DHAV-1和DHAV-3质粒样品峰型化熔解曲线图;
图3是DHAV-1和DHAV-3特异性试验峰型化熔解曲线图;
图4是DHAV-1和DHAV-3敏感性试验标准化熔解曲线图;
图5是DHAV-1和DHAV-3敏感性试验峰型化熔解曲线图;
图6是DHAV-1和DHAV-3临床样品标准化熔解曲线图;
图7是DHAV-1和DHAV-3临床样品峰型化熔解曲线图。
具体实施方式
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物,其核苷酸序列如下所示:
P1:5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’(SEQ ID NO:1);
P2:5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’(SEQ ID NO:2)。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM试剂盒,该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM方法,包括以下步骤:
1)从样品中提取病毒RNA;
2)将RNA反转录为cDNA;
3)以cDNA为模板,用上述所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物;
4)对扩增产物进行HRM分析,确定病毒基因型。
优选的,步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为:
Vazyme 2×Taq Plus Master Mix 5μl
引物P1 0.5μl
引物P2 0.5μl
模板 1μl
STO-9染料 0.5μl
ddH2O 至10μl。
优选的,步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性20s,43℃退火20s,72℃延伸10s;循环35次;72℃终延伸8min;55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
优选的,步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程为:
1)以DHAV-1阳性质粒样品为对照时,若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-1;
2)以DHAV-3阳性质粒样品为对照时,若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-3。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明,但并不局限于此。
实施例1 区分鸭甲肝病毒1型和3型 PCR-HRM引物的筛选
PCR-HRM引物:
经过对所设计的大量引物进行筛选后,发现引物碱基序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2对PCR-HRM法区分DHAV-1和DHAV-3的效果最好,其碱基序列如下所示。
DHAV-P1:5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’(SEQ ID NO:1);
DHAV-P2:5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’(SEQ ID NO:2)。
实施例2一种区分鸭甲肝病毒1型和3型 PCR-HRM方法的建立
(1)DHAV-1和DHAV-3 RNA的提取及反转录
用试剂盒Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0提取病料样品中的RNA,并用Takara Reverse Transcriptase M-MLV把RNA反转录为cDNA。
(2)阳性质粒样品的制备
用Takara公司的试剂盒将DHAV-1和DHAV-3纯化后的DNA分别连接至pMD-18T载体中,通过氨苄抗性筛选、菌落PCR及测序,筛选得到阳性克隆子即为阳性质粒样品。
(3)阳性质粒样品的PCR-HRM操作步骤
分别以上述获得的三种阳性质粒样品为DNA模板,分别进行PCR-HRM扩增反应和分析;
Vazyme 2×Taq Plus Master Mix 5μl
引物P1 0.5μl
引物P2 0.5μl
模板 1μl
STO-9染料 0.5μl
ddH2O 至10μl。
PCR扩增的反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性20s,43℃退火20s,72℃延伸10s;循环35次;72℃终延伸8min;55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
(4)阳性质粒样品PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。DHAV-1和DHAV-3 HRM(高分辨率熔解曲线,High Resolution Melting curve)结果如图1、图2所示。
图1为标准化熔解曲线图,如图所示,DHAV-1和DHAV-3 两种阳性质粒样品熔解曲线相互分开,表明所设计引物适合用于HRM分析。
图2 为峰型化熔解曲线图,如图所示,2种阳性质粒样品熔解曲线形状相同,均有1个熔解峰,表明引起GCP差值的主要原因为2种阳性质粒样品熔解温度(Tm)不同。2种阳性质粒样品当中,DHAV-3熔解温度较低为71.2℃,DHAV-1熔解温度较高为72.2℃。
实施例3 区分鸭甲肝病毒1型和3型 PCR-HRM方法的特异性试验
(1)从样本中提取病毒RNA或者DNA及反转录:方法同实施例1(1)病毒核酸提取方法和RNA反转录。
(2)用建立的PCR-HRM方法对DHAV-1和DHAV-3的cDNA进行PCR扩增,并以GPV、MDPV、MDRV、NDV、DEV、DTMUV的核酸作为对照样品,检验该方法的特异性。PCR-HRM的扩增反应:方法同实施例1(2)的反应体系和反应程序。
(3)特异性试验PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析,结果如图3所示。
从图3所示的峰型化熔解曲线图上可以看出,DHAV-1和DHAV-3阳性样品出现了跟阳性质粒一样的特异性峰型,而其他样品均没有出现熔解峰,表明所设计的引物特异性高适合用于HRM分析。
实施例3 区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM方法的敏感性试验
(1)用构建好的DHAV-1和DHAV-3阳性质粒样品进行敏感性试验,质粒浓度分别为127.2ng/μl和133.2ng/μl。阳性质粒用灭菌双蒸水作10倍倍比稀释至10-11,共11个稀释度,并用灭菌双蒸水作阴性对照。PCR-HRM的扩增反应:方法同实施例1(2)的反应体系和反应程序。
(2)敏感性试验PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。结果如图4和图5。
图4和图5分别是DHAV-1和DHAV-3的峰型化熔解曲线图,从图中可以看出,阳性质粒从10-1稀释至10-10均出现了特异性的熔解峰。结果表明该方法的灵敏度高,对DHAV-1和DHAV-3阳性质粒的最低检测限分别为1.5 copies和1.6 copies。
实施例3 区分鸭甲肝病毒1型和3型 PCR-HRM方法的临床样品检测
(1)从样本中提取病毒RNA及反转录:方法同实施例1(1)病毒核酸提取方法和RNA反转录。
(2)以提取的病毒cDNA为模板,进行PCR-HRM的扩增反应,方法同实施例1(2)的反应体系和反应程序。
(3)对扩增产物进行HRM分析,确定病毒的基因型。
本发明检测了22份鸭甲肝病毒的临床样品,PCR-HRM的结果如图6、图7所示。
从图6所示的标准化熔解曲线图上可看出,当分别以DHAV-1和DHAV-3阳性质粒样品作为对照时(GCP参数设值其值大于等于90%判定为相同基因型),22份临床样品中13份样品分型为DHAV-1,其GCP值为93.24%±0.78;9份临床样品分型为DHAV-3,其GCP值为94.52%±0.67。
图7为临床样品峰型化熔解曲线图,DHAV-1和DHAV-3 Tm值分别为72.2℃和71.2℃。
另外,分别用DHAV-1和DHAV-3的引物对22份临床样品进行普通PCR扩增,其鉴定结果与本发明方法检测的结果完全一致,说明本发明方法的准确性高,可达100%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物和方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
tagtgttgtg ggataccc 18
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
gtgggtgttt tacgtgtact c 21
Claims (6)
1.一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物,其核苷酸序列如下所示:
P1:5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’(SEQ ID NO:1);
P2:5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’(SEQ ID NO:2)。
2.一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM试剂盒,其特征在于:该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)从样品中提取病毒RNA;
2)将RNA反转录为cDNA;
3)以cDNA为模板,用权利要求1所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物;
4)对扩增产物进行HRM分析,确定病毒基因型;
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤3)中的PCR-HRM扩增反应体系为:
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤3)中的PCR-HRM扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性20s,43℃退火20s,72℃延伸10s;循环35次;72℃终延伸8min;55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:步骤4)中所述HRM分析的具体分析过程为:
1)以DHAV-1阳性质粒样品为对照时,若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为鸭甲肝病毒1型;
2)以DHAV-3阳性质粒样品为对照时,若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为鸭甲肝病毒3型。
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Detection and differentiation of the vaccine strain and field isolates of duck hepatitis a virus type 1 using real-time RT-PCR and high resolution melting assays;Kuang-Po Li, et al.;《Taiwan Veterinary Journal》;20151021;第41卷(第4期);第1页摘要、第2页右栏第1段、第3页左栏第1段、第6页右栏第1段 * |
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