CN105331740A - 一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型pcr-hrm的引物和方法 - Google Patents

一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型pcr-hrm的引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM引物和方法，该方法首先构建了DHAV-1和DHAV-3相应目的片段的质粒样品作为阳性质粒，然后从样品中提取病毒RNA并反转录为cDNA，再以cDNA为模板，利用所设计的特异性引物对cDNA进行PCR-HRM扩增；对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。本发明操作简单，只需在普通PCR反应之前加入荧光饱和染料；检测快速且高通量，整个操作过程需约3.5小时，即可完成96/384孔板的PCR产物检测，极大缩短了检测时间；费用低，不需要多条引物和特异性探针；敏感性高、特异性和重复性好，有利于在临床上的推广应用。

Description

一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物和方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物和方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎（Duckviralhepatitis，DVH）的病原包括鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirus，DHAV)（包括DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3）和鸭星状病毒（Duckastrovirus，DAstV）(包括DAstV-1和DHV-3)。据国内学者研究表明，鸭甲肝病毒（DHAV-1和DHAV-3）流行最为广泛，二者所表现的流行病学、临床症状、病理变化类似，已有两者混合感染的报道，临床上很难做到鉴别诊断。国内外对鸭甲肝病毒的病原检测传统方法主要有中和试验、琼脂扩散试验、凝集试验、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验和单克隆抗体技术，这些方法在实际应用中，存在程序操作繁琐、试验结果敏感性和稳定性差、耗费时间长等特点。尽管国内学者建立了二重RT-PCR的检测方法用于鉴别DHAV-1和DHAV-3，但此方法需要设计2对特异性的引物，而且判定结果需要进行凝胶电泳，所以该方法在进行高通量的检测任务时会显得费时费力，限制了其在临床上的推广应用。因此，寻找和建立一种操作相对简易、检测结果可靠且检测高通量和成本低廉的鉴别DHAV-1和DHAV-3的方法显得十分紧迫。本专利根据DHAV-1和DHAV-3在3D基因上的双碱基突变，利用HRM技术对DHAV-1和DHAV-3进行基因分型。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）的PCR-HRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠、检测高通量且成本低廉，有利于在临床实上的推广应用。
本发明的目的在于提供一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物和方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物，其核苷酸序列如下所示：
P1：5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’（SEQIDNO:1）；
P2：5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’（SEQIDNO:2）。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA；
2）将RNA反转录为cDNA；
3）以cDNA为模板，用上述所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒基因型。
进一步的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
Vazyme2×TaqPlusMasterMix5μl
引物P10.5μl
引物P20.5μl
模板1μl
STO-9染料0.5μl
ddH2O至10μl。
进一步的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，43℃退火20s，72℃延伸10s；循环35次；72℃终延伸8min；55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
进一步的，步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为：
1）以DHAV-1阳性质粒样品为对照时，若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-1；
2）以DHAV-3阳性质粒样品为对照时，若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-3。
本发明的有益效果是：
1）本发明首次建立了一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM引物和方法，该方法操作简单，只需在普通PCR反应之前加入荧光饱和染料；检测快速且高通量：整个操作过程需约3.5小时，即可完成96/384孔板的PCR产物检测，极大缩短了检测时间；费用低，不需要多条引物和特异性探针；敏感性高、特异性好，有利于在临床上的推广应用。
2）本发明的PCR-HRM引物，能高效扩增DHAV-1和DHAV-3，有助于提高PCR的效率，缩短病毒鉴别分型的时间。
3）本发明的PCR-HRM引物特异性好，除可以特异性扩增DHAV-1和DHAV-3外，不与其他常见禽类病毒核酸结合，有利于提高本发明对基因型分析的准确性。
附图说明
图1是DHAV-1和DHAV-3质粒样品标准化熔解曲线图；
图2是DHAV-1和DHAV-3质粒样品峰型化熔解曲线图；
图3是DHAV-1和DHAV-3特异性试验峰型化熔解曲线图；
图4是DHAV-1和DHAV-3敏感性试验标准化熔解曲线图；
图5是DHAV-1和DHAV-3敏感性试验峰型化熔解曲线图；
图6是DHAV-1和DHAV-3临床样品标准化熔解曲线图；
图7是DHAV-1和DHAV-3临床样品峰型化熔解曲线图。
具体实施方式
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物，其核苷酸序列如下所示：
P1：5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’（SEQIDNO:1）；
P2：5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’（SEQIDNO:2）。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA；
2）将RNA反转录为cDNA；
3）以cDNA为模板，用上述所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒基因型。
优选的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
Vazyme2×TaqPlusMasterMix5μl
引物P10.5μl
引物P20.5μl
模板1μl
STO-9染料0.5μl
ddH2O至10μl。
优选的，步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，43℃退火20s，72℃延伸10s；循环35次；72℃终延伸8min；55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
优选的，步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为：
1）以DHAV-1阳性质粒样品为对照时，若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-1；
2）以DHAV-3阳性质粒样品为对照时，若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为DHAV-3。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM引物的筛选
PCR-HRM引物：
经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物碱基序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2对PCR-HRM法区分DHAV-1和DHAV-3的效果最好，其碱基序列如下所示。
DHAV-P1：5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’（SEQIDNO:1）；
DHAV-P2：5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’（SEQIDNO:2）。
实施例2一种区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM方法的建立
（1）DHAV-1和DHAV-3RNA的提取及反转录
用试剂盒TakaraMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.4.0提取病料样品中的RNA，并用TakaraReverseTranscriptaseM-MLV把RNA反转录为cDNA。
（2）阳性质粒样品的制备
用Takara公司的试剂盒将DHAV-1和DHAV-3纯化后的DNA分别连接至pMD-18T载体中，通过氨苄抗性筛选、菌落PCR及测序，筛选得到阳性克隆子即为阳性质粒样品。
（3）阳性质粒样品的PCR-HRM操作步骤
分别以上述获得的三种阳性质粒样品为DNA模板，分别进行PCR-HRM扩增反应和分析；
Vazyme2×TaqPlusMasterMix5μl
引物P10.5μl
引物P20.5μl
模板1μl
STO-9染料0.5μl
ddH2O至10μl。
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，43℃退火20s，72℃延伸10s；循环35次；72℃终延伸8min；55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
（4）阳性质粒样品PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-GeneQ分析仪进行分析。DHAV-1和DHAV-3HRM（高分辨率熔解曲线，HighResolutionMeltingcurve）结果如图1、图2所示。
图1为标准化熔解曲线图，如图所示，DHAV-1和DHAV-3两种阳性质粒样品熔解曲线相互分开，表明所设计引物适合用于HRM分析。
图2为峰型化熔解曲线图，如图所示，2种阳性质粒样品熔解曲线形状相同，均有1个熔解峰，表明引起GCP差值的主要原因为2种阳性质粒样品熔解温度（Tm）不同。2种阳性质粒样品当中，DHAV-3熔解温度较低为71.2℃，DHAV-1熔解温度较高为72.2℃。
实施例3区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM方法的特异性试验
（1）从样本中提取病毒RNA或者DNA及反转录：方法同实施例1（1）病毒核酸提取方法和RNA反转录。
（2）用建立的PCR-HRM方法对DHAV-1和DHAV-3的cDNA进行PCR扩增，并以GPV、MDPV、MDRV、NDV、DEV、DTMUV的核酸作为对照样品，检验该方法的特异性。PCR-HRM的扩增反应：方法同实施例1（2）的反应体系和反应程序。
（3）特异性试验PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-GeneQ分析仪进行分析，结果如图3所示。
从图3所示的峰型化熔解曲线图上可以看出，DHAV-1和DHAV-3阳性样品出现了跟阳性质粒一样的特异性峰型，而其他样品均没有出现熔解峰，表明所设计的引物特异性高适合用于HRM分析。
实施例3区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM方法的敏感性试验
（1）用构建好的DHAV-1和DHAV-3阳性质粒样品进行敏感性试验，质粒浓度分别为127.2ng/μl和133.2ng/μl。阳性质粒用灭菌双蒸水作10倍倍比稀释至10-11，共11个稀释度，并用灭菌双蒸水作阴性对照。PCR-HRM的扩增反应：方法同实施例1（2）的反应体系和反应程序。
（2）敏感性试验PCR-HRM结果分析
PCR扩增产物用Rotor-GeneQ分析仪进行分析。结果如图4和图5。
图4和图5分别是DHAV-1和DHAV-3的峰型化熔解曲线图，从图中可以看出，阳性质粒从10-1稀释至10-10均出现了特异性的熔解峰。结果表明该方法的灵敏度高，对DHAV-1和DHAV-3阳性质粒的最低检测限分别为1.5copies和1.6copies。
实施例3区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM方法的临床样品检测
（1）从样本中提取病毒RNA及反转录：方法同实施例1（1）病毒核酸提取方法和RNA反转录。
（2）以提取的病毒cDNA为模板，进行PCR-HRM的扩增反应，方法同实施例1（2）的反应体系和反应程序。
（3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。
本发明检测了22份鸭甲肝病毒的临床样品，PCR-HRM的结果如图6、图7所示。
从图6所示的标准化熔解曲线图上可看出，当分别以DHAV-1和DHAV-3阳性质粒样品作为对照时（GCP参数设值其值大于等于90%判定为相同基因型），22份临床样品中13份样品分型为DHAV-1，其GCP值为93.24%±0.78；9份临床样品分型为DHAV-3，其GCP值为94.52%±0.67。
图7为临床样品峰型化熔解曲线图，DHAV-1和DHAV-3Tm值分别为72.2℃和71.2℃。
另外，分别用DHAV-1和DHAV-3的引物对22份临床样品进行普通PCR扩增，其鉴定结果与本发明方法检测的结果完全一致，说明本发明方法的准确性高，可达100%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>广东省农业科学院动物卫生研究所
<120>一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物和方法
<130>
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工引物
<400>1
tagtgttgtgggataccc18
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工引物
<400>2
gtgggtgttttacgtgtactc21

Claims (6)

1.一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型PCR-HRM的引物，其核苷酸序列如下所示：
P1：5’-TAGTGTTGTGGGATACCC-3’（SEQIDNO:1）；
P2：5’-GTGGGTGTTTTACGTGTACTC-3’（SEQIDNO:2）。
2.一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型的PCR-HRM方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒RNA；
2）将RNA反转录为cDNA；
3）以cDNA为模板，用权利要求1所述的引物对P1、P2及荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒基因型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
Vazyme2×TaqPlusMasterMix5μl
引物P10.5μl
引物P20.5μl
模板1μl
STO-9染料0.5μl
ddH2O至10μl。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，43℃退火20s，72℃延伸10s；循环35次；72℃终延伸8min；55℃到85℃以0.3℃/步的速率进行熔解曲线分析。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为：
1）以DHAV-1阳性质粒样品为对照时，若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为鸭甲肝病毒1型；
2）以DHAV-3阳性质粒样品为对照时，若其基因分型置信值GCP大于等于90%则判定为鸭甲肝病毒3型。
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