CN104342497A

CN104342497A - 缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法

Info

Publication number: CN104342497A
Application number: CN201410679471.XA
Authority: CN
Inventors: 陆绍红; 陈睿; 童群波; 孔庆明; 郑斌; 楼涤; 丁建祖
Original assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明涉及生物技术领域中寄生虫的快速检测技术，公开一组伊氏锥虫缺失RoTat1.2基因变异株的环介导等温扩增（LAMP）检测中的特异性引物。包括两对用于检测伊氏锥虫的环介导等温扩增引物FIP、BIP、F3与B3，和一种利用上述两对引物检测伊氏锥虫的LAMP方法，其中包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和检测结果判断。其操作简便、成本低廉，结果易于观察，特异性针对伊氏锥虫中缺失RoTat1.2基因的变异株检测。

Description

缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是用于寄生虫快速检测技术中的一种利用环介导等温扩增技术快速检测伊氏锥虫缺失RoTat1.2基因的变异株所使用的特异性引物。

背景技术

伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）是一种寄生于脊椎动物造血脏器和血液中的血鞭毛原虫，虻、吸血蝇是主要的传播媒介，能引起牛、骡、马、羊和犬等家畜严重的伊氏锥虫病，又称苏拉病，临床主要表现为高热、贫血、黄疸和虫血症、急性者死亡率很高。伊氏锥虫感染还导致机体严重的免疫抑制，往往引发其他机会性疾病，如炭疽、巴斯德菌属感染。苏拉病广泛流行于我国江苏、浙江、安徽、云南、贵州、广东、广西、新疆等二十多个省、市、自治区，动物血清学调查平均阳性率高达5～20%，有的地方耕牛感染率甚至达64.47%，严重危害家畜健康。最近有报道首例人体感染伊氏锥虫的病例，更应引起广泛的重视。

伊氏锥虫感染常用的检测方法包括病原学检查和免疫学诊断，病原学检查主要是镜检和小鼠接种，存在灵敏度不高的缺点，尤其在慢性感染和低虫血期；免疫学诊断方法中的抗体检测特异性不高，不能区分现症和既往感染，而抗原的检测虽然特异性较强，但敏感性不高。为有效控制伊氏锥虫病，需要建立高度敏感、特异和简便的检测技术。聚合酶链反应（PCR）具有极高的灵敏度和特异性，并已应用于多种寄生虫病的诊断，但PCR需要精密仪器的配套使用，无法满足基层和现地检测的需求。

Notomi T等在2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其原理是利用Bst （Bacillus stearothermophilus）大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP由F1C和F2组成；BIP由B1C和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。

LAMP技术从2003年开始逐步用于医学检测，目前主要是应用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，已有应用环介导等温扩增技术快速检测伊氏锥虫的专利（专利号CN 101892313 B），该专利是靶向RoTat 1.2变异表层糖蛋白（VSG）基因的，但是目前已知存在有缺失RoTat 1.2基因的变异株，用该方法无法实现对RoTat 1.2基因缺失株伊氏锥虫的检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于环介导等温扩增技术（LAMP）检测缺失RoTat 1.2基因的伊氏锥虫变异株的高灵敏度、高特异性的检测方法，使其操作简便、成本低廉，结果易于观察。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）提取待测的伊氏锥虫的DNA；

（2）在环介导等温扩增反应体系中扩增靶DNA；步骤1提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中的体积浓度为0.05v/v；所述环介导等温扩增反应体系的反应条件为：65℃恒温反应60分钟，80℃反应5分钟；环介导等温扩增反应体系各组分及含量为：0.1～0.2μM的引物F3、0.1～0.2μM的引物B3、1.2～1.6μM的引物FIP、1.2～1.6μM的引物BIP、1.4～2.8 mM的dNTP、6～16mM的Mg²⁺、8U的链置换DNA聚合酶BstDNA polymerase、1.0～1.6 M的甜菜碱betaine、0.1V/V的10×ThermoPol Reaction Buffer，溶剂为无菌双蒸水；所述引物F3、B3、FIP、BIP如下：

FIP（SEQ ID NO.2）：

5’－AGTTCACGTGCCTCCGCTTCAATCAAAGACGAGCGGTTCG－3’；

BIP（SEQ ID NO.3）：

5’－TAGCCCGCCGCTGCTAAAATAGCGTATTTTCCCGCTACG－3’；

F3（SEQ ID NO.4）： 5’－CTGGCAGAGTCCACGAATT－3’；

B3（SEQ ID NO.5）： 5’－AGATCGGCTCCAGCTTCT－3’；

（3）结果分析。结果分析包括3种方法，方法一：直接观察步骤2反应后的产物是否有白色沉淀，若出现白色沉淀，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株；方法二：在步骤2反应的混合液中加入染色剂钙绿黄素（FD），染色剂FD的体积分数为4%，若出现绿色，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株；方法三：在步骤2反应后的混合液中加入溴酚蓝上样缓冲液，溴酚蓝上样缓冲液的体积分数为20%，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v，时间为30min，溴化乙锭（EB）染色后在紫外灯下观察，若出现梯度条带，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株。

本发明的有益效果是：该方法与常规检测方法相比，具有操作简便快速、敏感特异、无需特殊仪器、检测时间比普通PCR短等特点，适合于伊氏锥虫病现场防治人员使用。

附图说明

图1是LAMP检测伊氏锥虫的敏感性试验，采用电泳方法检测。1）是DNA标志物 DL2000，2）是10ng模板DNA，3）是1ng模板DNA，4）是100 pg模板DNA，5）是阴性对照。从结果可看出，LAMP检测伊氏锥虫的最低检测量是1 ng。

图2是LAMP检测伊氏锥虫的特异性试验，采用电泳方法检测。1）是DNA标志物 DL2000，2）是伊氏锥虫缺失RoTat1.2的突变株DNA样本，3）是伊氏锥虫正常株DNA样本，4）是疟原虫DNA样本，5）是刚果锥虫DNA样本， 6）是活动锥虫（VIVAX）DNA样本，7) 是利什曼原虫的DNA样本，8）正常小鼠血液DNA样本，9）阴性对照。从结果可看出，伊氏锥虫缺失RoTat1.2的突变株样本显示为阳性，其他样本均为阴性，表明伊氏锥虫正常株不扩增，且与其他寄生虫无交叉反应。

具体实施方式

以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。如无特别指明，实验所用的引物由上海生工生物技术有限公司合成；BstDNA聚合酶（购自New England公司）；甜菜碱（Betaine）、Mg²⁺购自SIGMA公司。

实施例一、特异性DNA序列查找：

从美国基因数据库—GENBANK检索获得伊氏锥虫变异株JN2118Hu表层糖蛋白（VSG）基因序列，登录号为AJ870487.1，针对该保守靶序列进行LAMP引物设计，该特异性靶序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例二、引物的设计

LAMP方法中的引物设计是LAMP法实现扩增的关键所在，应用PrimerExplorerV3软件设计引物。LAMP扩增的靶序列长度控制在300bp以下，LAMP最少需要4条引物，分别是正向内引物FIP，由F2区段(与靶基因F2c区段完全互补)和F1c区段（同靶基因3’末端的F1c序列相同）组成；正向外引物F3(与靶基因F3c区段完全互补)；反向内引物BIP，由B2区段(与靶基因3’末端的B2c区段完全互补)和Blc区段(同靶基因3’末端B1c序列完全相同)组成；反向外引物B3(与靶基因B3c区段完全互补)。各区段的设计规则与PCR相同。内引物长度通常超过40个碱基，外引物为20个碱基左右。除了引物的长度、碱基组成外，需要考虑引物与靶序列的环状结构等。设计出的扩增伊氏锥虫JN2118Hu变异表层糖蛋白（VSG）基因的4条特异性引物为：

FIP：5’－AGTTCACGTGCCTCCGCTTCAATCAAAGACGAGCGGTTCG－3’

BIP：5’－TAGCCCGCCGCTGCTAAAATAGCGTATTTTCCCGCTACG－3’

F3： 5’－CTGGCAGAGTCCACGAATT－3’

B3： 5’－AGATCGGCTCCAGCTTCT－3’。

实施例三、环介导等温扩增（LAMP）反应

本发明是根据环介导等温扩增（LAMP）技术原理，针对伊氏锥虫JN2118Hu分离株的变异表层糖蛋白（VSG）基因特异性片段设计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构；具体过程为：

1、伊氏锥虫基因组DNA提取：实验室建立伊氏锥虫的动物感染模型。使用Takara公司的基因组提取试剂盒提取伊氏锥虫的基因组DNA，分光光度分析A260/A280>1.8，为检测体系提供模板，-80℃冰箱中储存备用。

2、LAMP反应的条件：

反应体系包括引物FTP、BIP、F3、B3；dNTP、Mg²⁺、链置换型DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）、Betaine、核酸模板，终体积25μl。LAMP反应在60～65℃恒温条件下进行。最佳反应条件因引物的效率和模板DNA质量变化而不同，因此通过比较试验确定最佳反应时间、反应温度和试剂浓度。每个反应设立阴性与阳性对照。

3、反应的敏感性、特异性分析

将伊氏锥虫基因组DNA梯度稀释后进行LAMP检测，由最低DNA检出量分析反应的敏感性，在各反应体系中加入的模板量分别为10ng、1ng、100pg，同时加入4%的FD染液，65℃恒温反应60min,结果显示模板量为10ng和1ng的反应液变成绿色，100pg和阴性对照（去离子水）的反应液不变色。再对反应液进行电泳检测，结果如图1，10ng和1ng的反应液具有大小不一的条带，100pg及阴性对照（去离子水）未有条带。综上可知，本发明LAMP检测伊氏锥虫的方法最低检测量是1 ng，具有较强的敏感性。

以伊氏锥虫正常株、疟原虫、刚果锥虫、活动锥虫（VIVAX）、利什曼原虫等五种寄生虫核酸为模板检测体系的特异性。在各反应体系中加入的模板分别为是伊氏锥虫缺失RoTat1.2的突变株DNA样本、伊氏锥虫正常株DNA样本、疟原虫DNA样本、刚果锥虫DNA样本、活动锥虫（VIVAX）DNA样本、利什曼原虫的DNA样本、正常小鼠血液DNA样本及阴性空白对照（去离子水）。同时加入4%的FD染液，65℃恒温反应60min,结果显示伊氏锥虫缺失RoTat1.2的突变株DNA样本反应液变成绿色，其他反应液均未变色。再对反应液进行电泳检测，结果如图2，只有伊氏锥虫缺失RoTat1.2的突变株DNA反应液具有大小不一的条带，其他均未有条带。综上可知，LAMP检测体系的特异性良好，伊氏锥虫正常株、疟原虫、刚果锥虫、活动锥虫（VIVAX）、利什曼原虫DNA没有交叉反应，可以特异性地检测伊氏锥虫。具有特异性。

4、LAMP反应的鉴定分析：

（1）直接观察：LAMP反应中核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物—焦磷酸镁白色沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度判断扩增与否。

（2）显色反应：直接向扩增管中加入嵌入剂钙黄绿素 (FD)，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。

（3）琼脂糖凝胶电泳：取反应后的混合液2μl，加入0.5μl溴酚蓝上样缓冲液，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v，时间为30min。EB染色剂染色后在紫外灯下观察。LAMP反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的大小不一的条带现象。

5、根据优化结果，确定了最佳的LAMP检测体系，在实际操作中可以存在一定的浮动范围，具体如下：

DNA提取物 0.05v/v；

F3 0.1～0.2μM；

B3 0.1～0.2μM；

FIP 1.2～1.6μM；

BIP 1.2～1.6μM；

dNTP 1.4～2.8 mM；

MgSO₄ 6～16 mM；

链置换DNA聚合酶 BstDNA polymerase 8U；

甜菜碱betaine 1.0～1.6 M；

10×ThermoPol Reaction Buffer 0.1 v/v。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省医学科学院

<120> 缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1489

<212> DNA

<213> 伊氏锥虫变异

<400> 1

tagaacagtt tctgtactat attgcttccg atactctaaa ggacatcaac gaaagtgcaa 60

aaatattgct tcatagattt taagccgact gagccgatgt ggagcctagt ggcgttgata 120

acagcaatag cgatatccaa tgcccagcac ggagagtcaa cgcacaaaaa acccttaaaa 180

ctagcagcaa tgcaaaaagt ttgccattta tcacttgaaa tgacaaaggt cccggcatac 240

gtcgccaatc gtctacaaca gcttgggcgg gaagcagcgg agctgcaaca actacaacag 300

attctgctta cagcagttct accaactgac ggagcggtgg acgaggaaat ggcaacactg 360

ttactgctag ccgataagct aggagtcgaa acggcgcgaa aaatccaaag cgcagcggaa 420

aaagcggtgc tcaccggcgg ccgctgcggt ttttacgctg gcagagtcca cgaatttgtg 480

agtgtctttt tccaatcaaa gacgagcggt tcgaactact gcatcaaggg aagcagcgac 540

gaagcggagg cacgtgaact tgattgcatc accgatgcat ccggagctag cccgccgctg 600

ctaaaatcca gcacctcgga acagcctgac gtagcgggaa aatacgctat cctaaaagaa 660

gctggagccg atctggttgc cgagagcacc gaaaaggact gcggcctcac aaaccacgac 720

gccacggacg gcggctacat ctacgcagga gcggcaacca gaccgataca ctggggaggc 780

gggttgttta aaacagcgtc gggagcagcg gctagcgcag cgagctggca gactgcaacg 840

gcaccgacaa tcgacaattc aacataccaa gaatgctcaa aacacctggc agagatcgtc 900

gcacaactta agtcagcaga acaagcggac aaactgttgc ttctcttagg caccgatcag 960

tcaacatggc aagacctcaa aattccggcg agaagtgtgg cggataaata ccctgaaaaa 1020

gagataactg tcaaaggcga caagctcaag agcatacacg aagcaatcca aaaattcaag 1080

caggccaact cagaagctaa taaagcagag caggcagtgg cagcagcagc actttctcgc 1140

atcgctctaa tcaaaacagc atgtcaactc gcagcgctgc tggccggcaa cgaaggttgt 1200

caagtcacca aagcggaggc ggccaaatgt gaagacaaga aacaagctga atgcggcacc 1260

actaagggtt gcgaatggaa taaaacagaa gaaaagtgca aaatcacaga gaaaccacaa 1320

aaagcagatg taacaaaaga agatggaaaa acaaccacaa acaccacagc gagcaattca 1380

tttgtgatta agaaggcccc tcttttgctt gcatttttgt ttttttaatt tcccctcttt 1440

ttcttccttg ctaaaacttt gctgaaaatt tctgatatat tttaacacc 1489

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agttcacgtg cctccgcttc aatcaaagac gagcggttcg 40

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tagcccgccg ctgctaaaat agcgtatttt cccgctacg 39

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctggcagagt ccacgaatt 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agatcggctc cagcttct 18

Claims

1.一种缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）提取待测的伊氏锥虫的DNA；

（2）将步骤1提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中扩增靶；其中，步骤1提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中的体积浓度为0.05v/v；所述环介导等温扩增反应体系的反应条件为：65℃恒温反应60分钟，80℃反应5分钟；环介导等温扩增反应体系各组分及含量为：0.1～0.2μM的引物F3、0.1～0.2μM的引物B3、1.2～1.6μM的引物FIP、1.2～1.6μM的引物BIP、1.4～2.8 mM的dNTP、6～16mM的Mg²⁺、8U的链置换DNA聚合酶BstDNA polymerase、1.0～1.6 M的甜菜碱betaine、0.1V/V的10×ThermoPol Reaction Buffer，溶剂为无菌双蒸水；所述引物F3、B3、FIP、BIP的序列分别如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.5所示：

（3）结果分析：直接观察步骤2反应后的产物是否有白色沉淀，若出现白色沉淀，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株；或者在步骤2反应的混合液中加入染色剂钙绿黄素FD，染色剂FD的体积分数为4%，若出现绿色，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株；或者在步骤2反应后的混合液中加入溴酚蓝上样缓冲液，溴酚蓝上样缓冲液的体积分数为20%，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v，时间为30min，溴化乙锭（EB）染色后在紫外灯下观察，若出现梯度条带，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株。