CN101429539B - 实时荧光定量pcr检测绿脓杆菌的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测临床细菌性肺炎、角膜溃疡、泌尿道感染、败血症等患者样品中以及化妆品、环境监测物等样品中的病原体绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断绿脓杆菌感染的试剂盒。

Description

实时荧光定量PCR检测绿脓杆菌的试剂盒

技术领域

本发明涉及检测临床细菌性肺炎、角膜溃疡、泌尿道感染、败血症等患者样品中以及化妆品、环境检测物等样品中的绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断绿脓杆菌感染的试剂盒。 

背景技术

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又称铜绿假单胞菌，属于假单胞菌属，在自然界中广泛存在，是一种常见的条件致病菌，可引起人和动物致病，引起化脓感染，人主要表现在烧伤、外科创伤和手术后感染居多。临床上可引起败血症、呼吸道感染、心内膜炎、尿路感染、中枢神经系统感染、骨关节感染、眼科、耳、乳突及鼻窦感染、皮肤软组织感染、消化道感染等。由于绿脓杆菌分布广、适应性强、且容易产生抗药性，是医院内感染的重要病原菌，常引起医院内感染的爆发和流行，因此，为了监测和控制绿脓杆菌的感染，研究绿脓杆菌的快速检测方法具有重要意义。 

传统的检测方法主要依靠绿脓杆菌的生物学特征(如革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓毒素等)结合多种生化试剂进行检测，虽然该方法具有一定的特异性和敏感性，但操作繁琐且耗时长，不利于对大规模样品进行检测。由于绿脓杆菌感染进展快，易耐药，病死率高，传统的检测方法有可能延误诊断和治疗，因此，开发早期、快速的检测技术非常必要。 

近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，聚合酶链反应(PCR)技术已经广泛应用于细菌、病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。国内外已经有部分实验室采用PCR扩增靶核酸来检测绿脓杆菌，如：Kingsford通过扩增16S rRNA基因来检测羊毛洗脱液中的绿脓杆菌(Kingsford NM，Raadsma HW.Detection of Pseudomonas aeruginosa from ovine fleecewashings by PCR amplification of 16S ribosomal RNA[J].VeterinaryMicrobiol，1995，47(1-2)：1-70)，Saint以脂蛋白I基因为靶点，通过设计引物和杂交探针来检测绿脓杆菌(Saint O，Romeyer F，Lebel P，et al.Specificity of the Pseudomonas aeruginosa Ollipoprotein I gene as a DNA probe and PCR target region within the Pseudomonadaceae[J].JGeneral Microbiol，1992，138(4)：733-741.)，Song通过扩增外毒素A基因来检测角膜炎患者临床标本中的绿脓杆菌(Song KP，Chan TK，Ji ZL，Wong SW：Rapid identification of Pseudomonas aeruginosa from ocular isolates by PCR using exotoxin A-specific primers.Mol Cell Probes2000；14：199-204.)，由于需要对PCR产物进行电泳或杂交分析等后处理，极易造成PCR产物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断。 

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion inBiotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。 

与普通PCR相比，TaqMan PCR技术具有如下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。 

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。因此，现在需要发展一种能够检测绿脓杆菌的实时荧光PCR方法，满足绿脓杆菌的检测与监测工作的需要。 

众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探 针。本发明人将实时荧光定量PCR技术应用于绿脓杆菌的所有已知变异体之基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。 

发明内容

本发明涉及检测临床细菌性肺炎、角膜溃疡、泌尿道感染、败血症等患者样品中以及化妆品、环境监测物等样品中的病原体绿脓杆菌(铜绿假单胞菌)存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断绿脓杆菌感染的试剂盒。 

因此，本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性及定量检测样品中绿脓杆菌的试剂盒，特别是涉及绿脓杆菌感染的早期和反复感染期在实验室诊断中的应用。基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺等PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI7500等荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。 

本发明所提供的检测临床样品中绿脓杆菌的试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别是ETA-F：5’-CCT CGA CGA TAC CTG GGA AGG CAA GAT CTA CC-3’(SEQ ID NO：1)和ETA-R：5’-ATG ACT GAT GAC CGT GGG TTT GAT GTC CAG GTC-3’(SEQ IDNO：2)，其中正向引物ETA-F可向5’和3’端方向各延伸5个碱基，反向引物ETA-R可向5’和3’端方向各延伸5个碱基。 

根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针是ETA-P：5’-CTC GCC GGC AAC CCG GCG AAG CAT GAC CTG G-3’(SEQ ID NO：3)，其中该寡核苷酸探针序列可向5’和3’端方向各延伸5个碱基。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中DNA提取液由chelex-100、NaOH、EDTA组成。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶、(b)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)(c)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(d)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物，和(e)能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳引物浓度为0.33μmol/L、探针浓度为0.22μmol/L； 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳镁离子浓度为 2.1mmol/L、酶最佳用量为3U/份、脱氧核糖核苷三磷酸最佳浓度为0.20mmol/L。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：93℃预变性2～3min；然后93℃45s，55℃1min，10个循环；最后93℃30s，55℃45s，30个循环。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为不含绿脓杆菌的液体培养基或生理盐水。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为绿脓杆菌标准株培养液，包括5×10⁷个/ml的强阳性质控品和5×10³个/ml的临界阳性质控品。 

根据本发明的另一个优选实施方案，其中定量参考品为绿脓杆菌标准株培养液，包括4个浓度梯度：1×10⁷个/ml、1×10⁶个/ml、1×10⁵个/ml、1×10⁴个/ml。 

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测出绿脓杆菌的最低浓度为5.0×10²个/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。 

本发明针对绿脓杆菌的外毒素基因保守区设计特异引物和探针，可检测出绿脓杆菌病原体，但不能检测出非绿脓杆菌病原体，说明本试剂盒具有很好的特异性。 

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测临床创口、烧伤面、角膜溃疡等病变区的分泌物或刮取物、痰液、尿液、血液、化妆品以及环境监测物等样品中的绿脓杆菌病原体，其中所说的分泌物包括但不限于脓液，其中所说的环境监测物包括但不限于水；可为灵敏、快速早期诊断绿脓杆菌感染以及诊断绿脓杆菌反复感染提供可靠的实验证据；同时由于能准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。 

附图说明

图1显示3个阳性参考品的检测结果图，3个阳性参考品的Ct值为17～24，扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性 

图2显示阴性参考品的检测结果图，7个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。7个阴性参考品包括近源种荧光假单胞菌、菊苣假单胞菌、恶臭假单胞菌，以及非近源种奇异变形杆菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌，都为中国微生物菌种保藏管理委员会所购买的标准株。 

图3显示线性与灵敏度标准品扩增结果的标准曲线。针对模板数为5.0×10¹～1.0×10⁶个/mL的反应体系进行TaqMan PCR分析。当绿脓杆菌个数为5.0×10²时，检测样品的Ct值在25左右，即检测下限灵敏度可到达5.0×10²个/mL。绘制得到的标准曲线斜率为-3.54，在Y轴截距为34.17，相关系数(R²)＝0.998。 

图4显示同一份阳性标本10次重复性实验的检测曲线，可看出不同的扩增曲线均在同一Ct值范围，变异系数CV＜6％，说明试剂盒的重复性好。 

图5显示六个临床阳性标本的扩增曲线。六个标本的Ct值分别是8.83，9.63，17.02，19.01，20.28，23.61；结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。 

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 

实施例1：绿脓杆菌检测试剂的研制 

1、引物和探针的设计：通过对Genbank数据库已有的全部绿脓杆菌核酸序列以及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以与绿脓杆菌致病有关的主要毒力因子外毒素A(ETA)基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。 

2、临床样本的选择：根据国内外相关文献报到表明，可以选择临床创口、烧伤面、角膜溃疡等病变区的分泌物或刮取物、痰液、尿液、血液、化妆品以及环境监测物，其中所说的分泌物包括但不限于脓液；其中所说的环境监测物包括但不限于水。 

3、反应体系的建立与优化 

样品的准备：以中国微生物菌种保藏管理委员会的绿脓杆菌标准株(CMCC(B)10104)作为绿脓杆菌检测的阳性标准品；以荧光假单胞菌、菊苣假单胞菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌作为阴性参考品。分别用DNA提取液煮沸法提取上述阳性标准品与阴性参考品的基因组DNA待用。 

引物探针的筛选：以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性标准品与阴性参考品的基因组DNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合(如序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3)。 

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.15μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的引物和从0.075μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为0.33μmol/L、探针浓度为0.22μmol/L。 

镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.1mmol/L。 

酶用量的优化：在40μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/份进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的酶用量为3U/份。 

dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.20mmol/L。 

反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：93℃预变性2～3min；然后93℃45s，55℃1min，10个循环；最后93℃30s，55℃45s，30个循环。 

4、灵敏度实验：以麦氏比浊法测定上述ATCC的绿脓杆菌标准株纯培养物的浓度为5.0×10⁹个/mL，然后10倍梯度稀释成5.0×10⁶个/mL、5.0×10⁵个/mL、5.0×10⁴个/mL、5.0×10³个/mL、5.0×10²个/mL、5.0×10¹个/mL作为绿脓杆菌线性灵敏度参考品，检测结果表明，本试剂盒的灵敏度为5.0×10²个/mL。 

5、临床标本检测；以临床创口刮取物作为待检标本，分别用DNA提取液煮沸法提取标本的基因组DNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明本试剂盒可以很灵敏的检测出临床标本中的绿脓杆菌病原体。 

实施例2：绿脓杆菌检测试剂盒及其使用 

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：DNA提取液(500μl/管)2管、PCR扩增反应液(？μl/管)20管、阴性质控品(100μl/管)1管、阳性质控品(50μl/管)1管、定量标准品(50μl/管)4管。 

2、标本采集、运送和保存 

(1)标本采集：包括各种临床标本，如血液、尿液、痰液、脓汁以及穿刺液等，亦包括来自医院环境中的各种标本，如水、空气、物体表面采样等，按照临床取样要求进行操作；还包括化妆品采样等，按照国家化妆品微生物检验标准进行操作。密闭送检。 

(2)标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送时应保存在0℃～8℃。 

3、检测步骤 

(1)标本处理与DNA提取 

增菌处理与DNA提取：上述采集的各类标本都可以按照国家有关绿脓杆菌标准培养方法进行增菌后，取菌液50μl加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟，12,000rpm离心5分钟，备用； 

非增菌处理与DNA提取：根据不同类型的标本选择合适的方法或核酸提取试剂盒进行DNA提取。以痰液为例：痰液中加入4倍体积的4％NaOH溶液，混匀后室温或65℃水浴30分钟；用枪头或吸管混匀后吸取1ml至1.5ml离心管中，5,000rpm离心5分钟；去上清，留沉淀及液体约20μl，加入1ml灭菌生理盐水，混匀后12,000rpm离心5分钟；去上清，留沉淀及液体约20μl，加入30μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟，12,000rpm离心5分钟，备用。 

(2)PCR反应与结果分析 

分别取阴性质控品、标本、阳性质控品、定量参考品品各5μl，加入PCR反应管中进行PCR扩增。PCR循环条件是：93℃预变性3min；然后93℃45s，55℃1min，10个循环；最后93℃30s，55℃45s，30个循环。 

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)(参见附图3所示)。由附图1可以看出，阳性样品的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值分别为16.77，20.34，23.04；在附图2中，由于阴性标本的荧光曲线低于阈值，故没有Ct值。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)，即标本中绿脓杆菌的浓度分别为1.04×10⁵、8.78×10³、1.36×10³(个/ml)。 

实施例3：应用绿脓杆菌检测试剂盒定量检测临床样品 

临床样品来自南京儿童医院的半固体培养物，直接取上层培养物50μl作为待测物，标本处理与DNA提取、PCR反应与结果分析参照实施例2进行。 

PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)，然后分析临床样品。临床样品的检测结果如附图5所示：六个临床阳性标本扩增曲线的Ct值分别是8.83，9.63，17.02，19.01，20.28，23.61，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。参照同一次试验中线性定量参考品的标准曲线图(如附图3所示)可以判定六个临床阳性标本的绿脓杆菌浓度分别为：2.53×10⁸、1.37×10⁸、5.12×10⁵、1.11×10⁵、5.02×10⁴、3.14×10³个/ml。 

                      序列表 

<110>中山大学达安基因股份有限公司 

<120>实时荧光定量PCR检测绿脓杆菌的试剂盒 

<140> 

<141> 

<160>3 

<210>1 

<211>32 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>1 

    cctcgacgat acctgggaag gcaagatcta cc 

<210>2 

<211>33 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>2 

    atgactgatg accgtgggtt tgatgtccag gtc 

<210>3 

<211>31 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 

<400>3 

    ctcgccggca acccggcgaa gcatgacctg g 

Claims (6)

1.一种定量检测样品中绿脓杆菌存在的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物分别为：

正向引物ETA-F：5’-CCT CGA CGA TAC CTG GGA AGG CAA GAT CTA CC-3’(SEQ ID NO：1)

反向引物ETA-R：5’-ATG ACT GAT GAC CGT GGG TTT GAT GTC CAG GTC-3’(SEQ ID NO：2)。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中所使用的寡核苷酸探针为：寡核苷酸探针ETA-P：5’-CTC GCC GGC AAC CCG GCG AAG CAT GAC CTG G-3’(SEQ ID NO：3)。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中正向引物浓度为0.33μmol/L、反向引物浓度为0.33μmol/L、寡核苷酸探针浓度为0.22μmol/L。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中耐热DNA聚合酶的浓度为3U/份。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.20mmol/L。

6.根据权利要求1中试剂盒，其特征还在于所检测的样品为血液、尿液、痰液、脓汁、穿刺液、医院环境中的水、空气、物体表面采样及化妆品。

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